8/6/2019 Prediction of Chain Flexibility in Proteins

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P r e d i c t i o n o f C h a i n F l e x i b i l i t y i n P r o t e i n sA T o o l f o r t h e S e l e c t io n o f P e p t i d e A n t i g en sP . A . K a r p l u s a n d G . E . S c h u l zI n s t i t u t f ii r O r g a n i s c h e C h e m i e u n d B i o c h e m i e d e r U n i v e r s i t f it ,D - 7 8 0 0 F r e i b u r g i .B r .

T o d a y , a m u l t i t u d e o f ge n e s h a v e b e e ns e q u e n c e d o f w h i c h t h e r e s p e c t iv e p r o -t e in s r e m a i n u n k n o w n . T h e s e p r o t e in sc a n b e i d e n t i f ie d , l o c a l i z e d , a n d p u r i -f i e d b y u s i n g a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s to l i g o p e p ti d e s t h a t c o r r e s p o n d t o s e g-m e n t s o f th e h y p o t h e t i c a l p r o t e i n s e-q u e n c e [ 1 , 2 ] . I n s p e c i a l c a s e s , s u c h o l i -g o p e p t i d e s m a y e v e n g i v e r i se t o s y n -t h e t i c v a c c i n e s [ 3, 4 ]. C u r r e n t l y , t h e s e -l e c t i o n o f o l i g o p e p t i d e s t r e t c h e s f r o ma p r o t e i n s e q u e n c e i s b a s e d o n s c h e m e sd e s i g n e d t o p r e d i c t s e g m e n t s o f h ig ha n t i g e n i c i t y [ 5] , h y d r o p h i l i c i t y [ 6, 7 ],o r r e v e r s e - t u r n p o t e n t i a l [ 8, 9 ]. H o w -e v e r , i t h a s r e c e n t l y b e e n d e m o n s t r a t e dt h a t s e g m e n t a l f l e x i b i l it y is m o r e i n d i -c a t iv e o f a n a n t ig e n i c d e t e r m i n a n t t h a nt h e s e l e c t i o n c r i t e r i a m e n t i o n e d a b o v e[ 10 ], a n d t h a t i t i s a l s o b e t t e r s u i t e df o r s e l e c t i n g c r o s s r e a c t i n g p e p t i d e s[ 11 ]. A c c o r d i n g l y , w e h a v e a n a l y z e d 3 1r e f i n e d p r o t e i n s t r u c t u r e s t o d e v e l o p am e t h o d f o r p r e d i c ti n g f le x ib l e se g m e n t sf r o m a g i v en a m i n o a c i d s eq u e n c e.T h e d a t a b a s e u s e d f o r t he p r e d i c t i o no f c h a i n f l e x ib i l it y c o n s i s t e d o f 3 1 p r o -t e i ns ( g i v e n i n F i g . 2 ) o f k n o w n t h r e e -d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e , a s d e p o s i t e d i nt h e P r o t e i n D a t a B a n k , B r o o k h a v e n ,U S A . T h e p r o t e i n s t r u c t u r e s s e l e c t edh a d b e e n r e f i n e d w i t h in d i v i d u a l a t o m -i c t e m p e r a t u r e f a c t o r s ( i. e. B - v a l u e s ) ;t h e y h a d m o r e t h a n 3 0 r e s i d u e s , t h e i rr e s o l u ti o n w a s b e t t e r t h a n o r e q u a l t o0 .3 n m , a n d t h e y w e r e a t l e a s t 5 0 % d i f -f e r e n t i n s e q u e n c e f r o m a ll o t h e r i n -c l u d e d p r o t e i n s .A s a m e a s u r e f o r c h a i n f l e x i b i l i t y w ec h o s e t h e t e m p e r a t u r e f a c t o r s , i . e . B -v a l u e s , o f t h e C ~ a t o m s . A n i n s p e c t i o no f e x p e r i m e n t a l d a t a s h o w e d t h a t t h ea v e r a g e s a n d t h e s p r e a d s o f B - v a l u e sv a r i e d g r e a t l y f r o m p r o t e i n t o p r o t e i n ,w h i c h p r e s u m a b l y r e f l e c t s d i f f e r e n c e si n s t r u c tu r e r e f i n e m e n t m e t h o d s a n ds t ag e s m o r e t h a n n a t u r a l v a r i a n c e s . I no r d e r t o a v o i d b i a s t o w a r d s p r o t e i n sw i t h e x t r e m e a v e r a g e s o r s p r e a d s , t h eB - v a l u e o f e a c h C ~ a t o m w a s n o r m a l -i z e d f o l l o w i n g t h e e q u a t i o nBnorm = ( B + D p ) / ( < B > p + D p ) ,

i n w h i c h < B > p i s t h e a v e r a g e B - v a l u eo f a l l C~ a t o m s o f p r o t e i n p , o m i t t in gt h e 3 - N - a n d t h e 3 - C - t e r m i n a l r e s i d u e s .T h e a v e r a g e B . . . . o f a p r o t e i n i s a l w a y s1 .0 . T h e v a l u e o f D r f o r a g i v e n p r o t e i n

p w a s c h o s e n i n s u c h a w a y t h a t t h er o o t m e a n s q u a r e d e v i a t i o n o f t h eB . . . . - v a l u e s w a s 0 . 3. B e f o r e a d j u s t -m e n t u s i n g Op t h e m a j o r i t y o f th e3 1 p r o t e i n s s h o w e d r o o t m e a n s q u a r ed e v i a t i o n s b e t w e e n 0 . 2 a n d 0 . 4 .T h e c h a i n e n d s o f p r o te i n s a r e k n o w nt o h a v e a n a b o v e a v e r a g e a n t i g e n i c i t y[ 12 ]. T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h i s is c o r -r e l a t e d w i t h f l e x i b i l i t y , s t a t i s t i c s w e r ec o m p i l e d o n t h e f i r s t ( 1 , 2 , . . . 2 0 ) a n dt h e l a s t ( m - 1 9 , m - 1 8 , . . . m ) r e s i d u e so f a ll c h a in s . T h e a v e r a g e B . . . . - v a lu e so f r e s i d u e s 1 , 2 , 3, m - 1 , m w e r e 1 . 60 ,1 . 2 8 , 1 . 1 7 , 1 . 2 7 , 1 . 5 3 , r e s p e c t i v e l y ,w h e r e a s t h e r e m a i n i n g 3 5 p o s i t i o n s h a dv a l u e s f l u c t u a t i n g b e t w e e n 0 . 8 7 a n d1 . 0 7 . T h u s , t h e c h a i n t e r m i n i a r e e x c e p -t i o n a l l y f l e x i b l e .N e x t , w e e s t a b l i s h e d t h e a v e r a g e r e l a -t i o n s h ip b e t w e e n B . . . . -v a l u e a n d a m i -n o a c i d t y p e ( F i g . 1 a ) . F o r f l e x i b i l i t yp r e d i c t i o n t h e s e s i n g l e - r e s id u e s t a t is t i c s

KSGPDEOTNRALHVY FCWM1.05 @ .

1.00.95

0 .0 : : : ::

-2.O ~ tKSGPDEQTNRALHVY F C W M

Fig. 1 . Single-residue coefficients , a )A ve r-a g e B . . . - v a l u e s d e r iv e d f r o m a ll 3 1 p r o t e i n so f t h e d a t a b a s e . T h e f i r s t 3 a n d t h e l a s t3 res idues o f each cha in were exc luded .b ) R e v e r s e - t u r n c o n f o r m a t i o n a l p o t e n t i a l so f [8 ] ; c ) an t igen ic i ty ac cord in g to [5]

w e r e r e f i n e d b y a n e a r e s t - n e i g h b o ra n a l y s i s . F i r s t , t h e 2 0 a m i n o a c i d t y p e sw e r e d i v i d e d i n t o 2 g r o u p s , " r i g i d "a n d " f l e x i b l e " . R i g i d r e s id u e t y p e s a ret h o s e w i t h a v e r a g e B . . . . - v a l u e s l e sst h a n 1 . 0 ( i . e . A , L , H , V , Y , I , F , C ,W , M ) . T h e n , s e p a r a t e a v e r a g e B . . . . -v a l u e s w e r e d e t e r m i n e d f o r r e s i d u e sw i t h n o r i g i d n e i g h b o r s , r e s i d u e s w i t ho n e r ig i d n e i g h b o r , a n d r e s i d u e s f o rw h i c h b o t h n e i g h b o r s a r e r i g i d . T h e r e -s u l ti n g n e i g h b o r - c o r r e l a t e d B . . . . -v a l u e s a re g i v e n i n t h e D A T A s t a te -m e n t s f o r B N O R M 0 , B N O R M 1 , a n dB N O R M 2 i n Fi g . 2 . T h e r e i s a s tr i k in gn e a r e s t - n e i g h b o r e f f e c t, f o r i n s ta n c e ,B . . . . o f S c h a n g e s f r o m 1 6 . 9 % a b o v ea v e r a g e f o r n o r i g i d n e i g h b o r t o 7 . 7 %b e l o w a v e r a g e f o r 2 r i g i d n e i g h b o r s .T h e p r e d i c t e d r e l a t i v e f l e x ib i l it y a t r e s i -d u e p o s i t i o n n o f a g i v e n a m i n o a c i d

P R O G R A M F L E X P L O Tc T h e i n p u t t o t h i s p r o g r a m i s a n a ~ i n o a c i d s e q u e n c e i nc th e one l e t t e F c o d e w h i c h i s e n t e r e d f r o m t h e - t e r m i n a l .c B a s e d o n a m i n o a c i d f l e x i b i l i t y c o e f f i c i e n t s t h ec p r e d i c t e d f l e x i b i l i t y p r o f i l e i s c a l c u l a t e d .c T h e B r o o k h a v e n P r o t e i n D a t a B a n k a b b r e v i a t i o n s f o r t h ec 3 1 p r o t e i n s s e l e c t e d a r e : 2 A C T , 2 C P V B , I I C B , 5 C P A ,c 2 G C H , I C R N , 4 C Y T , I C 2 C B , 3 5 1 c , 3 D F R , 1 E C D , 2 F D I , I H M Q ,c I P H 3 $ , I F B 4 , f I N S , I L H 2 , I L Y M , I M B D . I N X B , I S M 3 , 1 0 V 0 ,c I B P 2 , I P C Y , I S G A , 4 R S A , 2 R X N A , 2 S O D , 3 T L N , 2 P T N , 4 P T I

C H A R A C T E R ~ I S E Q , A A , A A I N , P L O T , I L I N E , I F , I B L AN KI N T E G E R I S E Q ( 9 9 9 )D I M E N S I O N S ~ Q ( 9 9 9 ) , N A Y B { 9 9 9 ) , F P R E D ( 9 9 9 ) , A A [ 2 1 ) , ~ T E ( 7 ] ,S B S C A N I 7 ) , H N Q R M0 ( 2 0 ) , B N O R M I { 2 0 1, B N O R M 2 ( 2 0 1 , P L O T( 3 1 )D A T A A A / ' K ' , ' S ' , ' G ' . ' P ', ' D ' , ' E ' , ' Q ' , ' T ' ,' N ' ,

c A ~ e * f l ~ x i b i l l t y p a r a m e t e r s f o r n o ' r ig i d ' n e i g h b o r sD A T A B N O R M 0 / I . 0 9 3 , I . I 6 9 , 1. 1 4 2 , 1 . 0 5 5 , 1 . 0 3 3 , 1 .0 9 4 , 1 . 1 6 5 ,~ i . 0 7 3 , 1 . i 1 7 . 1 . 0 3 8, 1 . ~ 4 1 , 0 . 9 6 7 . 0 . 9 8 2 ,0 . 9 8 2 , 0 . 9 6 1 , i . 0 0 2 ,$ 0 . 9 3 0 , 0 . 9 6 0 . 0 . 9 2 5 , 0 . 9 4 7 /c e a s e * f l e x i b i l i t y p a r a m e t e r s f o ~ o n e ' r iq i d ' n e i g h b o rD A T A B N O R M I / I . 0 8 2 , 1 . 0 48 , I . 0 4 2 , 1 , 0 8 5 , 1 . 0 8 9, I . 0 3 6 , 1 ~ 0 2 8 ,$ i. Q 5 1 , 1 . 0 0 6 , 1 . 0 2 8 . 0 . 94 6 , 0 . 9 6 1 , 0 , 9 5 2 , 0 , 9 27 . 0 . 9 3 0 , 0 . 8 9 2 ,$ 0 . 9 1 2 , 0 . 8 7 8 , 0 . 9 1 7 , 0 . ~ 6 2 [

c ~ A * ~ f l e x i b i l i t y p a r a m e t e : s f o r t w o ' r ig i d ' n ei q l fo o rsD A T A B N O R M 2 1 1 . 0 5 7 , 0 . 9 2 3 , 0. 9 2 3 . 0 . 9 3 2 . 0 . 9 3 2 , 0 .9 3 3 , 0 . 8 8 5 ,$ 0 . 9 3 4 , 0 . 9 3 0 , 0 . 9 0 1, 0 . 8 9 2 , 0 . 9 2 1 , 0 . 8 9 4 ,0 . 9 1 3 , 0 . 8 3 7 , 0 . 8 7 2 ,S 0 . 9 1 4 , 0 . 9 2 5 , 0 . 8 0 3 , 0 . B 0 4 /D A T A k~ f ~ 0 . ~ 5 , 0 . 5 0 , 0 . 7 5 . 1 . 0 0 , 0 . 7 5 , 0 . 5 0 , 0 . 2 5 !D A ~ A I B L A N K , I L I N E , I F / ' ' , ' I ' , 'F ' !c h & h * ~ t y p e t h e s e q u e n c e i n o n e l e t t e r c o d e ; f i n i s h w i t h - ~ ,~ .T Y P E i 0 1D O 2 I = i , 9 9 9R E A D ( 5 , 1 0 0 ) A A INI F ( A A I N . E Q . A A ( 2 1 ) ) G O T 0 3S E Q ( I ) = A A I ND O I J = l , 2 01 I F { A A I N . E Q . A A ( J } ] G O T 0 2S T O P ' I l l e g a l a m i n o a c i d t y p e '2 I S E Q [ I ) = Jc ~ e ~ t h e c o m p l e t e s e q u e n c e i ~ i n3 L E N G T H = I 1c ~ & * ~ d o n e a r e s t n e ig h b o r a n a l y s i sD O 4 I = 2 , L E N G T H - IN A Y B ( 1 ) = 0I F ( ( I S E ~ ( I - I ) . G E .I I ) . 0 R . ( I S E Q { I + I ) .~ E . I I ) ) N A Y B ( 1 )= II F ( ( I S E Q (I I ) , G E . I I ) . A N D . ( I ~ EQ ( I + I ] . G E . I I ) ) N A Y B II ) = 2e ~ c a l c u l a t e p r e d i c t e d r e l a t i v e f l e x i b i l i t yD O 5 I = 5 , L E N G T H 4D 0 5 J = I , 7N J = I S E Q ( I 4 + J )I F ( N A Y B ( I - 4 + J ) . E ~ . 0 ) B S C A N ( f f ) = B N O R M 0 ( NJ II F ( N A Y B ( I 4 + J ) . E Q . I ) B S C A N ( J ) = B N O R M I ( N J ]I F { N A Y B ( I - 4 + J ) . E Q . 2 ) B S C A N ( f f ) = B N O R M2 1 M J I

5 F P R E D ( I ) = F P R E D ( I ) + B S C A N (J ) ~ T ~ ( J ) / 4 . 0c ~ p l o t t h e f l e x i b i l i t y p r of i l e w i t h m e a n s e t t o 1 6D O ~ I = I , L E N G T HD 0 J = l , 3 1 [ i n i t i a l i z e t h e p l ~ t a r ~ & y6 P L O T ( J ) = I B L A N KP L O T { 1 6 ) = I L I N E [ m a r k t h e m e a nN P O S = N I N T ( ( F p R E D ( I ) ~ I . 0 ) * I 0 0 . 0 + I 6 . 0 )I F { N P O S . G E . I . A N D . N P OS . L E . 3 1 ) P L O T I N P 0 S ) =I F~ I T E ( 6 , 1 0 2 1 I , S E Q ( 1 ) . F PR E D ( I ) , P L O T7 C O N T I N U ES T O P

I 0 0 F O R M A T [ A I )i 0 1 s F O R M A T ( ~, E n t e r a m i n o a c i d s e q u e n c e i n s i n g l e l e t t e ~ ' ,c o d e ' / ~ o n e a m i n o a c i d p e r l i n e . S i q n a l e n d ' ,$ , b y e n t e r i n g , ' ~, ' .~ )1 0 2 F Q R M A T ( 1 5 , A 5 , F 8. 3 , S X . 3 1 A I )E N D

F i g. 2 . F o r t r a n p r o g r a m e x a m p l e f o r t h epred ic t ion o f cha in f lex ibi l ity . A bbre v ia -t i o n s f o r t h e 3 1 p r o t e i n s u s e d a s d a t a b a s ea r e g i v e n . T h e a r r a y A A r e f l e c t s t h e o r d e r -ing o f amino ac ids accord ing to f lex ib i l i tya s g i v e n i n F i g . I a . T h e a r r a y s B N O R M O ,B N O R M I , a n d B N O R M 2 c o n t ai n t h en e i g h b o r - c o r r e l a t e d B . . . - v a l u e s i n t h eo r d e r o f A A212 Natn rwiss ensch af ten 72 (1985) 9 Spr inger -V er lag 1985

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s e q u e n c e i s t a k e n a s t h e w e i g h t e d s u mo f t h e n e i g h b o r - c o r r e l a t e d B . . . . - v a l u e sf o r th e a m i n o a c i ds a t p o s i t i o n s n - 3 ,n - 2 , n - l , n , n + l , n + 2 , a n d n + 3 u s-i n g t h e w e i g h t s 0 . 2 5 , 0 . 5 0 , 0 . 7 5 , 1 . 0 0 ,0 . 7 5 , 0 . 5 0 a n d 0 . 2 5 , r e s p e c t i v e l y . AF o r t r a n p r o g r a m f o r t h is c al c u l a t io n i sg i v e n i n F i g . 2 . T h e q u a l i t y o f t h em e t h o d c a n b e v i s u a l i z e d i n F i g . 3 ,w h i c h s h o w s e v i d e n t c o r r e s p o n d e n c eb e t w e e n t h e p r e d i c t e d a n d t h e o b s e r v e df l e x i b il i ty o f l y s o z y m e . R e s i d u e s 1 1 5t h r o u g h 1 1 9 a r e p r e d i c t e d t o b e f l ex -i b le , b u t i n th e n a t i v e s t r u c t u r e t h e y a r eh e l d t ig h t b y t h e d i s u lp h i d e b o n d b e -t w e e n r e s i d u e s 3 0 a n d 1 1 5. I t s h o u l db e n o t e d t h a t t h e t w o h i g h e s t p e a k s o ft h e p r e d ic t e d p r o f i l e c o r r e s p o n d t o t h ek n o w n c o n t i n u o u s e p i t o p e s o f l y so -z y m e [ 1 4 ] .A c o m p a r i s o n o f t h e s i ng l e - re s i d ue c o -e f f i c ie n t s o f o u r s c h e m e w i t h t h o s e u s e df o r r e v e r s e - t u r n [ 8] a n d a n t i g e n i c i t yp r e d i c t i o n [ 5] r e v e a l s s i g n i f i c a n t d i f f e r -e n c e s ( F ig . 1 ). I n c o n s e q u e n c e , t h e p r o -p o s e d f l e x ib i l i ty p r e d i c t i o n d e v i a t e s a p -p r e c i a b l y f r o m t h e p r e s e n t l y u s e dm e t h o d s [ 5 - 9 ] a n d t hu s p ro v i d e s n o v -e l i n f o r m a t i o n . T h e p r e s e n t e d s c h e m eu s e d in c o n j u n c t i o n w i t h o t h e r m e t h -o d s s h o u l d a i d f u t u r e s e l e c t i o n o f c h a i ns e g m e n t s s u i t a b l e f o r i n d u c i n g a n t i -b o d i e s w h i c h c r o s s r e a c t w i t h n a t i v ep r o t e i n s .

"

20 40 6 0 80 100 120Res idue no.

F i g . 3 . P r o f il e s f o r h e n e g g w h i t e l y s o z y m e( e n tr y 1 L Y M o f t h e B r o o k h a v e n P r o t e inD a t a B a n k ). a ) E x p e r i m e n t a l B . . . - v a lu e sd e r i v e d f r o m t h e X - r a y s t r u c t u r e o f l y so -z y m e [ 1 3] . b ) P r e d i c t e d f l e x ib i l it y u s i n g t h ep r o p o s e d s c h e m e . C o e f f i c ie n t s u se d f o r c a l -c u l a t i n g t h i s p r e d i c t i o n w e r e d e r i v e d f r o mt h e d a t a b a s e a f t e r e l i m i n a t i n g l y s o z y m e( d a t a n o t s h o w n ) . C o n t i n u o u s a n t i g e n i c d e -t e r m i n a n t s [ 1 4] a r e i n d i c a t e d i n b o l d

R e c e i v e d J a n u a r y 1 4 , 19 8 51 . W al te r , G . , e t a l. : P roc . N a t . Aca d . Sc i .U S A 77, 5197 (1980)2 . Su tc li f fe , J .G . , e t a l . : N a tu r e 287, 80 1(1980)3. Bittle, J . L . , et al. : ibid. 298, 30 (1982)4 . P fa f f , E . , e t a l . : EM BO J . 1 , 869 (1982)5 . H o p p , T . P . , W o o d s , K . R . : P r o c . N a t .

A c a d . S c i . U S A 78, 3824 (1981)6 . R o s e , G . D . : N a t u r e 272, 586 (1978)7 . Ky te , J . , Doo l i t t le , R .F . : J . Mol . B io l.157, 105 (1982)8 . C h o u , P . Y . , F a s m a n , G . D . : B i o p h y s . J .26, 367 (1979)

9 . G a r n i e r , J . , O s g u t h o r p e , D . J . , R o b s o n ,B. : J . M ol. Biol. 120, 97 (1978)1 0. W e s t h o f , E . , e t a l . : N a t u r e 311 , 12 3(1984)11. Tainer, J .A. , e t a l . : ibid. 312, 12 7(1984)12 . W al te r , G. , Doo l i t t le , R .F . , in : Gen e t icE n g i n e e r i n g : P r i n c i p l e s a n d M e t h o d s ,Vol . 5 , p . 61 (Set low, J .K. , Ho l laende r ,A . , e d s . ) . N e w Y o r k : P l e n u m 1 9 8 31 3. R a o , S . T . , H o g l e , J . , S u n d a r a l i n g a m ,M . : A c t a C r y s t a l l o g r . C39, 237 (1983)1 4. I b r a h i m i , I . M . , e t a l .: M o l . I m m u n o l .17, 37 (1980) ; Tak aga k i , Y. , e t a l . : B io -c h e m i s t r y 19, 2498 (1980)

Synthesis o f Acetylcholine Receptorsin XenopusOo cytes Induced by Poly(A) +-m RN Afrom Locust Nervous T issueH . B r e e r a n d D . B e n k eA b t e i l u n g f f ir Z o o p h y s i o l o g i e d e r U n i v e r si t~ i t , D - 4 5 0 0 O s n a b r / .i c kT h i s p a p e r d e m o n s t r a t e s t h e s y n th e s i so f a c e t y l c h o l i n e r e c e p t o r s , a s d e f i n e db y s p e c i f i c c ~ - b u n g a r o t o x i n ( c ~ - B G T X )b i n d i n g , i n Xenopus o o c y t e s a f t e r m i -c r o in j e ct i on o f p o l y ( A ) + - m R N A f r o mt h e n e r v o u s s y s t e m o f i n s e c ts .T h e c e n t r a l n e r v o u s t i s s u e o f i n s e c t sh a s b e e n s h o w n t o c o n t a i n h i g h c o n -c e n t r a t i o n s o f a - t o x i n b i n d i n g s i te s [1 ],w h i c h o b v i o u s l y r e p r e s e n t f u n c t i o n a lr e c p e t o r s f o r a c e t y l c h o l i n e w i t h a d i s -t i n c t n i c o t i n i c p h a r m a c o l o g y [ 2, 3 ]q u i t e s i m i l a r t o t h e r e c e p t o r s i n n e u -r o m u s c u l a r j u n c t i o n s a n d i n e le c t r o-p l a q u e s . T h u s i n s e c t s o f f e r t h e p o s s i b i l -i t y t o a n a l y s e n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e -c e p t o r s w h i c h a re p r o d u c e d a n d w h i c ho p e r a t e i n n e r v e c e l l s , n o t i n m u s c l ec e ll s o r e l e c tr o c y t e s . R e c e n t b i o c h e m i -c a l a n a l y s e s h a v e s h o w n t h a t t h e n i c o -t i n i c b i n d i n g s i t e f r o m i n s e c t g a n g l i ar e p r e s e n ts a m a c r o m o l e c u l e w i t h a s e d-i m e n t a t i o n c o e f fi c i en t o f 9 - 1 0 S a n dt h a t i t is o b v i o u s l y a n o l i g o m e r o f s e v -e r a l i d e n t i c a l s u b u n i t s [ 4 ] . T h e i n s e c tr e c e p t o r t h u s c o m p r i s e s a m o l e c u l a rs t r u c t u r e q u i t e d i f f e r e n t f r o m t h e w e l lc h a r a c t e r i z e d Torpedo r e c e p t o r .T h e v e r y p o w e r f u l t e c h n i q u e s o f m o l e c -u l a r g e n e t i c s h a v e g r e a t l y f a c i l i t a te d t h ea n a l y s i s o f t h e Torpedo r e c e p t o r [ 6 ] ;i f m R N A e n c o d i ng t h e r e c e p to r p o ly -p e p t i d e s i n i n se c t s c a n b e o b t a i n e d , a

m o l e c u l a r a p p r o a c h w i ll g iv e in s i g h ti n t o t h e d e t a i l e d s t r u c t u r e o f t h e i n s e c tr e c e p t o r p r o te i n . S u c h i n f o r m a t i o nc o u l d e l u c i d a t e t h e m o l e c u l a r f u n c t i o n -i n g o f t h e r e c e p t o r a n d t h u s e n a b l e a ni n t e re s t in g c o m p a r i s o n w i t h t h e m o l e c -u l a r s t r u c t u r e o f t h e Torpedo r e c e p t o r .I n a f i r s t a p p r o a c h , t h e n e r v o u s t i ss u eo f lo c u s t w a s p r o b e d f o r r e c e p to r - s p e -c if ic m R N A . A s a n a s s a y i n g s y s te m ,t h e Xenopus o o c y t e s h a v e p r o v e d v e r yu s e fu l i n i d e n t if y i n g t he m R N A a n dg e n e s c o d i n g f o r t h e n i c o t i n i c a c e t y l -c h o l i n e r e c e p t o r f r o m Torpedo [7].T h e r e f o r e , R N A e x t r a c ts f r o m l o cu s t sw e r e i n je c t e d i n t o o o c y t e s a n d a n a l y s e dw i t h r e g a r d t o t h e i r c a p a b i l i t y o f d i r e c t -i n g t h e s y n t h e s i s o f t h e r e c e p t o r p r o -t e i n .R N A w a s is o la t ed f r o m t h e h e a d a n dt h o r a c i c g a n g l i a o f l o c u s t (Locusta mi-gratoria) u s i n g t h e g u a n i d i n i u m - i s o -t h i o c y a n a t e / C s C l - g r a d i e n t p r o c e d u r e[8 ] a n d w a s s u b s e q u e n t l y f r a c t i o n a t e db y o l ig o ( d T ) - ce l l u lo s e c h r o m a t o g r a -p h y . T h e p o l y ( A ) + - m R N A f r a ct i o nt h u s i s o l a t e d w a s m i c r o i n j e c t e d i n t of u ll y g r o w n o o c y t e s w h i c h w e r e i n cu -b a t e d f o r 4 8 h a t 2 0 ~ C . P r o t e i n s w e r et h e n e x t r a c t e d f r o m i n j e c te d a n d n o n -i n je c t ed o o c y t e s b y h o m o g e n i z i n g i np h o s p h a t e b u f f e r, p H 7 .4 c o n t a i n i n g1 % d e t e r g e n t. B G T X b i n d i n g w a s d e -

N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 7 2 ( 1 98 5 ) 9 Spr inge r -Ve r lag 1985 213