pcr (polymerase chain reaction ).pptx

7/26/2019 PCR (Polymerase Chain Reaction ).pptx

1/15

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Suatu tehnik sintesis dan amplifkasi DNA

secara invitro.Tehnik ini ditemukan oleh ary

!. "ullis dan #. #aloona pada tahun $%&'. PCRdidasarkan pada amplifkasi enimatik

ra*men DNA den*an men**unakan dua

oli*onukleotida primer yan* komplementerden*an u+un* ', dari kedua untaian sekuensi

tar*et.

Apa itu PCR?


2/15

Pada proses PCR men**unakanmen**unakan alat termosiklus.Se-uah mesin yan* memiliki

kemampuan untuk memanaskansekali*us mendin*inkan ta-un* reaksidan men*atur temperatur untuk tiap

tahapan reaksi.

Alat PCR


3/15


4/15


5/15

Amplifkasi DNA pada PCR dapat tercapai -ila

men**unakan primer oli*onukleotida yan* -iasa

dise-ut amplimers. DNA primer merupakan rantai

tun**al DNA yan* pendek yan* nantinya akan

dilen*kapi sesuai den*an urutan dari DNA

template. /mumnya primer yan* di*unakan pada

PCR terdiri dari 01231 nukleotida. Tidak ditemukan

adanya penin*katan pada spesiftas den*anpan+an* primer yan* mele-ihi 31 nukleotida.

Amplikasi DNA


6/15

a.DNA cetakan yaitu ra*men DNA yan* akan dilipat*andakan.

DNA cetakan yan* di*unakan se-aiknya -erkisar antara $1' 4

$15 molekul. Dua hal pentin* tentan* cetakan adalah kemurnian

dan kuantitas.

-.6li*onukleotida primer yaitu suatu sekuen oli*onukleotida

pendek ($& 4 0& -asa nukleotida) yan* di*unakan untuk

men*a7ali sintesis rantai DNA yan* mempunyai kandun*an 8 9

C se-esar '1 4 51: untuk kesta-ilan penempelan primer.

c.Deoksiri-onukelotida triosat (dNTP) terdiri dari dATP dCTP

d8TP dTTP. dNTP men*ikat ion "*09 sehin**a dapat men*u-ahkonsentrasi eekti ion. omponen ini yan* diperlukan untuk

reaksi polimerasi.

Komponen utama padaPCR


7/15

d.;nim DNA Polimerase yaitu enim yan* melakukan katalisis

reaksi sintesis rantai DNA. ;nim ini diperoleh dari ;u-acterium

yan* dise-ut Thermus aer. ?arutan

-u>er PCR umumnya men*andun* $1 4 '1m" Tris2@Cl p@ &32

&& (suhu 01oC) '1 m" Cl 1$: *elatin atau !SA (!ovine

Serum Al-umin) T7een 01 se-anyak 11$: atau dapat di*anti

den*an Triton B2$11 se-anyak 1$: disampin* itu perlu

ditam-ahkan $' m" "*Cl0.

Lanjutan


8/15

Ti*a tahapan pentin* dalam Proses PCR)

a.Denaturasi

Di dalam proses PCR denaturasi a7al dilakukan se-elum

enim ta< polimerase ditam-ahkan ke dalam ta-un* reaksi.

Denaturasi DNA merupakan proses pem-ukaan DNA untai *andamen+adi DNA untai tun**al. ni -iasanya -erlan*sun* sekitar 3

menit untuk meyakinkan -ah7a molekul DNA terdenaturasi

men+adi DNA untai tun**al. Denaturasi yan* tidak len*kap

men*aki-atkan DNA men*alami renaturasi (mem-entuk DNA

untai *anda la*i) secara cepat dan ini men*aki-atkan *a*alnyaproses PCR. Adapun 7aktu denaturasi yan* terlalu lama dapat

men*uran*i aktiftas enim Ta< polymerase. Aktiftas enim

terse-ut mempunyai 7aktu paruh le-ih dari 0 +am 1 menit '

menit masin*2masin* pada suhu %0' %' dan %E'oC.

Adakah tahapan-tahapan prosesnya?


9/15

-. Annealin* (penempelan primer)

riteria yan* umum di*unakan untuk merancan* primer yan* -aik

adalah -ah7a primer se-aiknya -erukuran $& 4 0' -asa men*andun*

'1 4 51 : 89C dan untuk kedua primer terse-ut se-aiknya sama.

Sekuens DNA dalam masin*2masin* primer itu sendiri +u*a se-aiknya

tidak salin* -erkomplemen karena hal ini akan men*aki-atkan

ter-entuknya struktur sekunder pada primer terse-ut dan men*uran*i

efsiensi PCR.

Faktu annealin* yan* -iasa di*unakan dalam PCR adalah 31 4 '

detik. Semakin pan+an* ukuran primer semakin tin**i temperaturnya.

isaran temperatur penempelan yan* di*unakan adalah antara 35oC

sampai den*an E0oC namun suhu yan* -iasa dilakukan itu adalah

antara '1 4 51o C.

Lanjutan


10/15

c. Peman+an*an Primer (;Gtention)

Selama tahap ini Ta< polymerase memulai aktivitasnya

memperpan+an* DNA primer dari u+un* 3,. ecepatan

penyusunan nukleotida oleh enim terse-ut pada suhu

E0oC diperkirakan 3' 4 $11 nukleotidaHdetik -er*antun*pada -u>er p@ konsentrasi *aram dan molekul DNA

tar*et. Den*an demikian untuk produk PCR den*an pan+an*

0111 pasan* -asa 7aktu $ menit sudah le-ih dari cukup

untuk tahap perpan+an*an primer ini. !iasanya di akhirsiklus PCR 7aktu yan* di*unakan untuk tahap ini

diperpan+an* sampai ' menit sehin**a seluruh produk PCR

diharapkan ter-entuk DNA untai *anda.

Lanjutan


11/15

Apa-ila keti*a tahap dalam proses PCRtelah dilakukan maka setiap satu se*men DNApita *anda diamplifkasikan men+adi duase*men DNA pita *anda yan* identiksehin**a +umlahnya men+adi dua kali le-ih-anyak dari +umlah semula. Siklus diulan*kem-ali mulai la*i den*an denaturasipenempelan dan eGtensi primer.

Apa yang terjadi setelah ketiga tahapdilakukan ?


12/15

Dalam proses PCR ini memiliki siklus dansiklus yan* ter+adi kisaran siklus optimumdalam proses PCR adalah 31 4 3' siklus-er*antun* pada enim polimerase +umlah

template dan se-a*ainya.

Lanjutan


13/15

!e-erapa komponen yan* diperlukan untukproses PCR adalah alat PCR (DNA ThermalCycler) dan -ahan seperti DNA sampel yan*

diamplifkasi dNTP yaitu -ahan -akunukleotida saat polimerasi (terdiri atas dATPd8TP dCTP dan dTTP) oli*onukleotida primeryaitu nukleotida pendek untuk men*a7ali

reaksi polimerasi enim DNA polimerase untukmen*katalisis reaksi peman+an*an primer dandd@06 serta -u>er PCR se-a*ai -ahan pelarut-ahan terse-ut.

Adapun komponen-komponenprosesnya


14/15

ele-ihan PCR dikatakan memilikin tin*kat keun**ulan yan*

san*at tin**i Spesiftas (sensiti)

Spesiftas PCR terletak pada kemampuannyamen*amplifkasi sehin**a men*hasilkan produkmelalui se+umlah siklus

;fsiensi

Akurateakuratan yan* tin**i karena DNA polymerasemampu men*hindari kesalahan pada amplifkasiproduk.

Kelebihan dan KekuranganPCR


15/15

ekuran*an "asalah yan* -erkenaan den*an PCR yaitu

-iaya PCR yan* masih ter*olon* tin**i.

Lanjutan

pcr (polymerase chain reaction ).pptx

Documents