Quel modèle animal ?

Quelle mesure fonctionnelle ?

L’épithélium respiratoire trachéo-bronchique:

- histologie (rappels)

- rôles

- physiopathologie de l’asthme

EPITHELIUM RESPIRATOIRE

• continu (complexes jonctionnels)

• de type cilié

• de hauteur variablepseudostratifié Tr / Br

unistratifié br distales

EPITHELIUM RESPIRATOIRE 8 types cellulaires

situation basale• C. basales• C. Kultschitsky

situation superficielle• C. ciliées C. non ciliées

sécrétrices• C. à mucus• C. Clara

non sécrétrices• C. intermédiaires• C. en brosse• C. mixtes: ciliées et à

mucus

CELLULES CILIÉES• prédominantes (1 c. à mucus / 5 c. ciliées)• prismatiques avec cils vibratils• noyau basal• mitochondries apicales ++

associées aux corpuscules basaux

• prismatiques, évasées (cellules caliciformes)• grains de sécrétion grands, floculeux, riches en glycoprotéines de haut PM (mucines) responsables de la viscoélasticité du mucus• sécrétion accrue et accélérée en cas d'agression• prolifèrent en cas d'agression chronique • progénitrices des C. ciliées

CELLULES à MUCUS

CELLULES en BROSSE

• dépourvues de cils

• microvillosités apicales

• corpuscules basaux, parfois

cellules immatures impliquées dans la

régénération de l'épithélium

CELLULES SÉREUSES• épithélium respiratoire fœtus, rat

• épithélium des glandes trachéobronchiques +

• cellules ovoïdes reposant largement sur la membrane basale

• assurent l'ancrage de l'épithélium respiratoire par des: - hémidesmosomes (face basale)

- desmosomes (faces latérales)

• nombre corrélé à la hauteur de l'épithélium

CELLULES BASALES

CELLULES INTERMÉDIAIRES

• cellules indifférenciées

• progénitrices des autres cellules épithéliales

• responsables de l'aspect pseudostratifié de l'épithélium respiratoire (intercalées entre les autres types cellulaires sans atteindre la basale ni la lumière)

EPITHELIUM BRONCHIOLAIRE

• cellules basales peu nombreuses, absentes dans les zones distales

• cellules ciliées

• cellules à mucus progressivement remplacées par:

• cellules de Clara

L’éotaxine est produite par les cellules épithélialesmais pas seulement!

Epithélium respiratoire et immunité

• Cellules présentatrices de l’Ag: monocytes/macrophages, cellules dendritiques/Langerhans

• Lymphocytes T, B

• Polynucléaires neutrophiles, éosinophiles, basophiles/mastocytes

EPITHELIUM RESPIRATOIRE et IMMUNITÉ

- à l'état normal:• existence de lymphocytes intraépithéliaux ou regroupés en structures organisées associées aux

bronches (BALT: chez le rongeur)

• présence de c. de Langerhans intraépithéliales• expression épithéliale des molécules de classe

IIen pathologie: infiltration accrue par Ly au cours des réponses immunitaires et inflammatoires, développement des BALT lors d'infections bronchiques, expression augmentée des classe II dans asthme et rhinite allergique

Physiopathologie de l’asthme

Les lymphocytes « TH1, TH2 »

Asthme et réponse TH2

L’éosinophile dans l’asthme

Eosinophil-derived proteins

Toxic granule protein FunctionMajor basic protein Cytotoxic to respiratory

epitheliumDegranulation of mast cellsIncreased smooth muscle activity

Eosinophil cationic protein Cytotoxic to respiratory epithelium

Eosinophil-derived neurotoxin Ribonuclease activityCysteinyl leukotrienes Increase vascular permeability

Smooth muscle contractionIncrease mucus secretion

RANTES Eosinophil chemoattractantEotaxin 1 and 2 Eosinophil chemoattractant

Th-2–type cytokines Perpetuation of Th-2 inflammationEosinophil chemoattractant

Le mastocyte dans l’asthme

Entretien de l’inflammation

La bronche de l’asthmatique

Agression et inflammationLiens mésenchyme - épithélium

Activation épithéliale

Activation des fibroblastes

Deux types de réponse à l’agression chronique: l’inflammation chronique ou le

remodelage

Inflammation aiguërépétée

Inflammation chroniqueà éosinophiles

Symptômes

Corticoïdes sensible

Agression

Myofibroblastes transitoires

Remodelage(Épaississement MB,hypertrophie cml…)

Altérations fonctionnelles

Insensible aux corticoïdes ?

cicatrisation

switch ?

maladie

Asthme : épidémiologie

• Prévalence de 5.8 % en février 2000

• En France (1998) : 3.5 M d’asthmatiques

• Mortalité: 4/100 000 hab./an en France (1990)

• 2000 morts/an en France (2001)

OBSTRUCTION HYPERREACTIVITE

INFLAMMATION

Stimulation du SN végétatif

Physiopathologie de l’obstruction bronchique dans l’asthme

Asthme et modèles animaux

- Evaluation de la mécanique respiratoire des rongeurs

- Choix des modèles animaux

- Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (1)

1) Techniques nécessitant la « bipneumonectomie »– Mesure de la contraction de segments isolés des voies

aériennes :étude de la réponse contractile isométrique ou isotonique (soluté physiologique -transducteur de force ou mouvt): mediateurs contractiles ou stim électrique des CML

- : secretions in vivo (étude de le contraction musc seule)

innervation et circulation bronchique non étudiées+ : trachée isolée sensibilisée Ag plus réactive que

trachée contrôle donc la contractilité de la CML intervient dans l’HRB

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (2)

– Mesure du volume de gaz piégé : souris: seul le poumon (Pel) influence la CRF (pas la paroi thoracique) tonus des VA, certaines VA peuvent être fermées à la CRF si BC vol air piégé (trapping) mesuré par principe d ’Archimède

+ : facile, état in vivo à l’euthanasie, rés. id metach A/J vs C3H/HeJ

- : 1 mesure/souris, relation obstruction VA gaz trappé ? (petites VA)

– Mécanique sur poumon isolé volume, débit, pr transpulm compliance statique et dyn, résistance non utilisé pour les tests de BC (fermeture hétérogène des VA)

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (3)

2) Techniques nécessitant l’anesthésie et l’intubation+: exclut les VAS (résistance); contrôle de la FR et du mode ventilatoire respect innervation, mesures répétées (<6h), effets cellulaires et bioch-: effets des anesthésiques (neuro, vascul, agoniste/antagoniste récepteurs)– Pression des VA lors de la ventilationVT et FR fixes, profil P/t modif par stim BC (Airway Pressure Time Index)+: simple -: mesure globale de l ’impédance respiratoire(RVA? Compliance pulm?)– pression d’occlusionRr = Pr /débit Cr = V/P(fin occlusion - CRF)+: modif isolée Rr = grosses VA et modif isolée Cr = petites VA-: mesure Rr inspiratoire, interruption de la ventilation

Enregistrement de la pression trachéale chez l’animal anesthésié(VT et FR fixes)

Pb: variations de RVA et/ou élasticité pulmonaire

Evaluation de la mécanique respiratoire chez la souris (4)– Mesure de la résistance et de la compliance dynamique VT , débit, pression transpulmonaire PTP = débit x Rpulm + VT / Cdyn

PTP = P trachéale - P pleurale (thoracotomie bilatérale, EEP>Patm)

V pléthysmographie; PTP et VT en phase

+: enregistrement continu Rpulm et Cdyn

-: techniquement difficile– Mesure de la résistance et de la compliance avec capsules alvéolaires

3) Techniques non invasives+: même animal , mesures répétées-: chgt de l’ouverture de la glotte, résistance nasale modif R resp– oscillations forcées (Po/débit=R)P oscill surface corporelle mesure de débit généré à l’ouverture des VA-:FR élevée, masque nasal modifie le contrôle neurol ventilatoire– Plethysmographieinspir réchaufft de l’air modif P mesurées lors du cycle ventilatoire

Plethysmographie

Calcul de la pause et de la pause augmentée (Penh)

Pause = (Te – Tr) / Tr

Penh = PEP/PIP x (Te – Tr) / Tr

NB: Pas d’interférence avec les R des VAS des rongeurs

Augmentation de la Penh après provocation à la metacholine

Modèles animaux et asthme (1)• Pas d’asthme allergique dans le monde animal

Depuis 1990 nombreuses publications décrivant des modèles de maladies allergiques (pour le développement de nouvelles molécules pharmaceutiques) … chaque modèle ± avantage mais de la maladie humaine

• Mécanisme exploré1) Réponse précoce : bronchospasme aigü- Pas de modèle murin, rare chez le rat (Donryu>Wistar)- Cobaye +++ : OVA /conscient ou anesthésié/ fr,Vt, Rl, Cdyn /ip, iv, sc, im, po

- Bronchospasme levé par 2 agonistes, antimuscariniques, anti-H1 chez cobaye homme / ± antagoniste des LT, inhib des PDE

Modèles animaux et asthme (2)

2) Réponse tardive- souris ? / Rat Brown Norway (OVA)- cobaye (OVA ip puis inhalé B/C 17 à 24h + eosino)- lapin, mouton, chien, cochon ± metapyrone, singe (ascaris)

PAS DE MODELE D’INFLAMMATION CHRONIQUE DES VOIES AERIENNES

3 ) Hyperréactivité bronchique Aptitude des VA à répondre à des stimuli bronchoconstricteurs

Différents modèles animaux utilisés

Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (1)

• Grande variabilité entre animaux d ’espèces différentes et entre animaux de même espèce

Réactivité bronchique aux stimuli directs• Agonistes cholinergiques (acétylcholine, métacholine et carbachol),histamine, PGF2, LT, serotonine• comparaisons entre espèces difficiles

– pour la métacholine : réponse maximale et sensibilité élevées pour cobaye > rat > lapin >chat > chien (sauf Basenji-greyhound=HRBNS naturelle)

• déterminants in vivo :– force de contraction vs impédance du raccourcissement (Pel parenchyme,

cartilage, rigidité par repliement de la muqueuse…)– quantité de muscle lisse (cobaye > rat ou lapin)– maturation (variation métabolisme des phosphoinositides)– génétiques (Basenji-greyhound, rat , souris, cobaye)

Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (2)

Réactivité bronchique aux stimuli indirects(cellules effectrices autres que musculaire lisse)• Adénosine , neurokinine A (mastocytes)• Bradykinine (B1,B2 - eos/macrophages et fibres NANC) cf rats

sensibilisés antagonistes des récepteurs B2

Hyperréactivité induite par mécanismes non allergéniques• Ozone (chien / rat Lewis Long Evans - serotonine IV Wistar,

Sprague-Dawley, Brown Norway, Fisher 344)• Séphadex (rat: augm réactivité bronchique à la sérotonine IV/ eosino)• Agonistes contractiles (LTD4, bradykinine, PAF-cobaye)• Cytokines: cobaye - IL5 (eos), IL8 (TxA2) • endotoxine: cobaye - HRB subst P

Modèles animaux d’hyperréactivité bronchique (3)

Réponses des VA aux allergènes et hyperréactivité- modèles murins +++: OVA ip - 4 semaines - aerosol OVA histamine et serotonine ( homme) HRB variable A/J >>>C57BL/6J indépendant inflamm VA, eosino, IgE

totales ou spécifiques HRB chez Balb/c sans eosino des VA

- rat : OVA, TMA / HRB indépendant inflamm des VA et dissociation effet tt antiinflamm sur HRB et VA / NB:agonistes cholinergiques IV

- cobaye : OVA, ac plicatique (cf cèdre rouge), toluène diisocyanate

-

Modèle murin et génétique de l’hyperréactivité bronchique

Intérêt du modèle murin• Génome murin: marqueurs satellites permettant

l ’identification de loci (d’intérêt physiologique) gènes candidats (clonage positionnel…)

• Similarités génome humain et murin• Connaissance de la réponse immunitaire chez la

souris• Souris KO ou surexprimant un gène cible

Cytokines et modèles murins d’asthme

Modèle murin d’asthme (BALB/c – OVA):hyperréactivité bronchique et cellules à mucus épithéliales

(H Hirose et al, J Pharmacol Sci 2003,92:209 – 217)

Modèle de remodelage des voies aériennes in vivo chez le rat

Palmans et al, Am J Resp Crit Care Med 2000; 161: 627-635

Effet de l’exposition allergénique répétée chez le ratPalmans et al, Am J Resp Crit Care Med 2000; 161: 627-635

concentration carbachol (mg/ml)

Cellules dendritiques, asthme et modèle murin

GM-C

SF

Augmentation du nombre de cellules dendritiqueschez les souris BALB/c sensibilisées OVA

stimulées par aérosol d’OVA vs PBS(B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282)

L’administration intra-trachéale de CD stimulées par OVA à des souris ou des rats naïfs induit une

forte réponse TH2 après exposition à un aérosol d’OVA

(B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282)

Infiltration éosinophile, hyperplasie c. à mucus et HRB

La suppression des CD de souris allergiques à l’OVA(transgéniques: gène suicide des CD sous ganciclovir)

lors de l’exposition allergénique fait disparaître l’inflammation des voies aériennes

(B. N. Lambrecht, Allergy 2005: 60: 271–282)

Vaccination anti - IL-5

1993 : cobaye

2001: souris

Vaccin actif souris sensib. OVA (A)et modèles d’asthme après transfert CD4+ (B)