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ISSN 1808-9909 Volume 5, Nmero 1, 2009

PLANT CELL CULTURE&

MICROPROPAGATION

Cultura de Clulas&

Micropropagao de Plantas

Publicao Cientfica da Associao Brasileirade Cultura de Tecidos de Plantas

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, MG, v. 5, n. 1, p. 1-70, 2009

A revista Plant Cell Culture & Micropropagation , editada semestralmente pela Editora daUniversidade Federal de Lavras (Editora UFLA), publica artigos cientficos da rea de cultura de tecidosde plantas por membros da comunidade cientfica nacional e internacional. Com uma tiragem de 600exemplares distribuda aos membros da ASSOCIAO BRASILEIRA DE CULTURA DETECIDOS DE PLANTAS (ABCTP) em dia com a anuidade.

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Editorao EletrnicaLuciana Carvalho Costa Editora UFLA

Christyane Aparecida Caetano Editora UFLAIsabel Cristina de Oliveira Editora UFLA

Consultoria Cientfica (v.5, n.1, 2009)

Adriana Madeira Santos Jesus EMBRAPAAna Cardoso Clemente Filha Ferreira de Paula UNIFENAS

Antonio Carlos Torres EMBRAPAtila Francisco Mogor UFPRCarlos Vincio Vieira UFMT

Celso Luiz Salgueiro Lage UFRJElisabeth Atalla Mansur de Oliveira UERJ

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Fabiano Guimares da Silva CEFET-RVJos Raniere F. Santana UEFSLilia Gomes Willadino UFRPE

Luciana Lopes Fortes Ribas UFPRMagdi Ahmed Ibrahim Aloufa UFRN

Marcelo Murad Magalhes UFLAMauricio Reginaldo Alves dos Santos EMBRAPA

Osmar Alves Lameira EMBRAPARodrigo Kelson Silva Rezende UFGDTherezinha Rangel Cmara UFRPE

Plant Cell Culture & Micropropagation

ISSN 1808-9909

Plant Cell Cult. Micropropag., Lavras, v.5, n.1, p. 1-70, 2009

CONTEDO

Sacarose e um aditivo orgnico complexo na micropropagao de amoreira-preta (Rubus sp.) Sucrose and a complex organic addictive on micropropagation of Blackberry (Rubus sp.) Fabola Villa, Moacir Pasqual, Franscinely Aparecida Assis, Leila Aparecida Salles Pio .. 1

Estudo da anatomia de plntulas da espcie Malus domestica var. Golden delicious cultivada in vitro Anatomical study of Malus domestica var. Golden delicious cultivated in vitro Kelly Cristina de Macedo Bezerra, Magdi Ahmed Ibrahim Aloufa, Juliana Espada Lichston .................... 9

Crescimento in vitro de pequizeiro (Caryocar brasiliense a. St.-hil.): influncia da polaridade e luminosidade In vitro growth of Caryocar brasiliense a. St.-hil.: influence of polarity and light Breno Rgis dos Santos, Renato Paiva, Sandro Barbosa, Patrcia Duarte de Oliveira Paiva, Daiane Peixoto Vargas, Cristiano Martinotto ........................................................................................................... 19

Factors affecting in vitro germination of passion fruit seeds Fatores afetando a germinao in vitro de sementes de maracujazeiro Rodrigo Sobreira Alexandre, Flvio Alencar D arajo Couto, Jos Maria Moreira Dias, Wagner Campos Otoni, Paulo Roberto Cecon, Simone Bhering de Souza Gomes ................................................................. 27

Assepsia de rizomas e pices caulinares de Curcuma alismatifolia Asepsis of Curcuma alismatifolia rhizomes and shoot tips Tatiana Michlovsk Rodrigues, Jos Magno Queiroz Luz, Leandro de Oliveira Lino, Carlos Ribeiro Rodrigues, Geraldo Batista de Melo .................................................................................................................................................................. 36

Teor de flavonas e do cido 3,5-O-dicafeoilqunico em calos e em plantas in vitro e in vivo de carqueja [Baccharis trimera (LESS) dc.] Flavones and 3,5-O-dicaphenoilchinic acid contents on callus and on in vitro and in vivo Baccharis trimera (LESS) dc. plants Fabiano Guimares Silva, Ana Helena Janurio, Jos Eduardo Brasil P. Pinto, Vivian Elias Nascimento, Wellington dos Santos Barizan, Suzelei de Castro Frana ........................................................................... 42

Comparison of two particle bombardment devices using histochemical and fluorimetric assays of -glucuronidase in soybean embryogenic suspensions

Comparao de dois aparelhos de bombardeamento de partculas utilizando os ensaios histoqumicos e fluorimtricos da -glucuronidase em suspenses embriognicas de soja Marcelo Murad Magalhaes, Pon Samuel Jayakumar, Hee Sook Song, Sonitichai Chanprame, Jack Milton Widholm ............................................................................................................................................ 50

COMUNICAO CIENTFICA

Aclimatizao do hbrido de orqudea em substratos a base de p de bagao de cana-de-acar Acclimatization of orchid hybrid in sugar cane bagasse powder based substrates Lilian Yukari Yamamoto, Vanessa Stegani, Ricardo Tadeu de Faria, Ins Cristina de Batista Fonseca, Bruno Luiz Domingues de Angelis ........................................................................................................... 60

Micropropagation of black pepper (Piper nigrum) Micropropagao da pimenta-do-reino (Piper nigrum) Elisa Ferreira Moura, Ilmarina Campos de Menezes, Oriel Filgueira de Lemos, Osmar Alves Lameira Leila Mrcia Souza do Amaral, Clarisse Beltro Rosas Rocha .................................................................... 65

Sacarose e um aditivo orgnico complexo... 1


(Recebido em 8 de janeiro de 2008 e aprovado em 16 de maro de 2009)

SACAROSE E UM ADITIVO ORGNICO COMPLEXO NAMICROPROPAGAO DE AMOREIRA-PRETA (Rubus sp.)

SUCROSE AND A COMPLEX ORGANIC ADDICTIVE ON MICROPROPAGATIONOF BLACKBERRY (Rubus sp.)

FABOLA VILLA1, MOACIR PASQUAL2, FRANSCINELY APARECIDA ASSIS3, LEILA APARECIDA SALLES PIO4

1Engenheira Agrnoma, Dra., Bolsista FAPEMIG Empresa de Pesquisa Agropecuria de Minas Gerais/EPAMIG Setor de Fruticultura - Rua Washington Alvarenga Viglione Vargedo 37200-000 Maria da F, MG [email protected]

2Engenheiro Agrnomo, Dr., Professor Titular do DAG Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG [email protected] Agrnoma, Mestranda em Entomologia no DEN Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG [email protected] Agrnoma, Dra., Bolsista da FAPEMIG Universidade Federal de Lavras/UFLA 37200-000 Lavras, MG [email protected]

RESUMOA micropropagao de amoreira-preta utilizada,

principalmente, para a obteno de plantas livres de vrus eem curto espao de tempo. Com o objetivo de aprimorartcnicas de cultivo in vitro de amoreira-preta cv. Tupy, testou-se o uso de concentraes de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1)e de suco de uva (SuFresh ) (0, 5, 10, 15 e 20%) adicionadasao meio MS acrescido de 1,0 mg L-1 de BAP, 6,0 g L-1 de gare pH ajustado para 5,8 antes da autoclavagem a 121C e 1,0atm por 20 minutos. Segmentos nodais, oriundos de brotaespr-estabelecidas in vitro foram excisados e inoculados emtubos de ensaio contendo 15 mL do meio de cultura e mantidosem sala de crescimento com temperatura de 25 2C, irradinciade 32 mol m 2 s 1 e fotoperodo de 16 horas. O delineamentoexperimental utilizado foi inteiramente casualisado,utilizando-se 4 repeties com 12 segmentos cada. Oexperimento foi avaliado aps 70 dias de cultivo in vitro.Melhores resultados na micropropagao da amoreira-pretacv. Tupy ocorrem com a adio de altas concentraes desacarose (45-60 g L-1) associadas a baixas concentraes desuco de uva (0-5%).

Termos para indexao: cultivo in vitro, meio de cultura MS,carboidrato, suco de uva, Rubus.

ABSTRACTThe blackberry micropropagation is used, mainly to

produce virus-free plants in a short period of time. With theobjective to improve the techniques of in vitro blackberry cv.Tupy cultivation, different concentrations of sucrose (0, 15,30, 45 and 60 g L-1) and grape juice (SuFresh ) (0, 5, 10, 15 and20%) added to MS medium supplemented with 1.0 mg L-1

BAP, 6.0 g L-1 agar and pH adjusted to 5.8 prior sterilization at121C and 1 atm for 20 minutes were tested. Nodal segments,originated from in vitro plants were excised and inoculated intubes containing 15 mL of culture medium and then transferred

to a growth room with temperature of 25 2C, irradiance of32 mol m-2 s-1 and photoperiod of 16 hours. The experimentwas a complete randomized design with four replicates and 12segments each. The experiment was evaluated after 70 days ofin vitro cultivation. Best results for micropropagation of theblackberry cv. Tupy were obtained using high (45-60 g L-1)sucrose concentrations associated with reduced (0-5%)concentrations of grape juice.

Index terms: In vitro culture, MS culture medium, carbohydrate,grape juice, Rubus.

INTRODUO

A amoreira-preta (Rubus sp.) uma frutfera de clima

temperado pertencente famlia Rosaceae, que contm

aproximadamente 740 espcies. Estima-se que a rea

cultivada no Brasil esteja ao redor de 250 hectares, sendo

o Rio Grande do Sul o principal produtor, seguido de Santa

Catarina, Paran, So Paulo e Sul de Minas (ANTUNES &

RASEIRA, 2004).

A sua propagao se faz por meio de estacas de

razes, brotos (rebentos) originados de plantas cultivadas,

ou ainda por estacas herbceas. Alm disso, com a

micropropagao da amoreira-preta, possvel obter

plantas livres de vrus, geneticamente uniformes e em curto

espao de tempo, sendo assim uma alternativa vivel

(SKIRVIN et al., 1981).

Um dos objetivos da micropropagao a

maximizao da multiplicao de gemas. Muita ateno para

VILLA, F. et al.2


sua obteno tem sido dada manipulao de reguladores

vegetais no meio. Vrios meios de cultura para amoreira-

preta tm sido testados e um especfico identificado pela

composio de sais minerais, enquanto as vitaminas,

reguladores vegetais e outros suplementos orgnicos

variam em concentrao (ERIG et al., 2002; VILLA et al.,

2004, 2008).

O meio nutritivo composto por gua, elementos

essenciais, vitaminas, aminocidos, acares, agente

solidificante, reguladores vegetais e eventualmente

aditivos como antibiticos, carvo ativado e aditivos

orgnicos complexos. Essas so preparaes obtidas de

produtos naturais, de composio indefinida, mas que

atendem ao propsito de enriquecimento do meio, visando

a melhor resposta no padro de crescimento das plantas

in vitro (TORRES et al., 2001).

Vrios elementos aditivos complexos como coco

(endosperma, gua, leite), peptona de carne, polpa de

banana, sucos de frutas, foram utilizados no meio de cultura

de tecidos (orqudeas) (STANCATO et al., 2008); (citros)

(FERREIRA et al., 2004). Entretanto, os dados

comparativos disponveis no permitem uma discusso

razovel sobre o efetivo estmulo ao crescimento

promovido por esses elementos (GEORGE, 2008). Sucos

de frutas so considerados fontes de carboidrato

alternativas, em substituio sacarose (SILVA, 2003).

A sacarose um componente importante no meio

de cultura, servindo como fonte de esqueleto de carbono

e energia. Sua concentrao tambm um fator

determinante no crescimento e dependente do tipo de

explante. Estudos comprovaram que 75 a 85% do aumento

da biomassa se devem incorporao de carbono pela

adio de sacarose (CALDAS et al., 1990). Para amoreira-

preta cv. Tupy, esse aumento se deu em meio de cultura

MS 150%, acrescido de 45-60 g L-1 de sacarose (VILLA et

al., 2004).

Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de avaliar

os efeitos da sacarose e de outra fonte de acar, como o

suco de uva industrializado, no cultivo in vitro de amoreira-

preta cv. Tupy.

MATERIAL E MTODOS

Segmentos nodais de amoreira-preta, cv. Tupy,

contendo duas gemas axilares e 2 cm de comprimento,

oriundos de dois subcultivos in vitro de brotaes

preestabelecidas, foram excisados e introduzidos em tubos

de ensaio (20x150mm), contendo 15 mL de meio MS

(MURASHIGE & SKOOG, 1962). Este meio foi acrescido

de 1,0 mg L-1 de BAP, 6 g L-1 de gar (Merck) e de

combinaes de sacarose (0, 15, 30, 45 e 60 g L-1) e de suco

de uva (Su Fresh - 0, 5, 10, 15 e 20%). O pH foi ajustado

para 5,8 antes da esterilizao a 121C e 1 atm por 20 minutos.

Posteriormente, os tubos de ensaio contendo os explantes

foram transferidos para a sala de crescimento, para os quais

as condies de cultivo foram mantidas a 25 2C,

irradincia de 32 mol m 2 s 1 e fotoperodo de 16 horas.

Ao final de 70 dias de cultivo in vitro, foram

avaliados nmero de brotos, nmero de folhas, massa

fresca da parte area, comprimento da parte area, nmero

de razes e massa fresca de calos.

O delineamento experimental utilizado foi o

inteiramente casualisado com quatro repeties

constitudas de trs explantes cada uma, totalizando 12

brotaes. Os dados foram analisados por meio do software

Sisvar (FERREIRA, 2000) e as concentraes de sacarose

e suco de uva comparadas por regresso polinomial.

RESULTADOS E DISCUSSO

Os resultados da anlise de varincia so

apresentados na Tabela 1. A interao entre as

concentraes de suco de uva e de sacarose promoveu

efeito significativo para todas as variveis analisadas.

Maior valor absoluto para nmero de folhas foi

obtido com 5% de suco de uva associado a 60 g L-1 de

sacarose. Por outro lado, sob o ponto de vista econmico,

melhores resultados (25,85) foram verificados com 20% de

suco de uva adicionado ao meio de cultivo MS e na ausncia

de sacarose (Figura 1).

No meio MS, contendo 0% e 5% de suco de uva,

maior nmero de folhas foi obtido com 60 g L-1 de sacarose,

enquanto que no meio MS contendo 20% de suco de uva



TABELA 1 Resumo da anlise de varincia para nmero de folhas (NF), nmero de brotos (NB), nmero de razes(NR), comprimento da parte area (CP) e peso da matria fresca da parte area (PMF). UFLA, Lavras, MG, 2007.

FV GL Quadrados mdios

NF NB NR CP PMF

Sac. 4 93,40** 0,0447 n.s. 0,8083** 7,0976** 0,033**

Suco 4 199,04** 0,3944 n.s. 0,9287** 4,544** 0,0362**

Sac. x suc. 16 219,38** 0,3595** 0,2979** 8,9457** 0,0135**

erro 71 0,1 0,6 0,12 1,91 0,004

CV% 23,27 18,20 19,50 2,67 5,09

** Significativo ao nvel de 5% de probabilidade de erro pelo teste F.sac. = sacarose; suc. = suco de uva; n.s. = no significativo.

FIGURA 1 Nmero de folhas de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentraes de suco de uva e desacarose, aps 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.

Y5% suco de uva = 13,94 + 0,2028x + 0,0032x2 R2 = 0,76

Y20% suco de uva = 25,84 - 0,2068x - 0,0015x2 R2 = 0,98

Y0% suco de uva = 9,04 + 0,63x - 0,0064x2 R2 = 0,94

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 10 20 30 40 50 60

Sacarose (g L-1)

Nm

ero

de fo

lhas

0% suco de uva 5% suco de uva 20% suco de uva

houve tendncia de reduo nesse nmero em relao ao

aumento da concentrao de sacarose. O comportamento

do nmero de brotos dessa cultivar foi semelhante ao

nmero de folhas, sendo estimulado pelo aumento da

concentrao de sacarose associado a 0 e 5% de suco de

uva (Figura 2).

Maior nmero de brotos ocorreu com 5% de suco

de uva associado a 60 g L-1 de sacarose, corroborando

assim com Villa et al. (2004, 2008), cujos autores estudando

diferentes meios para micropropagao da amoreira-preta,

afirmaram que, o uso de 60 g L-1 de sacarose proporcionou

maior nmero de brotos (2,8) das cultivares bano e Tupy.

Porm, Cao et al. (2003) afirmaram que, maior nmero de

brotos de Vaccinium corymbosum L. cvs. Bluecrop, Duke

e Georgiagem deu-se com a adio de 15 g L-1 de sacarose

adicionado ao meio de cultura WPM modificado.

Mesmo na ausncia de sacarose foi observada a

produo de brotos de amoreira-preta, corroborando assim

com Souza (1995), cujo autor verificou que na ausncia de

sacarose ocorreu uma produo mdia de 2,9 brotos/

VILLA, F. et al.4


explante e com 35,3 g L-1 de sacarose a produo passava

de 18,2 brotos/explante. Essa resposta, divergente do

presente estudo, sugere que o explante utilizado pode ter

usado suas prprias reservas de carbono na induo de

novas brotaes, sendo dispensvel a sacarose como

fonte de carbono.

Com o aumento nas concentraes de sacarose,

verificou-se um aumento quadrtico no nmero de razes,

sendo que maior nmero ocorreu entre 45-60 g L-1 de

sacarose na ausncia de suco de uva adicionado ao meio

de cultura (Figura 3). Leite et al. (2000) tambm afirmaram

que a percentagem de enraizamento de porta-enxerto de

FIGURA 2 Nmero de brotos de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentraes de suco de uva e desacarose, aps 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.

Y5% suco de uva = 1,80 + 0,0141x + 1E-06x2 R

2 = 0,83

Y15% suco de uva = 2,50 - 0,0299x + 0,0003x2

R2 = 0,83

Y0% suco de uva = 1,43 + 0,0415x - 0,0005x2 R

2 = 0,99

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

0 10 20 30 40 50 60

Sacarose (g L-1

)

Nm

ero

de b

roto

s


FIGURA 3 Nmero de razes de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentraes de suco de uva e desacarose, aps 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.

Y0% suco de uva = 0,99 + 0,0312x - 0,0002x2 R

2 = 0,97

Y10% suco de uva = 1,05 + 0,0055x + 0,0001x2 R

2 = 0,74

Y5% suco de uva = 1,22 + 0,0037x + 1E-04x2 R

2 = 0,60

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0 10 20 30 40 50 60

Sacarose (g L-1

)

Nm

ero

de ra

zes




pereira OH x F97 apresentaram comportamento quadrtico

significativo, com aumento nas concentraes de sacarose

estudadas.

Maior percentual de enraizamento foi obtido na

presena de uma situao oposta, ou seja, pela combinao

da maior concentrao de sacarose associada menor de

suco de uva industrializado. A combinao de altas

concentraes de sacarose (60 g L-1) associadas as

menores concentraes (0-10%) da outra fonte de

carboidrato, provavelmente afetam negativamente o

enraizamento por meio do aumento do potencial osmtico

do meio, fator sabidamente conhecido como inibidor do

crescimento radicial, durante o processo de propagao

vegetativa (MALDANER et al., 2006).

Comportamento semelhante ao nmero de razes

deu-se para comprimento da parte area e nmero de folhas.

Maior comprimento da parte area de amoreira-preta cv.

Tupy foi verificado com 45 g L-1 de sacarose, sem a adio

de suco de uva (Figura 4). A adio de sacarose no meio de

cultivo pode atuar como substrato para o processo de

respirao celular, fornecendo quantidade de energia para

o processo de rizognese e tambm atuaria na manuteno

do potencial osmtico do meio. Os dados obtidos

corroboram com as afirmaes de vrios autores de que a

presena de carboidrato essencial para a induo e

desenvolvimento de razes in vitro de muitas espcies

frutferas (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).

Quando se elevou a concentrao de sacarose, o

desenvolvimento da parte area diminuiu na maior

concentrao de suco de uva (20%). possvel que o

aumento do potencial osmtico e a consequente reduo

na absoro de nutrientes pelos explantes no tenha

evitado um efeito deletrio causado pela alta concentrao

do suco de uva. O aumento da concentrao de sacarose

no meio de cultivo no apenas elevou o suprimento de

carbono disponvel cultura, como tambm estimulou o

crescimento do material vegetal, conforme verificado na

ausncia e com a adio de 5% de suco de uva. J para

20% de suco de uva, o crescimento in vitro teve uma

resposta inversa, decorrente das altas concentraes de

fonte de carbono presentes no suco de uva, diminuindo

assim o potencial osmtico do meio.

A adio de 5% de suco de uva no meio de cultura

proporcionou maior massa fresca de brotaes, com

FIGURA 4 Comprimento da parte area de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentraes de sucode uva e de sacarose, aps 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.

Y0% suco de uva = 1,57 + 0,1927x - 0,0017x2 R

2 = 0,88

Y5% suco de uva = 2,42 + 0,1555x - 0,0018x2 R

2 = 0,82

Y20% suco de uva = 4,94 - 0,0112x - 0,0006x2 R

2 = 0,73

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 10 20 30 40 50 60

Sacarose (g L-1

)

Com

prim

ento

da

pa

rte

are

a (c

m)


VILLA, F. et al.6


FIGURA 5 Massa fresca da parte area de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentraes de sucode uva e de sacarose, aps 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.

aumento de sacarose at a concentrao de 60 g L-1 (Figura

5). Embora a alta concentrao de sacarose possa ter

elevado o potencial osmtico, a absoro de nutrientes

pelos explantes no foi prejudicada.

Verificou-se a formao de calos na base dos

explantes de amoreira-preta. Os resultados obtidos nas

concentraes de 0 a 10% de suco de uva foram muito

prximos (Figura 6), porm destaque deve ser dado

ausncia do suco de uva no meio de cultivo, quando maior

massa fresca de calos foi obtida com 60 g L-1 de sacarose.

O aumento nas concentraes de sacarose verificou-se de

forma quadrtica uma intensa formao de calos. Esses

FIGURA 6 Massa fresca de calos de amoreira-preta, cv. Tupy, cultivada em diferentes concentraes de suco de uvae de sacarose, aps 70 dias de cultivo in vitro. UFLA, Lavras, MG, 2007.

Y5% suco de uva = 1,09 + 0,0007x + 7E-05x2 R

2 = 0,97

Y0% suco de uva = 1,02 + 0,007x - 6E-05x2 R

2 = 0,82

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

0 10 20 30 40 50 60

Sacarose (g L-1

)

Mas

sa f

resc

a da

pa

rte

are

a (g

)

0% suco de uva 5% suco de uva

Y0% suco de uva = 0,99 + 0,0058x - 5E-06x2 R

2 = 0,97

Y5% suco de uva = 1,00 + 0,0072x - 6E-05x2 R

2 = 0,98

Y10% suco de uva = 1,04 + 0,0073x - 0,0001x2 R

2 = 0,87

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 10 20 30 40 50 60

Sacarose (g L-1

)

Mas

sa fr

esca

de

calo

s (g

)




resultados esto de acordo com Erig et al. (2004), quando

elevadas concentraes de sacarose induziram a formao

de calo na base dos explantes de marmeleiro (Cydonia

oblonga Mill.), cultivares MC e Adams. Essa formao na

zona de enraizamento indispensvel, pois pode afetar a

qualidade das razes, principalmente no que se refere

conexo vascular com a planta (FACHINELLO et al., 1995).

Pela pouca diferena entre a ausncia de sacarose

e sua adio no meio de cultivo para massa fresca da parte

area e de calos, o melhor resultado verificado foi na

ausncia dessa fonte de carboidrato.

Outro aspecto a ser considerado que a sacarose

tambm contribui na diferenciao dos tecidos vasculares

(SRISKANDARAJAH & MULLINS, 1981). Observou-se

que nos diferentes tratamentos nos quais ocorreram pouca

ou nenhuma formao de calos na base dos explantes, as

razes formaram-se diretamente da epiderme, pois com a

formao de calos, as razes formadas no so diretamente

ligadas aos explantes, podendo acarretar grande taxa de

mortalidade das brotaes, por ocasio de transferncias

para o substrato na fase de aclimatizao.

A sacarose e o suco de uva, como fontes de

carboidratos, visam a suprir as necessidades metablicas

dos explantes de amoreira-preta, atuando como fonte de

esqueletos carbnicos na diferenciao celular e no

crescimento, porm em concentraes antagnicas (altas

concentraes de sacarose e baixas de suco de uva) foram

essenciais no desenvolvimento in vitro dessa cultivar.

CONCLUSES

Maiores concentraes de sacarose associadas a

baixas concentraes de suco de uva proporcionaram

melhor cultivo in vitro da amoreira-preta cv. Tupy.

Plantas com maior nmero de razes foram obtidas

na ausncia do suco de uva em meio de cultura, adicionado

de 45, 60 g L-1 de sacarose.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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Estudo da anatomia de plntulas da espcie... 9


(Recebido em 31 de julho de 2008 e aprovado em 16 de maro de 2009)

ESTUDO DA ANATOMIA DE PLNTULAS DA ESPCIE Malusdomestica Borkh var. golden delicious CULTIVADA IN VITRO

ANATOMICAL STUDY OF Malus domestica var. golden delicious CULTIVATED IN VITRO

KELLY CRISTINA DE MACEDO BEZERRA1, MAGDI AHMED IBRAHIM ALOUFA2,JULIANA ESPADA LICHSTON3

1Biloga, MsC. Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Parnamirim, RN [email protected] Agrnomo, Dr., Professor Adjunto Departamento de Botnica Ecologia e Zoologia Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Rua Engo Nelson Bahia, 1800 Cidade Jardim 59078-280 Natal, RN [email protected]

3Biloga, Dra., - Professora Adjunta - Departamento de Botnica, Ecologia e Zoologia - Universidade Federal do Rio Grande do Norte/UFRN Avenida Salgado Filho s/n Lagoa Nova 59078-970 Natal, RN [email protected]

RESUMOA tcnica de cultura in vitro na fruticultura vem crescendo,

principalmente, para facilitar a produo de variedades resistentese de alta qualidade, havendo necessidade de novas alternativas afim de atender ao mercado consumidor. Neste trabalho objetivou-se analisar as estruturas anatmicas de plntulas de macieira(Malus domestica Borkh var. golden delicious) germinadasassepticamente in vitro e avaliar a taxa de germinao dassementes. As sementes de macieira foram escarificadas, inoculadasem meio MS bsico, e mantidas em condies controladas de luz,temperatura, fotoperodo e luminosidade. Para os estudosanatmicos, as plntulas germinadas foram fixadas em lcool, eutilizadas para confeco de lminas, pelo mtodo mo livre,como lminas permanentes. As sementes que tiveram o tegumentototalmente removido apresentaram a maior percentagem degerminao e a menor taxa de contaminao. No estudo histolgico,verificaram-se na raiz, em seco transversal, clulas da epidermecom espessamento na parede periclinal interna. Observou-se queseu sistema vascular composto por cinco plos de protoxilemaalternando-se com cinco do protofloema. No caule, o sistemavascular representado por um nmero variado de feixes do tipocolateral. A folha dorsiventral e hipoestomtica, e a epidermeapresenta acentuadas sinuosidades, com cutcula de espessuradelgada. Quanto anatomia, Malus domestica apresentaorganizao tecidual tpica das eudicotiledneas, havendodiferena entre os indivduos que crescem naturalmente e os decultivo in vitro.

Termos para indexao: Malus domestica, escarificao,histologia.

ABSTRACTThe technique of in vitro culture in horticulture has

grown mainly to facilitate the production of resistant high qualityvarieties, with the need of new alternatives in order to attendthe consumer market. The objective of this work was to analyse,in vitro, the anatomical structure of apple plantlets (Malusdomestica var. golden delicious) germinated aseptically in vitro,as well as to evaluate their seed germination rate. The appletree seeds underwent a scarification process being inoculated inbasic MS medium, and maintained under controlled conditions.

The germinated seedlings were scarified, for the anatomicalstudy, and both free hand and permanent laminae methods wereused. The seeds whose tegument was completely removedpresented the highest germination percentage and the lowestcontamination rate. For the histological study, it was found inthe root, using transverse section, cells of the epidermis withthickening in the internal periclinal wall. Five protoxylem polesalternated with five protophloem compose its vascular system.In the stem, the vascular system is represented by a variednumber of bunches of collateral type. The leaf is dorsiventraland hipostomatic, the epidermis presents accentuated sinuosity,with thin thickness cuticle. As for the anatomy, Malus domesticapresents the typical tissue organization of the eudicotyledons,showing difference among the individuals growing naturallyand those cultivated in vitro.

Index terms: Malus domestica, scarification, histology.

INTRODUO

O cultivo de diversas variedades de macieira est

consolidado como um empreendimento rentvel e vivel

no Brasil (CRUZ JUNIOR & RICARDO, 2002). A qualidade

da ma produzida no pas vem tornando o mercado

competitivo em relao ma importada (FREY, 1990).

Mas, na regio Sul do Brasil, onde ocorre maior produo

de macieira do pas, a maioria dos cultivares no tem sua

necessidade de frio invernal satisfatria, apresentando

srios distrbios fisiolgicos, como brotaes deficientes

e desuniformes, reduzindo a produtividade (CRUZ JUNIOR

& RICARDO, 2002).

A variedade golden delicious de origem americana,

uma das mais cultivadas do mundo. Sua casca verde,

com pontos escuros pequenos. Seu formato redondo e

regular. A polpa substancial, suculenta, doce e aromtica.

BEZERRA, K. C. de M. et al.10


Foi introduzida no mercado mundial em 1914 (ESCLAPON,

1969).

A macieira por muitas vezes apresenta perodo

juvenil encurtado, ocasionando um longo intervalo de

tempo at a germinao, tornando mais difcil e longo o

programa de melhoramento gentico para esta espcie

(ROEN, 1994). As sementes da macieira apresentam

dormncia e necessitam de uma temperatura tima para a

sua superao (DANTAS et al., 2002). Nesse sentido, o

cultivo in vitro dessas sementes apresenta-se como uma

alternativa de propagao da espcie, de forma rpida e

como possvel fonte assptica de explantes para

experimentos posteriores. Quando a dormncia

ocasionada por um balano desfavorvel entre promotores

e inibidores de germinao, mtodos que aumentem a

concentrao dos promotores ou que atuem impedindo a

ao dos inibidores devero ser empregados, como o

caso da estratificao, lixiviao e aplicao direta de

citocinina e/ou giberelina (FERREIRA & BORGHETTI,

2004). As interaes entre fitoreguladores afetam a

superao da dormncia e a subsequente germinao das

sementes (DUNLAP & MORGAN, 1977). Um outro tipo

de dormncia verificado a imposta pelo tegumento, que

eficiente para retardar a germinao (KHAN, 1996). E

uma forma de permitir a quebra da germinao, pela

escarificao mecnica, que obtida pela ruptura ou

abraso do tegumento (COHN, 1996; FERREIRA et al.,

1992).

Segundo Calvete et al. (2002), o cultivo de sementes

in vitro promove alteraes anatmicas, morfolgicas e

fisiolgicas nas plantas. Por isso, importante a

identificao dos aspectos estruturais da plntula para uma

melhor compreenso. As plantas crescidas in vitro podem

apresentar caractersticas peculiares como: abundncia de

espaos intercelulares, sistema vascular pouco

desenvolvido e reduzida capacidade de sustentao (baixa

incidncia de tecidos como esclernquima e colnquima),

estmatos no funcionais e baixa atividade autotrfica,

dentre outros tipos de desordens (CAMPOSTRINI &

OTONI, 1996).

As estruturas morfoanatmicas dos vegetais

sofrem grande influncia das condies ambientais em que

vivem, embora a relao entre esses caracteres adaptativos

e condies ambientais, em muitos casos, seja difcil de

estabelecer. Segundo Reeve & Sherman (1993), o termo

adaptao tem sido utilizado em anatomia vegetal para

descrever certos caracteres anatmicos associados a

determinadas condies ambientais e de cultivo.

Plntulas removidas do ambiente in vitro

necessitam de um perodo de aclimatizao, que lhes

permitiro adaptar-se s condies de cultivo em campo.

Campostrini & Otoni (1996) alertam para a dificuldade de

transio do mecanismo heterotrfico para autotrfico em

plantas micropropagadas, em virtude das alteraes

epigenticas, anatmicas e fisiolgicas, induzidas pelas

condies in vitro. Os estudos das adaptaes vegetais

em cultivo in vitro so de grande relevncia para

compreender o processo de aclimatizao das espcies e

seu desenvolvimento tecidual em resposta s novas

condies ambientais.

Conduziu-se este trabalho, com o objetivo de

analisar as estruturas anatmicas de plntulas de ma

(Malus domestica Borkh var. golden delicious) germinadas

assepticamente in vitro, por meio de um processo de

escarificao de sementes de ma e avaliar a taxa de

germinao das sementes sob as condies citadas.

MATERIAL E MTODOS

O trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de

Biotecnologia Vegetal, do Departamento de Botnica,

Ecologia e Zoologia, do Centro de Biocincias da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Para o

experimento de germinao, utilizou-se o meio Murashige

& Skoog (1962), contendo sais, vitaminas, 0,1 g L-1 de mio-

inositol, 6,0 g L-1 de agar e 30 g L-1 de sacarose. O pH do

meio foi ajustado para 5,7 antes da autoclavagem.

Utilizaram-se sementes de macieira (Malus domestica var.

golden delicious), retiradas assepticamente a partir de

frutos maduros, que foram colocadas para germinar sob

trs tratamentos assim denominados: T1 (sementes que



no sofreram nenhuma escarificao); T2 (a semente sofreu

um corte transversal) e T3 (remoo total do tegumento da

semente). Em seguida, as sementes foram inoculadas em

frascos contendo o meio acima citado. As culturas foram

mantidas em salas de crescimento com condies

controladas de luz (25 M m-2 s-1), fotoperodo (12h),

temperatura (262C) e umidade relativa (76%). Utilizou-se

o delineamento inteiramente casualizado, com trs

repeties de 10 frascos experimentais, onde cada frasco

apresentava uma semente. A cada 10 dias foram realizadas

as observaes, analisando a porcentagem de germinao

e contaminao.

Para o estudo anatmico, utilizaram-se razes, caules e

folhas de plntulas originadas de semente sem o tegumento

oriundas do cultivo in vitro, sendo retiradas do meio MS

aps 30 dias de incubao. As amostras foram retiradas a

partir de material fresco e fixadas em lcool 70% (JOHANSEN,

1940). Os cortes obtidos mo livre foram corados com azul

de astra e safranina (KRAUS & ARDUIM, 1998). As lminas

semi-permanentes foram montadas em gelatina glicerinada

50%. Para a confeco de lminas permanentes, o material foi

submetido s tcnicas usuais em anatomia vegetal (SASS,

1958), seccionados transversal e longitudinalmente, sendo

corados com azul de astra e safranina e montados em resina

sinttica (KRAUS & ARDUIM, 1998). Testes histoqumicos

foram realizados em corte de material fresco com a utilizao

de sudan IV para evidenciar substncias lipoflicas,

floroglucina para elementos lignificados, lugol para

evidenciar reservas de amido e cloreto frrico para sinalizar

substncias fenlicas (JOHANSEN, 1940). Para a obteno

de fotomicrografias, foi utilizado o equipamento

fotomicroscpio ZEISS. Os cortes histolgicos foram

observados com o auxilio de objetivas de 10X, 40X e 100X

de aumento. Utilizou-se tambm microscpio eletrnico de

varredura para a anlise das plntulas.


Germinao das Sementes

Os resultados obtidos neste trabalho mostraram

que no tratamento T1 (sementes sem corte), apenas

4,45% das sementes germinaram, obtendo-se a menor

porcentagem de germinao entre os tratamentos,

mostrando a dificuldade de embebio imposta pelo

tegumento e uma taxa de contaminao de 63,33% que

provavelmente ocorreu pelo fato das sementes no ter

passado por um processo de desinfestao, pois as

mas eram flambadas e cortadas dentro da capela de

fluxo laminar e as sementes eram logo colocadas em

frascos com meio de cultura. No tratamento T2 (com

corte), observou-se 15,55% de germinao resultado que

mostra que sementes parcialmente escarificadas

apresentam um aumento de germinao, comprovando

que a retirada parcial do tegumento torna o ambiente

das sementes mais favorvel ao seu desenvolvimento,

essa idia reforada quando se retira totalmente o

tegumento no tratamento T3 (sem tegumento) onde a

taxa de germinao alcanou 72,22%, mostrando que a

retirada total do tegumento bastante eficiente,

favorecendo uma melhor embebio para dar incio

germinao. Estando de acordo com Santos et al. (2003),

que trabalhando com sementes de Smilax japicanga

Grisebach, no obtiveram germinao nas suas sementes

sem escarificao. Em relao contaminao o maior

ndice 75,55% ocorreu no tratamento 2 provavelmente

em razo da inciso na semente, permitindo a entrada de

microorganismo alm dos presentes no tegumento e o

menor ndice 25,5% ocorreu no tratamento 3, mostrando

que a retirada total do tegumento, tem relao direta,

tanto com a germinao como a contaminao (Figura

1). A escarificao mecnica do tegumento tambm foi

eficiente na superao da dormncia das sementes de

vrias espcies com tegumento impermevel, como as

de Bauhinia monandra Kurz e B. ungulata L. (ALVES

et al. , 2000) e Dimorphandra mollis Benth

(HERMANSEN et al., 2000). Podemos inferir que as

sementes de macieira da variedade golden delicious,

possuem uma impermeabilidade do tegumento, como

mostra o tratamento T1, concordando com os trabalhos

de Barbosa et al. (1996) e Crepaldi et al. (1998), no que

diz respeito dureza do tegumento das sementes.



As sementes de muitas espcies frutferas,

principalmente daquelas que possuem frutos carnosos,

germinam em tempo relativamente curto quando colocadas

em condies de solo e ambiente favorvel, porm outras,

nas mesmas condies, no germinam (LEDO &

CABANELAS, 1996).

Caracteres estruturais da raiz

Em estudos realizados com a raiz, ao nvel da zona

pilfera, em seco transversal, verificou-se uma epiderme

unisseriada, destacando espessamento em algumas clulas

no sentido periclinal, pelos absorventes curtos e numerosos,

com cutcula delgada. A exoderme, tambm apresentou

paredes espessadas. A regio cortical compreende cerca de

sete camadas de clulas parenquimticas, com grandes

espaos intercelulares. Limitando o crtex, a endoderme

caracteriza-se pela parede delgada, no sendo observada

estrias de Caspary, reforos de suberina que sustentam o

feixe vascular, comumente encontrado nas razes de

angiospermas (GLRIA & GUERREIRO, 2006). O periciclo

unisseriado, com clulas maiores que as observadas na

endoderme e paredes delgadas. No cilindro central, o xilema

formado por cinco plos de protoxilema (pentarca), cujo

espessamento delgado. O arco procambial se mostra

evidente. A regio da medula ocupada por um parnquima

de parede delgada e poucos espaos intercelulares, sendo

FIGURA 1 Taxa de contaminao e germinao de sementes de macieira em trs tratamentos diferentes.

4,45

15,55

72,22

63,3375,55

25,55

0,00

15,00

30,00

45,00

60,00

75,00

90,00

Sem corte Com corte Sem tegumento

Porc

enta

gem

mdias das taxas de germinao

mdias das taxas de contaminao

registrada pouca substncia ergsticas identificadas pela

colorao escura dada pelos corantes lugol e cloreto frrico.

Caracteres estruturais do caule

Na seco transversal do caule, na estrutura

primria, observa-se uma epiderme unisseriada, e a cutcula

se mostra delgada. Sob a epiderme, verificam-se dois

estratos de clulas do colnquima, que de acordo com o

espessamento do tipo angular. Verificaram-se ainda, nesta

regio, clulas com contedo fenlico, determinado pela

colorao escura dada pela reao com o cloreto frrico. O

parnquima cortical formado por cerca de cinco estratos,

com formato isodiamtrico, deixando poucos espaos

intercelulares (Figura 2). Delimitando o crtex, v-se uma

camada de clulas parenquimticas, a bainha amilfera. O

sistema vascular circular, fechado e do tipo colateral.

Idioblastos fenlicos surgem entre os feixes vasculares,

principalmente prximos aos elementos do floema. A medula

ampla e constituda por clulas parenquimticas com

poucos espaos intercelulares (Figura 3).

Caracteres estruturais da folha

Na figura 4, representa-se um corte paradrmico da

folha de M. domestica. Verifica-se que as clulas da

epiderme da superfcie adaxial so delgadas, e menores

quando comparadas s da superfcie abaxial (Figura 4 e 5).



FIGURA 2

Seco transversal do caule de Malusdomestica de plntulas oriundas do cultivo in vitro emestrutura primria, revelando epiderme (ep), colnquima(co), crtex (c), xilema (x) floema (f) (40X). Barra = 30 m.

FIGURA 3 Pormenor do caule de plntulas oriundas docultivo in vitro de Malus domestica, observando o siste-ma vascular. Crtex (c), compostos fenlicos (cf), floema(f), xilema (x) e medula (m) (100X). Barra = 30 m.

As paredes das clulas da superfcie abaxial so delgadas

apresentando maiores sinuosidades; os estmatos so

grandes e do tipo anomocticos. Na figura 5, verificou-se

que a maioria dos estmatos est aberto, com clulas-

guarda em formato arredondado, tpico de eudicotiledneas

(RAVEN et al., 2001). Assim sendo, como os estmatos

so pouco funcionais, as plantas respondem muito

lentamente ao estresse hdrico (PREECE & SUTTER, 1991).

Os estmatos se localizam acima das demais clulas

da epiderme (Figura 6 e 7). Verificou-se ainda crista

estomtica. A cmara subestomtica ampla e as clulas-

guarda possuem espessamento nas paredes periclinal

externa e interna, sendo mais espessada a periclinal externa.

Em seco transversal, a folha hipoestomtica e

FIGURA 4

Vista frontal da epiderme, superfcieadaxial da folha de Malus domestica (100X). Barra =50 m.

FIGURA 5 Vista frontal da epiderme da superfcie abaxialda folha de Malus domestica, evidenciando estmatos(es) arredondados e abertos (100X). Barra = 50 m.

dorsiventral, sendo observada apenas uma camada de

clulas palidicas, contguas com numerosos cloroplastos;

o parnquima lacunoso apresenta grandes espaos.

A cera foliar epicuticular constitui interface natural

entre as folhas e o meio, tendo como funo bsica conferir

ao vegetal uma maior resistncia perda d gua e a doenas

(HARBORNE & TURNER, 1984) e adicionalmente, pode

ser importante na interao inseto-planta (BALSDON et

al., 1995; SUGAYAMA & SALATINO, 1995).

Nas Figuras 6 e 7, evidencia-se a morfologia da

cera foliar epicuticular de M. domestica cultivada in vitro,

classificada segundo Barthlott et al. (1998) como uma cera

do tipo filme com circunvolues como crostas sobrepostas

epiderme, no caracterizando cristais de cera.



FIGURA 6 Superfcie abaxial da folha de macieira.

FIGURA 7 Superfcie adaxial da folha de macieira.

Vrios pesquisadores afirmam que a morfologia da

cera foliar epicuticular reflete a sua constituio qumica

(BARTHLOTT, 1998; BONDADA et al., 1996). Segundo

Salatino et al. (1986), a cera inicia o depsito sobre a

cutcula, como uma camada amorfa que pode receber

camadas adicionais que se cristalizam e sugerem que ceras

que permanecem amorfas devem ter predomnio de

terpenides, substncias que determinam um alto poder

de impermeabilizao foliar e conferem defesa contra

fungos. Considerando a possibilidade da cera foliar

epicuticular de M. domestica ter um predomnio de

terpenides, estes constituintes qumicos podem ter

influenciado no equilbrio hdrico da variedade em cultivo

in vitro, evidenciado pela ausncia de estresse hdrico.

Na variedade golden delicious, encontramos 7

camadas de clulas parenquimticas, com grandes espaos

intercelulares, o periciclo unisseriado e o cilindro central

formado com 5 plos de protoxilema, diferindo do estudo

realizado por Rodrigues et al. (2006) com macieira da

variedade gala, cuja raiz se observa uma regio cortical,

apresentando cerca de 4 a 5 camadas de clulas

parenquimticas, com pequenos espaos intercelulares,

periciclo do tipo uniestratificado e cilindro central formado

por 4 a 6 plos de protoxilema. As variedades citadas acima



apresentam semelhana na regio da medula, na qual

apresentam um parnquima de parede delgada e poucos

espaos intercelulares. Mas, de acordo com Fahn (1990),

na maioria das espcies, o nmero de plos de protoxilema

pode variar entre plantas diferentes, ou em raiz diferentes

na mesma planta.

Na estrutura caulinar, observamos que a variedade

golden delicious apresenta um sistema vascular do tipo

circular, fechado e colateral, confirmando o sistema de

classificao de Foster & Gifford Junior (1974), o qual

confirma que as eudicotiledneas apresentam sistema

vascular do tipo eustele. O caule da plntula de macieira

variedade golden delicious apresentou as mesmas

caractersticas da macieira variedade gala, como relatado

por Rodrigues et al. (2006). Como a conexo entre o sistema

vascular do caule e das razes ainda precria para permitir

o fluxo transpiratrio adequado e o nmero de elementos

condutores reduzido, estes tambm podem ser

considerados fatores de risco na aclimatizao

(JOHANSSON et al., 1992; PREECE & SUTTER, 1991).

Nas folhas de macieira, desenvolvidas in vitro,

observou-se que, sua espessura menor quando

comparadas com as espcies desenvolvidas naturalmente.

A cutcula se mostra tambm menos espessa e os estmatos

acima das clulas, como mencionado nos trabalhos de

Donnely & Vidaver (1984) e Johansson et al. (1992).

Resultado semelhante foi verificado por Barboza et al (2006)

em estudo com plantas micropropagadas de abacaxizeiro.

Vrios autores afirmam que plantas sob condies

satisfatrias de suprimento hdrico e alto ndice de umidade

tendem a desenvolver uma cutcula foliar menos espessa

(SUGAYAMA & SALATINO, 1995), minimizando o gasto

energtico contra a dessecao. Em condies de cultivo

in vitro, a macieira evita o gasto metablico excessivo com

a produo de cutcula, uma vez que a planta encontra-se

adaptada ao ambiente mido e com grande oferta de gua

caracterstico deste meio de cultivo.

As clulas da epiderme da superfcie adaxial so

menores em relao da abaxial. O mesofilo compreende

apenas uma camada de clulas palidicas apresentando

espaos intercelulares. Nos estudos realizados por Brainerd

& Fuchigami (1981) para as folhas de ameixeira

micropropagadas in vitro, verificou-se que a camada de

clulas palidicas era formada apenas por uma camada.

Esse mesmo comportamento foi observado na espcie

framboesa vermelha (DONNELLY & VIDAVER, 1984),

videira (SMITH et al., 1986) e morangos (FABBRI et al.,

1986), as plantas crescidas no campo apresentam outro

comportamento, como a presena de tricomas unicelulares.

Em relao aos estmatos, alguns autores relatam

inabilidade de fechamento dos estmatos de plantas

cultivadas in vitro, quando removidas do meio de cultura.

A forma arredondada dos estmatos de Malus domestica

difere das clulas-guarda existentes em grandes variedades

de ma (BLANKE & BELCHER, 1989). Na variedade

estudada, a maioria dos estmatos est aberta,

concordando com os estudos realizados por Brainerd &

Fuchigami (1981). Resultados idnticos foram obtidos com

folhas incisadas de Solanum laciniatum Ait. (CONNER &

CONNER, 1984). Foi observado por Sutter (1988) que

estmatos de brotos de mas permaneceram abertos

aps a sua remoo do meio de cultura, porm cerca de

78% dos estmatos das cerejas e plantas de goma doce

desenvolvida in vitro se fecharam aps uma hora de

exposio s condies ambientais numa bancada de

laboratrio.

As plantas micropropagadas crescem em condies

de alta umidade relativa do ar, baixa luminosidade e trocas

gasosas restritas, resultando em baixas taxas de

transpirao e fotossntese (POSPSILOV et al., 1999;

PREECE & SUTTER, 1991). Durante a aclimatizao, as

plantas sofrem mudanas morfolgicas, anatmicas e

fisiolgicas, que as tornam capazes de crescer em um novo

ambiente (SUTTER et al., 1992). Essas alteraes

anatmicas nas plantas cultivadas in vitro podem

inviabilizar a aclimatizao das mesmas (ALBARELLO et

al., 2001). Brainerd & Fuchigami (1981) relataram a

necessidade da aclimatizao das plantas provenientes da

cultura in vitro, porque elas so sensveis e tenras, a

cutcula pouco desenvolvida, resultando em alta



transpirao e a parede celular no apresenta rigidez

suficiente para a sustentao.

CONCLUSES

Sementes de Malus domestica cultivadas in vitro e

desprovidas de tegumentos, promoveram uma germinao

de forma mais rpida e com menor ndice de contaminao.

As plntulas desenvolvidas in vitro apresentaram

caractersticas anatmicas que no permitem coloc-las

de imediato para aclimatizao, por isso recomendvel

que seja feita uma pr-aclimatizao para maior sucesso

das plantas propagadas.

O estudo anatmico de plntulas cultivadas in vitro

mostra-se como uma importante ferramenta para programar

as etapas do processo de aclimatizao do vegetal

maximizando as chances de viabilidade da espcie em

campo.

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Crescimento in vitro de pequizeiro (Caryocar... 19


(Recebido em 26 de maio de 2008 e aprovado em 19 de maro de 2009)

CRESCIMENTO IN VITRO DE PEQUIZEIRO (Caryocar brasilienseA. St.-Hil.): INFLUNCIA DA POLARIDADE E LUMINOSIDADE

IN VITRO GROWTH OF Caryocar brasiliense A. St.-Hil.: INFLUENCE OF POLARITY AND LIGHT

BRENO RGIS DOS SANTOS1, RENATO PAIVA2, SANDRO BARBOSA3,PATRCIA DUARTE DE OLIVEIRA PAIVA4, DAIANE PEIXOTO VARGAS5, CRISTIANO MARTINOTTO6

1Engenheiro Agrnomo, Dr., Professor, Universidade Federal de Alfenas/UNIFAL Rua Gabriel Monteiro da Silva 700 Centro

37130-000 Alfenas, MG [email protected] Agrnomo, Dr., Professor, Universidade Federal de Lavras/UFLA

Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected], Dr., Professor, Universidade Federal de Alfenas/UNIFAL Rua Gabriel Monteiro da Silva 700 Centro 37130-000

Alfenas, MG [email protected] Agrnoma, Dra., Professora, Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-000 Lavras, MG [email protected], Dra., Bolsista FAPEMIG Universidade Federal de Lavras/UFLA

Cx. P. 3037 37200-00 Lavras, MG [email protected] Agrnomo, Dr., Universidade Federal de Lavras/UFLA Cx. P. 3037 37200-00 Lavras, MG

[email protected]

RESUMODecorrente da devastao do Cerrado, a propagao

natural do pequizeiro tem sido comprometida. Alm disso,suas sementes apresentaram srios problemas de dormnciategumentar e uma possvel presena de inibidores. Nessecontexto, a cultura de tecidos torna-se uma alternativa para apropagao do pequizeiro. Objetivou-se avaliar o efeito dapolaridade de explantes foliares e nodais durante o cultivo invitro e verificar a influncia da luminosidade na calognese ena induo de brotaes de pequizeiro. O estudo da polaridadena calognese foi observado por meio da inoculao desegmentos foliares em meio WPM. O efeito da luminosidadena calognese foi verificado por meio da inoculao de explantesfoliares em meio WPM, acrescido de 1 mg L-1 de TDZ e 2 mgL-1 de 2,4-D, permanecendo os explantes aps a inoculao napresena e ausncia de. O efeito da luminosidade na induode brotaes foi averiguado por meio da inoculao desegmentos nodais em meio WPM acrescido com 0,75 mg L-1

de BAP e 0,05 mg L-1 de ANA, sendo que, aps a inoculaoos explantes foram mantidos na presena e ausncia de luz.Para a induo de calos em explantes foliares, a inoculaocom a superfcie abaxial voltada para o meio de cultivo e naorientao horizontal apresentou melhores resultados. Paraexplantes nodais, a orientao horizontal mostrou-se maiseficiente, uma vez que, este procedimento permitiu obter 3,88brotos/explantes, em mdia, sendo este valor superior aoencontrado na orientao vertical (1,5 brotos/explantes). Aformao de calos foi 38,31% maior na ausncia de luz. Asbrotaes em segmentos nodais desenvolveram-se melhor napresena de luz.

Termos para indexao: Micropropagao, Caryocarbrasiliense, explante.

ABSTRACTDue to the great devastation of cerrado, the natural

propagation of Caryocar brasiliense has been seriously affected.Besides, its seeds present serious problems of coat dormancyand possible presence of inhibitors. In this context, plant tissueculture becomes an alternative for the especies propagation. Theobjective of this work was to evaluate the effect of the polarityon leaf and nodal explants of Caryocar brasiliense during in vitrocultivation and verify the influence of light on callus and shootinduction. The study of the polarity influence on callus inductionwas observed inoculating leaf segments on WPM. The influenceof light on callus induction was investigated inoculating leafexplants on WPM supplemented with 1.0 mg L-1 TDZ and 2.0mg L-1 2.4-D, and maintained under the presence and absence oflight. The influence of light on shoot induction was evaluatedinoculating nodal segments on WPM supplemented with 0.75mg L-1 BAP and 0.05 mg L-1 NAA and maintained in the presenceand absence of light. For callus induction, inoculation of leafexplants with the abaxial surface in contact with the cultivationmedium on the horizontal position showed better results. Fornodal explants, the horizontal orientation showed to be moreeffective resulting in an average production of 3.88 shoots/explantwhen compared with the vertical position (1.5 shoots/explant).Callus induction was 38.31% higher in the absence of light. Shootsinduced on nodal segments developed better in the presence oflight.

Index terms: Micropropagation, Caryocar brasiliense, explant.

INTRODUO

O cerrado considerado um ecossistema com

recursos renovveis se manejado adequadamente.

SANTOS, B. R. dos et al.20


Entretanto, vem sendo destrudo e, com ele, espcies

frutferas importantes que poderiam ser utilizadas com

propsito econmico e social (POZO, 1997).

O pequizeiro (Caryocar brasiliense A. St,-Hil.)

destaca-se pelo uso de seus frutos na culinria, extrao

de leos para a fabricao de cosmticos ou mesmo na

medicina popular para tratamento de problemas

respiratrios. Alm disso, sua madeira considerada de

tima qualidade e resistncia (ALMEIDA & SILVA, 1994).

Em razo da grande devastao do cerrado e matas

ciliares, a propagao natural do pequizeiro tem sido

comprometida e, alm disso, suas sementes apresentam

srios problemas de dormncia tegumentar e presena de

inibidores (DOMBROSKI, 1997; MELO & GONALVES,

1991).

As dificuldades encontradas no processo de

propagao do pequizeiro por meio de sementes valorizam

a busca por solues alternativas para a produo de

mudas de maneira rpida e eficiente, o que, sem dvida,

pode significar um maior estmulo ao cultivo econmico

do pequizeiro. Nesse contexto, a cultura de tecidos

apresenta-se como uma soluo que pode favorecer a

obteno de mudas de pequizeiro, tornando possvel a

produo destas em grande quantidade.

Os explantes inoculados in vitro normalmente

exibem uma acentuada polaridade na proliferao celular e

na morfognese, de maneira a estarem relacionados com a

posio em que o rgo ou tecido se encontra na planta

intacta e tambm com sua orientao dentro do recipiente

de cultivo (SANTANA, 2003). Outro fator importante

que na micropropagao no basta conseguir altas taxas

de multiplicao, o importante obter uma taxa mdia

satisfatria por explante (ERIG & SCHUCH, 2002). Para

isso, necessrio estudar os fatores que influenciam as

respostas morfognicas no cultivo in vitro de plantas.

Santos et al. (2006) estabeleceram protocolos de

micropropagao para o pequizeiro e relataram que o melhor

tratamento para induo de brotaes foi aquele que

utilizou meio WPM suplementado com 0,05 mg L-1 de ANA

combinado com 0,75 mg L-1 de BAP, proporcionando a

maior taxa de multiplicao. Contudo, os autores no

trabalharam com os efeitos da influncia da luminosidade

e polaridade na micropropagao dessa planta.

Neste trabalho objetivou-se avaliar o efeito da

polaridade de explantes foliares e nodais durante o cultivo

in vitro e estudar a influncia da luminosidade na

calognese e na induo de brotaes in vitro de

pequizeiro, para otimizao dos protocolos de cultura de

tecidos e a produo eficiente de mudas micropropagadas.

MATERIAL E MTODOS

Efeito da polaridade de explantes foliares na obteno decalos in vitro

Folhas retiradas de plantas matrizes mantidas em

sala de crescimento sob irradincia luminosa de 67 mol

m-2 s-1, temperatura de 28 3 C e umidade relativa mdia

de 63% foram lavadas em gua corrente por 12 horas. Em

seguida, efetuou-se a desinfestao em cmara de fluxo

laminar, utilizando lcool etlico 70% por 1 minuto e

hipoclorito de sdio comercial (2,5% de cloro ativo) por

10 minutos, com subsequente lavagem, por trs vezes,

em gua estril.

Aps a assepsia, as folhas foram excisadas em

fragmentos de 3 cm2 e inoculadas em tubos de ensaio,

contendo 15 mL de meio WPM (Wood Plant Mdium)

(LLOYD & MCCOWN, 1980), suplementado com 30 g L-1

de sacarose, solidificado com 7g L-1 de gar e acrescido

com 1 mg L-1 de TDZ e 2 mg L-1 de 2,4-D. O pH do meio de

cultura foi ajustado para 5,8; autoclavado a 121C e presso

de 1 atm, por 20 minutos. Os explantes foram mantidos em

sala de crescimento com fotoperodo de 16 h e temperatura

de 25 1C.

O experimento foi conduzido em delineamento

experimental inteiramente casualizado, com 2 tratamentos

e 25 repeties, sendo cada repetio composta por um

tubo de ensaio contendo um explante. O tratamento 1

correspondeu inoculao do explante foliar com a

superfcie abaxial voltada para o meio de cultivo e o

tratamento 2 correlata-se inoculao do explante foliar

com a superfcie adaxial voltada para o meio de cultivo.



Foram avaliados, aos 30 dias aps a inoculao, a

porcentagem de calos formados e o peso da matria fresca

dos mesmos.

A anlise estatstica dos dados foi realizada com

base no teste T-student, considerando significncia de

5%.

Efeito da polaridade dos segmentos nodais na obtenode brotaes in vitro

Foram utilizados segmentos nodais de pequizeiro,

com aproximadamente 1 cm, possuindo 2 gemas, obtidos

de plantas matrizes mantidas em sala de crescimento, sob

as mesmas condies citadas no item 1. Aps a

desinfestao, os seguimentos foram inoculados em tubos

de ensaio, contendo 15 mL de meio WPM suplementados

e ajustados conforme item 1, porm acrescidos de 0,05 mg

L-1 de ANA; 0,75 mg L-1 de BAP e 800 mg L-1 de PVP. Os

explantes foram mantidos em sala de crescimentos com

fotoperodo de 16 horas e temperatura de 25 1C.


inteiramente casualizado, constando de 2 tratamentos

(inoculao com a base do segmento inserido no meio de

cultivo na posio vertical e na horizontal) e 15 repeties,

cada uma composta por um tubo.

Aos 30 dias de cultivo, foram avaliados os nmeros

de brotaes, o nmero de gemas por explantes, o nmero

de folhas, o comprimento da maior brotao e a taxa de

multiplicao que se refere razo entre o nmero de gemas

obtidas como resposta aos tratamentos empregados e o

nmero de gemas iniciais contidas no explante utilizado,

segundo metodologia descrita por Erig & Schuch (2000).

Para este estudo, foi realizado o teste de Kruskall-Wallis

(TRIOLA, 1999), considerando significncia de 5%.

Efeito da luminosidade na obteno de calos in vitro apartir de explantes foliares

Folhas foram retiradas de plantas matrizes mantidas

em sala de crescimento e lavadas em gua corrente por 12

horas, ao trmino das quais, efetuou-se a desinfestao

em cmara de fluxo laminar conforme procedimento descrito

no item 1.

Aps a assepsia, as folhas foram excisadas em

fragmentos de aproximadamente 3 cm2 e inoculados em

tubos de ensaio, contendo 15 mL de meio WPM

suplementados e ajustados conforme item 1.

O experimento foi conduzido em delineamento

experimental inteiramente casualizado com 2 tratamentos e

15 repeties, em que o tratamento 1 correspondeu

permanncia dos explantes aps a inoculao sob

irradincia de 36 mol m-2 s-1, fornecida por lmpadas

fluorescentes frias, com fotoperodo de 16 horas, o

tratamento 2 correspondeu permanncia dos explantes

na ausncia de luz. Os tratamentos foram mantidos a uma

temperatura de 25 1C.

Foi avaliada, aos 30 dias aps a inoculao a

formao de calos, o peso da matria fresca dos calos

formados e o aspecto visual dos mesmos. Para a anlise

dos dados, foram utilizados os testes de T-student e Teste

de F, considerando significncia de 5%.

Efeito da luminosidade na induo de brotaes emsegmentos nodais de pequizeiro

Segmentos nodais, consistindo de 2 gemas e

tamanho aproximado de 1 cm foram extrados de plntulas

com aproximadamente 6 cm de altura, obtidas por meio da

germinao in vitro de sementes. Os materiais botnicos

foram inoculados em meio WPM, acrescido de 800 mg L-1

de PVP, 30 g L-1 de sacarose, 0,05 mg L-1 de ANA e 0,75 mg

L-1 de BAP, sendo solidificado com 7 g L-1 de gar, sendo o

pH ajustado para 5,8 e autoclavado a 121C e presso de 1

atm, por 20 minutos.

Aps a inoculao, os explantes foram mantidos

em sala de crescimento a uma temperatura de 25 1C na

ausncia de luz e em fotoperodo de 16 h, irradincia de 36

mol m-2 s-1. Aos 30 dias de cultivo, foram avaliados o

nmero de brotos, o nmero de gemas por explante, nmero

de folhas, a taxa de multiplicao e o comprimento da maior

brotao. A taxa de multiplicao foi determinada

dividindo-se o nmero de gemas formadas por explante,

obtidos aos 40 dias, pelo nmero de gemas do explante no

momento da inoculao (ERIG & SCHUCH, 2002).




inteiramente casualizado com 2 tratamentos e 15 repeties,

sendo a unidade amostral composta por um tubo contendo

um explante. Para a anlise dos dados foi utilizado o teste

de probabilidade Kruskall-Wallis (TRIOLA, 1999),

considerando significncia de 5%.


Efeito da polaridade de explantes foliares na obteno decalos in vitro

Os resultados apresentados na Tabela 1 referem-se

anlise dos pesos obtidos da matria fresca dos calos

formados em explantes foliares de pequizeiro nos dois

tratamentos. Os tratamentos no diferiram pelo teste t-

student para um nvel de significncia de 5%.

TABELA 1 Peso da matria fresca dos calos formadosem explantes foliares de Caryocar brasiliense submetidosa diferentes polaridades. Lavras, 2008.

Esse resultado demonstra que, para a formao de

calos em explantes foliares de pequizeiro, no h

necessidade de se observar a posio em que este ser

inoculando no meio de cultivo. O mesmo resultado foi

obtido por Martins et al. (2001) quando trabalharam com

explantes foliares de macieira.

Mesmo que os dados da porcentagem de induo

de calos no tenham sido significativos a 5% de

probabilidade, a diferena numrica da mdia de induo

obtida quando se inoculam os explantes com a superfcie

abaxial em contato com o meio de cultivo (49,2%), chega

a ser 52% maior do que a superfcie adaxial no meio de

cultivo (25,6%) (Figura 1). Do ponto de vista biolgico, a

polaridade influenciou a calognese in vitro de explantes

foliares de pequizeiro, sendo mais eficiente a inoculao

dos explantes com a superfcie abaxial voltada para o

meio de cultivo.

FIGURA 1

Mdias de calos formados em funo dapolaridade de inoculao dos explantes foliares depequizeiro. Lavras, 2008.

49,2

25,6

0

10

20

30

40

50

60

Abaxial Adaxial

Polaridade de inoculao

For

ma

o d

e ca

los

(%)

2 Efeito da polaridade dos segmentos nodais na obtenode brotaes in vitro

A posio de inoculao dos segmentos nodais

(vertical ou horizontal) influenciou a resposta morfognica

significativamente, segundo o teste de Kruskall-Wallis a

5% para o nmero de brotos formados por explante,

nmero de gemas observado e taxa de multiplicao

(Tabela 2).

TABELA 2

Mdias para as variveis: nmero debrotaes, de folhas, de gemas, comprimento e taxa demultiplicao para segmentos nodais de pequizeiro paraorientao vertical e horizontal de inoculao. Lavras,2008.

Varivel Tratamento Mdias

Vertical 8,00 a Nmero de brotaes Horizontal 23,0 b

Vertical 13,3 a Nmero de folhas Horizontal 17,7 a

Vertical 9,00 a Nmero de gemas Horizontal 22,0 b

Vertical 18,0 a Comprimento

Horizontal 13,0 a

Vertical 9,00 a Taxa de multiplicao Horizontal 22,00 b

* Mdias seguidas pela mesma letra no diferemestatisticamente pelo teste de Kruskall-Wallis 5%.

Tratamento Mdia

Abaxial (0) 0,319

Adaxial (1) 0,313



As caractersticas comprimento da maior brotao

e nmero de folhas no apresentaram resultados

significativos. McClelland & Smith (1990), testando a

influncia da orientao na induo de brotaes em

segmentos nodais de Amelanchier spicata K. Koch., Acer

rubrum L., Malus domestica Borkh. e Betula nigra L.,

observaram que no houve diferena entre os

comprimentos das brotaes desenvolvidas a partir dos

explantes inoculados na orientao horizontal e vertical. O

mesmo resultado foi observado por Erig & Schuch (2002)

para o comprimento da maior brotao em segmentos

nodais de macieira (Malus prunifolia).

Para todas as caractersticas avaliadas, os maiores

valores observados foram obtidos quando se inoculou o

segmento nodal na posio horizontal, embora no tenham

sido detectadas diferenas estatsticas pelo teste Kruskall-

Wallis (5%) para nmero de folhas e com maior brotao.

Ao se inocular os segmentos nodais na orientao

horizontal, induziu-se a formao de 3,88 brotos por

explante, em mdia, mais do que o dobro de brotos obtidos

nos explantes que foram inoculados na orientao vertical

(1,5 broto/explante). A orientao horizontal promoveu um

maior nmero de brotaes por explantes em 5 espcies

lenhosas estudadas por McClelland & Smith (1990)

(Amelanchier spicata Lam., Acer rubrum L., Malus

domestica Borkh., Betula nigra L., Forsythia intermedia

Zab.), em relao inoculao dos segmentos nodais na

orientao vertical, corroborando os resultados

encontrados neste trabalho.

Apesar da no significncia estatstica, as

brotaes provenientes dos segmentos nodais inoculados

na orientao horizontal produziram 1,3 folha a mais do

que as brotaes desenvolvidas a partir dos explantes

inoculados na orientao vertical. Antagonicamente, no

comprimento da maior brotao, os valores dos caracteres

avaliados foram maiores nas brotaes provenientes dos

segmentos nodais inoculados na orientao vertical,

apresentando mdia de 12,14 mm, enquanto as brotaes

provenientes dos segmentos nodais inoculados na

horizontal tiveram o comprimento mdio de 9,88 mm.

Em relao ao nmero de gemas e taxa de

multiplicao, os resultados dos explantes inoculados na

orientao horizontal foram quase trs vezes maiores que

os obtidos pela inoculao destes na posio vertical. O

nmero de gemas por explante obtido pela inoculao na

orientao horizontal foi de 9,13 e, para os inoculados na

orientao vertical, 3,71. A taxa de multiplicao que um

dos fatores mais importantes para a micropropagao de

uma espcie por fornecer mais explantes para os

subcultivos, foi em mdia, de 4,56 para os explantes que

foram inoculados na orientao horizontal, e de 1,86 para

os segmentos nodais inoculados na orientao vertical.

Segundo Erig & Schuch (2002) um maior nmero de

brotaes, maior nmero de gemas e maior taxa de

multiplicao foram obtidos ao se inocular explantes nodais

de macieira (Malus prunifolia Steud.) na orientao

horizontal, assim como os resultados encontrados para a

induo de brotaes em segmentos nodais de pequizeiro.

Santana (2003), ao estudar a influncia da orientao

dos explantes na induo de brotaes em fruta-do-conde

(Annona squamosa L.), observou resultados inversos ao

encontrado neste trabalho, tendo o melhor resultado sido

encontrado na inoculao dos explantes na posio

vertical, com mdia de 8,3 brotos/explante. Em seus estudos

com outras anonceas, o autor relata que a influncia da

polaridade no potencial morfognico um fenmeno

provavelmente ligado ao transporte de fitorreguladores

no explante. Pelos resultados deste trabalho, pode-se

sugerir que os segmentos nodais de pequizeiro inoculados

na posio vertical tm predominncia de auxinas

endgenas, pois, segundo Taiz & Zeiger (2004), estas

inibem a formao de mltiplas brotaes, estabelecendo

a dominncia apical. A obteno de um maior nmero de

brotaes com o segmento nodal na orientao horizontal

deve-se, principalmente, quebra da dominncia apical

(ERIG & SCHUCH, 2002) que poderia ser ocasionada pela

maior concentrao endgena de citocininas, em

detrimento do contedo de auxinas, o que explicaria o

surgimento de vrias brotaes no mesmo explante

inoculado na orientao horizontal. Taiz & Zeiger (2004)



comentam que a razo auxina/citocinina regula a

morfognese de tecidos cultivados in vitro o que permite

inferir que a modificao da orientao do explante no

cultivo in vitro, pode sim alterar a relao endgena de

auxinas e citoc

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