paper of the month, november 2016 - research for rare€¦ · biologische vorgänge in inneren...
TRANSCRIPT
Paper of the month, November 2016
MDM2 prevents spontaneous tubular epithelial cell death and acute kidney injury
Dana Thomasova, Martrez Ebrahim, Kristina Fleckinger, Moying Li, Jakob Molnar, Bastian Popper,
Helen Liapis, Ahmed M Kotb, Florian Siegerist, Nicole Endlich and Hans-Joachim Anders
Cell Death and Disease, 30 November 2016, Epub ahead of print
__________________________________________________________________________________
Proteine zur Regulation von Apoptose spielen eine Rolle in allen gesunden Geweben, sind aber bei
einigen seltenen Erkrankungen sowie Krebserkrankungen fehlreguliert. So kann der Verlust der
Regulation des hierfür zentralen Proteins p53 sehr spezielle Auswirkungen in einem Gewebe haben.
Systemische Eingriffe in die Regulation von Zellüberleben und –tod zur Behandlung von
Erkrankungen sollten daher gut abgewogen werden.
Dies zeigt das Beispiel der Publikation aus dem STOP-FSGS Verbund. Die Forscher untersuchten die
Auswirkungen eines Knock down von MDM2, dem Inhibitor von p53, in tubulären Epithelzellen der
Niere. Es zeigte sich eine erniedrigte Überlebensrate der Zellen, welche durch den zusätzlichen Knock
down von p53 rückgängig gemacht werden konnte. Dies konnte sowohl in vitro als auch in
Zebrafisch- und Mausmodell nachgewiesen werden. Zudem entwickelten sich im Zebrafisch ein
Nierenödem und eine Erweiterung des Pronephros, was auf einen Verlust der Nierenfunktion
hindeutet. Die Nierenfunktion (Filtrationsrate) sank sowohl in der Maus wie auch im Zebrafisch.
Zudem zeigten die tubulären Epithelzellen Anzeichen für einen verfrühten Zelltod, darunter
Vakuolisierung, Verlust der Mitochondrien und Verlagerung von p53 in den Zellkern. MDM2 bewirkt
außerdem, dass arretierte Zellen im Zellzyklus in die Zellteilungsphase übergehen. Zellen mit einem
knock down von MDM2 können nicht mehr in die Zellteilungsphase übergehen. Eine Balance von
Zelltod und Zellteilung in der Niere ist jedoch sehr wichtig, da die tubulären Epithelzellen ständig
zellulärem Stress wie Hypoxie, Hyperosmolarität und Toxinen ausgesetzt sind.
Die Regulation dieser Prozesse spielt nicht nur bei der Embryonalentwicklung und Heilungsprozessen
eine Rolle, sondern hat auch Auswirkungen auf seltene Autoimmunerkrankungen wie Lupus
Erythematosus, aber auch auf Krebs. Vor dem Hintergrund der Entwicklung von MDM2 Antagonisten
für die Krebstherapie sollte man im Auge behalten, dass diese Anwendung für gesunde Gewebe vor
allem für die Niere schädlich sein könnte, da so Zellverluste nicht mehr ausgeglichen werden können
und es zu einer Nierendysfunktion kommen kann.
__________________________________________________________________________________
Kommentar von:
Susanne Artmeier, Dr. von Haunersches Kinderspital, Ludwig Maximilians Universität München
Paper of the month, November 2016
MDM2 prevents spontaneous tubular epithelial cell death and acute kidney injury
Dana Thomasova, Martrez Ebrahim, Kristina Fleckinger, Moying Li, Jakob Molnar, Bastian Popper,
Helen Liapis, Ahmed M Kotb, Florian Siegerist, Nicole Endlich and Hans-Joachim Anders
Cell Death and Disease, 30 November 2016, Epub
__________________________________________________________________________________
Proteins regulating apoptosis play an important role in every healthy tissue. Yet, they may be
dysregulated in rare diseases and cancers. Thus, the loss of regulation of p53 in a certain tissue can
have specific consequences. Therefore, systemic interventions in the regulation of cellular survival
and death to treat diseases should be undertaken cautiously.
This is shown by the publication of the STOP-FSGS network. The scientists investigated the effects of
a knock down of MDM2, the inhibitor of p53, in renal tubular epithelial cells. Cells which had less
MDM2 had lower survival rates. An additional knock down of p53 could rescue cellular survival. The
scientists were able to verify this in vitro as well as in a zebrafish and a mouse model. Additionally,
the zebrafish developed renal oedema and an expansion of the pronephros indicating a loss of renal
function. The filtration rate was reduced in both, the zebrafish and the mouse model. The renal
tubular epithelial cells showed signs of premature cell death such as vacuolization, loss of
mitochondria and localization of p53 to the nucleus. Moreover, MDM2 leads cells which are in a state
of cell cycle arrest to enter into cellular division. Cells with MDM2 knock down are not able to enter
the cell cycle. A balance of cellular death and cell division is mandatory for maintaining the function
of the kidney as these cells are constantly exposed to cellular stress such as hypoxia, hyperosmolarity
and toxins.
A regulation of cellular growth and apoptosis is not only important during embryonic development
and healing but also affects auto-immune diseases such as Lupus Erythematosus and also cancer.
Given the fact that MDM2 antagonists are in development to treat cancer one should bear in mind
that this treatment could harm healthy tissue. Especially, the kidney might not be able to
compensate for the loss of cells leading to renal dysfunction.
__________________________________________________________________________________
Comment by
Susanne Artmeier, Dr. von Hauner Children’s Hospital,
Ludwig Maximilians Universität München
�
�������������� ���������������
���������������� �������� ���������� ������������������������� ����������������!���
��"��#�$������#�����%�&��'�����
�������()�*���+#�,��+��-������#�.�/�������/��%������#�����������-���#�'��0��-�������#���1�����
���&&���#�������23��4/��#��������1�������#������%��&�#�2������)�5��1��#�,��������%��#�
����+��*����#�6��������(����#�������'�����#�'����/����������#�*����+����������1#�%3����
(��������#������7�����#����0���)�5�����#��������)�*�����+#�'�����8����#�8�������������#���1��)�
���1#�������$�������#�6���*��/��#�,�+��*�����+��9����#������� ��9�����#����1�����������#�
*������'��+����#�.����������+#������7���������#������� ����.)��������#��������1���5�� ���+�
�����1�������.���������*�1���%�������::#������ �;��
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<�
$�������0=������8�������������� ���� �������>������&������?���������@��1��/��������������
(��������������� �������������1���&���������9��������)������������!����������������1���>��
����������7�����/��!�����������1������������������A�������������)��3�����������6����������
���������������1���� �����������6���������,�+���+������!���$������#���������������/���
,�+���+��������!���5����)������������������,�+���+������+������� ����������!��������9�+���
����)�$����/��������������'����+�����������1�1�� ,�)�
$���9��������&�����������8����������&!���������1���� ����������&�������%����������B����� ��C�
������������������/���,�+���+�����)������������!������"�1����4��������+���������������:�
'�������1��������������+�=���������������D�����������������1��������%�������!�����)�$���
'���������+���+����1�5������������.�������������%����������������#���"���#�$���������B�����
&������������������ �����3����C#�(���+ ����������������+�����/���,����E��)�,����������'�������
&��������=����+���������1����������������'�'����+�����&!)���������1����+��)��������!����
������&�����=�����������+�/����������������������+�/����� �����#�&�1�(��� ��������
(�+��������+���#�����11�����/���'�������������������������=������������������)�9>��
A���������� ��/������1����������������'��&��������������&������#����������������������
��1���������A�����������������������(������������������6��������������=�����������������
�����1�����������'�����������!����������)�$����� ������������������/�������1����������������
��=����+��������������������'�������!����)�
$���������&������������3�#�!�����/���=��������!��+�����������(�����=����������������� ������
����&�������%�����������+���)��$������������������%���+������������1����������,�+���+������
!������� ����!������2�#���� �����#�5��������+���+����������5���������&�����!�����)�$�������
������������#�����'������#�������,�+���+������������+�������+���������������D���������!���#�
���������!������!�����������&������������)�
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<�
�
�
�
�������������� ���������������
���������������� �������� ���������� ������������������������� ����������������!���
��"��#�$������#�����%�&��'�����
�������()�*���+#�,��+��-������#�.�/�������/��%������#�����������-���#�'��0��-�������#���1�����
���&&���#�������23��4/��#��������1�������#������%��&�#�2������)�5��1��#�,��������%��#�
����+��*����#�6��������(����#�������'�����#�'����/����������#�*����+����������1#�%3����
(��������#������7�����#����0���)�5�����#��������)�*�����+#�'�����8����#�8�������������#���1��)�
���1#�������$�������#�6���*��/��#�,�+��*�����+��9����#������� ��9�����#����1�����������#�
*������'��+����#�.����������+#������7���������#������� ����.)��������#��������1���5�� ���+�
�����1�������.���������*�1���%�������::#������ �;��
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<�
���������F���!��������� ����� ��&�����1����������?���������@��1���1 ����&�������1 ���������
��� ��������1���������������)�-��������1 �����1�������1���������������������������������������
����!���������������������4�����)�$��������������� ������� ����������������/����������������������
����������#���������������/����������������������)���� �����������������������������������
������������!���#�!������������������������� ���������������1�� ,����!��+)�
������������������������������������!���������� ���������������������������B����� ��C�����
��������������/����������)�-��:� ������!������������������������/���������������!�����
���������������������!������������������1���������������������������!������"�1��
��4�������)����� �������������1����������1������#���"��#����������#������1����� ��"���
�������������/���������������������������������������������������)���1�� ���������!�
�����1�������������1��������������'� ��������������������� ������������)��������������/����
� ������������������������������������������#� ����������������������1�����1����������)�-�
������/���������������� ����)�9���������������������������1����� ����������1����������������
�������� ��1����������������� ���������� ��������������� �����������������������1��������������
������������������������ ������)�����������������������1����������������������1�����������
�"�1����� �����)�
����� ��������������������������/����������!����������������������!�������1 ���1��������
��� �������������������)�����������"�1������������ �������������������������������!��������
������������������2�#�1�� �����#��+����������������������)�����������!���!��������"�1��������
1�������� ��!������ ������!�����/������������!�����+��!������������+������)�
<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<�
��11�������
����������1�����G�$�)����1�����������#�$�)�/���*��������������F��*�� ���#��
2��!�����"�1�������D��/�������������
�������)��1����H1��)����1�������)��I���1���)�������H1��)����1�������)����
�
�������������� ������������
������������������� ������������������������������������������������������������� ����������
������������������������
��������������� �!�"��#����$�%� !�������&�$�'(&��!�)�� ���������)����!����������$��
*����+,��--./0!�12-3�4���-5�
�
�6������$�������������.���0 �� ��������������������� ���� ���������������7�����
$��� �$��(������������ ������"�� ������ �$���������!���������������&�����8���������7�����
��������������$��&������ �$����������������9����7��������� �������� ���'������
�����������:���������7������������� �������������������������������;2���<���������
&��������<����������!���������������������=� ��������� �6���:������������������ �!�
������������������������������������&��������$�7�'� �������������
$��� �����������������������!�����%��������������������$���9����������������� �8�$����
���� � �������������7�������������>:��������������?������>:����������?��� ��!�%�����
�����4��,!�@� �����,� ��������������%����@�������*�A���;7��
������������ 6��������8 ��������49�������������������������������*���� �����������$�
:4��,B��,��%9�� ����C�4$�������������������:���%������������������������(����� ���!�9������
$���������:����������������$�*���������9����@�������� ����������9����� �7�D�����
9�����������E��%!����������������������!�&��9����!�9����������������--�����1F�
���������7�D�$��� (��������� ����������������������:��������%��9����7�D������������
&��9����������@� �����,� �����!����������$(������!�����%���������������������������
�������������E��%�&�������������$������������%����������7�B$�%��&�������!���������� �����������
��E��%���� ���������������@� �����,� �������� ���9���!�9������������� ������E��%�
�������������������� 6��G������������������������%����������H�����6 ����������&��8������@����7�
4������� ���� ��&��8������@�����9���������$��������������=��8�������� !�������������������!�
�$������������ ����������������� ���������������� �������@�����&�����8����9���������
%�������7��
���=��������������������4������&��9��������������������!����������������"���� ��������:����$�
��6�������"��������������������������������������������������������$(�������9���7���$���
(���������������������&�����������&��8������@�����&���������9����7�D���������
=��9��������������������� (�����������������������4������������$������ �������
����������=��8�������&�������6���������9����7�D������������%��������������
&���&������������4���%�%�������:���������!�����%������������(����� �����������������
���������� �� ��� 6���� �7�������&����8����������9���������8 ��������D������@��������
����$��������� ���������!��$�����)�� ������&�������$����������������������������%�������!�
��&������%�������49������$�������� �$$�� �7���
�
�
�
��
������������������� ������������������������������������������������������������� ����������
������������������������
��������������� �!�"��#����$�%� !�������&�$�'(&��!�)�� ���������)����!����������$��
*����+,��--./0!�12-3�4���-5�
�
��� ��!��������������������������� ���$�����������������������7��������������$������� ������������
����������������������7��� �����$����������������� ������������7�+���������� ������$���������
������&�������������������7�������������������&�������������������������������� ����������
������!�����&�������� ������������������������������������ �!��������������9������������������
��&����$���� �$�����$��7�,�9�$���������$����������������������������������������9�$����
���������$��� ���������������� ���������������&�� �9������ �7�������$����������� �9����
?���������������I����?��������������I������������4��,!�%� �������������������$����
�������������*�A���;7�
4������������� �����:4��,B����9�� ���������$����� �������������������������� �������$������C�
�������������������9���9��������������$��������������������������&�����������!�9�� ���������
�������� ����������������������������������������E����������������������9�����������������
--����1F�� �����9����������E����7�����������������������������&���� �9�$�������� ����������
���7�����������9����������������&������������������������ ��������������������������������$�� �
���� �����$���������������������%� ������������7�����������������������������E���������������
�����������%� ����������������9���!��������������������$����������������������������7�������
$������������� ��������������������� �����$��� ���������7�4�������������$��� ��������������������
$����������������7�'�9�&��!����������� �����������$��������������������� �������������
������������ ��������� ����������7�
���������&������� �����$��������������9�� ������������������������������������������G�
����� ����������������������������� ������������$������������7������$��$�%���������� �� �
$������������� ����������������$��� ���������7��������������������!�������������� ������9�� ����
�������������� ��������������������$�������7���������$������������������������������9��� ������9�
�����$���� �������� �������7�+�&�������$�������������������� ��$���������������$���$����������
�������������&������������ �������������������������� ����� ������$�������� ������������������������
�������7�
�
�
��$$�������
������4��$�����J�D�7����$���������!��
D�7�&��'������������K��'�������!����9�������$������
B�&�������������
�����7���$����L$��7���$�����7��G����$�7�������L$��7���$�����7���
Paper of the month, July 2016
4D in vivo imaging of glomerular barrier function in a zebrafish podocyte injury model
Florian Siegerist, Weibin Zhou, Karlhans Endlich, Nicole Endlich
Acta Physiologica (Oxf), 2016 Jul 16
Mit der Identifikation der Röntgenstrahlen vor über 100 Jahren ließen sich erstmals
pathophysiologische Prozesse im Körper in Echtzeit abbilden. Nuklearmedizinische Methoden wie
SPECT und später die Positronenemissionstomographie ermöglichten in der Folge die Darstellung
weiterer biologischer Vorgänge. Inzwischen gewinnen zunehmend optische Verfahren, also
Fluoreszenz oder Biolumineszenz an Bedeutung. Verbesserte Techniken ermöglichen heutzutage eine
Darstellung physiologischer und pathophysiologischer Prozesse am lebenden Körper in Echtzeit auf
molekularer Ebene, dies ist die sog. Molekulare Bildgebung.
Neue Techniken werden in der Regel im Tiermodell entwickelt. Eine aktuelle Arbeit aus dem STOP-
FSGS Verbund zeigt beispielhaft die Möglichkeiten der molekularen Bildgebung bei einer seltenen
Erkrankung.
Das Zebrafischmodell eignet sich gut als vereinfachtes Modell für die Untersuchung der
Nierenfunktion. Im Gegensatz zu den meist verwendeten Mausmodellen ist es hier möglich,
biologische Vorgänge in inneren Organen mit Live-Imaging zu verfolgen. Hierfür kommt es den
Wissenschaftlern zugute, dass es bereits transparente Zebrafischlinien gibt. Die Forscher des FSGS-
Verbundes untersuchten so die Filtrationsrate des Pronephrons im Larvenstadium mithilfe eines
fluoreszenz-markierten Reporter-Proteins. So konnten auch kurzzeitige Schwankungen der
Filtrationsrate beobachtet werden. Es wurde untersucht, wie sich nach einer induzierten
Podozytenverletzung die Größenselektion des Pronephrons verändert. Dies ist auch als Modell
humaner chronischer Nierenerkrankungen relevant, da es auch hier zu einem Verlust der
Größenselektion und in der Folge zu Proteinurie kommt.
Diese Arbeit erörtert an einem Beispiel die technischen Möglichkeiten, die eine kontinuierliche
Beobachtung eines Systems ermöglichen. Dadurch können neue Einblicke in die Dynamik einer
Erkrankung gewonnen werden. Wichtig ist auch, dass das von Endlich et al entwickelte Modell für
eine Vielzahl von Fragestellungen modifiziert werden kann.
We have been able to visualize pathophysiological processes in the human body in real time for over
100 years with the identification of x-ray. Nuclear medicine methods such as SPECT and positron
emission tomography subsequently allowed the illustration of further biological processes. Currently
optical techniques such as fluorescence or bioluminescence gain importance. Nowadays, technical
improvements allow the visualization of physiological und pathophysiological processes in the living
body at molecular level in real time; this is also known as molecular imaging.
New techniques are usually developed in an animal model. A recent publication of the STOP-FFSGS
network exemplifies the possibilities of molecular imaging in a rare disease.
The zebrafish model is suitable as a simplified model for studying renal function. Unlike the
commonly used mouse model, you can track biological processes in inner organs with live-imaging
microscopy. In addition, there are transparent zebrafish breeding lines that can be used. The
researchers from the STOP-FSGS consortium monitored the filtration rate of the pronephros in
zebrafish larvae using a fluorescence tagged reporter protein for 26 hours. Thus they were able to
illustrate even transient changes in the filtration rate. After induction of podocyte lesions, the
scientists monitored how size selection in the pronephros changes. This work is relevant as a model
for human chronic renal disease, where size selection is impaired and proteinuria occurs.
This work describes exemplary the technical possibilities that allow a continuous surveillance of a
biological system in vivo. With these techniques, new insights into the dynamic course of a disease
can be obtained. It is also important to note that Endlich et al developed a model which can be
adapted to a big variety of scientific questions.
Comment by
Susanne Artmeier & Dr. Tilmann Schober, Dr. von Hauner Children’s Hospital, Ludwig Maximilians
University Munich
�
�������������� �����������
����������������� ������������������������ ���������� �����������������
�������������������������������������������� ��!���� �"���#������$��%�� ����������&�
&����'�� ��#��������(����)������ �����(�������*����+�����������������,�%�����������,�
������-�$���.&�����/���
/����/��� ���������������012�3���14�
�
�
5������������%����%����������������������' �%6�%����6����������5�%� %���������������!��
��6��������������������7 ���8�� ��"������������������������������%��� ������%��������������
���������'���6���������������������������5�%����������%����������� �����������������������
9� !���������5�%�������%8�(������ ������%�� ����������%��������������������%��"���%���
!�������6�%�����������&����6���%�� ����%����%�������)�����%��� !�������"������ ���������
�� �������8�)������������������������!���!����������������%����������������������%������������
9� �������������������������"%�������������������8��
(��� ���������������:�#./�!�����!��%�������������������������7 ����� ��������������������.
����.(�������!�����%���������/�������%����� ������'����!��%��8��������� �!�����������������
��� ������%�����������.����.(�������!�����%�� ������������������ ������&��� ���8�(�����
&������;����������� ������7������ ����������� ���8�� �������%�!��%�����������)�����%�����
/��� %�������%���!������' ��6����!���������������������������%������!��������������.�������
����/��� ��������������������8�<��#��������������������.(���!���!�����������.����.
(�������!�����%������������� �����������%�� ��������7���������!�����%�������������!���!���������
7��������������%�����'����!��%��8�(�����"�����&= �.� ���%���������������������������������
>��������8�(��� �%����������&= �.�;����� ������������������������8�(���������� �����
����������������������������������������%���� �.,��� �.����� ������,�������%.
����� ���� !�������8����������������� ����� ������!������ �����������6���%��%���
��!�����%�������&���6���%���������5�%���������������������/�������������������8��
(���9������ ��!��%�����������������.���%������� ��������&�� !�� ����������������������
����������������%�.�%������%����������������������!���5�%����������%��������������
� ��������)�����%��� !����������%���������"����8�� �����6%�����&�������;����?�� ����������
!���6���%�����������%����� ����������� �����������%�!����������%�������$����������
��������������������!���!�� ������������%��� ������%��������$�����8�
�
�
�
�
�
��
�
��%�����%����������������� ���� ���?���� �%� %�������������������������� ���8�#����
����������������� � ������ ���������������������%������������� �� �%������� ���������
����%���� ������%��� ������8�#����� ����������� �������%������ ������������������������ ��
����%�����%��������� �������%��� ������������������� ������ ���8�&�������������������
������������������� �������������%��������� ����������%���������� ���������������������8�
�=��������������������� �����:�#���� ������������� ��� �������������������������������� ��
������� �����%����� ��������*���8�+�� �� ����������� ������������������������ ��
� �������� ���������� ������ ��������������� ���� ������ ���������� ����������� �8�
#�������������� ����������������� �� ������ %������� �����%�� ����%�������� ����������������
����������������������������������������������� ��8���������������������������������������
���������� �������%������ ��������� ����������������������������� ������������������� ��
��������� ��������*�������� ����� ����8�@��� ���������������= ��� ���%�������� ������� ��
= ��������������������%� �= ������������� ��������8�#���������������%����������������
�� ���������� ��,��� ������� ������,�������%������ �������������� �������������8�
9������������������������������ ������������� ���� ����������� �%������������� �����
����������8�
#����������� ���=������������.�����%��� ������ ��� �� ���%��������������������.�
�����������������%��������� ������� ��� �� �%� %������������ �������� �������%�� ����
�����%8�#����� ��������������%������������������ �� ����������������������� ����
����� ������������������������������������������ ��� ��������������� ��������������� �8�
�
�
: ���������
�������&�������-�(�8�#��������� �����(�8�� ��)�����:�������A��) ������@����%��=��������
+����������������
������8������B���8���.��������8��C������8��� ���B���8���.��������8���
�
�������������� ����������
����������� � ������������������������ ���������� ���������������������� ���������������
����������������������������������������� !���"����������#�������
$�%�����������&�'������ &�(�)�)�� ��������&����*�����+����&�$�����������&�������������&�,�#���
-.���&�/�������� &�0�����������&�-������+�������&�(������� ������&�1�2����� ����&�3�����
4�������&�4� �����������&����������������&�/�� �3��!�&���������������&���� ����������&�
+�������� ��&���������"� �����&�3�����4���*���&�$�����0�5�� ��&�/�������'0��� �#&�����
-���������������&�
��������'����������6�����0���� ������� ������������� ����������#�78�9:������
�8;�8<=>�%��;78�9;?��
�
������������������������������ ��� ������ �������*!�� ������������@ ��� ��������� ���
0����������������*����!�����;�A�������������� �!�����&��������� ���(��� ����������������*�����
���*���������� ����� ���/�������������;�/��� �������� ��������0�.���������&�������������������
3���������������������0���#B3�@��#B$���������������������� ����6��������@;�1���������
(@����� C�������������� ������������ �����������������"����������������������(��� ������������
$���� �������;��
�����������&�!���������������������� ����+������������������������������������
(��� ��������������������������� ���&����������+���������1����������*!�� �;�/���(��� ����
������������������������������������#�������D���E����������� !��B"����������#�������D�"�E�
$���������.��������� ����������� ����F����� ���������!� ��;������������1�������B
�� ��� ������������������� ���6��������@������������@�;��������������@������������ ���
�� ��������� C�����.���������� ��������������#�������������������/�+B���������*����������
$��� ����������.����;�/������� ������������������ ���G��@����������������&���� ���������������
��H���*��������� �����&�������������� ������ ���-����*���+�!������� �����;�/���+������
�������� ������������+����������.������ ���������� ���-������&���������!���������� �*���������
����0���*���������������+������ ��������%�!��������-�������;�/����������������������@���� ��
�� ������0���*������������� ����/������� &������ ��������@������-�����������������
�� ��� �������� ������ ����I��� C����;���
����������������*���������������������&�!����������� ���������� ���(��� ����������������
����������������������������3�����.������+�!��������������/������� �����*��� ���;�+� ��������
����+��������������������+������ ������������0���*����������!������������������;�/�����
�� �������� C������������������.��!��������� ��� ���+������@����.������� ��������������� �����
/������� ��� ����������(��� �����������������������;�3������������*����������!�������&������
����+����������������������������@�� ����$�������������������;�����������B!���!���������
�������� ���/������� ����������� ����������3������&���������������� �������!� �����0���������
�.��������������� ����� ���(��� �������%� �����;�
�
�
��
J���������������������������������������������%���#�����������������;�-�������������������
����������� ���� ����������� �� ����������� ��;�-���������������������������� ����������������
����#�B����#�� �������������������� �����������#;�1������� ����������� � �������������
������������ ������� ����������������� ��!����������������� ������� ���� ��������;�
+���K��������������������� ��������������������!������������������1����������!�� ;�-���
� �������������������������� �������������������������������������� !���"����������#������;�
-������������������������������������� �������� ������#;����������������������� �
�� �������� ��� ���������������������������������#����������#����������������������/�+�
�������;���� ����������������������������� �������&���#� ���������#���������������#���������
��H��� ���;�-����������������������������������������� ��������!����#;�-����������������#�
���������� ��������������� ���������� ������������������������K����������������������
��������������������������� �������;��������#&������������ ��������������������������� �
�������� ����������������������� ������K ��������������������������������;�
������������������ ��#����!���!����� ��������������� ���������� ������� ��������������� ���� ���
�������� ����������;�-������������������ �������������������������������������������������*���
������;�1���������������������*����������!�� �������������������������� �����������;�
F������������ ��������� ���������������� ����������#���������������������������������������
���������������� ���� ��������� ����%� �;�
�
�
J�������#��
��������+�������L�/�;�-�������� �����&�/�;�����6������J�������M��6�����&�4��!�����K���������
F�������#����� ��
�������;�������N���;���B���� ���;��:�������;� �����N���;���B���� ���;���
�
��
�������������� ������������
������������� ���������������������������������������������������� ���������
!"� ���#��!�$� ���$�%&��'� �(#��'�����$�#��!��������#��#���)��*�������+��,��������-��
.�����/���-�0��1�.�����203�40567�089��1�-�,�� �0��1�:����8-�
�
�
(����� ��������;��)������<�������+"�������������������������������=��$������������
��$�)�����������$�)���������:��>�?��>������ ���>��������$-�!?����=�$�+������������������$���
��)�����;�����������)���������������,��������� ��-�%���@�=�����,�����������������������)���
����$��#����������$���A��>��������$���@�=������(�������$���$�� ����������A���������$�����$�
��������$��-�%����:���$���+����������?��������������!��$�$����������������>��������-�
#�"�������$�����������=�����"�������=������������>����$��������������=������$����"�����
������������������������:��������?�� )=-�:������������������������2�����������������
���� �$���>��-��
,������������:� �������$���:�%�����>������������$��� ���������-�������������
�������������������$����������������=����������/��B�����������������������������#����=���
$���-����$���C���������������������)����=��$����$����������<��$��#��������������������������
A�������=������-�D ��������$��=����)����$���������������E���������
�������������������;�?�����-�:�������$�>���$�����($����������� ���!"� ���������
������������ ����������������������������A������������������$�� �$����$�����������
;�?������)��&���$���������"����-��������������$�$� ���'�����$���=����������=�����������
��������������A�������$������E������)����=��������� ����������)<�$�����
%�����������������<���-����E�����$�����������$��&������)������$�������+�������>��������
��������)�������E��������������������������A����������$�����������$��������"F�����
G����������>����'�����<���-�%��$��<��)��&���$�������$���B���������������������������
������F��$��������)�����?����E�$������������ ������������� �����=��$��-��
���$���#�����)����$��:� ����������"���=��������������$��,�������)��������������
+���������=������;��)������������)��=��$��-�(������$���=$�����<������,�����������)���$���
�����������< ��=�����)��������������;�?������$���&��������������-�%�������?���$����$�������
>������>���������$����)�����A��������$����+����� �?��4���H6������ �$����"����-����
��������#�����������������������������,�����������-�
�
�
�
�
��
�
���������� �������������������$���� ����������$�>����������-������$������$���$�������$�
��>������ ��$�>�������-�*�����������������>�$�=�����������������������=�����������������
��>����������������-������������������������$��������$����������$����$�����������������
��������������������������������������������������$����-����������������������� �������
$����������$�������������������-��������$���$�������� ���������$�������=�����$��$�
�����������������$�������$������� ������������������=�����������������
��������������2�������������������������=� ���-�
:����������������������:�%��������>$��������$�� �����-���������������������������������������
������=������>��������������������������������������+������=��-����������������������� ����
���=������������������������������������������������������������������-�#����������������
��������������=�����������������������������-�#���������������������$�����!"� ���������
�>�������$�=������������������������������������������������������$�=�������������� ������
��������������������������������������-�����������$�����'����������� ���������������������
����������������������-�����$�������������=�������$���������$��������>����>����������������
������������ �=���$�����-�(������=����������������������=���� ���������=��������������������
���$����� ������������$��������$�������������������������-����������������������������'����=���
�������������$���������������������������������������������-��������$� ��������$�����
����������$�����$���������$� ��� ����>�����������$���-��
�������������������$����������=����=��������)�����������������$�����������������������������
���������������-�(���������������$�������������������������$����������������� ������� ��
���$��������=������������-������ ����������������������������� ��������������$>$����
����������������������������������� ���4���H6-���������������������������$��������������>����
������������������������������������>�������$>$����������-�
�
/������� ���
%�-��������#�� �����
%�-�>���!������/��$���I��!��������'�$=��E� �����G�>������E����
������-��� ��J��$-����������-$��
�
� � � �
�������������� �����������
����������������� �������������������������������
��������������������������������������������������������������� ��!�����������"���#���������
"�������$��� %��&�����'���"%�%���(�����"����"�������� �����"�)����� ������ ��������#������
"�������
$�*��"�����+����,-.������,/01%�#��.�0/%01203*"�%,/04/-/2 4�
�
5�����6�������"����7������7�������#���67�����������������%�8������#��������#��(�����������
�����������������9!��!�������6����%�9��!��������)��������������7��������������#�����(���
"����7������7��������#��������������6����������:��������������#����(��7����������6���%�
;��������!<�����#���������(�!�������=�����������#�#�����#��!����������7�#����6��
��#����!<�������������)���������������(�����������!������#���7�#��%�
9�������+��������>�(�����������*(�������#���"?8��@"A"����67�!��#������������#��������������
#�����������B���������#�6�����(����&������(����&�����%�������"����7������7���!����������
������!��!���������6�����7�#��%�9���������������)����������� ���������������C��8D�
7��(�������#������(���9!��!�����#�����)����������(�!����%�����@������)���"?8��@"A"�
�������������#���*�7�!���������������!�#�7��(67%�!���!����)�����������������
��(�&�������?����#�������#�!�������6�������#����#���@������)�����8�6����������<����
������&���@����������>����#�������+������������5�&�#������#����#�6��������������%�
9����� ��7����#�����#������8����������������������������(�������������+������!<������
���������#���@���������#���������������������5�&�#������#����8�9�+�������(���#��(���������
���5��������6�����#�������������#��&��������7������!������%�
�����(��!������)������������������6���������(���+��������7��������=���������7������
���+��������������"����7������7������������������������?����#�����#���9!����������6�
�������������������9!��!�����&����!<������7����!�����!�����������������������������
(�!��������#%� �������������9�+���������#������(��� ��7������>������)�������(���*���6����������
��������%�
�
�
����������������(�����+���7�������7������#��#%�8�����������������+���������)��)�#����
���������#�7������#������%�'������(�����������������������+�����������������������(�����+���7���
7������+������������#�������:�����()����(����+������+�����%�@����������������#������������������
+�)����7�!%�"����#������7���#����(���)���(�����(����!�������(��#����)��#%�
*����#�����+������+�)�#�#�(����������+(����������������"?8��@"A"����7�!�7�������)��������������
#������������������!��������+���7������+�#������%�?����+���7�����������#��(�������������#�
7���������#�������%� �7�)����������(��������!�������� ���������������C��8D��������������
�����(��������(�����#�����������#���#��%�?���������������������#����������������!���!�#�7����#�
� � � �
!���!����������������)������#�+��#�������������#���%�?����7����(���������7������������������8�
�����(�������#��������������������������������#���������+����#�(����+���������������������
+�#������%��*����������������8�7����+����������������������#�����#�(��������������������������
��8���+����������#��(��������+��#������������+����%�
?���+(�������������������������������������7����7����������������������+���7���7������#�����������
(���������#�(����#������##�����������+��������������+���7��%�'�������������!��7�������
������������#����������++�+��������������#���������+������������%�"(��E��������������������
��+���������#�����������������������������������������������%�
�
�
��������(���
"������*������F��%�?�������"���(����%�)��� ��������#��G�� ��+�������#7���������������
=��)������������
"�����%������H��#%����������%#�I��������%����(�H��#%����������%#��
�
��
�������������� ���������������
���������� ����������� ������������������� �������� ���������������
� ��������� ���������������� ������������!��"����#�����$�����% �������������&������
'��������! ���( !���� �����������)�����)�� �*��������������$�! ��&�+� �'�����������,��� ����
�� ����������&�� ���*������$���-��( ��������.��!!�����/���������-����������&����!�(� ��
�������(� ��$������(�� ��������&�����
� ��0�1234�*��150����6�� ���1237�28�4818990�:(����������������;�
�
�
����!�������(�-���-��!��� �������-��<���������!���*��-���������=�������������
�����0�#� �*��!�� ��!�� ���������� �����������.���� ������������������ ������ ��
��!������������!�������#�>����!������� ������������!������-�������� �����-����0�
����!� �����%���������������?����@ �����������<���������!������������������
��-������.�@ ������� �����-����������!����0����������&� �����@ �����
����������-���-��!�����&��������������������'�������� ����������������A�')�B�
��� ��!���� �����������0��
(���=�����������)%��C����!���-�� ������-��� ���������������������������������
����������-���0��')����������������������������������=������! D��0�%��*� �����
���������������������������������������#� ������$�����!����>�������� �!���
����������������������-����������������������������������������������������
@ �0����������� !������������!�����)��������������������� ���������������
@ �������! ����0����?������������� �@ ������(��� � �(������������������� ��
@ ��������� �����0�=�������)��� �������������������+�����!�#��������+������0�
@��$� ��-���%���������������*�����������@ ������E�� �������� ���������������
?���������������������@�� ��?�������!������#��?!��!�����0�%��(�!�����-���������
��!�����������������������������������-���������@ �� -����������������-�����
�������@ ������������������������!�������')������������������������>��
����0��
�
@������!���������������������!��������� ���?������� ���(�-���-��!���������
(���������!�-��� ,����!�������������*��-������� ����0��
��
�
� �
��
�
����!������������ ��������������!���������������������������������!��������������
�����0�$�����������+��������������������� ������������������ ��� ���0!0�������!���
��������!������ �������������+���������� ���������� �-���-����0�%����������������������
��� ���������� ���������������������������������������� ���������.�� ��������� �
�������������� �0�.�������� �������������������������������������,���������������
�������� ���������������A�')�B����������� ������� ����������� ������ ���������0��
�
��!�������������)%��C�������������- ���������� ����������������������������� !�����������0�
�')����������� ������������������������������!�0�%��������������������������������������
�������� �������������!������������ ���!�!�� �������������������������� �,��������������
�������������������� �0����������� �!��������������������������������������
����������!���� ��������������� �0�%������ �� ����������,��������������! �� � � �
���������� ��������� ��0���,�� ����� �����������+��������!������+�����!�
��������0�%��������� ������������� ��� ����������������� ��������������� �������!����
����������� �� ������!���������������0��������� ������!����������� ������������������ �
� ������������!����� �����������������,������������������0�.������� ���������������� ����
����')�����������������������0�
�
%�����������������-������!���,��� ������������������� ���� ������������������ ,���!���
�����������������0�
�
�
�
/����������
��������������F���0�.� ���������������0�����$�����/�� ��G��$������ ��'���!���,��� �����
<����������������
������0������H�0����������0I��� ����0������H�0����������0�
�
��
�������������� ��������������
���������������������� ������������������������������������ ��������������� �
!"#�$�%&�$� '��(�(���%'�����������'�������)�����'��������*!'�+����*'�*����'�,�����-'����������
-'�)������)�������.'�.�(����������'�/�����(�*'����#����!�������'�-(����'��������������'��(�����'�
������������0'���$����+'�����������'�����#����1'�-�����*'�!��#�������� �
-���������1����2##(�� �3456�-��7589�5�:338�84 ���:�54 5456;< <��� 345= 4> 43= �
�
�
��������?������(��������������#�������������#����(�'�� � ��(��������������$�������)��������
��������������/���������$������ �@��#����������������#����(���������������#A��#�������
@���������#�'���������B������������#�#���������������� ��*����#�����������/#�����A������
?������(���<������������(������������������������������'���������B�����B�����������@���������#��
��������(��A�����*�����������������$����B����� ����
?�������(�������������(����#��2%�+����������!�(��(#����!��#�������$����������������������
����������(#��������������(�����$(#���A�����������������#��� ����%���$���$ �%������
2##(��������B�������������������������������A�����(��(���������������C���������C�$�����
��������$������2##(��������'�����������������$����������D�(���������2##(�������(�������������
)������(��������� �.�������������������$�����������2##(�������(������#���
�(��##(��A�#�����(���<�B�������B������0A�������������������$�������������$C��������
%��#�������(�����������(��(������ (�������#����� �/������������������������#������C��
2##(���������B�������������������������(������#��� �#�$�����%�������$���(���(���2##(����(����
�������B�������������#����������������������������������������(��(��A���� ��
?���������$B������������)���$�������2##(���������'������������#A����������������
������$�����������������#�������������(����#������������ �(���������������� �)�������������
?��B����(��������������������������������?������(���� �E#��B���������������'�������������F������
B������������$��������(����������$������������������(����������������$(��������� ��
�
�
���������������������(����������#��'�� � ������������#�������������������#�#�����������
����������B������������� �@����������������#��������#����������#����������(���#(�����������
�����#�'�������#������#�#������������� ��#���#��'��B����'������#���������������������
����������������������������'�����(������������������#����������������������������� �
���������������#������2%�+������������(������!��#�����������������#�����������������
�#������������(��������������������������B���� �������������� ��������#����
�##(��������������B�����������������������������������������������#������������������������
��
�##(�������������'����B�������������������##(���������(�������������#����#������������� �
��#�����������������B�����##(���������(������B�������������(������##��������(��##(���� �
��(����������������������(�������#������##������B�����������������(���������������������
��B����(��(�����(�������#������� �2���������'������������������������#���������
�##(���������������(��������������������������(���B������#�������������������������
�##(����(�����������B������#���������������������������������� �
,���B���B��������������##(�����������������������#������#�����������#�������B����
���#��������������������������������(����#����(��������������������������������#� �
1#���������������������������������������������������B��� �,��������B����������#�������
�������G�?��������������#�����������������������$����'���������������#����#����������������������
���B�������������H�
�
�
�
1##��������
%� ����#����������'�%� ����0�(����1�������I��0�����'� (�B���*���#�������E����������*(������
���#��� ������J#�� (���#(������ ���
�