Praktikum 3. Potensial Aksi Gabungan pada Nervus Sciatic/Iskiadikus Katak BBS1-FL-Pr3 Padapercobaanini,akandilakukanpengukuranpotensialaksigabungan(CAPs)darinervus iskiadikus katak yang terisolasi (sudah diambil dari katak), untuk mengambarkan sifat fisiologis dasarimpuls saraf. Compound Action Potentials in the Frog Sciatic Nerve Background The fundamental unit of the nervous system is the neuron.Neurons andother excitable cells produce action potentials when they receive electrical or chemical stimulation.The action potential occurs as a large-scale depolarization when positive ions such as sodium rapidly enter the neuron via specialized membrane channel proteins. Action potentials are all-or-none events.Once an action potential begins, it propagates downthelengthoftheaxon.Whentheactionpotentialreachestheendoftheaxon,a neurotransmitter is typically released into the synapse.After an action potential occurs, the neuron must repolarize.During this time, called the refractory period, the neuron is incapable of producing another action potential. Measuringactionpotentialsfromsingleneuronsrequireshighlyspecializedequipment.Inthislab,youwillrecordcompoundactionpotentials(CAPs)fromtheisolatedfrogsciatic nerve.CAPs represent the summed action potentials of the multitude of neurons that comprise a nerve. ___________________________________________________________________________ Percobaan yang dilakukan : Percobaan 1: Menentukan voltase ambang (threshold voltage) dan amplitudo maksimal CAPPercobaan 2: Menentukan periode refraktoriPercobaan 3: Menentukan kecepatan konduksi saraf Bahan yang dibutuhkan : -Frog (Rana pipiens or Xenopus laevis) -Forceps -Dissection needle (jarum diseksi) -Ringers solution katak(Table 1) -Scalpel (pisau) -Glass hook / fine blunt probe (batang kaca dengan pengait di ujungnya) -Dissection tray (nampan) -Petri dish (piring petri ) -Scissors (gunting) -Fine thread (benang ) -Filter paper (kertas filter) -Aluminum foil (sebaiknya ada) -Pasteur pipette (pipet) Double-pithing procedure (Cara pembuatan hewan spinal) : 1)pegang katak dengan tangan kiri, tundukkan kepalanya (lipat ke arah ventral) di antara jari tengah dan telunjuk.2)Gunakan jarum diseksi, tentukan daerah cekung (depression) di dasar tengkorak; ini adalah foramen magnum. 3)Tusukkan (masukkan) jarum diseksi ke foramen magnum dan tekan ke arah kranial untuk merusak otak katak.4)Kemudian tarik jarum sebagian dan arahkan ke kaudal menuju kolumna spinalis untuk merusak spinal cord. Kaki katak pada mulanya akan tegang , dan kemudian menjadi flaksid (lumpuh) dan tidak berespon (tidak menarik kakinya bila dipijit denga forsep). Kondisi hewan yang sudah mengalami kerusakan pada spinal cordini disebut juga sebagai spinal animal. 5)Selanjutnya adalah melepaskan nervus sciatic dari katak. Prosedur diseksi nervus : 1)Lepaskan kulit katak mulai dari abdomen dan kaki. Yaitu dengan menggunting kulit di sekitar abdomen, dan tarik kulit ke arah bawah sehingga lepas.2)Letakkan katak di nampan , jaga kelembaban preparat dengan meneteskan larutan Ringer pada katak.Gambar 1. Pembuatan hewan spinal (spinal animal) 3)Jepit dan gunting urostil dan organ viseral abdomen hingga lepas. Akan terlihat pleksus saraf seperti gambar 2. Hati hati ! jangan merusak pleksus saraf. 4)Secara diseksi tumpul (gunakan kaca pengait), lepaskan nervus sciatic dari fascia dan jaringan lain.5)Gunting nervus dari spinal cord, dan runut (reflect) sepanjang serat saraf hingga ke kaki . 6)Ikat sepotong benang pada ujung yang sudah bebas, agar dapat dipegang dengan hati-hati (handled gently !). 7)Dengan kaca pengait dan forseps lanjutkan pemisahan nervus dari jaringan lain.8)Lepaskan (gunting) nervus dari muskulus gastrocnemius. 9)Letakkan nervus di piring petri yang berisi larutan Ringer, (dapat disimpan di lemari pendingin) . Table 1: Recipe for frog Ringers solution. SoluteNaClKClCaCl2NaHCO3 g/liter of solution 6.50.140.120.2 Alat dan bahan yang digunakan : -Sistem komputer -PowerLab -Software Scope -Nerve Bath dan kabel-kabel, kabel tembaga halus, aluminum foil. -Larutan Ringer -Nervus sciatic, kertas filter -Forceps, pipet. SacralvertebraUrostyleSciati c nerveSemi -membranosusGastrocnemiusGl uteusNerve branches forming sci ati c nerveGambar 2.Lokasi nervus sciatic pada katak Cara Kerja : Persiapan dan kalibrasi peralatan:1)Sambungkan penjepit merah dan hitam yang terdapat pada elektroda stimulator ke dua jenjang logam yang terletak di sisi berlawanan pada nerve bath (gambar 1). Jarak kedua elektroda 0,5 cm. 2)Sambungkan kabel merah (positif) BNC connector elektroda stimulator ke output analog positif (+) di PowerLab.Dan kabel hitam (negatif) output analog negatif (gambar 6). 3)Sambungkan lead (sadapan) merah dan hitam dari elektroda perekam pertama ke dua jenjang logam pada nerve bath (gambar 2). Hubungkan 8-pin DIN connector ke Pod portInput 1 pada PowerLab (gambar 6). 4)Ulangi langkah 3 untuk elektroda perekam kedua. Tapi tempatkan penjepit aligatornya lebih jauh dari elektroda stimulator (gambar 3). Hubungkan pod kePod port Input 2 pada PowerLab (gambar 6). 5)Teteskan larutan Ringer ke dalam kolom penampung di dalam Nerve Bath. Larutan tidak boleh sampai menyentuh jenjang/jajaranlogam. Note: OVERFILLING Nerve Bath akan menyebabkan timbulnya hubungan pendek (short circuit) pada percobaan. 6)Gunting sepotong kertas filter dan letakkan di atas jajaran logam pada nerve bath (gambar 4) sehingga menyentuh kedua elektroda stimulator dan kedua pasangelektroda perekam. Basahi sedikit kertas tersebut dan pasang penutup nerve bath.Ini bertujuan untuk melakukan tes koneksi. 7)Sebelum menghidupkan the PowerLab pastikan ia sudah terhubungkan ke komputer.8)Jalankan program Scope pada komputer, dan buka file CAP Set Scope. 9)Pada Scope Application window, pilih menu Macro dan pilihtest Connection.Sekarang Scope akan merekam data selama 1 detik secara otomatis.Rangkaian stimulus akan direkam secara serial (gambar 5). Bila tidak tampak, periksalah apakah penjepit Gambar 4.Nerve Bath yang sudah disiapkan untuk tes koneksi, dengan kertas filter dan larutan Ringer Gambar 3.Posisi elektroda perekam kedua pada Nerve Bath. Gambar 1. Posisi elektroda stimulator pada nerve bath Gambar 2. Posisi elektroda perekam pertama pada Nerve Bath. terpasang dan kertas filter cukup lembab dan meliputi semua elektroda aktif pada the Nerve Bath. Bila koneksi sudah berhasil, eksperimen dapat dimulai. 10)Ambil nervus dari larutan Ringer dengan cara menjepit pada kedua sisi benang. Note: jangan menjepit nervus secara langsung (DO NOT GRASP THE NERVE WITH FORCEPS! ) Hal itu akan merusak nervus. 11)Secara lembut (Gently) letakkan nervus pada sepotong kertas tisue atau filter, untuk menyerap kelebihan larutan Ringer.12)Pindahkan kertas filter dari Nerve Bath. Letakkan nervus melintang di atas jenjang, pastikan ia mengenai semua koneksi (elektroda) aktif (gambar 6). Bila nervus terlalu pendek, sedapat mungkin sesuaikan posisi elektroda perekam . Tutup kembali nerve bath. Gambar 5. Scope Zoom window memperlihatkan artifak/gambaran stimulus pada saat Test Connection macro. Gambar 6.Diagram Nerve Bath dan PowerLab yang sudah terpasang secara lengkap. Pastikan nervus melintang pada semua pasangan elektroda.Cara Melakukan Percobaan Percobaan 1: Menentukan voltase ambang (threshold voltage) dan amplitudo maksimal CAP. Pada percobaan ini serangkaian stimulus akan diberikan pada nervus, yang setiap kali akan ditingkatkan amplitudonya. Dengan perekaman ini, voltase ambang pada nervus akan dapat dianalisa, demikian juga voltase yang dibutuhkan untuk menimbulkan amplitudo maksimal CAP . 1.Pada Scope window, pilih Macro: Threshold Voltage. 2.Scope akan menstimulasi secara otomatis dan merekam 40 rekaman (pages) data. 3.Setiap page data menunjukkan hasil dari voltase stimulus yang berbeda. 4.Amplitudo CAP dapat diukur dengan cara : pada data di CAP1 (Channel 1) gunakan Waveform cursor untuk menentukan besar amplitudo. Nilai yang didapat oleh cursor akan tampak di bagian kanan atas Scope Application window. 5.Ulangi hal tersebut pada semua pages. Dan catat hasilnya pada tabel 1 (pada Laporan Praktikum). 6.Perhatikan pada level (nilai) stimulus berapa CAP terlihat pertama sekali. Juga tentukan amplitudo maksimal CAP. Percobaan 2: Menentukan periode refraktori Percobaan ini dapat dilakukan setelah seluruh analisis pada Percobaan 1 selesai (tabel 1). Pada percobaan ini PowerLab akan menstimulasi nervus dengan rangkaian stimulus. Dimana pada setiap blok data, interval antar stimulus akan dikurangi. Cara ini untuk mendapatkan periode refraktori relatif dan absolut dari nervus. 1)Dari hasil yang didapat pada tabel 1, tentukan voltase stimulus minimum yang dibutuhkan untuk dapat membangkitkan CAP maksimal pada nervus. Tuliskan hasilnya di sini : __________ mV 2)Pada Scope application window, pilih Macro: Refractory __mV.Note: terdapat empat versi Refractory macro. Setiap versi menggunakan voltase stimulus yang berbeda. Pilih voltase yang nilainya paling mendekati intensitas stimulus yang tertulis pada langkah 1 di atas.3)Scope akan merekam 15 rangkaian data (pages). Selama setiap page, dua stimulus akan dipaparkan pada nervus. Dimana interval antara kedua stimulus tersebut akan semakin berkurang pada page berikutnya.4)Isilah tabel 2 pada Laporan Praktikum, dan lakukan analisis . Menentukan Periode Rafrakter : -Pilih rekaman CAPs di CAP1 pada setiap page data yang didapat dari percobaan 2. -BukaZoom window dan lakukan penilaian dengan menggunakan Waveform Cursor.Catat setiap amplitudo CAP kedua ke dalam tabel 2.-Interval stimulus yang digunakan dalam percobaan ini direkam secara berurutan sebagaimana yang tertera dalam tabel 2. Tentukan pada interval stimulus manakah pertama sekali terjadinya penurunan amplitudo CAP kedua.Ini adalah periode rafraktori relatif.-Dan tentukan pada interval stimulus yang mana CAP kedua sama sekali tidak tampak. Ini merupakan periode refrakter absolut. Catat kedua hasil yang didapat ke dalam tabel 1. Gambar 7.Scope Zoom window memperlihatkan dua pulses untuk menentukan periode refraktori. Percobaan 3: Menentukan kecepatan konduksi saraf Dalam percobaan ini akan dihitung kecepatan CAP ketika merambat/berjalan di sepanjang nervus.1.Gunakan penggaris untuk mengukur jarak antara kedua lead hitam (negatif) elektroda perekam. Catat hasilnya pada tabel 3 (pada Laporan Praktikum).2.Pada Scope window, pilih Macro:Conduction Velocity 3.Scope akan merekam page data di dua channels selama 10 milliseconds. 4.Gunakan data yang didapat untuk mengisi tabel 3. Ikuti petunjuk analisis sebagaimana di bawah ini. 5.Setelah semua perekaman dibuat, kembalikan nervus ke dalam larutan Ringer dingin dan kembalikan kepada instruktur.Menghitung kecepatan konduksi ( conduction velocity) -Dari data percobaan 3, pilih kedua channels yang merekam CAP.-Pada Zoom window, gunakan Marker dan Waveform cursor untuk menentukan interval waktu yang dibutuhkan CAP untuk berjalan di antara kedua elektroda perekam (gambar 8).-Letakkan marker pada puncak CAP pertama. Kemudian pindahkan waveform cursor ke puncak CAP kedua. Baca nilai timepada Cursor yang tampak di Scope application window.Catat nilai ini di tabel 3.-Buatlah perhitungan dengan memasukkan nilai-nilai yang didapat kedalam rumus berikut ini : Conduction velocity (m/sec) =distance between electrodes (cm)time interval between CAPs (ms)| \ | . | - 100 cm1 m| \ | . | -1000 ms1 sec| \ | . | Gambar 8.Scope Zoom window memperlihatkan proseduranalisis untuk menghitung kecepatan konduksi.Informasi waveform Cursor tampak pada area di bawah menu bar. Laporan Hasil Praktikum Nama:Tanda Tangan : ............................................ NIM: Grup : Tanggal praktikum :Tanda tangan Instruktur: ..................................... ___________________________________________________________________________ Tugas rumah (homework) sebelum praktikum : (Jawablah pertanyaan berikut ini pada tempat yang tersedia. Anda harus sudah menuliskan jawabannya sebelum praktikum dimulai, instruktur akan memeriksa apakah tugas rumah ini sudah selesai) 1)Apa perbedaan CAP dengan potensial aksi tunggal ? 2)Apa yang menyebabkan terjadinya periode refrakter relatif ? 3)Potensial aksi disebut sebagai respon yangall or none , mengapa nervus sciatic katak memperlihatkan respon berjenjang (graded response) ? 4)Jelaskan dengan singkat peristiwa seluler yang terjadi sewaktu periode refrakter. Petunjuk : berkaitan dengan proses repolarisasiHasil : Tabel 1. Amplitudo CAP terhadap amplitudo stimulus Amplitudo Stimulus (mV) Amplitudo CAP (mV) Amplitudo Stimulus (mV)Amplitudo CAP (mV) 20220 30230 40240 50250 60260 70270 80280 90290 100300 110310 120320 130330 140340 150350 160360 170370 180380 190390 200400 210410 Threshold stimulusmV voltage: Maximum CAP amplitude:mV Tabel 2. Amplitudo CAP versus interval stimulus Interval Stimulus (ms)Amplitude CAP kedua 43.5 3.0 2.5 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.0 Relative refractory period: ms Absolute refractory period: ms Tabel 3. Perhitungan kecepatan konduksi Distance between recording electrodes:Cm Time interval between CAP1 and CAP2:Ms Conduction velocitym/s Menentukan voltase ambang (threshold voltage) Pada tempat di bawah ini, gambarlah kurve scatter plot yang menggambarkan hubungan amplitudo CAP versus voltage stimulus, dengan menggunakan data dari tabel 1 (contoh seperti gambar di bawah ini) Grafik 1. Amplitudo CAP vs.Intensitas StimulusAmplitudo CAP maksimumApa yang dimaksud dengan amplitudo CAP maksimal ? berapakah voltase stimulus minimum yang dibutuhkan untuk membangkitkan respon maksimal ? Amplitudo maksimal CAP : ________ mV. Voltase minimum untuk mendapatkan CAP maksimal CAP: ______________ mV. Penentuan periode refraktoriPada tempat di bawah ini, gambarkan kurve scatter plot yang menggambarkan hubungan amplitudo CAP vs. interval stimulus . Gunakan data dari tabel 2. Paa grafik, tentukan periode refrakter absolut dan relatif (seperti contoh di bawah ini) -202468101214160 100 200 300 400 500CAP amplitude (mV) Stimulus Intensity (mV) CAP amplitude vs. stimulus intensity Grafik 2. Hubungan amplitudoCAP vs. pulse interval.CAP diukur setelah stimulus kedua. Menghitung kecepatan konduksi Tentukan kecepatan konduksi yang dihitung dari data pada tabel 3. Kecepatan konduksi : ____________ m/sec. Kesimpulan : Jawablah pertanyaan berikut ini secara lengkap, sebagai sebuah paragraf. 1)Bagaimana pengertian responall or none ?Apakah anda melihat respon ini pada data di atas ? Jelaskan hasil yang didapat. 2)Jelaskan perbedaan antara periode refrakter relatif dan absolut. 0.002.004.006.008.0010.0012.000.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00CAP amplitude (mV) Pulse interval (ms) CAP amplitude vs. pulse interval Relative Refractory Absolute Refractory Period 3)Jelaskan mekanisme seluler yang menyebabkan adanya periode refrakter. 4)Pada percobaan ini, telah dilakukan penilaian efek peningkatan intensitas stimulus terhadap nervus. Bentuk stimulus yang bagaimana lagi yang dapat mempengaruhi kecenderungan/ tendensi nervus dalam membangkitkan CAP ? 5)Berdasarkan perhitungan kecepatan konduksi CAP, berapa lamakah waktu yang dibutuhkan CAP untuk berjalan di sepanjang nervus bila panjangnya adalah 10 cm ?