Questioning the Dogma of the Central Dogma Introduc)on  

The  flow  of  gene)c  informa)on  from  DNA  to  RNA  to  protein  is  the  commonly  accepted  dogma  of  molecular  biology.  Experimental  results,  however,  are  not  always  consistent  with  the  central  dogma.  The  goal  of  this  project  is  to  test  the  validity  of  several  aspects  of  the  central  dogma,  including  bidirec)onal  promoters,  mul)ple  start  codons,  and  codon  op)miza)on.    

Bidirec)onal  Promoters   Mul)ple  Start  Codons   Codon  Op)miza)on  

ATG  [N]ATG   NRFP   sfGFP  

Objec&ve  •  What  happens  if  there  are  mul)ple  start  codons  on  a  single  mRNA  

strand?  •  Which  start  codon  is  selected  for  the  ini)a)on  of  protein  synthesis?  

Rela)ve  flu

orescence  

Fluorescence  of  Threonine  6-­‐Repeat  Codon  Sequences  

Objec&ve  • How  does  codon  bias  affect  protein  transla)on  rate?  • What  is  the  op)mized  codon  for  threonine?  

GFP  mCherry  

AHL  leader  sequence  

6  codon  repeat  sequence  

Objec&ve  • What  direc)on  does  a  promoter  promote  in?  •  How  biased  is  a  promoter  in  each  direc)on?  •  How  do  palindromic  promoters  affect  direc)onality?  

•  All  fluorescence  was  measured  using  a  TECANM1000  •  Fluorescence  data  was  approximately  normalized  using  

the  K  constant  calculated  for  bidirec)onal  promoters  •  The  downstream  start  codon  coding  for  sfGFP  is  

preferred    •  The  downstream  start  codon  was  also  recognized  and  

translated  at  a  lower  rate  

• RFP  varia)ons  correspond  to  level  of  codon  op)miza)on  • ACG  is  the  op)mized  codon  for  threonine  in  DH10B  E.coli  • Constant  levels  of  GFP  demonstrate  that  enough  charged  tRNA  is  available  to  con)nue  protein  synthesis  in  the  cell  • Designed  and  implemented  a  gene)c  circuit  which  tests  codon  op)miza)on,  using  threonine  as  an  example  

•  All  fluorescence  was  measured  using  TECANM1000  •  Promoter  can  promote  in  both  direc)ons  •  Palindromic  promoters  were  not  expected  to  have  a  bias,  but  

were  shown  to  promote  primarily  in  one  direc)on  •  Designed  and  implemented  a  gene)c  circuit  to  test  

direc)onality  of  promoters  

RFP   GFP  

Method  • Circuit  was  generated  using  Gibson  Assembly  • Promoters  were  ligated  between  reporters  • Promoter  strength  and  direc)onality  correspond  to  measured  fluorescence  

Design  

Figure  1:  GFP  and  RFP  Fluorescence  of  different  promoters    

Figure  2:  Fluorescence  of  first  Start  Codon  (RFP)  and  second  Start  Codon  (sfGFP)  

Figure  3:  Codon  Bias  in  DH10B  E.  coli  for  Threonine.  GFP  is  a  constant  background,  while    mCherry  is  the  protein  produced  with  the  repeat  codons.  

ACT   ACC   ACA   ACG  

RFP   GFP  

Results  

GFP-­‐RFP  Normaliza&on    

• Normaliza)on  of  RFP  and  GFP  fluorescence  was  possible  though  a    calculated  constant  K  • Direc)onality  value  was  calculated  using  the  normalized  GFP/RFP  ra)o  

Design   ORF  (+1)  

ORF  (0)  

• Circuit  was  generated  using  Gibson  and  PCR  assembly  • Design  allows  for  uninhibited  protein  transla)on  through  both  ORFs  • Each  start  codon  corresponds  to  a  fluorescent  protein  in  its  reading  frame  

Method  

Fluorescence  of  RFP  and  GFP  Promoters  

1  

sfGFP  RFP  

Results  

Design  

Method  

• Circuit  was  generated  using  PCR  assembly  • Repeated  sequences  were  designed  and  inserted  • mCherry  is  the  repeat-­‐sequence  reporter  • GFP  is  the  control  reporter  

Fluorescence  of  RFP  and  GFP  Start  Codons  

Results  

Rela)ve  flu

orescence  

Rela)ve  flu

orescence  

Threonine  codons  

Threonine  6-­‐Repeat  Codons   Sequence  Threonine  Codon  ACT   5’  –  GATCCACTACTACTACTACTACTA–  3’  

Threonine  Codon  ACC   5'  –  GATCCACCACCACCACCACCACCA  –  3’  

Threonine  Codon  ACA   5'  –  GATCCACAACAACAACAACAACAA  –  3’  

Threonine  Codon  ACG   5'  –  GATCCACGACGACGACGACGACGA  –  3’  

Human  Prac)ces  Penn  State  iGEM  visited  a  local  high  school  and  presented  the  background,  design,  data,  and  results  from  this  year’s  project.  Students  were  taught  the  basic  terminology  and  techniques  of  synthe)c  biology.    

A  publicly  accessible  anima&on  created  by  a  team  member  was  uploaded  to  YouTube,  in  addi)on  to  each  project  descrip&on  presenta&on  shown  to  the  students.  

Penn  State  iGEM  members  also  par)cipated  in  a  presenta&on  and  Q&A  session  with  prospec&ve  high  school  iGEM  par&cipants  during  the  Americas  East  Regional  Jamboree  

Bba_J23102  

Palindrome  1  

Palindrome  2  

Palindrome  3  

Bba_J23114  

RFP   GFP