i

i

PROFIL KLT-BIOAUTOGRAFI METABOLIT SEKUNDER ACTINOMYCETES KK 6-1 DARI RHIZOSFER KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus Benth.) SEBAGAI

PENGHASIL SENYAWA ANTIFUNGI

PROFILE OF TLC-BIOAUTOGRAPHY IN SECONDARY METABOLITE OF ACTINOMYCETES KK 6-1 FROM Orthosiphon stamineus Benth. RHIZOSPHER AS A PRODUCER OF THE ANTIFUNGAL COMPOUNDS

EVI FEBRIANI N111 14 030

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

ii

ii

PROFIL KLT-BIOAUTOGRAFI METABOLIT SEKUNDER ACTINOMYCETES KK 6-1 DARI RHIZOSFER KUMIS KUCING

(Orthosiphon stamineus Benth.) SEBAGAI PENGHASIL SENYAWA ANTIFUNGI

PROFILE OF TLC-BIOAUTOGRAPHY IN SECONDARY METABOLITE OF ACTINOMYCETES KK 6-1 FROM Orthosiphon stamineus Benth.

RHIZOSPHER AS A PRODUCER OF THE ANTIFUNGAL COMPOUNDS

SKRIPSI

untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana

EVI FEBRIANI N111 14 030

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2018

iii

iii

iv

iv

v

v

vi

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah Subehanahu Wa Ta’ala,

Tuhan semesta alam yang senantiasa melimpahkan rahmat, hidayah dan

karuania-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat

serta salam penulis ucapkan kepada Nabi Muhammad Shallallahu ‘Alaihi

Wasallam, yang telah membawa umat muslim dari zaman kegelapan ke

zaman terang benderang.

Penulis sangat menyadari banyak kekurangan, hambatan, dan

kesulitan dalam menyelesaikan penelitian ini. Namun berkat bimbingan,

bantuan, dan dukungan dari berbagai pihak akhirnya penelitian ini dapat

terselesaikan. Oleh karena itu, penulis mengucapkan banyak terima kasih

yang setulus-tulusnya kepada:

1. Ibu Dr. Herlina Rante, S.Si., Apt. selaku pembimbing utama sekaligus

dosen penasehat akademik yang telah banyak meluangkan waktu dan

ilmunya dalam membimbing dan memberikan arahan kepada penulis dari

awal penyusunan perencanaan hingga terselesaikannya penyususanan

skripsi ini, serta memberikan nasehat, motivasi, bimbingan selama penulis

menempuh pendidikan strata satu di Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin. Ibu Dr. Sartini, M.Si., Apt. selaku pembimbing pertama, yang

juga telah meluangkan banyak waktu dan ilmunya dalam membimbing

dan memberikan arahan kepada penulis dari awal penyusunan

perencanaan hingga terselesaikannya penyususanan skripsi ini.

vii

vii

2. Tim dosen penguji, Bapak Prof. Dr. M.Natsir Djide, MS., Apt. selaku ketua

penguji, Ibu Dr. Latifah Rahman, DESS., Apt. selaku sekertaris, dan

Bapak Ismail, S.Si., M.Si., Apt. selaku anggota yang telah meluangkan

waktu, memberikan ilmu dan saran kepada penulis.

3. Dekan Fakultas Farmasi, dan segenap Wakil Dekan Fakultas Farmasi,

serta Bapak/Ibu Dosen Fakultas Farmasi, atas ilmu yang telah diberikan

kepada penulis selama menempuh pendidikan di Fakultas Farmasi

Universitas Hasanuddin. Dan juga untuk seluruh staf pegawai Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin yang telah membantu dalam proses

administrasi selama perkuliahan dan penyusunan skripsi.

4. Ayahanda Sudirman, S.Pd dan Ibunda Harmawati yang selalu

mendo’akan, memberikan kasih sayang, dukungan, nasehat,

mengingatkan segala hal dari kecil hingga sekarang dan berkat beliau

penulis bisa menyelesaikan skripsi ini. Karena mereka adalah

penyemangat penulis untuk terus melangkah. Serta saudara-saudara

penulis, Rustan Efendi, S.Pd.I dan Edi Suparman yang selalu mendukung

dan mengingatkan berbagai hal kepada penulis.

5. Semua Laboran Lab. Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin atas

dukungan dan bantuannya kepada penulis selama meneliti.

6. Herlina, Rahmawati Faisal, Zindy Regita Wulandari, Nurul Atikah, Nur

Indah Sari, Nurdiah Lestari, Dalaratmi, Sumi, Hikmawati, Nur Rahmah

Masda, Nurul Asmi, dan seluruh teman-teman Farmasi Unhas Angkatan

2014 (Hiosiamin) yang telah mendukung, saling menyemangati dan

viii

viii

ix

ix

ABSTRAK

EVI FEBRIANI. Profil KLT-bioautografi Metabolit Sekunder Actinomycetes KK 6-1 dari Rhizosfer Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth.) sebagai Penghasil Senyawa Antifungi (dibimbing oleh Herlina Rante dan Sartini).

Actinomycetes adalah salah satu kelompok mikroorganisme penghasil metabolit sekunder terbesar yang tersebar luas di alam khususnya pada rhizosfer. Salah satu Actinomycetes yang diisolasi dari rhizosfer tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth.) adalah Actinomycetes KK 6-1. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui metabolit sekunder Actinomycetes KK 6-1 yang berperan sebagai penghasil senyawa antifungi dengan menggunakan metode KLT-bioautografi. Actinomycetes KK 6-1 difermentasi selama 12 hari kemudian supernatan dan biomassa dipisahkan dengan proses penyaringan. Supernatan diekstraksi dengan etil asetat (1:1 v/v), fase air supernatan diliofilisasi, dan biomassa dimaserasi dengan metanol. Ekstrak yang mempunyai aktivitas antifungi Trichophyton rubrum kemudian dilakukan KLT-bioautografi dengan fase gerak n-butanol : metanol : air (8:2:1). Hasil KLT-bioautografi metabolit sekunder Actinomycetes KK 6-1 menunjukkan adanya senyawa antifungi pada ekstrak air dan diduga golongan peptida/protein. Kata Kunci : Actinomycetes KK 6-1, metabolit sekunder, KLT-bioautografi,

peptida/protein, aktivitas antifungi.

x

x

ABSTRACT

EVI FEBRIANI. Profile of TLC-bioautography in Secondary Metabolite of Actinomycetes KK 6-1 From Orthosiphon stamineus Benth. Rhizospher as a Producer of the Antifungal Compounds (supervised by Herlina Rante and Sartini).

Actinomycetes is one of the largest secondary metabolite producing microorganisms group that are widespread in nature especially in rhizosphere. One of the Actinomycetes isolated from Orthosiphon stamineus Benth. rhizosphere is Actinomycetes KK 6-1. This study aims to determine the secondary metabolite Actinomycetes KK 6-1 which acts as a producer of antifungal compounds by using the method of TLC-bioautography. Actinomycetes KK 6-1 was fermented for 12 days then the supernatant and biomass were separated by the filtration process. The supernatant was extracted with ethyl acetate (1:1 v/v), the supernatant water phase was lyophilized, and the biomass was macerated with methanol. Extracts which has Trichophyton rubrum antifungal activity then TLC-bioautography with the mobile phase of n-butanol : methanol : water (8:2:1). Results of TLC-bioautography secondary metabolite Actinomycetes KK 6-1 showed the presence of antifungal compounds in water extracts and suspected peptide/protein groups.

Keywords : Actinomycetes KK 6-1, secondary metabolite, TLC-bioautography, peptide/protein, antifungal activity.

xi

xi

DAFTRA ISI

halaman

UCAPAN TERIMA KASIH vi

ABSTRAK ix

ABSTRACT x

DAFTRA ISI xi

DAFTAR TABEL xiv

DAFTAR GAMBAR xv

DAFTAR LAMPIRAN xvii

BAB I PENDAHULUAN 1

I.1 Latar Belakang 1

I.2 Rumusan Masalah 3

I.3 Tujuan Penelitian 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 4

II.1 Actinomycetes 4

II.1.1 Defenisi Actinomycetes 4

II.1.2 Strultur Actinomycetes 5

II.1.3 Habitat Actinomycetes 8

II.1.4 Pentingnya Actinomycetes 9

II.2 Rhizosfer Tanaman Kumis Kucing 9

II.3 Antifungi 12

II.4 Fermentasi 14

xii

xii

halaman

II.5 Uji Aktivitas Antifungi 16

II.6 Uraian Fungi Uji 17

II.6.1 Candida albicans 17

II.6.2 Aspergillus niger 20

II.6.3 Trichophyton rubrum 21

II.7 KLT-bioautografi 23

II.7.1 Kromatografi Lapis Tipis 23

II.7.2 Bioautografi 25

BAB III METODE PENELITIAN 27

III.1 Alat dan Bahan 27

III.2 Metode Kerja 27

III.2.1 Penyiapan Alat 27

III.2.2 Pembuatan Medium 28

III.2.3 Penyiapan Fungi Uji 29

III.2.4 Penyiapan Isolat Actinomycetes KK 6-1 29

III.2.4.1 Peremajaan Isolat Actinomycetes KK 6-1 29

III.2.4.2 Identifikasi Morfologi Actinomycetes KK 6-1 29

III.2.4.3 Fermentasi Isolat Actinomycetes 30

III.2.4.4 Ekstraksi 30

III.2.5 Uji Aktivitas Antifungi 30

III.2.6 Uji KLT-bioautografi 31

III.2.7 Identifikasi Senyawa Kimia 31

xiii

xiii

halaman

III.2.7.1 Steroid 32

III.2.7.2 Alkaloid 32

III.2.7.3 Fenolik 33

III.2.7.4 Saponin 33

III.2.8 Analsis Kualitatif Protein dengan Metode Lowry 33

III.2.8.1 Pembuatan Pereaksi Lowry 33

III.2.8.2 Prosedur Analisis 34

III.2.9 Analisis Data 34

III.2.10 Pembahasan dan Kesimpulan 34

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 35

IV.1 Identifikasi Morfologi Actinomycetes KK 6-1 35

IV.2 Hasil Fermentasi dan Ekstraksi Metabolit Sekunder 37

IV.3 Hasil Uji Aktivitas Antifungi 40

IV.4 Hasil KLT-bioautografi 41

IV.5 Hasil Identifikasi Senyawa Kimia 43

IV.6 Hasil Analisis Kualitatif Protein dengan Metode Lowry 44

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 47

V.1 Kesimpulan 47

V.2 Saran 47

DAFTAR PUSTAKA 48

LAMPIRAN 54

xiv

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel halaman

1. Bakteri yang termasuk kelompok Actinomycetes 6

2. Antibiotik yang diproduksi oleh mikroba tanah 7

3. Golongan obat antifungi 13

4. Hasil uji aktivitas ekstrak air terhadap T.rubrum dengan metode difusi aga 40

xv

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar halaman

1. Ilustrasi morfologi Candida 19

2. Ilustrasi morfologi Aspergillus 20

3. Morfologi Trichophyton rubrum 22

4. Hasil pengamatan makroskopik Actinomycetes KK 6-1 setelah inkubasi 14 hari 35

5. Mikroskopik rantai spora Actinomycetes KK 6-1 36

6. Macam-macam rantai spora Actinomycetes dan struktur permukaan spora 37

7. Kurva lama fermentasi (hari) terhadap diameter zona hambat (mm) 38

8. Hasil uji aktivitas antifungi ekstrak air 40

9. Uji aktivitas antifungi ekstrak hasil fermentasi Actinomycetes KK 6-1 41

10. Hasi uji KLT-bioautografi ekstrak air 42

11. Pembacaan plat kromatogram 43

12. Hasil identifikasi senyawa kimia ekstrak air 43

13. Hasil uji kualitatif protein 44

14. Reaksi protein metode Lowry 45

15. Medium fermentasi 55

16. Proses ekstraksi supernatan Actinomycetes KK 6-1 dengan pelarut etil asetat (1:1) 55

17. Proses maserasi biomassa Actinomycetes KK 6-1 dengan pelarut metanol 55

xvi

xvi

Gambar halaman

18. Proses penyaringan maserasi biomassa Actinomycetes KK 6-1 55

19. Ekstrak hasil fermentasi A= ekstrak metanol, B= ekstrak etil asetat, C= ekstrak air 56

xvii

xvii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran halaman

1. Skema kerja 54

2. Proses ekstraksi Actinomycetes KK 6-1 55

3. Komposisi medium 57

1

1

BAB I

PENDAHULUAN

I.1 Latar Belakang

Kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth.) merupakan salah satu

tanaman yang kaya akan senyawa kimia yang berpotensi dalam mengobati

berbagai penyakit, diantaranya steroid, asam oleanolat, polifenol dan

terpenoid. Suatu penelitian menunjukkan bahwa kandungan flavonoid total

pada daun kumis kucing yang diekstraksi dengan etil asetat mempunyai

aktivitas antibakteri (Nair dkk, 2014). Menurut Neharkar dan Laware (2013),

pada konsentrasi terendah ekstrak hidro alkohol daun kumis kucing mampu

menghambat aktivitas bakteri dan fungi patogen baik pada fungi uniseluler

maupun multiseluler. Senyawa monoterpen dan seskuiterpen yang terdapat

dalam minyak esensial dari batang dan daun kumis kucing berpotensi sebagai

antifungi yaitu mampu menghambat pertumbuhan miselium terhadap jamur

penyebab penyakit (Hossain dkk, 2008).

Seiring perkembangan zaman, penyakit infeksi yang disebabkan oleh

fungi terus berkembang dalam bidang kesehatan. Salah satu penyakit yang

disebabkan oleh infeksi fungi adalah mikosis superfisialis, meliputi

dermatofitosis, pitiriasis versikolor, folikulitis malassezia, dan kandidiasis

superfisialis (Richardson dan Warnock, 2012). Menurut penelitian Rosida dan

Ervianti (2017), jumlah penderita mikosis superfisialis di RSUD Dr. Soetomo

Surabaya pada periode 2011-2013 sebanyak 1136 pasien, dan penelitian

2

2

yang dilakukan Sheilaadji dan Zulkarnain (2016) di rumah sakit yang sama

pada periode 2013-2015 sebanyak 132 pasien pada usia anak-anak. Menurut

Caputo dkk (2001), di Eropa lebih dari 50% subjek yang diperiksa terbukti

memiliki riwayat penyakit kaki dan dua pertiga terinfeksi jamur superfisial

terutama pada anak-anak yang aktif olahraga. Pola hidup yang kurang sehat

dan iklim tropis dengan kelembaban udara tinggi di Indonesia sangat

mendukung pertumbuhan fungi. Oleh karena itu, perlu dilakukan penemuan

senyawa antifungi dari produk alami yang dapat mengatasi masalah

pertumbuhan infeksi fungi, khususnya senyawa yang bersumber dari temuan

Actinomycetes.

Actinomycetes adalah kelompok mikroorganisme dengan produk

metabolit sekunder yang mampu mensintetis senyawa bioaktif seperti

antibakteri, antijamur, dan antivirus. Actinomycetes terdistribusi di tanah

sekitar tanaman, ekosistem laut, mangrove, dan ekosistem lainnya (Berdy,

2005; Cao dkk, 2004). Rhizosfer merupakan bagian tanah disekitar perakaran

tanaman dan berperan melindungi akar tanaman dari fungi patogen pada

akar. Populasi mikroorganisme di rhizosfer biasanya lebih banyak dan

beragam dibandingkan pada tanah bukan rhizosfer. Rhizosfer kaya akan

senyawa yang dikeluarkan oleh tanaman melalui proses sekresi akar dan

mempunyai fungsi yang berbeda (Geetanjali dan Jain, 2016). Nirma (2017),

telah mengisolasi Actinomycetes dari rhizosfer Orthosiphon stamineus Benth.

dan salah satu isolat diberi nama KK 6-1 yang belum diketahui senyawa yang

berperan sebagai antifungi.

3

3

I.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah penelitian ini adalah bagaimana profil KLT-

bioautografi metabolit sekunder Actinomycetes KK 6-1 dari rhizosfer kumis

kucing sebagai penghasil senyawa antifungi.

I.3 Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui profil KLT-bioautografi

metabolit sekunder Actinomycetes KK 6-1 dari rhizosfer kumis kucing yang

berperan sebagai penghasil senyawa antifungi.

4

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Actinomycetes

II.1.1 Defenisi Actinomycetes

“Actinomycetes” berasal dari bahasa Yunani “aktis” yang berarti “sinar”

dan “mykes” yang berarti “jamur” (Faja dkk, 2017). Actinomycetes adalah

bakteri gram positif yang terkenal sebagai produsen yang menghasilkan

beragam senyawa metabolit sekunder yang selektif terhadap molekul target.

Metabolit sekunder bioaktif yang dihasilkan oleh Actinomycetes termasuk

antibiotik dan antitumor. Metabolit ini diketahui memiliki aktivitas seperti

antibakteri, antijamur, antivirus (Gebreyohannes dkk, 2013). Diantara

senyawa bioaktif yang diperoleh sejauh ini bersumber dari mikroba, 45%

diproduksi oleh Actinomycetes, 38% oleh jamur dan 17% oleh eubakteria

uniseluler (Tiwari dan Gupta, 2012). Actinomycetes biasanya diinkubasi pada

suhu 25°-30°C atau 45°-55°C untuk termofil, koloni paling banyak

berkembang dalam waktu 14 hari (5 hari untuk termofil). Namun masa

inkubasi yang direkomendasikan adalah 4-6 minggu, hal ini dikarenakan

pertumbuhan Actinomycetes yang lebih lambat (Goodfellow dan Williams,

1983).

5

5

II.1.2 Strultur Actinomycetes

Actinomycetes termasuk bakteri dengan sel yang sangat beragam dan

plemorfik, berbentuk batang dan tidak beraturan, gram positif, bersifat aerobik

atau anaerob fakultatif. Struktur berupa filamen lembut dan bercabang yang

disebut dengan hifa atau miselia seperti filamen yang terdapat pada fungi,

memiliki konidia hifa yang tegak, bereproduksi dengan cara pembelahan sel.

Bentuk koloni dapat dibedakan dengan menggunakan mikroskopis.

Actinomycetes mempunyai warna miselium udara, miselium vegetatif, dan

warna pigmen yang berdifusi ke dalam media setelah diinkubasi selama

beberapa hari. Sekitar 1 bulan, ciri-ciri Actinomycetes mulai muncul dengan

beberapa permukaan koloni yang telah kering (Sulistyani dan Akbar, 2014).

Kelompok Nocardia memiliki tekstrur beludru, miselium yang bersporulasi

mempunyai warna koloni bagian bawah berwarna merah sedangkan tekstru

koloni yang belum bersporulasi mengkerut di bagian tengah koloni, unisel,

bagian bawah tidak berwarna. Kelompok Sterptomyces yang belum

bersporulasi bentuk koloni koveks, tepi rata, berwarna krem, permukaan

berfilamen, balikannya tidak berwarna, sementara yang telah bersporulasi

bagian bawah berwarna merah. Actinomycetes kelompok Nocardiopis

memiliki tekstur koloni yang hampir sama dengan Nocardia yaitu tekstur

koloni seperti beludru, miselium dan bagian atas koloni berwarna putih dan

bagian bawah berwarna krem (Pujiati, 2014). Berikut beberapa kelompok

bakteri yang termasuk Actinomycetes.

6

6

Tabel 1. Bakteri yang termasuk kelompok Actinomycetes

Kelompok Karakteristik Liannya

Nocardioform Aerobik, tahan asam; berbentuk batang, kokus dan filamen bercabang atau bentuk substrat dan fragmen miselium di udara; dinding kemotip IV; mengandung asam mikolik.

Caseobacter, Corynebacterium, Mycobacterium,

Nocardia, Rhodococcus.

Multilokular Aerobik atau fakultatif anaerobik; terdapat miselium, tidak ada hifa udara, dinding kemotip III.

Dermatophilus, Frankia, Geodermatophilus.

Actinoplanetes SporoActinomycetes aerob, nonmotil, kemungkinan spora tertutup dalam vesikula; tidak ada miselium udara; dinding kemotip II; dapat menghidrolisis arabinosa dan xilosa.

Actinoplanes, Amorphosporangium,

Ampullariella, Dactylosporangium, Micromonospora,

Pilimelia. Sterptomycetes Sporo Actinomycetes aerobik,

memiliki substrat luas bercabang dan miselium udara, spora miselium di bawa udara, dinding kemotip I.

Intrasporangium, Kineosporia, Kitasatoa,

Nocardioides, Sporichthya,

Streptomyces, Streptoverticillium.

Thermomonospora Sporo Actinomycetes aerobik, memiliki substrat luas bercabang dan miselium udara, yang keduanya dapat membawa satu rantai spora; spora motil atau nonmotil; dinidng kemotip III.

Actinocynnema, Nocardiopsis,

Streptoalloteichus, Thermomonospora.

Mikropolyspora Sporo Actinomycetes aerobik, rantai tunggal atau pendek terhadap spora yang mungkin menjadi substrat dan miselium udara, dinding kemotip IV, tidak mengandung asam mikolik.

Actinopolyspora, Micropolyspora, Pseudonocardia,

Saccharomonospora, Saccharopolyspora.

Maduromycetes Sporo Actinomycetes aerobik, rantai tunggal atau pendek, spora dapat ditanggung miselium udara atau terbentuk di dalam vesikel; spora motil ataupun nonmotil; dinding kemotip III; anorganisme hidrolisis yang mengandung madurose (3-0-metil-D-galaktosa)

Actinomadura, Microspora,

Micrtotetraspora, Planobispora,

Planomonospora, Spirillospora,

Streptosporangium.

Actinobacteria Aerobik, fakultatif anaerobik atau anaerobi; berbentuk batang atau kokkus atau membentuk filamen bercabang pada bagian fragmen; tidak ada miselium udara; komposisi dinding variabel tapi meliputi kemotip I, II, V, VI, dan VII.

Actinomyces, Agromyces, Arachnia,

Arcanobacterium, Arthrobacter,

Brevibacterium, Cellulomonas,

Cyrtobacterium, Microbacterium,

Micrococcus.

Sumber: Tiwari. Rare Actinomycetes : A Potential Storehouse for Novel Antibiotics. Critical Reviews in Biotechnology. 2012.

7

7

Diantara kelompok Actinomycetes di atas, Streptomyces merupakan

salah satu kelompok bakteri yang paling terkenal dan banyak terisolasi pada

tanah. Menurut Kar (2008), keuntungan dari Streptomyces yaitu:

1. Termasuk organisme aerob

2. Menghasilkan enzim ekstraselular yang pada umunya menggunakan

protein, polisakarida, dan senyawa organik lain yang banyak ditemukan di

tanah

3. Membentuk senyawa gas yang dikenal dengan geosmin, terdapat pada

tanah segar dan berbau khas

4. Menghasilkan sejumlah antibiotik seperti pada Tabel 2.

Tabel 2. Antibiotik yang diproduksi oleh mikroba tanah

Antibiotik Produk mikroba Aktivitas spektrum

Streptomisin Streptomyces griseus Bakteri gram negatif

Eritromisin Streptomyces erythreus Bakteri gram positif

Neomisin Streptomyces fradiae Spektrum luas

Tetrasiklin Streptomyces rimosus Spektrum luas

Vankomisin Streptomyces orientalis Bakteri gram positif

Kanamisin Streptomyces kanamyceticus Bakteri gram positif, negatif

dan mikobakteri

Amfoterisin B Streptomyces nodosus Fungi

Trikomisin Streptomyces hachijoensis Fungi

Polimisin Bacillus polymyxa Bakteri gram negatif

Gramisidin Bacillus brevis Bakteri gram positif

Sumber: Geetanjali. Antibiotic Production by Rhizospheric Soil Microflora. Departement of

Biotechnology, University Institute of Engineering and Technology, Kurukshetra University. 2016.

8

8

II.1.3 Habitat Actinomycetes

Bakteri golongan Actinomycetes dapat hidup pada beberapa tempat

yaitu (Goodfellow dan Williams, 1983):

1. Tanah

Actinomycetes tanah bersifat neutrofil dalam kultur, isolat

Actinomycetes mempunyai kisaran pertumbuhan antara pH 5,0 dan 9,0 dan

pertumbuhan optimum pada pH netral. Actinomycetes mempunyai peran

penting dalam degradasi polimer kompleks. Actinomycetes di rhizosfer

mampu menekan pertumbuhan patogen pada akar. Terutama kelompok

Streptomyces berperan penting dalam interaksi antagonis dalam tanah.

2. Kompos dan bahan yang terkait

Actinomycetes mesofilik aktif dalam kompos sebagai tahap awal

dekomposisi, Actinomycetes jenis ini tumbuh pada lumpur limbah. Sedangkan

Actinomycetes termofilik tumbuh dengan baik pada pembususkan kotoran

hewan.

3. Lingkungan perairan

Actinomycetes terdistribusi luas di perairan yang menentukan jumlah

dan jenis Actinomycetes. Kelompok ThermoActinomycetes dapat diisolasi dari

air tawar. Actinoplanes dan organisme terkait umumnya berlangsung di tanah,

sungai, dan danau yang erat kaitannya dengan pembusukan vegetasi

terutama pada ranting dan sampah daun Allochthonous. Strepromyces paling

banyak di temukan di air tawar. Beberpa penelitian menyebutkan bahwa

secara umum Actinomycetes paling banyak ditemukan di habitat laut.

9

9

II.1.4 Pentingnya Actinomycetes

Penemuan metabolit sekunder dari Actinomycetes sangat bermanfaat

dalam pengaplikasian pengobatan pada manusia, kesehatan hewan, dan

perlindungan yang menggunakan pendekatan teknik pematangan

Actinomycetes yang lebih cocok sehingga akan meningkatkan eksploitas

metabolit sekunder dalam skala besar khususnya Actinomycetes kelompok

Streptomyces. Antibiotik yang dihasilkan baik terhadap aktivitas fungi maupun

bakteri telah banyak digunakan dan terbukti secara efektif (Goodfellow dan

Williams, 1983). Strain baru dari Actinomycetes yang diidenstifikasi secara

morfologi, fisiologi dan analisis filogenetik berdasarkan urutan gen 16S rRNA

sebagai Streptomyces cavourensis mempunyai aktivitas antijamur terhadap

jamur patogen tanah dalam hal ini mengatasi jamur penyebab penyakit layu

pada tanaman (Genilloud, 2017).

II.2 Rhizosfer Tanaman Kumis Kucing

Rhizosfer merupakan tanah disekitar perakaran tanaman yang menjadi

tempat kelangsungan hidup berbagai mikroorganisme tanah yang umumnya

didominasi oleh bakteri, Actinomycetes, dan fungi (Geetanjali dan Jain, 2016).

Istilah rhizosfer pertama kali diperkenalkan oleh Lorenz Hilter pada tahun

1904 dengan gagasan bahwa “eksudat dari akar tanaman yang berbeda

mendukung perkembangan komunitas mikroba yang berbeda pula” (Hartman

dkk, 2007). Akar tanaman menjadi sumber penghasil energi utama bagi

mikroorganisme tanah. Nutrisi yang disekskresikan melalui akar tanaman ke

rhizosfer banyak dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan spesies tanaman,

10

10

yang selanjutnya mempengaruhi kelimpahan dan keragaman mikroba di

rhizosfer, khususnya mempengaruhi potensi mikroorganisme dalam

menghambat mikroorganisme patogen lainnya. Sehingga populasi

mikroorganisme di rhizosfer berbeda secara genetik dibandingkan tanah

bukan rhizosfer (Neori dan Agami, 2017).

Tanaman kumis kucing memiliki potensi nilai budidaya yang besar

karena mengandung metabolit sekunder dengan berbagai aktivitas biologis.

Rhizosfer kumis kucing mengandung berbagai macam senyawa organik yang

merupakan hasil eksudasi dari sistem perakaran tanaman (Geetanjali dan

Jain, 2016). Senyawa-senyawa tersebut terdiri dari nitrat, nitrogen, asam

amino, karbohidrat, mineral, vitamin dan zat-zat lainnya yang dibutuhkan

mikroorganisme di sekitar perakaran tanaman (Chouwdhury dkk, 2017).

Selain tanaman yang mengeluarkan eksudat, keberadaan mikroorganisme di

tanah seperti bakteri pelarut fosfat dan bakteri penambah nitrogen akan

meningkatkan kesuburan dan mengkonservasi tanah sehingga

mikroorganisme tanah juga bermanfaat pada rhizosfer tanaman dalam

mengatasi penyakit layu pada tanaman. Beberapa mikroorganisme di

rhizosfer berperan dalam siklus hara dan proses pembentukan tanah,

pertumbuhan tanaman, dan mempengaruhi aktivitas mikroorganisme, serta

sebagai pengendali hayati terhadap penyakit tanaman (Poosarla dkk, 2013).

Menurut Djide dan Sartini (2014), sumber energi yang dibutuhkan

mikroorganisme dapat digolongkan menjadi 7 golongan besar yaitu:

11

11

1. Air

Komponen utama penyusun mikroorganisme adalah air yang berfungsi

sebagai sumber oksigen untuk bahan organik sel respirasi dan juga sebagai

pelarut sekaligus alat transpor dalam proses metabolisme.

2. Sumber energi

Senyawa organik maupun senyawa anorganik dapat dioksidasi oleh

cahaya matahari merupakan sumber energi bagi mikroorganisme. Sementara

untuk menghasilkan energi metabolit ada tiga mekanisme utama yaitu

fermentasi, respirasi, dan fotosintesis.

3. Sumber karbon (C)

Selain karbohidrat, asam-asam organik polialkohol dan lainnya sebagai

senyawa organik, juga terdapat senyawa anorganik seperti karbonat-karbonat

atau CO2 sebagai sumber utama karbon.

4. Sumber nitrogen (N)

Pemanfaatan senyawa-senyawa nitrogen dalam bentuk ammonia,

nitrat, asam-asam amino, dan protein-protein tergantung dari jenis dan

kemampuan mikroorganisme dalam memetabolisme senyawa tersebut.

5. Sumber mineral-mineral penting

Mineral berfungsi sebagai penyusun sel, pengatur tekanan osmosis,

kadar ion hidrogen, permeabilitas, potensial oksidasi-reduksi suatu medium.

Unsur-unsur mineral yang dibutuhkan mikroorganisme antara lain karbon,

oksigen, nitrogen, fosfor, sulfur, kalium, kalsium, natrium, dan magenisum.

12

12

Sementara unsur-unsur yang dibutuhkan dalam jumlah kecil antara lain Fe,

Mn, Cu, Co, Bo, Mo, Zn, dan Al.

6. Sumber aseptor elektron

Aseptor elektron atau penangkapan elektron merupakan suatu agensi

pengoksidasi. Pada mikroorganisme yang berfungsi sebagai aseptor elektron

adalah oksigen, senyawa-senyawa organik, NO3, NO2-, SO4

-2, CO2, Fe3+.

7. Sebagai faktor pertumbuhan

Senyawa-senyawa yang dibutuhkan sebagai faktor tumbuh

mikroorganisme hanya diperlukan dalam jumlah sedikit. Berdasarkan strukutr

dan fungsinya dalam metabolisme sel maka faktor tumbuh dapat

dikelompokkan asta asam amino (sebagai penyusun protein), purin dan

pirimidin (sebagai penyusun asam nukleat), vitamin-vitamin (sebagai gugus

prostetik atau bagian aktif dari sel).

II.3 Antifungi

Antifungi adalah suatu golongan obat yang bersifat fungisid atau

fungistatik yang dapat digunakan untuk mengobati dan mencegah penyakit

yang disebabkan oleh fungi patogen (Gunawan, 2012). Salah satu kelompok

Actinomycetes yang bertanggung jawab untuk mensintesis senyawa

antimikroba adalah Streptomyces. Streptomyces merupakan kelompok

Actinomycetes yang banyak menghasilkan antibiotik. Diperkirakan pada tahun

1950-1960an, mayoritas antibiotik ditemukan dari kelompok tersebut (Tiwari

dan Gupta, 2012). Contoh antibiotik yang aktif terhadap jamur dan bersifat

fungisid yaitu Amfoterisin B dihasilkan oleh Streptomyces nodosus dan

13

13

Nistatin dihasilkan oleh Streptomyces noursei. Mekanisme kerja obat

golongan polien dengan cara berikatan kuat dengan ergosterol pada

membran sel jamur, ikatan tersebut akan menyebabkan membran sel bocor

sehingga terjadi kehilangan beberapa bahan intrasel dan mengakibatkan

kerusakan yang tetap pada sel jamur (Gunawan, 2012).

Tabel 3. Golongan obat antifungi

Golongan Mekanisme kerja Contoh obat

Azole Sintesis ergosterol direduksi oleh inhibisi enzim-enzim sitokrom P450 jamur

Klotrimazol, mikonazol, vorikonazol, itrakonazol,

ketokonazol, dan flukonazol Alilamin Menghambat epoksidasi skualen pada

jamur Terbinafin, amorolfin, butenafin, dan naftifin

Ekinokandin Bekerja ditingkat dinding sel jamur dengan menghambat pembentukan β(1-

3)-glukan

Kaspofungin, mikafungin, anidulafungin

Polien Berikatan kuat dengan ergosterol pada membran sel jamur, sehingga membran sel bocor dan terjadi kerusakan pada sel

jamur

Kandisidin, natamisin, hamisin, amfoterisin B, Nistatin, dan rimosidin

Antimetabolit pirimidin sintetik

Obat ini diserap oleh sel jamur dana di dalam sel diubah menjadi 5-FU lalu diubah menjadi 5-fluorodeoksiuridin monofosfat dan fluorouridin trifosfat yang masing-masing menghambat pembentukan DNA dan RNA jamur.

Flusitosin

Sumber: Katzung. Farmakologi Dasar dan Klinik. Buku Kedokteran EGC. Jakarta. 2012. hal. 696-670

Pada periode tahun 1988-1992, metabolit bioaktif yang diproduksi oleh

Actinomycetes sebagai antifungi sebanyak 154 spesies. Senyawa antifungi

alami yang ampuh dan tidak beracun sangat dibutuhkan dalam menghambat

pertumbuhan fungi patogen. Pada umumnya Actinomycetes yang merupakan

produk dari mikroba berpotensi melawan bakteri dan sel jamur seperti

melawan infeksi yang disebabkan oleh mikroba tersebut maupun produk yang

toksin terhadap tumbuhan (Heng dkk, 2011).

14

14

II.4 Fermentasi

Fermentasi merupakan salah satu tahap untuk memperbanyak atau

menghasilkan suatu metabolit yang terdapat dalam sel pada isolat dalam

konidisi anaerob sehingga menghasilkan produk penting dan bermanfaat

seperti obat-obatan, produk makanan dan minuman. Produk sampingan yang

dihasilkan oleh fermentasi mikroba ada 3 macam diantaranya metabolit

primer, metabolit sekunder, dan enzim.

Ada beberapa metode yang dapat digunakan dalam porses fermentasi

antara lain (Sambamurti dan Kar, 2006):

1. Fermentasi dalam keadaan padat

Metode ini biasanya digunakan untuk menumbuhkan mikroba dan

sebagian besar bentuk produk terjadi pada permukaan substrat padat seperti

fermentasi keju, budidaya starter, budidaya jamur dan lainnya. Metode ini

dibedakan menjadi dua pokok utama yaitu:

a. Fermentasi padatan uap rendah baik tanpa atau dengan sesekali

agitasi/terus-menerus agitasi.

b. Fermentasi padatan tersuspensi dalam kolom padat di mana cairan

disirkulasikan.

2. Fermentasi anaerobik

Pada metode ini menggunakan alat yang khusus. Hal-hal yang perlu

diperhatikan pada saat fermentasi anaerobik yaitu:

a. Memerlukan aerasi pada tahap awal untuk menumbuhkan inokulum

15

15

b. Sebagian besar penelitian yang telah dilakaukan tidak memerlukan

pencampur, sementara ada beberapa yang memerlukan pencampuran

awal inokulum

c. Karbon dioksida yang dihasilkan dalam wadah fermentasi dapat

menyebabkan agitasi

d. Pada produk akhir fermentasi diperlukan keahlian untuk memindahkan

hasil fermentasi dalam kondisi anaerobik.

3. Fermentasi aerobik

Fermentasi aerobik biasanya digunakan pada mikroorganisme aerobik

dan proses fermentasi ini dilakukan alat khusus. Oleh karena itu, bioreaktor

selalu bekerja untuk melakukan fermentasi aerobik dengan ketentuan yang

konstan. Selain itu, fermentor harus memiliki perangkat dan mekanisme yang

sesuai untuk pengadukan dan pencampuran antara kultur cair dengan sel

mikroba. Fermentasi aerobik ini terdiri dari dua jenis yaitu fermentor dengan

jenis pengadukan bertingkat dan fermentor tipe pengangkat udara.

4. Bioreaktor sel imobilisasi

Dalam prakteknya, ada dua pendekatan dasar untuk imobilisasi sel

yaitu:

a. Immurement culture (kultur pengukur)

Jenis kultur ini, sel-sel terkurung dalam medium dengan pembatas yang

permeabel. Keuntungan dari teknik ini adalah sangat efektif digunakan

untuk skala hingga 1 L dan memberikan kepadatan sel 1-2 x 108 sel mL-1,

16

16

hasil yang didapatkan lebih banyak, dan bioreaktor skala kecil dan besar

tersedia.

b. Entrapment culture (kultur penjerap)

Teknik ini, sel-sel sangat tersimpan dalam matriks terbuka yang dilalui

oleh medium yang memgalir dengan bebas.

II.5 Uji Aktivitas Antifungi

Kemampuan metabolit sekunder yang dimiliki oleh bakteri yang bersifat

antagonis terhadap mikroorganisme patogen dapat dilihat dengan uji aktivitas.

Uji aktivitas antifungi dapat dilakukan dengan menginokulasikan

mikroorganisme patogen ke dalam media uji yang dibandingkan dengan

aktivitas antibiotik atau senyawa kimia dari obat lain yang mempunyai aktivitas

sinergis dengan produk metabolit sekunder dari isolat yang diperoleh (Ranjan

dkk, 2015). Metode yang umum digunakan untuk uji aktivitas antimikroba

adalah metode difusi agar, berikut 3 cara yang dapat dilakukan yaitu:

1. Kirby Bauer (difusi cakram)

Cara ini menggunakan kertas cakram atau paper disk yang didasarkan

pada pengamatan zona hambat yang terbentuk dari hasil difusi ekstrak uji dan

bahan pembandung antimikroba lainnya ke dalam media agar yang berisi

inokulum mikroba uji. Kelebihan dari metode ini adalah mudah dilakukan dan

tidak memerlukan banyak tenaga serta lebih praktis dan ekonomis (Ranjan

dkk, 2015).

17

17

2. Sumuran

Prinsip metode ini hampir sama dengan cara Kirby Bauer yaitu

terbentuknya zona hambat, yang membedakan adalah kondisi atau tempat

cairan uji untuk berdifusi ke dalam agar. Sumur dibuat dengan menggunakan

cork borer dengan diameter 6 mm kemudian sumur diisi cairan uji yang

masing-masing 25 µL pada media agar yang berisi inokulasi mikroba uji.

Cawan petri dimasukkan ke dalam lemari pendingin agar cairan uji berdifusi

ke dalam media gara uji. Selanjutnya diinkubasi pada suhu yang sesuai

dengan mikroba uji tersebut (Sulistyani dan Akbar, 2014).

3. Pencadang

Metode ini juga sama dengan metode sebelumnya, yang membedakan

adalah pengguna pencadang sebagai wadah untuk cairan uji pada madia uji.

Pencadang yang digunakan yaitu silinder gelas dan logam tahan karat.

Keuntungan dari metode ini adalah jumlah cairan uji yang digunakan dapat

diatur sesuai kapasitas (Djide dan Sartini, 2014).

II.6 Uraian Fungi Uji

II.6.1 Candida albicans

Klasifikasi Candida albicans

Kingdom : Fungi

Filum : Ascomycota

Subfilum : Saccharomycotina

Class : Saccharomycetes

Ordo : Saccharomycetales

18

18

Family : Saccahromycetaceae

Genus : Candida

Spesies : Candida albicans

Candida albicans adalah salah satu fungi penyebab terjadinya infeksi

candidosis superfisialis meliputi candidosis oroparingeal, candisosis vagina,

candidosis penil, candidosis kutan, infeksi Candida pada kuku, dan candidosis

mukokutan kronik. Sejuah ini diketahui lebih dari 20 genus Candida penyebab

infeksi pada manusia yang mengancam jiwa. Secara normal Candida albicans

terdistribusi pada individu yang sehat dan umumnya ditemukan sebagai flora

normal pada mulut, saluran gastrointestinal, dan urogenital pada wanita.

Infeksi biasanya terjadi karena disebabkan kondisi tubuh yang hangat dan

lembab, pakaian yang terlalu ketat atau terbuat dari bahan nilon yang mudah

menyerap panas (Richardson dan Warnock, 2012).

Pada tahun 2014, angka kejadian dan prevalensi infeksi Candida

albicans pada saluran urinoir wanita di daerah Port Harcort Urban terjadi

peningkatan yang cukup tingga yaitu sekitar 18,9% wanita yang telah diteliti

dengan kondisi berbeda diantaranya wanita dengan infeksi saluran urogenita,

wanita hamil, dan diabetes masing-masing tercatat 10,3%, 5,6%, dan 3,0%.

Faktor utama terjadinya kolonisasi jamur pada jaringan manusia yaitu

kesetiaanya terhadap permukaan inang, proses ini dikontrol dan diinduksi

oleh beberapa sel sinyal baik pada jamur maupun lingkungan. Meningkatnya

kejadian mikosis sistemik yang disebabkan oleh spesies Candida pada pasien

19

19

menajdi penyebab penting dari morbiditas dan mortilitas diseluruh dunia

(Onianwah, 2014).

Secara morfologi Candida mempunyai beberapa bentuk elemen jamur

yaitu sel ragi (blastospora/yeast), hifa dan intermediet/pseudohifa. Candida

memperbanyak diri dengan membentuk tunas yang terus memanjang

membentuk hifa semu, pertumbuhan optimum pada pH 2,5-7,5 pada

temperatur 20-38°C dan waktu pertumbuhannya cepat sekitar 48-72 jam.

Spesies yang patogen akan tumbuh pada suhu 25-37°C, sedangkan spesies

yang saprofit kemampuan tumbuhnya menurun pada temperatur yang lebih

tinggi (Djide dan Sartini, 2014; Sardi dkk, 2013). Kemampuan Candida

albicans untuk mengubah morfologi selulernya dikaitkan dengan virulensi,

interaksi sel ragi lebih banyak terjadi dibanding sel filamen yang berperan

untuk infeksi oportunistik. Berikut gambar bentuk morfologi Candida albicans.

Gambar 1. Ilustrasi morfologi Candida. (a) bentuk khamir, (b) bentuk pseudophyta, (c) bentuk hifa (Henriques dkk, 2006)

20

20

II.6.2 Aspergillus niger

Klasifikasi Aspergillus niger

Kingdom : Fungi

Filum : Ascomycota

Class : Ascomycetes

Ordo : Eurotiales

Family : Trichocomaceae

Genus : Aspergillus

Spesies : Aspergillus niger

Gambar 2. Ilustrasi morfologi Aspergillus (Kar, 2008)

Aspergillus niger umumnya dianggap sebagai jamur non patogen.

Hanya dalam beberapa kasus Aspergillus niger menyerang tubuh manusia

sebagai penyakit opotunistik, hal ini pasien memeiliki penyakit parah atau

pengobatan imunosupresif (Schuster dkk, 2002). Menurut Person dkk, (2010),

fungi Aspergillus niger dilaporkan menyebabkan penyakit invasif yang

berkaitan dengan otomikosis, infeksi kutan, dan penyakit paru. Serta terdapat

21

21

beberapa laporan tentang Aspergillus niger dapat menyebabkan infeksi

pneumonia pada pasien yang telah terpapar steroid dalam jangka panjang,

memiliki riwayat paparan asbes dan tuberkulosis, dan yang terakhir memiliki

riwayat Mycobacterium kompleks penyebab penyakit kavitasi.

Aspergillus niger merupakan kapang yang tumbuh optimum pada suhu

30° - 34°C, sulit tumbuh pada suhu tubuh manusia yaitu 37°C dan bersifat

asidofilik yang memungkinkan tumbuh pada pH asam. Kapang ini

mempunyai ciri-ciri kepala konidia yang besar, bulat, dan berwarna hitam,

coklat hitam atau ungu coklat. Permukaan konidia kasar dan mengandung

pigmen, hifa septa, dan miselium bercabang. Konidiofora membengkak

membentuk vesikel pada ujungnya. Aspergillus niger memproduksi berbagai

jenis asam dan enzim (Schuster dkk, 2002).

II.6.3 Trichophyton rubrum

Klasifikasi Trichophyton rubrum

Kindom : Fungi

Filum : Ascomycota

Class : Eurotiomycetes

Ordo : Onygenales

Family : Arthrodermataceae

Genus : Trichophyton

Spesies : Trichophyton rubrum

22

22

Gambar 3. Morfologi Trichophyton rubrum (Inaoki dkk, 2015)

Trichophyton rubrum merupakan jamur yang paling sering

menyebabkan infeksi superfisial dermatofitosis. Dermatofitosis adalah

penyakit kulit menular yang mempengaruhi struktur korneum dan juga bisa

menyerang rambut dan kuku yang ditandai dengan adanya lesi atau cedera

pada bagian tersebut. Penyakit ini umumnya lebih menyerang pria daripada

wanita. Penularannya dapat melalui kontak langsung dengan penderita atau

kontak tidak langsung melalui benda yang terkontaminasi. Faktor suhu dan

kelembaban sangat mendukung terjadinya beberapa infeksi kulit seperti Tinea

pedis, Tinea corporis, Tinea cruris, dan Tinea unguium (Richardson dan

Warnock, 2012).

Jamur ini mempunyai mikrokonidia seperti spora yang paling banyak.

Mikrokonidia berdinding halus, berbentuk tetesan air mata sepanjang sisi hifa

dan koloni menghasilkan pigmen merah pada sisi baliknya. Terdapat 2 strain

Trichophyton rubrum yaitu T.rubrum berbulu halus dan T.rubrum tipe granuler.

Karakteristik Trichophyton rubrum berbulu halus memproduksi mikrokonidia

yang jumlahnya sedikit, halus, tipis, kecil, dan tidak mempunyai makrokonidia.

23

23

Sedangkan Trichophyton rubrum tipe granuler mempunyai karakteristik yaitu

produksi mikrokonidia dan makrokonidia yang jumlahnya lebih banyak.

Mikrokonidia berbentuk clavate dan pyriform, makrokonidia berdinding tipis,

dan berbentuk seperti cerutu. Strain Trichophyton rubrum tipe granuler paling

banyak menginfeksi kulit manusia (Inaoki dkk, 2015).

II.7 KLT-bioautografi

Cara sederhana untuk menedeteksi senyawa yang terdapat dalam

metabolit sekunder dari hasil ekstraksi isolat dapat dilakukan dengan

pengujian Kromatografi Lapis Tipis (KLT) bioautografi. Metode ini merupakan

pengujian yang menggabungkan antara pemisahan kromatografi dan

penentuan biologis suatu senyawa kimia hasil metabolit sekunder dari bakteri.

Penelitian tentang skrining antifungi dan antibakteri dari produk alami telah

dilaporkan menggunakan metode KLT-bioautografi (Tang dkk, 2016).

II.7.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis adalah teknik pemisahan komponen senyawa

kimia yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen

campuran antara dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam. Analisis dengan

kromatografi dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantutatif.

Kromatografi lapis tipis telah diaplikasikan di berbagai industri, termasuk

produksi farmasi, analisis klinis, kimia industri, toksikologi lingkungan, analisis

kimia makanan, air, anorganik, pestisida, kemurnian pewarna, kosmetik dan

analisis herbal (Liu dkk, 2017).

24

24

Fase diam (lapisan penjerap) merupakan salah satu komponen penting

dalam proses pemisahan dengan kromatografi, karena dengan adanya

interaksi dengan fase gerak maka terjadi perbedaan waktu retensi dan

terpisahnya komponen senyawa. Fase diam dapat dibuat berupa bahan padat

atau berpori berbentuk molekul kecil atau cairan yang umumnya dilapiskan

pada padatan pendukung. Penjerap yang umum digunakan adalah silika gel,

aluminium oksida, keiselgur, selulosa, poliamida, dan lain-lain. Sedangkan

fase gerak (pelarut) adalah medium angkut yang terdiri dari satu atau

beberapa pelarut. Pemilihan fase gerak didasarkan pada polaritas senyawa

dan merupakan campuran beberapa cairan yang berbeda polaritasnya,

sehingga didapatkan perbandingan tertentu (Stahl, 1962). Kepolaran pelarut

sangat berpengaruh terhadap nilai Rf (Retention factor) yang diperoleh.

Bercak yang terdeteksi pada plat KLT divisualisasikan di bawah lampu

UV 254 nm dan 366 nm. Penentuan golongan senyawa pada uji KLT

dilakukan dengan penyemprotan plat KLT dengan pereaksi semprot.

Identifikasi noda atau penampakan noda, jika noda sudah berwarna dapat

langsung diperiksa dan ditentukan nilai Rf. Nilai Rf merupakan parameter

karakteristik KLT. Nilai ini merupakan ukuran kecepatan suatu senyawa pada

kromatogram yaitu dengan perbandingan antara jarak yang ditempuh

komponen senyawa dengan jarak tempuh pelarut. Untuk setiap senyawa

berlaku rumus sebagai berikut (Valle dkk, 2016):

25

25

Beberapa faktor yang dapat mempengaruhi nilai Rf:

1. Struktur kimia senyawa yang dipisahkan

2. Sifat dari penjerap (adsorben) dan derajat aktivitasnya

3. Pelarut sebagai fase gerak dan derajat kemurniannya

4. Kejenuhan dari uap dalam chamber

II.7.2 Bioautografi

Bioautografi adalah suatu metode yang dikembangkan untuk

mendeteksi adanya suatu senyawa yang berperan sebagai antimikroba.

Prinsip pengujia bioautografi ini didasarakan atas teknik difusi agar, di mana

senyawa yang mempunyai aktivitas antimikroba dipindahkan dari lapisan KLT

ke medium agar yang berisi mikroba uji secara merata. Zona bening yang

terbentuk disekitar senyawa dapat terlihat setelah dilakukan masa inkubasi

pada waktu tertentu (Hamburger dan Cordell, 1987). Bioautografi dapat dibagi

atas tiga kelompok yaitu (Djide dan Sartini, 2014):

1. Bioautografi langsung

Metode ini berdasarkan prinsip kerja suspensi baketri uji langsung di

semprotkan pada permukaan KLT yang telah dihilangkan sisa-sisa eluen yang

menempel. Plat kromatogram diinkubasi selama 1 x 24 jam dalam kotak

plastik yang dilapisi dengan kertas, kemudian disemprot dengan larutan TTC

(20 mg/mL) atau INT (5 mg/mL), INTB (5 mg/mL), dan MTT (2,5 mg/mL).

Selanjutnya diinkubasi kembali selama 4 jam pada suhu yang sesuai (bakteri

pada suhu 37°C dan fungi pada suhu ruang). Mikroorganisme uji secara

26

26

langsung tumbuh pada plat KLT. Kekurangan metode ini yaitu menggunakan

lempeng KLT yang lebih banyak (20 x 20 cm).

2. Bioautorgrafi kontak

Metode ini didasarkan atas difusi dari senyawa yang telah dipisahkan

dengan KLT. Plat kromatogram ditempel diatas medium yang berisi inokulasi

mikroorganisme uji yang sensitif terhadap senyawa yang terdapat pada plat

KLT dan dibiarkan berdifusi selama 30 menit pada lemari pendingin.

Selanjutnya plat KLT diangkat dan diinkubasi pada suhu yang sesuai (bakteri

pada suhu 37°C dan fungi pada suhu ruang). Metode ini paling banyak

digunakan karena mudah dilakukan dan hasilnya lebih terlihat jelas.

3. Bioautografi pencelupan

Matode ini hampir sama dengan bioautografi kontak, yang

membedakan terletak pada medium yang digunakan. Plat kromatogram yang

telah dielusi diletakkan diantara medium dasar (base layer) dengan medium

yang tidak berisi mikroba uji (seed layer).

27

27

BAB III

METODE PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf (All

American® model 25x-2), oven (Ecocell®), Laminar Air Flow (Envirco®),

corong pisah (Pyrex®), lemari pendingin (Panasonic®), hot plate, inkubator

(Memmert®), mikropipet, mikroskop (Olympus®), plat KLT, pencadang,

jangka sorong, shaker (Gemmy® model VRN-480), timbangan analitik

(Acis®), vortex (VM-300), lampu UV 254 nm dan 366 nm, serta alat-alat gelas

yang biasa digunakan di laboratorium.

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah air steril,

DMSO 50%, etil asetat, isolat Actinomycetes KK 6-1, kutlur murni Candida

albicans, kultur murni Aspergillus niger, kultur murni Trichophyton rubrum,

larutan pereaksi identifikasi senyawa kimia (Liberman Bourchard, Dragendorff,

FeCl3, Mayer, H2SO4 10%, vanilin-asam sulfat, dan Wagner), medium PDA

(Potato Dextrose Agar), medium SNA (Starch Nutrien Agar), medium SNB

(Starch Nutrien Agar), metanol, n-butanol, NaCl fisiologis 0,9% steril, pereaksi

Lowry dan suspensi Nistatin®.

III.2 Metode Kerja

III.2.1 Penyiapan alat

Alat-alat yang digunakan dicuci dengan deterjen, kemudian dibilas

dengan air dan dikeringkan. Alat-alat gelas yang tidak berskala disterilkan

28

28

menggunakan oven pada suhu 180°C selama 2 jam. Untuk alat-alat logam

disterilkan dengan cara dipijarkan dengan menggunakan bunsen. Sementara

alat-alat yang terbuat dari karet, plastik, serta alat-alat ukur yang mempunyai

skala disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

III.2.2 Pembuatan medium

1. Medium PDA (Potato Dextrose Agar)

Ditimbang medium PDA (Potato Dextrose Agar) sebanyak 9,75 g,

dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian dilarutkan dengan aquades 250

mL, diatur pH sampai 4, ditutup dengan kapas, diaduk dan dipanaskan hingga

larut, selanjutnya disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15

menit.

2. Medium SNA (Starch Nitrate Agar)

Ditimbang bahan-bahan yang akan digunakan sesuai dengan

komposisi medium yang akan dibuat, dimasukkan ke dalam erlenmeyer,

kemudian dilarutkan dengan air steril 1000 mL, diatur pH sampai 7,0; ditutup

dengan kapas, diaduk dan dipanaskan hingga larut, selanjutnya disterilkan

dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

3. Medium SNB (Starch Nitrate Broth)

Ditimbang bahan-bahan yang akan digunakan sesuai dengan

komposisi medium yang akan dibuat, dimasukkan ke dalam erlenmeyer,

kemudian dilarutkan dengan air steril 1000 mL, diatur pH sampai 7,0; ditutup

dengan kapas, diaduk dan dipanaskan hingga larut, selanjutnya disterilkan

dengan autoklaf pada suhu 121°C selama 15 menit.

29

29

III.2.3 Penyiapan fungi uji

Fungi uji yang digunakan pada penelitian ini adalah Candida albicans,

Aspergillus niger dan Trichophyton rubrum. Fungi uji diremajakan pada

medium PDA kemudian diinkubasi selama 2 x 24 jam untuk Candida albicans,

3 x 24 jam untuk Aspergillus niger, dan 5 x 24 jam untuk Trichophyton rubrum

pada suhu ruang. Biakan fungi disuspensikan dengan cara diambil 1 ose

peremajaan fungi ke dalam 10 mL NaCl fisiologis 0,9%.

III.2.4 Penyiapan isolat Actinomycetes KK 6-1

III.2.4.1 Peremajaan isolat Actinomycetes KK 6-1

Isolat Actinomycetes yang diperoleh dari penelitian sebelumnya

diremajakan dengan cara diinokulasikan ke dalam medium SNA pada cawan

petri steril sebanyak 15 mL dan media miring sebanyak 10 mL dalam tabung

reaksi dan diinkubasi selama 14 x 24 jam pada suhu 37°C (Alimuddin dkk,

2011).

III.2.4.2 Identifikasi morfologi Actinomycetes KK 6-1

Isolat Actinomycetes KK 6-1 diidentifikasi morfologinya secara

makroskopik dan mikroskopik. Pengamatan secara makroskopik dilakukan

dengan cara isolat Actinomycetes KK 6-1 ditumbuhkan pada medium SNA

dalam cawan petri selama 14 hari pada suhu 37°C kemudian diamati karakter

koloni, produk pigmen, ada atau tidaknya miselium udara, dan miselium

substrat tanpa menggunakan alat bantu. Sedangkan secara mikroskopik

dilakukan dengan metode culture slide untuk melihat morfologi rantai spora

30

30

Actinomycetes KK 6-1. Cover glass steril ditanam pada media SNA yang telah

ditumbuhkan isolat Actinomycetes KK 6-1 yang berumur 3 hari dengan sudut

penanaman 30°C, kemudian diinkubasi kembali selama 9 hari. Selanjutnya

pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop pada pembesaran

1000x (objektif 100x dan okuler 10x) (Atta, 2015).

III.2.4.3 Fermentasi isolat Actinomycetes

Isolat Actinomycetes KK 6-1 yang telah diremajakan diambil 1 cawan

petri dimasukkan ke dalam 5 Erlenmeyer 500 mL yang mengandung 200 mL

medium SNB. Fermentasi dilakukan pada suhu 28°C selama 12 hari dengan

sekali-kali digojok pada laju penggojokan 150 rpm (Alimuddin dkk, 2011).

III.2.4.4 Ekstraksi

Hasil fermentasi disaring untuk dipisahkan biomassa dengan cairan

fermentasi. Cairan fermentasi diekstraksi 2 kali dengan pelarut etil asetat (1:1

v/v) dalam corong pisah selama 20 menit, biomassa dimaserasi dengan

metanol selama 3 x 24 jam. Ekstrak yang diperoleh diuapkan, sementara fase

air supernatan diliofilisasi kemudian disimpan untuk digunakan pada tahap

selanjutnya (Alimuddin dkk, 2011).

III.2.5 Uji aktivitas antifungi

Uji aktivitas dilakukan dengan metode difusi agar (sumuran) yaitu

terlebih dahulu dibuat base layer (15 mL medium PDA), selanjutkan dibuat

sumuran dengan pencadang dan seed layer (10 mL medium PDA ditambah

100 µL suspensi fungi uji). Setelah seed layer memadat, pencadang diangkat.

31

31

Selanjutnya setiap sumuran diisi larutan uji (ekstrak etil asetat, ekstrak

metanol, dan ekstrak air) dengan kadar 4 mg/30 µL setiap sumuran atau

setara dengan 13,3% b/v. DMSO 50% sebagai kontrol negatif dan suspensi

Nistatin® sebagai kontrol positif, pengujian ini dibuat triplo kemudian

diinkubasi selama 4-5 x 24 jam. Dilakukan pengamatan dan pengukuran zona

hambat yang terbentuk dengan jangka sorong (Balouiri dkk, 2015).

III.2.6 Uji KLT-bioautografi

Ekstrak yang aktif menghambat fungi uji ditotolkan 3 µL pada plat silika

GF254 ukuran 1 cm x 7 cm dengan kosentrasi 10% kemudian dikembangkan

dengan fase gerak yang sesuai. Pembacaan kromatogram dilakukan di

bawah sinar UV (254 nm dan 366 nm) dan H2SO4 10% dengan pemanasan,

noda yang terdeteksi dihitung nilai Rf-nya. Selanjutnya plat KLT ditempel

dalam cawan petri yang berisi 15 mL medium PDA dan 100 µL suspensi fungi

uji. Plat KLT dibiarkan menempel pada permukaan medium selama 90 menit

di lemari pendingin. Setelah 90 menit, plat kromatogram diangkat dengan hati-

hati. Kemudian diinkubasi selama 5 x 24 jam pada suhu ruang. Dilakukan

pengamatan dengan melihat zona bening yang terbentuk sebagai daerah

yang tidak ditumbuhi fungi (Ali, 2009).

III.2.7 Identifikasi senyawa kimia

Identifikasi senyawa kimia dilakukan untuk mengetahui senyawa pada

noda yang mampu menghambat fungi uji dengan cara dilakukan

penyemprotan dengan beberapa pereaksi semprot (Liberman Bourchard,

32

32

Dragendorff, FeCl3, dan vanilin-asam sulfat) pada plat KLT yang telah

dikembangkan dengan fase gerak yang sesuai dan metode tabung (Mayer

dan Wagner).

III.2.7.1 Steroid

Identifikasi senyawa steroid dilakukan dengan menyemprotkan

pereaksi Liberman Bourchard (5 mL asam sulfat dalam 50 mL etanol 95%.

Ditambahkan secara hati-hati 5 mL asetat anhidrat) pada profil KLT ekstrak

uji. Kemudian dipanaskan di atas plat panas. Hasil positif jika bercak noda

pada kromatogram menunjukkan warna biru kehijauan (Harbone, 1987;

Depkes, 2011).

III.2.7.2 Alkaloid

Identifikasi senyawa alkaloid dilakukan dengan menyemprotkan

pereaksi Dragendorff (20 mL larutan bismuth subnitrat P 40% b/v dalam asam

nitrat dengan 50 mL kalium iodida P 54,4% b/v, kemudian didiamkan hingga

memisah sempurna. Diambil larutan jernih dan diencerkan dengan air 100

mL) pada profil KLT ekstrak uji. Hasil positif jika bercak noda pada

kromatogram menunjukkan warna coklat jingga dengan latar belakang kuning

(Harbone, 1987; Depkes, 2011).

Identifikasi senyawa alkaloid dilakukan dengan metode tabung. Ekstrak

Air ditimbang sebanyak 0,5 g, ditambahkan HCl 2N dan air 9 mL, digojok

hingga larut (larutan stok). Masing-masing 3 mL dari larutan stok dipindahkan

ke dalam 2 tabung reaksi. Tabung 1 ditambahkan 1 tetes reagen Wagner

33

33

(1,27 g iodine dan 2 g KI dalam 100 mL aquades) dan tabung 2 ditambahkan

1 tetes reagen Mayer (1,4 g HgCl2 dalam 60 mL aquadest dan 5 g KI dalam

10 mL aquades. Kemudian kedua larutan dicampur dan diencerkan sampai

100 mL). Hasil positif menunjukkan adanya endapan putih pada tabung 1 dan

perubahan warna merah bata pada tabung 2 (Depkes, 1995).

III.2.7.3 Fenolik

Identifikasi senyawa fenolik dilakukan dengan menyemprotkan

pereaksi FeCl3 1% (1 g FeCl3 dalam 100 mL air) pada profil KLT ekstrak uji.

Kemudian dipanaskan di atas plat panas. Hasil positif jika bercak noda pada

kromatogram menunjukkan warna biru kehitaman, hijau kehitaman (Harbone,

1987; Depkes, 2011).

III.2.7.4 Saponin

Identifikasi senyawa fenolik dilakukan dengan menyemprotkan

pereaksi vanillin-asam sulfat kemudian dipanaskan (1 g vanillin dalam 100 mL

asam sulfat pekat) pada profil KLT ekstrak uji. Hasil positif jika bercak noda

pada kromatogram menunjukkan warna biru sampai biru violet terkadang

berupa bercak berwarna merah, kuning, biru tua, ungu, hijau atau berupa

kuning coklat pada sinar tampak (Harbone, 1987; Depkes, 2011).

34

34

III.2.8 Analsis kualitatif protein dengan metode Lowry

III.2.8.1 Pembuatan pereaksi Lowry

Reagen A berisi campuran reagen Folin Ciocalteu dengan aquadest

(1:1). Reagen B berisi campuran 50 mL larutan (2% Na2CO3 dalam NaOH

0,1N) dengan 1 mL larutan (1% CuSO4 + 1% NaK-tartrat) (Purwanto, 2014).

III.2.8.2 Prosedur analisis

Ekstrak air ditetesi dengan reagen B sebanyak 5 tetes kemudian

ditambahkan 1 tetes reagen A. Hasil positif jika terjadi perubahan warna

menjadi biru pekat (Purwanto, 2014).

III.2.9 Analisis data

Data diperoleh dengan mengukur zona hambat, menghitung nilai Rf

noda, dan golongan senyawa yang menghambat pertumbuhan fungi uji.

III.2.10 Pembahasan dan kesimpulan

Pembahasan diambil berdasarkan analisis data dan kesimpulan

diperoleh dari hasil pembahasan.

35

35

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Identifikasi Morfologi Actinomycetes KK 6-1

Hasil pengamatan morfologi secara makroskopik dan mikroskopik

Actinomycetes KK 6-1 dapat dilihat pada Gambar 4 dan Gambar 5.

Pengamatan morfologi secara makroskopik digunakan untuk melihat miselium

udara dan miselium vegetatif dari Actinomycetes. Sementara secara

mikroskopik untuk melihat bentuk dan permukaan rantai spora yang dimiliki

isolat Actinomycetes KK 6-1.

(a) (b)

Gambar 4. Hasil pengamatan makroskopik Actinomycetes KK 6-1 setelah inkubasi 14 hari. (a) tampak dari depan, (b) tampak dari belakang

Berdasarkan Gambar 4, Actinomycetes KK 6-1 yang didapatkan dari

rhizosfer kumis kucing mempunyai permukaan kasar, keriput dan pigmen

miselium yakni warna putih pada miselium udara yang tampak dari sisi depan

dan warna coklat pada miselium substrat dengan inti berwarna coklat

kehitaman yang tampak dari sisi belakang. Shirling dan Gottlieb (1966),

mengatakan bahwa penentuan warna miselium dapat dilakukan dengan 3

cara yaitu (1) untuk warna massa dewasa, pertumbuhan permukaan spora

36

36

udara; (2) untuk warna miselium substrat dapat dilihat dari sisi belakang; dan

(3) untuk pigmen yang mudah larut terhadap melanin. Menurut Sulistyani dan

Akbar (2014), bahwa koloni Actinomycetes muncul perlahan, bulat dengan

elevasi timbul dan cembung, tepian rata dan tidak beraturan, dan permukaan

berbubuk yang dipenuhi hifa yang terdiri dari banyak spora, serta melekat erat

pada permukaan media.

Gambar 5. Mikroskopik rantai spora Actinomycetes KK 6-1

Pengamatan mikroskopik dengan perbesaran 1000x (okuler 10x dan

objektif 100x) terlihat seperti Gambar 5 yang menunjukkan bahwa isolat KK 6-

1 mempunyai rantai spora yang fleksibel, permukaan spora berkutil, dan

individual spora yang khas berbentuk bulat seperti anggur yang diduga

Actinomycetes genus Streptomyces. Menurut Cross (1981), genus

Streptomyces yang diisolasi dari tanah mempunyai ciri-ciri miselium

bercabang (rantai spora panjang pada miselium udara dan rantai pendek atau

rantai tunggal pada miselium substrat) yang membawa sporanya sendiri

37

37

berbentuk bulat menyerupai anggur. Menurut Sharma (2014), Streptomyces

adalah genus terbesar dari Actinomycetes keluarga Streptomycetaceae yang

menghasilkan spora dengan permukaan rantai spora yang berbeda-beda

(halus, berkuti, berduri, dan berbulu).

Gambar 6. A. Macam-macam rantai spora Actinomycetes. a. Lurus; b. Fleksibel; c. Refleksibel; d. Monoverticilate, tidak spiral; e. Loop terbuka, spiral panjang, hooks; f. Spiral terbuka; g. Spiral tertutup; h. Monoverticilate dengan spiral; i. Biviticilate, tidak spiral; j. Biviticilate dengan spiral; B. Struktur permukaan spora (Shirling, 1966)

IV.2 Hasil Fermentasi dan Ekstraksi Metabolit Sekunder

Fermentasi dilakukan untuk memperoleh metabolit sekunder dari isolat

Actinomycetes KK 6-1. Setiap hari dilakukan pencuplikan kultur fermentasi

selama 14 hari dan diujikan ke Candida albicans, Aspergillus niger, dan

Trichophyton rubrum. Hasil pengujian menunjukkan bahwa kultur fermentasi

Actinomycetes KK 6-1 hanya mempunyai aktivitas terhadap Trichophyton

rubrum dan aktivitas paling tinggi pada hari 12. Hal tersebut dikarenakan

A

B

38

38

pertumbuhan Actinomycetes lambat dan diduga pada hari 12 isolat KK 6-1

memasuki fase stasioner.

Gambar 7. Kurva lama fermentasi (hari) terhadap diameter zona hambat (mm)

Pada fase ini jumlah mikroorganisme yang mati sama dengan jumlah

mikroorganisme yang hidup, sehingga jumlah keseluruhan bakteri yang hidup

akan tetap. Pertumbuhan dan metabolisme cepat dan pesat. Oleh karena itu,

sintesis bahan sel sangat cepat dan waktu generasi pendek serta mulai terjadi

perubahan warna medium fermentasi dari bening yang banyak mengandung

soluble starch berubah menjadi jernih kecoklatan dengan massa miselia yang

tampak seperti butiran pasir pada dasar wadah fermentasi. Penelitian ini

diperkuat dengan penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Prapagdee dkk

(2015), bahwa Actinomycetes starin SRA14 menghasilkan metabolit sekunder

pada hari 12-14 fermentasi yang menghambat pertumbuhan fungi patogen.

Menurut Sujatha dkk (2015), bahwa supernatan fermentasi NBtAS

menunjukkan aktivitas antifungi pada hari 10.

Hasil fermentasi dipanen dengan ekstraksi pelarut etil asetat dan

metanol. Etil asetat termasuk dalam pelarut nonpolar yang mempunyai

0

5

10

15

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Dia

met

er z

on

a h

amb

at

(mm

)

Lama fermentasi (hari)

Trichophyton rubrum

39

39

konstanta dielektrik yang cukup tinggi daripada pelarut nonpolar lainnya.

Menurut penelitian Ali (2009), pelarut etil asetat mampu menarik semua

senyawa yang memiliki aktivitas antifungi. Sedangkan metanol merupkaan

pelarut polar yang mempunyai konstanta dielektrik tinggi.

Hasil ekstraksi diperoleh bobot ekstrak etil asetat sebanyak 128 mg,

ekstrak metanol 90 mg, dan ekstrak fase air yang telah diliofilisasi sebanyak

2,7 g. Bobot ekstrak filtrat dan biomassa yang diperoleh sangat sedikit

dibanding ekstrak fase air, hal ini dikarenakan tidak dilakukannya optimalisasi

medium fermentasi. Menurut Faja dkk (2017), bahwa medium fermentasi yang

sesuai dengan kondisi optimum pertumbuhan Actinomycetes akan

menghasilkan metabolit sekunder yang lebih banyak. Fase air merupakan

medium fermentasi Actinomycetes yang mengandung banyak komposisi

medium dan juga diduga metabolit sekunder KK 6-1 yang disekresikan ke

media lebih tertarik pada pelarut yang lebih polar, sehingga kemungkinan

senyawa metabolit sekunder KK 6-1 bersifat polar.

Medium fermentasi yang digunakan adalah medium SNB yang

merupakan media dalam bentuk cair yang digunakan dalam proses

fermentasi karena kaya akan sumber karbon. Sumber karbon berasal dari

soluble starch yang mengandung sejumlah karbon berupa pati dan gliserol.

Menurut Shahat dkk (2011), bahwa starch nitrate merupakan medium yang

cocok untuk memproduksi metabolit antifungi. Sumber nitrogen anorganik

berasal dari KNO3, dan mineral-mineral baik makro maupun mikro yang

40

40

dibutuhkan oleh mikroorganisme berasal dari magnesium, kalium, natrium,

besi yang merupakan komposisi dari medium SNB (Sulistyani, 2013).

IV.3 Hasil Uji Aktivitas Antifungi

Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekstrak hasil fermentasi dengan

kadar 4 mg/30 µL setiap sumuran atau setara dengan 13,3% yang aktif

menghambat Trichophyton rubrum adalah ekstrak air.

Tabel 4. Hasil uji aktivitas ekstrak air terhadap T.rubrum dengan metode difusi agar

Perlakuan Diameter zona hambat (mm)

Ekstrak air 13.50

14.97

20.50

Rata-rata 16.32 ± 3.69

Kontrol + 18.62

19.14

18.42

Rata-rata 18.72 ± 0.37

Gambar 8. Hasil uji aktivitas antifungi ekstrak air

Menurut Ali (2009), bahwa >20 mm dikategorikan daya hambat kuat,

10-20 mm dikategorikan daya hambat sedang, dan <10 mm dikategorikan

daya hambat lemah. Ekstrak yang aktif terhadap fungi uji dikategorikan daya

hambat sedang. Dan berdasarkan Gambar 9 menunjukkan bahwa ekstrak air

0.00

10.00

20.00

30.00

Ekstrak air Kontrol +

Dia

met

er z

on

a h

amb

at

(mm

)

Perlakuan

Trichophyton rubrum

41

41

bersifat fungistatik. Dimana daya hambatnya semakin berkurang setelah

diinkubasi hingga 5 x 24 jam.

Gambar 9. Uji aktivitas antifungi ekstrak hasil fermentasi Actinomycetes KK 6-1. 1 =

Inkubasi 4x24 jam, 2 = inkubasi 5x24 jam

Ket: + = suspensi Nistatin®

- = DMSO 50%

E = ekstrak etil

M = ekstrak metanol

A = ekstrak air

Penghambatan fungi uji oleh ekstrak air Actinomycetes KK 6-1

diasumsikan karena adanya metabolit ekstraseluler yang disekresikan ke

media. Berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Wahaab dan

Subramaniam (2018), bahwa ekstrak etil asetat menunjukkan aktivitas

antifungi yang paling tinggi.

IV.4 Hasil KLT-bioautografi

Hasil KLT-bioautografi (Gambar 10) menunjukkan adanya tiga bercak

noda dengan nilai Rf yang berbeda (0,16; 0,33; 0,46) berdasarkan fase gerak

n-butanol : metanol : air (8:2:1). Namun, ketiga bercak noda tersebut tidak

menunjukkan aktivitas antifungi. Melainkan bekas totolan pada plat KLT yang

- - E E

A A

M M

+ +

1 2

42

42

menunjukkan adanya aktivitas antifungi yang ditandai dengan adanya zona

bening seperti pada Gambar 10. Hal tersebut kemungkinan disebabkan oleh

senyawa yang menghambat Trichophyton rubrum tidak ikut terelusi dengan

fase gerak dan diduga senyawa tidak dapat berdifusi sempurna ke dalam

media inokulum sehingga kemampuan menghambatnya kecil.

Gambar 10. Hasi uji KLT-bioautografi ekstrak air

Pemilihan fase gerak didasarkapn pada pemisahan bercak noda

terbaik. Pembacaan kromatogram dilakukan di bawah sinar UV (254 dan 366

nm) dan penyemprotan H2SO4 10% dengan pemanasan. Pada Gambar 11

bercak noda tidak terdeteksi pada UV 254 nm dan tidak terdeteksi jelas pada

366 nm. Namun, setelah disemprot dengan H2SO4 10% dan dipanaskan

muncul 3 bercak noda. Ketiga bercak noda tersebut kemungkinan tidak dapat

terdeteksi dengan jelas pada kisaran di bawah panjang gelombang 366 nm

atau di atas panjang gelombang 254 nm. H2SO4 10% bersifat reduktor dalam

merusak gugus kromofor dari zat aktif sehingga panjang gelombangnya akan

bergeser ke arah yang lebih panjang sehingga bercak noda yang sebelumnya

43

43

tidak terlihat pada UV 254 dan 366 nm, akan menjadi tampak oleh mata

(Isnindar, 2014).

Gambar 11. Pembacaan plat kromatogram

Ket : 1. Penampakan bercak noda 254 nm

2. Penampakan bercak noda 366 nm

3. Penampakan bercak noda H2SO4 10% dan pemanasan

IV.5 Hasil Identifikasi Senyawa Kimia

Gambar 12. Hasil identifikasi senyawa kimia ekstrak air

Ket : 1. Penyemprotan Dragendorff (+)

2. Uji tabung pereaksi Mayer (–)

3. Uji tabung pereaksi Wagner (–) 4. Penyemprotan Libermen Bouchard (–) 5. Penyemprotan FeCl3 (–) 6. Penyemprotan vanillin-asam sulfat (–)

Identifikasi senyawa kimia bertujuan untuk mengetahui senyawa yang

terdapat dalam metabolit sekunder isolat KK 6-1 yang berpotensi sebagai

4 3 2 1

1 2 3

5 6

44

44

antifungi. Setelah disemprot dengan beberpa perekasi semprot, hanya

pereaksi Dragendorff yang menunjukkan hasil positif senyawa alkaloid

(Gambar 12) yang ditandai dengan perubahan warna coklat jingga berlatar

kuning pada bekas noda totolan (Harbone, 1987). Namun hasil negatif pada

uji tabung menggunakan pereaksi Mayer dan Wagner. Sehingga tidak dapat

dikatakan positif alkaloid.

IV.6 Hasil Analisis Kualitatif Protein dengan Metode Lowry

Gambar 13. Hasil uji kualitatif protein

Pengujian ini bertujuan untuk mengidentifikasi adanya protein/peptida

pada sampel ekstrak air hasil fermentasi Actinomycetes KK 6-1 dengan

metode Lowry. Berdasarkan Gambar 13 menunjukkan bahwa sampel ekstrak

air mengandung protein yang ditandai dengan perubahan warna sampel

menjadi biru pekat setelah diteteskan reagen Lowry. Oleh karena itu, diduga

zona bening yang terlihat pada KLT bioautorgafi merupakan golongan

peptida/protein yang menghambat Trichophyton rubrum.

Terdapat dua rekasi yang terjadi pada metode Lowry. Reaksi pertama

yaitu ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks dengan

penambahan garam kupri dalam suasan basa, Cu2+ akan tereduksi menjadi

45

45

Cu+. Pada reaksi ini terlibat 2 atau lebih ikatan peptida. Reaksi kedua yaitu

ion Cu+ akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks fosfomolibdat-

fosfotungstat (fosfomolibdotungstat) menghasilkan hetero-polymolybdenum

blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino)

terkatalis Cu yang memberikan warna biru (Purwanto, 2014).

Gambar 14. Reaksi protein metode Lowry (Purwanto, 2014)

Beberapa penelitian yang telah dilakukan mengenai penemuan

senyawa antifungi dari golongan peptida. Menuruut Vasconcelos dkk (2015),

bahwa Streptomyces strain Tur-10 memproduksi senyawa antibiotik nukleusid

peptida yang kompetitif menghambat fungi patogen. Menurut Bennur dkk

(2016), bahwa Actinomycetes menghasilkan senyawa poliketida dan peptida

yang berperan sebagai antibakteri dan juga aktif terhadap fungi. Menurut

Mayer dkk (2009), bahwa golongan senyawa peptida dari Actinomycetes

mempunyai aktivitas biologis diantaranya sebagai antifungi.

Peptida/protein yang terdapat dalam ekstrak air diasumsikan bahwa

metabolit sekunder Actinomycetes KK 6-1 lebih tertarik pada pelarut yang

lebih polar. Sehingga peptida/protein tidak akan rusak pada saat diekstraksi

dengan etil asetat selama peptida/protein tidak ikut terekstraksi. Cheng dkk

(2015), menunjukkan bahwa dari lingkungan air ke nonpolar, polyprotein

dilepaskan ke dalam bentuk polipeptida yang tidak terstruktur ketika ditarik ke

46

46

dalam pelarut nonpolar. Hal tersebut dapat dilihat dengan menggunakan

mikroskop gaya molekul tunggal dan dinamika molekuler (MD).

47

47

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan

bahwa profil KLT-bioautografi metabolit sekunder Actinomycetes KK 6-1

menunjukkan adanya senyawa antifungi dan diduga golongan peptida/protein.

V.2 Saran

Perlu dilakukan optimalisasi suhu dan medium fermentasi untuk hasil

yang lebih baik, dan penelitian lebih lanjut mengenai spesies serta jenis

peptida/protein yang dimiliki Actinomycetes KK 6-1.

48

48

DAFTAR PUSTAKA

Ali, A., 2009. Skrining dan Karakterisasi Parsial Senyawa Antifungi dari Actinomycetes Asal Limbah Padat Sagu Terdekomposisi. Berk Penel Hayati, 14, pp.219-225.

Alimuddin, A., Widada, J., Asmara, W. and Mustofa, M., 2011. Antifungal Production of A Strain of Actinomycetes spp Isolated from the Rhizosphere of Cajuput Plant: Selection and Detection of Exhibiting Activity Against Tested Fungi. Indonesian Journal of Biotechnology, 16(1).

Atta, H.M., 2015. Biochemical studies on antibiotic production from Streptomyces sp.: Taxonomy, fermentation, isolation and biological properties. Journal of Saudi Chemical Society, 19(1), pp.12-22.

Balouiri, M.O.U.N.Y.R., Bouhdid, S.A.M.I.R.A., Harki, E., Sadiki, M.O.U.L.A.Y., Ouedrhiri, W.E.S.S.A.L. and Ibnsouda, S.K., 2015. Antifungal Activity of Bacillus spp. Isolated from Calotropis Procera Ait. Rhizosphere Against Candida albicans. Asian J. Pham. Clin. Res, 8, pp.213-217.

Bennur, T., Kumar, A.R., Zinjarde, S.S. and Javdekar, V., 2016. Nocardiopsis Species: A Potential Source of Bioactive Compounds. Journal of applied microbiology, 120(1), pp.1-16.

Berdy, J., 2005. Bioactive Microbial Metabolites. The Journal of antibiotics, 58(1), p.1.

Cao, L., Qiu, Z., DaI, X., Tan, H., Lin, Y., and Zhou ,S., 2004. Isolation of Endophytic Actinomycetes from Roots and Leaves of Banana (Musa acuminata) Plants And Their Activities Against Fusarium oxysporumf. sp. Cubense. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 20(5), pp.501-504.

Caputo, R., De Boulle, K., Del Rosso, J. and Nowicki, R., 2001. Prevalence of

Superficial Fungal Infections Among Sports‐Active Individuals: Results from the Achilles Survey, A Review of the Literature. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology, 15(4), pp.312-316.

Cheng, B., Wu, S., Liu, S., Rodriguez-Aliaga, P., Yu, J. and Cui, S., 2015. Protein Denaturation at A Single-Molecule Level: the Effect of Nonpolar Environments and Its Implications on the Unfolding Mechanism by Proteases. Nanoscale, 7(7), pp.2970-2977.

49

49

Chowdhury, S., Thangarajan, R., Bolan, N., O’Reilly-Wapstra, J., Kunhikrishnan, A. and Naidu, R., 2017. Nitrification Potential in the Rhizosphere of Australian Native Vegetation. Soil Research, 55(1), pp.58-69.

Cross, T., 1981. Aquatic Actinomycetes: A Critical Survey of the Occurrence, Growth and Role of Actinomycetes in Aquatic Habitats. Journal of Applied Microbiology, 50(3), pp.397-423.

Depkes RI. 1995. Materia Medika Indonesia, Jilid 5 & 6. Departemen Kesehatan Republik Indonesia. Jakarta. pp.333-334.

Dirjen POM DepKes RI. 2011. Farmakope Herbal Indonesia. Edisi 1. Depkes RI. Jakarta. p.119.

Djide, N. dan Sartini. 2014. Analisis Mikrobiologi Farmasi. Lembaga Penerbitan Universitas Hasanuddin (Lephas). Makassar. pp.87-90, 282-283, 321-324.

Djide, N. dan Sartini. 2014. Dasar- dasar Mikrobiologi Farmasi. Lembaga Penerbitan Universitas Hasanuddin (Lephas). Makassar. pp.101, 223, 297-299.

Faja, O., Sharad, A.A., Younis, K.M., Usup, G. and Ahmad, A., 2017. Isolation, screening and antibiotic profiling of marine Actinomycetes extracts from the coastal of Peninsular Malaysia. International Journal of ChemTech Research. 10(3), pp.212–24.

Gebreyohannes, G., Moges, F., Sahile, S. and Raja, N., 2013. Isolation and Characterization of Potential Antibiotic Producing Actinomycetes from Water and Sediments of Lake Tana, Ethiopia. Asian pacific journal of Tropical biomedicine, 3(6), pp.426-435.

Geetanjali and Jain, P., 2016. Antibiotic Production by Rhizospheric Soil Microflora-A Review. International Journal of Pharmaceutical Sciences and Research, 7(11), pp.4304-4314.

Genilloud, O., 2017. Actinomycetes: Still A Source of Novel Antibiotics. Natural product reports, 34(10), pp.1203-1232.

Goodfellow, M. and Williams, S.T., 1983. Ecology of Actinomycetes. Annual Reviews in Microbiology, 37(1), pp.189-216.

Gunawan, S.G,. 2012. Farmakologi dan Terapan. Ed. 5. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran – Universitas Indonesia. UI Press. Jakarta. pp.571, 581.

50

50

Hamburger, M.O. and Cordell, G.A., 1987. A Direct Bioautographic TLC Assay for Compounds Possessing Antibacterial Activity. Journal of Natural Products, 50(1), pp.19-22.

Harborne, J.B., 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: ITB. pp.53-239

Hartmann, A., Rothballer, M. and Schmid, M., 2008. Lorenz Hiltner, A Pioneer in Rhizosphere Microbial Ecology and Soil Bacteriology Research. Plant and Soil, 312(1-2), pp.7-14.

Heng, J.L.S., Shah, U.K. and Hamzah, H., 2011. Isolation, Characterization and Identification of Potential Actinobacteria with Antifungal Activities Towards Chilli Anthracnose. African Journal of Biotechnology, 10(32), pp.5979-5987.

Henriques, M., Azeredo, J. and Oliveira, R., 2006. Candida Species Adhesion To Oral Epithelium: Factors Involved and Experimental Methodology Used. Critical reviews in microbiology, 32(4), pp.217-226.

Hossain, M.A., Ismail, Z., Rahman, A. and Kang, S.C., 2008. Chemical Composition and Anti-Fungal Properties of the Essential Oils and Crude Extracts of Orthosiphon stamineus Benth. Industrial crops and products, 27(3), pp.328-334.

Inaoki, M., Nishijima, C., Miyake, M., Asaka, T., Hasegawa, Y., Anzawa, K. and Mochizuki, T., 2015. Case of Dermatophyte Abscess Caused by Trichophyton rubrum: A Case Report and Review of the Literature. Mycoses, 58(5), pp.318-323.

Isnindar, I., 2014. Aktivitas Antioksidan Daun Bawang Mekah (Eleutherine americana Merr.) dengan Metode DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil). As-Syifaa Jurnal Farmasi, 6(1), pp.73-81.

Kar, A., 2008. Pharmaceutical Microbiology. New Delhi: New Age International (P) Ltd., Publishers. pp. 91, 146-155, 156.

Katzung, B.G,, Masters, S.B., and Trevor, A.J. 2012. Farmakologi Dasar dan Klinik. Edisi 12. Vol. 2. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta. pp. 969-970

Liu, Y., Friesen, J.B., Grzelak, E.M., Fan, Q., Tang, T., Durić, K., Jaki, B.U., McAlpine, J.B., Franzblau, S.G., Chen, S.N. and Pauli, G.F., 2017. Sweet Spot Matching: A Thin-Layer Chromatography-Based Countercurrent Solvent System Selection Strategy. Journal of Chromatography A, 1504, pp.46-54.

51

51

Mayer, A.M., Rodríguez, A.D., Berlinck, R.G. and Hamann, M.T., 2009. Marine Pharmacology in 2005–6: Marine Compounds with Anthelmintic, Antibacterial, Anticoagulant, Antifungal, Anti-Inflammatory, Antimalarial, Antiprotozoal, Antituberculosis, and Antiviral Activities; Affecting the Cardiovascular, Immune and Nervous Systems, and Other Miscellaneous Mechanisms of Action. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects, 1790(5), pp.283-308.

Nair, A., Kiruthika, D., Dheeba, B., and Tilton, F., 2014. Cytotoxic Potentials of Orthosiphon stamineus Leaf Extracts Against Pathogenic Bacteria and Colon Cencer Cells. Asian Journal of Science and Techlonogy. 5(3), pp. 221-225.

Neharkar, V. and Laware, S., 2013. Antibacterial and Antifungal Activity of Hydro–Alcoholic Extract of Orthosiphon stamineus Benth. International Journal of Pharmaceutical and Chemical Science, 2(2), pp.713-715.

Neori, A. and Agami, M., 2017. The Functioning of Rhizosphere Biota in Wetlands–A Review. Wetlands, 37(4), pp.615-633.

Nirma, A. 2014. Isolasi Actinmycetes dari Rhizosfer Tumbuhan Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) sebagai Penghasil Antifungi. Skripsi tidak diterbitkan. Makassar. Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin

Onianwah, I.F., 2014. The Incidence and Prevalence of Candida albicans Onfection of the Urogenital Tract of Females between the Ages of 18 and 45 Years Old: A Case Study of Patients Receiving Treatment In Ashford and Patrice Clinic in Port Harcourt. Int. Res. J. Environment Sci, 3(4), pp.101-104.

Person, A.K., Chudgar, S.M., Norton, B.L., Tong, B.C. and Stout, J.E., 2010. Aspergillus niger: An Unusual Cause of Invasive Pulmonary Aspergillosis. Journal of Medical Microbiology, 59(7), pp.834-838.

Poosarla, A. and Krishna, R.M., 2013. Isolation of Potent Antibiotic Producing Actinomycetes from Marine Sediments of Andaman and Nicobar Marine Islands. Journal of Microbiology and Antimicrobials, 5(1), pp.6-12.

Prapagdee, B., Kuekulvong, C. and Mongkolsuk, S., 2008. Antifungal Potential of Extracellular Metabolites Produced by Streptomyces hygroscopicus Against Phytopathogenic Fungi. International Journal of Biological Sciences, 4(5), p.330.

52

52

Pujiati, P., 2014. Isolasi Actinomycetes Dari Tanah Kebun Sebagai Bahan Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Florea: Jurnal Biologi dan Pembelajarannya, 1(2).

Purwanto, M.G.M., 2014. Perbandingan Analisa Kadar Protein Terlarut dengan Berbagai Metode Spektroskopi UV-Visible. Jurnal Ilmiah Sains & Teknologi, 7(2), pp.64-71.

Ranjan, R.K., Vasantba,, Bhoomi, M., Bonisha, T., and Bhumika, C., 2015. Antibacterial Potentials of Actinomycetes Isolated from Gujarat. International Journal of Pharmaceutical Sciences Review and Research. 30(1), pp.78-83.

Richardson, M.D. and Warnock, D.W., 2012. Fungal Infection: Diagnosis and Management. John Wiley & Sons. pp.105, 189. Available as PDF file.

Rosida, F. and Ervianti, E., 2017. Superficial Mycoses. Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin, 29(2), pp.117-125.

Sambamurti, K., and Kar A. 2006. Pharmaceutical Biotechnology. New Age International (P) Ltd., Publishers. pp.186-195. Available as PDF file

Sardi, J.C.O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A.M. and Giannini, M.M., 2013. Candida Species: Current Epidemiology, Pathogenicity, Biofilm Formation, Natural Antifungal Products and New Therapeutic Options. Journal of medical microbiology, 62(1), pp.10-24.

Schuster, E., Dunn-Coleman, N., Frisvad, J.C. and Van Dijck, P., 2002. On the Safety of Aspergillus niger–A Review. Applied microbiology and biotechnology, 59(4-5), pp.426-435.

Shahat, A.S., Abouwarda, A. and El-Wafa, W.M.A., 2011. Production of Anti-Candida albicans by Egyptian Streptomyces Isolates. International Journal of Microbiological Research, 2(2), pp.167-171.

Sharma, M., 2014. Actinomycetes: Source, Identification, and Their Applications. Int J Curr Microbiol App Sci, 3(2), pp.801-32.

Sheilaadji, M.U. & Zulkarnain, I., 2016. Profil Mikosis Superfisialis pada Pasien Dermatology Anak. Jurnal Berkala Ilmu Kesehatan Kulit dan Kelamin – Periodical of Dermatology and Venereology. 28(3), pp.1-12.

Shirling, E.T. and Gottlieb, D., 1966. Methods for Characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 16(3), pp.313-340.

53

53

Stahl, E., 1962. Thin-Layer Chromatography. A Laboratory Handbook. Springer. pp.4-50.

Sujatha, T., Ramadevi, M., Siva, Raagini, P.S., dan Ushasri, K., 2015. Isolation of Antagonistic Actinomycetes Species from Rhizosphere of Non BT-Cotton. International Journal of Multidisciplinary Research and Development. 2(4), pp.116-122.

Sulistyani, N. and Akbar, A.N., 2014. Activity of Actinomycetes Isolate from Seeweed (Eucheuma cottonii) as Antibiotic Producer against Staphylococcus aureus and Escherichia coli. Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, 12(1), pp.1-9.

Sulistyani, N., 2013. Aktivitas Cairan Kultur 12 Isolat Actinomycetes terhadap Bakteri Resisten. Kes Mas: Jurnal Fakultas Kesehatan Masyarakat, 7(2).

Tang, J., Zhou, J., Tang, Q., Wu, T. and Cheng, Z., 2016. A New TLC Bioautographic Assay for Qualitative and Quantitative Estimation of Lipase Inhibitors. Phytochemical Analysis, 27(1), pp.5-12.

Tiwari, K. and Gupta, R.K., 2012. Rare Actinomycetes: A Potential Storehouse for Novel Antibiotics. Critical reviews in biotechnology, 32(2), pp.108-132.

Valle, D.L., Puzon, J.J.M., Cabrera, E.C. and Rivera, W.L., 2016. Thin Layer Chromatography-Bioautography and Gas Chromatography-Mass Spectrometry of Antimicrobial Leaf Extracts from Philippine Piper betle L. Against Multidrug-Resistant Bacteria. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 2016.

Vasconcelos, N.M., Fontes, J.M., Lins, M.R.C.R., Bernardo, G.R.B., Araujo, J.M. and Lima, G.M.S., 2015. Streptomyces ansochromogenes Tur-10 Produces a Substance with Antifungal Bioactivity. Genet. Mol. Res, 14, pp.5435-5444.

Wahaab, F. and Subramaniam, K., 2018. Bioprospecting Marine Actinomycetes for Multidrug-Resistant Pathogen Control from Rameswaram Coastal Area, Tamil Nadu, India. Archives of microbiology, 200(1), pp.57-71.

54

54

LAMPIRAN

Lampiran 1

Skema Kerja

Isolat Actinomycetes KK 6-1

Dilakukan identifikasi morfologi isolat

Actinomycetes KK 6-1

Dilakukan fermentasi isolat Actinomycetes pada

medium SNB selama 12 hari

Medium fermentasi dipisahkan biomassa dengan

supernatan

Supernatan diekstraksi dengan etil asetat selama

20 menit (corong pisah) dan biomassa maserasi

dengan metanol

Lapisan etil asetat, metanol diuapkan dan fase air

supernatan diliofilisasi dengan Freeze drying

Setiap ekstrak masing-masing

konsentrasi 13,3% b/v dalam

sumuran medium PDA yang

berisi fungi uji pada cawan petri

Suspens Nistatin® sebagai

kontrol positif dan DMSO 50%

sebagai kontrol negatif

Diinkubasi selama 4-5 x 24 jam

pada suhu ruang

Plat kromatogram

Diamati dan dihitung

diameter zona hambat

Ekstrak yang aktif terhadap fungi

uji ditotol pada beberapa plat KLT

kemudian dikembangakan dengan

fase gerak yang sesuai

Diamati di UV dan H2SO4 10%

kemudian dihitung nilai Rf noda

KLT bioautigrafi

Plat ditempel diatas

medium PDA yang

berisi fungi uji selama

90 menit pada lemari

pendingin

Kemudian plat KLT

diangkat dan

diinkubasi selama 5

hari pada suhu ruang Diamati zona hambat

Diamati warna pada noda

Ekstrak

Pembahsan

Kesimpulan

Disemprot

dengan

pereaksi

semprot

Uji aktivitas antifungi

Identifikasi senyawa

kimia

Analsis protein metode Lowry

55

55

Lampiran 2

Proses ekstraksi Actinomycetes KK 6-1

Gambar 15. Medium fermentasi

Gambar 16. Proses ekstraksi supernatan Actinomycetes KK 6-1 dengan pelarut etil asetat (1:1)

Gambar 17. Proses maserasi biomassa Actinomycetes KK 6-1 dengan pelarut metanol

Gambar 18. Proses penyaringan maserasi biomassa Actinomycetes KK 6-1

56

56

Gambar 19. Ekstrak hasil fermentasi A= ekstrak metanol, B= ekstrak etil asetat, C= ekstrak air

B A C

57

57

Lampiran 3

Komosisi medium

1. Komposis medium PDA :

Ekstrak kentang 200 g

Dekstrosa 20 g

Agar 15 g

Air suling ad 1000 mL

2. Komposisi medium SNA :

Soluble starch 20 g

Agar 20 g

KNO3 1 g

MgSO4 0,5 g

K2HPO4 0,5 g

NaCl 0,5 g

FeSO4 0,01 g

Air suling ad 1000 mL

3. Komposisi medium SNB :

Soluble starch 20 g

KNO3 1 g

MgSO4 0,5 g

K2HPO4 0,5 g

NaCl 0,5 g

FeSO4 0,01 g

Air suling ad 1000 mL