resumo biomol diagnostica 2

Biomol Diagnostica II 1

Recordando....

Os Nucleotídeos são formados por: base nitrogenada + açúcar (desoxirribose - pentose) + fosfato.

As fitas de DNA são ligadas através das pontes de hidrogênio. As bases nitrogenadas ficam na parte interna e o

grupo fosfato para fora.

O grupamento fosfato é ligado a hidroxila do açúcar por meio da ação da DNA polimerase, formando a ponte

fosfodiéster.

A nova fita sintetizada sempre será no sentido (fosfato) 5’ � 3’ (OH livre do açúcar), assim o novo nucleotídeo será adicionado à hidroxila livre do açúcar.

Condições das enzimas in vitro:

Toda e qlq enzima necessita de um tampão apropriado para agir, esse tampão precisa conter:

• tampão – mantém a proteína dentro de uma faixa de pH.

• sal (NaCl) que estabiliza a PTN.

• íons divalentes (Mg++) requeridos para a atividade enzimática.

• glicerol (para estoque), vem na enzima estabiliza a estrutura da enzima, não deixando que a estrutura

primaria seja perdida pela formação de cristais de gelo.

• EDTA – agente quelante de íons positivos (vem dentro do tubo da enzima), quelar é se ligar a uma substancia

roubando-a da solução.

Condições das enzimas em vivo – temperatura, pH, cofator ou coenzima.

Enzimas modificadoras do DNA

• Nucleases – fragmenta a molécula de DNA de maneira aleatória

• Ligases – unem fragmento de DNA (dupla fita) refazendo a ligação fosfodiester

• Polimerases – sintetizam novas moléculas de DNA (utilizando um molde)

• Fosfatases e quinases – adicionam ou removem grupamento de fosfato.

Base nitrogenada

As bases nitrogenadas são unidas por pontes de hidrogênio

Açúcar (pentose)

Grupo fosfato � Extremidade 5’

se tivesse um oxigênio aqui é RNA (ribose) Todo grupamento novo de nucleotídeo é

adicionado aqui na hidroxila (extremidade 3’)�

ligação fosfodiéster


I) Nucleases – rompem pontes fosfodiester, ocorre nas duas fitas de DNA.

a) Exonuclease – removem nucleotídeos das extremidades de fita de DNA, essas enzimas são tempo

dependente, qto mais expor a enzima ao DNA mais nucleotídeos serão retirados.

b) Endonucleases – rompem pontes fosfodiéster de dentro da cadeia de DNA (enzimas de restrição).

Obs.: As bactérias não tem seu DNA quebrado por essas enzimas pois ele é metilado, as enzimas de

restrição reconhecem as duas fitas para corta-las (fitas são parlindromes).

figura 1.1

Fatores que influenciam a atividade das enzimas de restrição: composição do tampão, concentração

da enzima, temperatura, metilação do DNA.

o Endonucleases sem especificidade (quebra pontes fosfodiesteres aleatoriamente), ex.:

DNAse I

II) Ligases

a) Ligases – restabelece as pontes fosfodiester (na presença de ATP)

Todas as DNA ligases requerem um fosfato no terminal 5’ e um OH livre no terminal 3’ para formação da ponte

fosfodiéster.

b) Polimerase – promove replicação do DNA a partir de um molde (fita simples).

Só ocorre no sentido 5´� 3´da fita de DNA.

o DNA polimerase I Holoenzima (mais de um domínio catalítico e mais de uma atividade

enzimática, 1º atividade – polimerase 5’�3’, 2º e 3º atividade exonuclease 5’ �3’ e 3’�5’

reparo erros do DNA).


o Klenow fragment:

- Preenchimento da extremidade simples de DNA – qdo vc fornece os nucleotídeos

prevalece o dominio de polimerase completando a fita simples.

- Digestão de extremidade fita simples – qdo vc não coloca os nucleotídeos o domínio de

exonuclease prevalece retirando os nucleotídeos de fita simples.

O que determina a função de uma enzima é sua estrutura espacial (tridimensional). As Taqs diferem entre si pela

estrutura tridimensional.

o DNA polimerase III - 5´-3´polimerase

o DNA polimerase termoestável (Ex: TaqDNA polimerase)

Quinases – Transferem/adicionam grupamento fosfato para uma molécula de DNA. Sempre 5’ � 3’. São usadas na

preparação do DNA para a ligação e na marcação de DNA.

Fosfatases - Catalisam remoção de fosfatos das extremidades 5’ do DNA. Ao remover o grupo o DNA é desforilado e

assim é impedido de realizar novas ligações. Usado no tratamento do vetor antes da ligação com o inserto, assim ele

não se ligará sozinho sem o inserto.

Corrida de gel

O gel de poliacrilamida é bem mais delgado, em comparação com o de agarose, e produz poros bem menores (malha

mais fina). Assim o gel de poliacrilaminda tem uma resolução maior, isto é, é capaz de diferenciar ‘mais’ as pb de

bases, de até 1 pb. Também é utilizado na corrida de gel de RNA.

O DNA é marcado com brometo de etídeo na corrida de gel; O brometo se intercala nas pontes de hidrogênio.

É possível purificar os fragmentos de DNA direto do gel. Corta-se o pedaço desejado com um bisturi e aplica-se uma

substancia capaz de digerir a molécula de agarose.

SMEAR é o padrão de corrida ‘arrastado’. Muito comum no DNA genômico, por causa do tamanho do DNA. Por ser

um DNA muito grande, e sua digestão produz muitos diferentes tamanhos fica difícil diferenciar um do outro por

estarem muito próximos.

Clonagem gênica – inserção dos vetores na célula hospedeira

Clonagem:

• Proporciona a produção de copias de uma molécula de DNA em larga escala.

• É feito a partir de um DNA recombinante – DNAs de origens diferentes.

• Utiliza um vetor, que identificação, replicação e estabilização do inserto.


Passos necessários para a clonagem:

a) Isolar o fragmento desejado (por PCR ou digestão com enzimas de restrição).

b) Seleção do vetor apropriado (plasmídeo, fago, células eucarióticas).

c) Ligação de vetor-inserto (DNA vetor + DNA inserto = DNA recombinante).

d) Escolha da célula hospedeira.

e) Inserção do vetor na célula hospedeira.

f) Seleção dos clones recombinantes

Porque clonar um fragmento ao invés de utilizar o PCR ?

● Armazenamento - por meio da clonagem é possível armazenar o DNA para utilizar futuramente. Enquanto o

mesmo DNA em um tubo de PCR com o tempo irá se deteriorar.

● Sequenciamento – para a realização do sequenciamento a molécula de DNA precisa estar clonada (ligada a um

vetor)

● Proteína – produto resultante do gene clonado

O objetivo final da clonagem dificilmente é apenas obter um número grande de cópias de um fragmento de DNA,

seu emprego é múltiplo.

O método de clonagem se baseia na replicação da fita utilizando a maquinaria existente em uma célula hospedeira.

O Vetor deve:

- Permite a estabilização da molécula na célula hospedeira

- Permite a replicação da molécula na célula hospedeira

- Permite a identificação da molécula na célula hospedeira

Os vetores podem ser de clonagem ou de expressão. Os de expressão apresentam toda a parafernália do de

clonagem com alguns ‘extras’ que permitem a expressão do produto gênico.

Características essenciais nos vetores:

● Polylinker ou síQo de restrição (região que contém vários sítios para enzimas de restrição)

● Origem de replicação pra DNA polimerase

● Método de seleção da bactéria recombinante, por exemplo, gene de resistência a algum antimicrobiano

b.Vetores

1. Plasmídeos

2. Fagos

3. Cosmídeos

4. Bacteriofagos

5. Outros vetores (BAC e YAC)


Os vetores de clonagem molecular são moléculas de DNA capazes de amplificar, em centenas de cópias, a

informação genética que neles foi inserida. Existem diferentes tipos de vetores possuindo cada um particularidades

que lhe são próprias.

1)PLASMÍDEOS

Os plasmídeos são pequenas moléculas de DNA de cadeia dupla, que

contêm os elementos necessários à sua replicação e um gene que confere

resistência a um antibiótico. Podem estar presentes em duas ou mais

cópias na célula e podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases). Este

plasmídeos, sendo capazes de amplificar o segmento de DNA neles

inserido, são utilizados como vetores de clonagem. Para isso, têm que

possuir certas propriedades:

• Ter uma origem de replicação, que consiste numa sequência de DNA

que permite a replicação do vetor na célula hospedeira;

• Possuir Múltiplos Sítios de Clonagem (MSC), ou seja, vários locais

únicos de clivagem para endonucleases de restrição, os quais

constituem o sítio de inserção no vetor de clonagem;

• Conter um gene que codifique uma substância que possa distinguir

uma célula transformada de uma não transformada. Muitas vezes, são utilizados genes que conferem

resistência a um antibiótico, destacando-se, devido à sua grande utilização, o gene que confere resistência à

ampicilina. Assim, as células que possuem este gene são capazes de crescer em meios com ampicilina,

enquanto que as restantes não sobrevivem.

Estes vetores constituem parte essencial no processo de clonagem, sendo necessária a atuação das enzimas de

restrição para ligar o DNA a ser clonado ao DNA do vetor, através da produção de extremidades coesivas

complementares (ou extremidades abruptas). Seguidamente, a molécula híbrida resultante é inserida numa célula

hospedeira, muitas vezes bactérias, por um processo

denominado transformação. O vetor pode assim sofrer

replicações e proceder à consequente amplificação do número

de cópias. Como foi referido anteriormente, estas células são

identificadas devido a novas características concedidas pelo

plasmídeo (por exemplo, sobreviver num meio contendo um

dado antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência).

Figura 2: Clonagem em plasmídeos. Um plasmídeo é uma

pequena molécula circular que contém uma origem de

replicação (ori), gene que confere resistência a um antibiótico

(no exemplo ampicilina, Amp) e sítio(s) de restrição (no

exemplo, sítio de restrição para a EcoRI), o qual pode ser usado

para inserir fragmentos de DNA. O DNA inserido é ligado ao

vector e os plasmídeos recombinantes são transformados em

bactérias, tais como aE. coli. As bactérias são plaqueadas em

Figura 1 - Plasmídeo. Plasmídeo com sequências que conferem resistência à ampicilina e tetraciclina. Apresenta ainda uma origem de replicação (ori) e sítios de restrição para a EcoRI, SalI e PstI.


meios contendo o antibiótico para o qual o plasmídeo confere resistência, como forma de seleccionar as bactérias

resistentes (ou seja, transformadas). Desenvolvem-se então colónias de bactérias com o plasmídeo recombinante.

2)FAGOS

O fago mais utilizado na clonagem molecular é o bacteriófago λ que se comporta como um vírus da E. coli. É

assim, uma partícula viral constituída por proteínas e DNA em igual quantidade, e que se apresenta como

uma molécula linear de cadeia dupla (cerca de 48.500 pares de bases). É injetado na célula hospedeira por

possuir a particularidade das suas extremidades (sítio cos) serem de cadeia simples, constituídas por cerca

de 12 nucleótidos que, sendo complementares na sequência de bases, permitem ao DNA adquirir uma forma

circular antes da sua inserção. O genoma do fago λ codifica para 50 proteínas, aproximadamente.

▲ Figura 3: Clonagem em bacteriófagos λ. O vector contém

um sítio de restrição (por exemplo, para EcoRI) para

inserção do DNA clonado. Adicionalmente, sítios cos,

necessários para o empacotamento do DNA nos fagos, estão

presentes em ambas as extremidades do vector de DNA. O

DNA inserido é ligado ao vector e as moléculas

recombinantes são empacotadas nos fagos. Os fagos

recombinantes são então usados para infectar bactérias,

tais como a E. coli. Cada fago recombinante, que carrega um

fragmento único do DNA clonado, forma uma placa única no

interior da cultura bacteriana.

O fago é usado na clonagem molecular por possuir certas vantagens:

O DNA inserido é empacotado in vitro. A eficiência do empacotamento é somente de 10%

aproximadamente, no entanto, uma vez empacotado, a eficiência de inserção na célula E. coli hospedeira é

de 100%;

Mais eficiente que a transformação bacteriana com plasmídeos, pois esta na melhor das hipóteses tem

108 transformantes por μg de DNA, o que significa que menos de 1 em 1000 plasmídeos são transformados.


3)COSMÍDEOS

O aparecimento da clonagem em cosmídeos deu-se para ultrapassar algumas limitações da clonagem em fagos

e plasmídeos. No fago λ, os fragmentos de DNA a serem inseridos não podem ultrapassar os 15 kb, e, apesar de,

por vezes, ser o suficiente para conter um gene completo com as suas sequências limitadoras, na maior parte

das vezes, os genes são de maiores dimensões (35 a 40 kb) o que torna impossível a sua inserção.

Os cosmídeos são assim, plasmídeos (com origem de replicação e genes que conferem resistência a antibióticos),

que contêm um fragmento de DNA do fago λ incluindo o local cos. São utilizados como veículos de clonagem

molecular através do empacotamento in vitro (técnica já referida na clonagem em fagos, que, neste caso, reconstitui

a estrutura do fago em cabeça e cauda, sendo assim utilizado para infectar a célula hospedeira). As enzimas de

empacotamento reconhecem dois locais cos com distância de 35 a 49 kb, o que limita o tamanho dos fragmentos

passíveis de serem empacotados. Assim, o DNA é clivado com uma enzima de restrição que produz grandes

fragmentos de DNA que se vão ligar ao cosmídeo anteriormente clivado com uma enzima semelhante. Numa

situação ideal, cada fragmento de DNA genômico possui um local cos nas suas extremidades que, durante o

empacotamento, vão ser reconhecidos por enzimas (caso estes locais estejam situados a uma distância de 49 kb).

Seguidamente, uma vez injetado no interior da célula hospedeira, vai circularizar e replicar como um plasmídeo

normal, sem exprimir qualquer função do fago, sendo igualmente reconhecido com base na resistência adquirida a

um antibiótico específico.

▲ Figura D4: Esquema de clonagem em cosmídeo.

4. Bacteriófagos

Parasitos celulares - para se reproduzirem precisam infectar uma

célula. Interação célula-vírus é específica.

� Bacteriófagos - vírus que infectam bactérias

� Vírus vegetais ou animais - infectam células animais ou

vegetais.

A informação genética dos vírus pode estar contida em moléculas

de DNA ou de RNA. Exemplos:

� RNA - R17, MS2, f2, Q

� DNA circular ss - φX174, M13

� DNA circular ds - T4, T5, T7, P1, λ

Os bacteriófagos podem ser:


� Virulentos: ciclo lítico

� Temperados: ciclo lisogênico + ciclo lítico

5)OUTROS TIPOS DE VECTORES

• BAC (cromossoma artificial bacteriano): derivado de plasmídeos naturais de E. coli, denominado de

factor F. A origem de replicação e as outras sequências do factor F, permitem a sua replicação

enquanto plasmídeosestáveis, possuindo inserções de 120-300kb. Devido à sua estabilidade,

capacidade de aceitar grandes fragmentos de DNA e facilidade de manuseamento, são agora

os vectores de clonagem preferidos para construir bibliotecas de DNA de organismos complexos.

• YAC ( cromossoma artificial de levedura): contém origens de replicação de leveduras e outras

sequências (centrómeros e telómeros), que

permitem a sua replicação como moléculas

lineares do tipo cromossómico em células

de levedura.

▲ Figura 5: YAC. Os YAC (Yeast Artificial

Chromossome) permitem a clonagem de

moléculas de DNA relativamente grandes.

TEL, CEN e ORI correspondem a telómero,

centrómero e origem de replicação,

respectivamente, para a

levedura Saccharomyces cerevisiae. BamHI

e EcoRI correspondem a sítios de restrição

para as respectivas enzimas de restrição. As

sequências A e B codificam enzimas que

servem como marcadores de selecção,

permitindo um fácil isolamento das

leveduras que apresentarem o cromossoma

artificial.

c. Ligação de vetor-inserto

A reação de ligação entre vetor (ex.: plasmideo) e inserto (o

fragmento de DNA) é feito através de uma enzima

chamada DNA ligase(pag.2) que ira unir o vetor e o inserto.

Para que essa ligação ocorra disponibilizamos de alguns

artifícios, as extremidades do inserto e vetor podem ser

coesivas e blunt (ver pagina 2, figura 1.1), a fim de evitar

ligações inespecíficas (extremidades coesivas).

A ligação com extremidade blunt requer mais gasto de

energia para que ocorra. A reação de ligação é feita em um

termociclador com temperatura, tampão ideais para o funcionamento da enzima.

O plasmideo vem “fechado” então precisamos abri

baseada no sitio de clonagem (polylinker) que o plasmideo possui, para tanto o fa

plasmideo(figura 1.3).

Se vc tiver um vetor com a extremidade

for blunt ou vice-versa podemos fazer uso de adaptadores

para que essa ligação ocorra(figura 1.4).

ultilizado a enzima T4 DNA ligase.

Biomol Diagnostica II

lador com temperatura, tampão ideais para o funcionamento da enzima.

O plasmideo vem “fechado” então precisamos abri-lo com uma enzima de restrição, a escolha dessa enzima é

baseada no sitio de clonagem (polylinker) que o plasmideo possui, para tanto o fabricante nos fornece

Se vc tiver um vetor com a extremidade coesiva e seu inserto

podemos fazer uso de adaptadores

para que essa ligação ocorra(figura 1.4). Para essa reação é

Figuras 1. 2

inserto no vetor.

Figura 1.4


lo com uma enzima de restrição, a escolha dessa enzima é

bricante nos fornece o mapa do

Figuras 1. 2 – Passos para inserir o

inserto no vetor.


Para evitar a re-ligação do vetor depois de ser “digerido” pela enzima de restrição, o vetor pode ser tratado com

uma enzima a fosfatase, ela desfosforila (tira fosfatos) evitando assim sua religação.

d. Células hospedeiras

Tipos de células hospedeira:

- Células eucarióticas: leveduras, células de ou organismos tecidos variados

- Células procarióticas: bactérias

d. Inserção do vetor na célula hospedeira

Para inserir o vetor recombinante na célula hospedeira essa precisa de um tratamento que pode ser:

• Transformação - a célula hospedeira é tornada quimicamente competente para o vetor de clonagem ser

introduzido. Se as DNAs polimerases da célula hospedeira reconhecerem os sítios de replicação do DNA

exógeno, a bactéria vai replicar o DNA exógeno junto com seu próprio DNA. As bactérias e o vetor são

misturados com uma solução de cloreto de cálcio e sofrem um choque térmico. Os íons cálcio têm a função

de neutralizar as cargas negativas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela

membrana no momento do choque

térmico.

Figura 1.5 – Os pontos vermelhos

representam o cloreto de cálcio que

se ioniza (em Cl- e Ca2+), o Ca2+ será

atraído pela parede bacteriana (que é

neg), formando uma película que

promove a aproximação do DNA

Figura 1.3 – Mapa de um

plasmideo.


exógeno (plasmideo) que possui carga neg.

Crescimento em meio líquido de cultura - Incubação à 37ºC com agitação durante 1 hora, Sem antibiótico. No

tubo, crescerão todas as bactérias viáveis (com e sem plasmideo recombinante).

O meio sólido contém: Antibiótico,X-Gal,

IPTG, Incubação durante 18 horas a 37ºC.

Placa com os clones, colônias azuis

sem o plasmideo recombinante,

colônias branca presença do

plasmideo recombinante

• Eletroporação - a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos

abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido

técnica na qual se misturam bactérias e o

com o objetivo de desestabilizar a membran

rapidamente transferida para meio de cultura e incubada a 37ºC para que se possa recuperar após o choque.

• Transfecção - quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser

transfectada para receber a molécula recombinante

utilizados como vetor. Foram mantidos genes essenciais a reprodução vira


a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos

abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido

técnica na qual se misturam bactérias e o vetor num único tubo e aplica-se um choque e

tivo de desestabilizar a membrana e permitir a entrada do vetor


quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser

transfectada para receber a molécula recombinante. São utilizados fagos geneticamente modificados

utilizados como vetor. Foram mantidos genes essenciais a reprodução viral.

Para que o DNA seja injetado na cel hospedeira ele precisa

estar dentro do fago. Um vírus precisa ser montado em volta

do DNA in vitro (figura ao lado).

Após isso coloca-se as bactérias em meio de cultura liquido

juntamente com os fagos, e induz o

(integração do DNA recombinante do fago no DNA da

bacteria) essa indução é feita com a temperatura a 37ºC

Depois essa cultura de meio liquido é plaqueado

cultura semissólido pois assim tem maior motilidade

Infecção ou tr

1. bactéria.

2. 3.

ser montado as partículas fagicas, e o

DNA recombinante é encapsulado.

4. célula hosp e a liberação dos fagos no

meio de cultura (semi

podem infect

Essa figura é oq ocorre no meio de

cultura semi


a célula é submetida a um campo elétrico que faz com que pequenos poros sejam

abertos temporariamente em sua membrana por onde o DNA pode ser inserido. A eletroporação é uma

se um choque elétrico na mistura,

vetor na bactéria. Ela é então


quando o vetor de clonagem tem características de vírus, a célula hospedeira pode ser

São utilizados fagos geneticamente modificados

Para que o DNA seja injetado na cel hospedeira ele precisa

estar dentro do fago. Um vírus precisa ser montado em volta

se as bactérias em meio de cultura liquido

, e induz o ciclo lisogênico

(integração do DNA recombinante do fago no DNA da

bacteria) essa indução é feita com a temperatura a 37ºC.

Depois essa cultura de meio liquido é plaqueado em meio de

pois assim tem maior motilidade.

Infecção ou transfecção

O fago injeta o DNA na

Esse DNA é replicado

Dentro da cel começa a

ser montado as partículas fagicas, e o

DNA recombinante é encapsulado.

Com isso ocorre a lise da

célula hosp e a liberação dos fagos no

meio de cultura (semi-solido) e eles

podem infectar outras bactérias.

Essa figura é oq ocorre no meio de

cultura semi- solido. O ciclo lítico (lise da


célula bacteriana) é induzido por temperatura a 42ºC.

Nessa figura podemos observar que após o crescimento das

bactérias + fagos vc tem um tapete de bactérias(A). Depois de

um certo tempo é possível observar mais halos na placa isso

mostra que esta ocorrendo o ciclo lítico (B). C e D mostra o

ciclo lítico com o passar do tempo.

O fago recombinante produzirá durante a cultura placas de lise

com o centro claro morfologicamente fácil de ser visualizada.

Após isso é possível recortar os halos com uma ponteira,

purifica-los e utilizar o DNA recombinante dos fagos.

Após a transformação, as bactérias são incubadas em condições adequadas para que se possam multiplicar e, a

seguir, plaqueadas em meio sólido, para que se possam isolar colônias. A identificação das colônias recombinantes é

feita utilizando as características conferidas pelos plasmídeos. Assim, se foi utilizado um plasmídeo que confere

resistência ao antibiótico A, podem isolar-se as colônias que foram transformadas simplesmente plaqueando-as num

meio de cultura com antibiótico A (as bactérias não transformadas não terão resistência ao antibiótico e morrerão).

Uma vez identificadas as bactérias que contêm o vetor recombinante de interesse de entre as várias colônias

plaqueadas, basta transferir a colônia para meio líquido para que se obtenham milhões de cópias da bactéria e,

consequentemente, do vetor recombinante desejado. Através da reação de extração de DNA chamada mini-prep.

Expressão de proteínas recombinantes em cels hospedeiras

Uso de uma célula para produção de uma proteína de outro organismo

Por que produzir proteínas recombinantes? Pesquisa em estrutura e prots, imunização, produção de AC, farmacos

(vacinas, hormônios, fatores de coagulação etc).

Justificativa da expressão de proteínas recombinantes

• Dificuldade de se purificar do tecido original

• Proteínas do tecido podem estar contaminadas

• Proteínas recombinantes podem ser engenheiradas (modificadas)

• Processo completamente controlado

• Especificidade

• Quantidade

A B


Como preparar um sistema recombinante

a. Isolar e preparar o DNA ou cDNA - Por clivagem com enzimas de restrição ou PCR, fazer a reação de

transformação ou transfecção

Escolher o sistema apropriado – escolher o vetor de

expressão (que contenha origem de replicação, promotor,

sitio polylinker, sitio de ligação do ribossomo, sitio de

poliadenilação - terminador, marcadores seletivos –

antibióticos e um gene reporter).

b. Escolher o sistema apropriado

Características avaliadas em cada sistema de expressão

Taxa de crescimento celular, Complexidade do meio de cultura, Custo do meio de cultura, Nível de expressão,

Capacidade de expressar extracelularmente, Capacidade de produzir as modificações pós-traducionais tais como:

dobramento correto, formação das pontes dissulfeto, glicosilação, fosforilação, acetilação.

Vantagens dos sistemas de expressão eucarióticos Desvantagens dos sistemas de expressão eucarióticos

Dobramento das proteínas mais semelhantes Níveis de expressão mais baixos

Adequado para proteínas ricas em cisteinas-pontes dissulfeto

Poucos vetores disponíveis

Pode produzir grandes quantidades de proteínas com o uso de equipamentos próprios (fermentadores)

Necessita de equipamentos adequados

Vantagens dos sistemas de expressão Bacterianos Desvantagens dos sistemas de expressão Bacterianos

Facilidade no crescimento e purificação Não há modificações pós-transducionais (glicosilação, ribosilação, acetilação)

Várias cepas e plasmídeos comerciais

Comparativamente barato

Sistemas de expressão bem conhecidos

Tecnologia relativamente simples

Escolha do sistema – hospedeiros

Bactérias Gram-negativas – E. coli

Bactérias Gram-positivas – Bacillus subtilis

Leveduras – Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris

Fungos filamentosos – Aspergillus e Trichoderma

Células de mamífero

Plantas e animais transgênicos

c. Transformar hospedeiro -Eletroporação, transformação, transfecção

d. Selecionar hospedeiro transformado


Tamanho do cDNA limitado

Não realiza secreção de proteínas

Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias.

Dobramento incorreto das proteínas

Bacillus subtilis

omyces cerevisiae, Pichia pastoris

Trichoderma

Eletroporação, transformação, transfecção etc.

Selecionar hospedeiro transformado

Seleção Antibióticos:

Cloranfenicol, Tetraciclina, Gentamicina,

Higromicina .


Não realiza secreção de proteínas

Algumas proteínas são tóxicas para as bactérias.

Dobramento incorreto das proteínas

Seleção Antibióticos: Ampicilina , Kanamicina,

Cloranfenicol, Tetraciclina, Gentamicina,

e. Checar se a proteína foi expressa

Através de géis de poliacrilamida vc verifica a produção da proteína

Se a proteína não for expressa – sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.

f. Purificar

Fazer um extrato proteico – solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura

negativa.

Selecionar o clone de expressão e crescer em meio liquido com IPTG (indutor) para produzir a proteína, fazer o

extrato proteico (proteínas totais) correr o gel em acrilamida.

Vetor de expressão possui um gene reporter (GST ou His His Histidina) que ajuda n

afinidade (gruda na resina-prot repórter).

GST

Vem antes da proteína recombinante, a resina tem

afinidade (AC GST ou glutationa), serve para proteínas

completas

pGEX – Glutationa S-Transferase - agarose

7X His his histidina

Fica depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel.

Uso de proteínas em fusão ou repórter:

Existência de um gene em região anterior ao inserto que servirá como “isca” na p

Existência, na região posterior ao inserto, de uma cauda de Poli

pQE, pET – tag de Histidinas - coluna de níquel

Purificação

- Passar as proteínas

- Lavar a coluna


Checar se a proteína foi expressa e se está solúvel

vc verifica a produção da proteína

sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.

solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura


extrato proteico (proteínas totais) correr o gel em acrilamida.

Vetor de expressão possui um gene reporter (GST ou His His Histidina) que ajuda na purificação por cromatografia de

prot repórter).

a proteína recombinante, a resina tem

afinidade (AC GST ou glutationa), serve para proteínas

agarose-glutationa

a depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel.

Existência de um gene em região anterior ao inserto que servirá como “isca” na purificação

Existência, na região posterior ao inserto, de uma cauda de Poli-histidina

coluna de níquel

Gel de poliacrilamida

Vc faz o extrato celular da clonagem, soma o tamanho da

tamanho da proteína (gene reporter + inserto)

Seu controle negativo será o extrato celular sem o vetor de

expressão para saber se sua proteína foi expressa.

Seu controle positivo será a proteína purificada (Inserto +

gene repórter)


sequenciar o inserto e alterar os níveis de indução de expressão.

solubilizar as proteínas (dissolvidas em solução aquosa) desnatura-las conferindo carga


a purificação por cromatografia de

a depois da proteina recombinante, não é uma proteína completa, a cauda de histidina tem afinidade pelo níquel.

urificação

Vc faz o extrato celular da clonagem, soma o tamanho da

inserto)

Seu controle negativo será o extrato celular sem o vetor de

expressão para saber se sua proteína foi expressa.

Seu controle positivo será a proteína purificada (Inserto +


- Eluir a proteína de interesse

- Digestao com a protease trombina que separa o gene reporter da proteína de interesse

- Passar na coluna novamente e eluir (proteína de interesse)

- Correr um gel para ver se deu certo

Construção de bibliotecas genômicas

È uma coleção de DNAs recombinantes

Para isso é necessário isolar as sequencias de interesse do gene + as regiões responsáveis pelo controle da sua

expressão.

Os fragmentos são clonados em uma única clonagem

Pode ser de 2 tipos:

� Biblioteca genômica

Total: é representativa de todo o conteúdo genético do tipo celular que se deseja estudar

Parcial: contém parte do conteúdo genético do tipo celular que se deseja estudar

Biblioteca de cDNA

Finalidade - O isolamento da porção do DNA genômico que contenha toda a unidade de transcrição, mais as regiões

flanqueadoras onde se localizam os elementos controladores da expressão desse gene.

Tamanho - O tamanho necessário de uma biblioteca genômica, para que um dado fragmento de interesse esteja

entre os fragmentos clonados, é determinado pelo tamanho do fragmento clonado e pelo tamanho do genoma.

passos necessários

� Isolamento e digestão do DNA – fragmentar a sequencia com enzimas de restrição ou

mecanicamente (fragmentos aleatorios)

� Utilização de vetores apropriados – grandes fragmentos (YAC’s, BAC’s, cosmideos e fagos)

� Ligação dos fragmentos no vetor – os diferentes fragmentos são clonados na mesma clonagem

(colocar uma boa quantidade do vetor e inserto). Calcula-se a probablilidade de cada fragmento

diferente ser ligado. Ex.: 10.000pb quebra-se em 10 partes, 5xn° de fragmentos -> 5x10= 50 clones

� Inserção na célula hospedeira – transformação ou transdução

Construção de biblioteca de cDNA


Vc pega o RNA total do organismo, seleciona o RNAm (que contem o oligo DT, para isso vc utiliza primers que tem

cauda de poli A, dessa maneira só ira selecionar os RNAm), a partir do RNAm faz um RT-PCR com a enzima

transcriptase reversa, obtendo assim cDNA (sem introns – informação certa para codificação de prots), a partir do

cDNA vc pode liga-lo no vetor de expressão apropriado.

Obs.: cada clone obtido ira expressar uma proteína diferente.

Vantagem vc so terá oq é codificante só éxons, sem introns.

Caracterização dos clones recombinantes de bibliotecas genômicas de DNA

Identificar os clones de cDNA (biblioteca genomica)

1° seleção ocorre durante a elaboração da clonagem (dupla seleção antibiótico e X-gal e IPTG).

2° seleção a. biblioteca expressão (proteína) selecionada reação Ag-AC (western blot)

b. biblioteca DNA somente – identificação com hibridização de DNA (sourthern blot)

a. biblioteca expressão – clones numa placa é feita a replica da placa com uma membrana de nitrocelulose

(marca a membrana com furos pra saber qual colônia foi), depois trata a membrana com solução de SDS

(detergente) para lisar as bactérias e as proteínas se aderirem a membrana, a partir disso fazer o imunoblot.

b. biblioteca DNA – Utiliza-se uma membrana de nylon fazendo uma replica da placa, lisar as bactérias na

membrana (para que o DNA grude),colocar uma solução desnaturante na membrana (DNA simples fita),

hibridizar com uma sonda (radioativa ou fluorescente), e revelar.

Sequenciamento do DNA

Método de Sanger - manual

O sequenciamento de DNA é um processo que determina a ordem dos nucleotídeos (blocos que constituem a

molécula de DNA) em uma amostra. Existem vários métodos disponíveis, e cada um apresenta vantagens e

desvantagens.

Um dos mais utilizado é o chamado “método didesoxi” conhecido também como de “terminadores de cadeia” ou de

“Sanger”; ele constitui a base da metodologia empregada no sequenciamento do genoma humano. Sua estratégia

consiste em identificar,continuamente e sequencialmente durante o processo, o último nucleotídeo incorporado na

extremidade de alongamento da cadeia. Os produtos da reação deverão também portar uma “marca” que permita

detecta-los na etapa de análise. Resumidamente, o processo é realizado a partir de uma cadeia simples (não dupla)

do DNA a ser sequenciado; esta servirá de molde para gerar a outra metade complementar da dupla hélice. Isto é

obtido pela desnaturação da “molécula nativa” (fig 1).

Disso depende o

modo de screening


FIG 1

A reação de síntese se processa em condições iônicas e de pH apropriadas, na presença da enzima DNA polimerase e

de uma mistura dos 4 nucleotídeos sob a forma de 3’-desoxinucleotídeo trifosfatos (dNTPs): dATP, dCTP, dGTP e

dTTP sendo um deles marcado radioativamente com ³²P ou ; um dos mais utilizado é o dATP ³²P (fig 2a). Como

a enzima utilizada catalisa somente o alongamento da cadeia nascente é necessário também, a presença na reação,

de um pequeno fragmento de DNA sintético (XXX) complementar a uma região conhecida (YYY) na extremidade 3’

do DNA molde; estas características permitirão sua hibridização no local mencionado, e fornecerão um ponto de

partida para a replicação do DNA. O fragmento XXX, denominado iniciador ou “primer", quando marcado, poderá ser

utilizado para rastrear o fragmento de DNA recém sintetizado no lugar do dNTP. Fato importante no processo é que

ele é executado em quatro reações separadas; cada uma delas, contendo adicionalmente pequena quantidade de

um (e apenas um) dos 4 tipos de cada dNTP sob a forma de análogo, 2’, 3’-didesoxinucleotídeo trifosfatos (ddNTPs)

(fig 2b).

FIG 2

Estes análogos conhecidos como “terminadores” quando incorporados à cadeia nascente, por não apresentarem

3’OH que permita formar ligação com o próximo dNTP a ser adicionado, bloqueará todo processo. Como todos os

nucleotídeos normais (dNTPs) estão presentes, o alongamento da cadeia prosseguirá até que a enzima DNA-

polimerase insira um análogo (ddNTP). Consequentemente, haverá parada imediata da reação de síntese no ponto

em que seu alongamento foi interrompido: na extremidade e, a molécula estará marcada com ³²P. Os fragmentos

assim obtidos, cada qual contendo um resíduo final

conhecido, pois se sabe em que tubo de reação o

análogo foi adicionado, são separados por tamanho

em gel de poliacrilamida individualmente: um canal

de análise para cada reação. O gel é “transferido”

para um suporte de nitrocelulose (filtro).

Após auto-radiografia a ordem dos nucleotídeos, na

cadeia de DNA recém sintetizada, pode ser visualizada

e obtida diretamente; esta é complementar à

da molécula sequenciada: que serviu de “molde”.

Levando estas observações em consideração, é

Fig. 3


possível conhecer a sequência de nucleotídeos do DNA sequenciado de 3’para 5’ partindo-se da parte inferior para a

superior do gel. O resultado e as etapas do processo descrito acima, frequentemente mostrado em fotografias nos

livros especializados, podem ser observados no esquema da Fig. 3.

Método automatizado

O método pode ser automatizado através de “maquinaria apropriada” gerenciada por computadores com “softs” que

lêm sequencialmente e identificam os produtos. Isto permitirá executar o processo em grande escala. Neste caso

utilizam-se simultaneamente os 4 didesoxinucleotídeos terminadores (ddNTPs) marcados por fluorescência fig 4a. Como

cada reação (A,T,G,C) utilizou um fluorocromo diferente os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes

realizada em um único canal do gel de sequenciamento fig 4b. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada

fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de

onda. A luz emitida é detectada por “escaneamento” do gel e a sequência deduzida por computador fig 4c. Variáveis

mais modernas, consequentemente mais rápidas e poderosas, incluem a robotização total do processo com a inclusão

das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA

FIG 4

Organismos geneticamente modificados X transgênicos

- Organismo geneticamente modificado - Todo o organismo cujo material genético foi manipulado de modo a

favorecer alguma característica desejada, Isolamento (melhoramento genético clássico) de características desejáveis

de espécies afins e também de espécies distintas.

- Organismo transgênico - Qualquer organismo que, por meio de engenharia genética, recebe e expressa genes

provenientes de outros organismos.

Organismo geneticamente modificado:

- Há registros, de 4 mil anos, da produção organismos geneticamente modificados, principalmente na cultura do

milho .

- Insulina –––– 1982 - Produzida por uma bactéria geneticamente modificada

Aplicação dos transgênicos

PESQUISA BÁSICA: estudo e regulação e função de sequências

· PESQUISAS BIOMÉDICAS: criação de modelos

· PESQUISAS DE DOENÇAS GENÉTICAS: animais com mutações

· INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos por

animais domésticos

Padrões de expressão dos transgenes: Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno

a tecidos específicos.

Riscos X Benefícios

• Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo.

• Elevar o valor nutricional dos alimentos

• Plantas resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30%

• Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas)

para fins farmacêuticos


PESQUISA BÁSICA: estudo e regulação e função de sequências genéticas específicas

PESQUISAS BIOMÉDICAS: criação de modelos “animais com doenças humanas”

PESQUISAS DE DOENÇAS GENÉTICAS: animais com mutações

INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos por

Padrão de integração e eficiência do processo:

A integração do DNA ao genoma da célula parece

ser aleatória

Apenas 10 a 30% dos ovos sobrevivem e, destes,

40% apresentam o DNA exógeno integrado

Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno

Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo.

Elevar o valor nutricional dos alimentos

resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30%

Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas)


INDÚSTRIAS BIOTECNOLÓGICAS: produção de proteínas, enzimas, hormônios e fatores de crescimentos por

Padrão de integração e eficiência do processo:

A integração do DNA ao genoma da célula parece

Apenas 10 a 30% dos ovos sobrevivem e, destes,

40% apresentam o DNA exógeno integrado

Geralmente corresponde ao padrão do gene endógeno, Pode ser direcionada

Provocar mutações genéticas ocasionando o funcionamento dos genes naturais do organismo.

resistentes a herbicidas, insetos e fungos que proporcionam uma maior produção de 15 a 30%

Vegetal capaz de produzir uma proteína animal até mesmo humana (hormônio, insulina, vacinas, enzimas)


ANEXO1

VETORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA GENÔMICA

Atualmente, os vetores mais utilizados na construção de bibliotecas genômicas são fagos λ e cosmídeos. Em ambos

os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por fragmentação aleatória, ligam-se ao DNA do vetor para poderem

ser empacotados em partículas de fago λ.

As bibliotecas construídas com vetores λ são armazenadas e propagadas na forma de fagos recombinantes. Estes

vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais. O fragmento ou braço esquerdo,

codifica as proteínas da cápsula, e o braço (fragmento) direito, tem a origem de replicação do fago e promotores de

outros genes essenciais. Entre o fragmento central e os dois braços estão os sítios de restrição usados na clonagem,

orientados inversamente – SalI, BamHI, EcoRI –. A extremidade de cada braço apresenta um segmento de cadeia

simples (cos). Estes segmentos são complementares entre si, permitindo assim a recircularização da molécula e

consequente replicação do fago dentro da célula hospedeira.

▲ Figura D6: Estrutura do vector λ

EMBL3. S=SalI; B=BamHI; E=EcoRI.

Este tipo de vetor é chamado vetor de substituição porque, no processo de clonagem, a parte central do DNA

do fago é substituída pelo fragmento de DNA a ser clonado, originando deste modo a molécula recombinante. Os

fragmentos clonados são ligados aos braços do fago, previamente preparados com BamHI, sendo esta mistura

empacotada in vitro em partículas víricas. Para se selecionar apenas os fagos recombinantes, estes são infectados

numa bactéria lisogênica. A suspensão de fagos resultante pode ser armazenada durante vários anos num frigorífico,

com algumas gotas de clorofórmio para prevenir o crescimento bacteriano, embora a concentração do número de

partículas infecciosas vá baixando gradualmente. A biblioteca também pode ser armazenada por congelamento da

mistura de ligação (fragmento de DNA/vetor).

Na clonagem em cosmídeos, as partículas virais servem apenas como veículos para introduzir o DNA recombinante

dentro da bactéria e uma vez dentro dela o cosmídeo comporta-se como um plasmídeo grande.

Os cosmídeos podem aceitar inserções de cerca de 45 kb, quase 2 vezes o tamanho das inserções clonáveis

num fago λ. Assim, quando um cosmídeo é utilizado como vector, apenas são necessários 350.000 recombinantes


para se atingir 99% de probabilidade de uma sequência de cópia única estar presente numa biblioteca genómica de

mamífero.

No entanto, as bibliotecas de cosmídeos são mais difíceis de construir e de manter que as bibliotecas de fagos.

Assim, os cosmídeos são utilizados quando o gene de interesse é muito grande ou quando se deseja uma região

extensa de DNA; o uso de vectores λ é mais recomendado no isolamento rotineiro de segmentos de genes ou em

circunstâncias em que a biblioteca vai ser utilizada muitas vezes.

O método utilizado para isolamento de clones genômicos específicos tem sido frequentemente o de rastreio

por hibridização com uma sonda, normalmente uma sonda de cDNA. A amplificação direta de fragmentos de DNA

por PCR é agora igualmente comum.

VECTORES UTILIZADOS NA CONSTRUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE cDNA

Após ter sido obtido o cDNA, é necessário prepará-lo para ser inserido num vetor de clonagem, processo que

depende do vetor escolhido: plasmídeo ou fago.

• O fago é mais utilizado devido à sua elevada eficiência: comparativamente com os plasmídeos, requer cerca

de 16 vezes menos cDNA por μg do vector para produzir um número equivalente de clones recombinantes;

• As bibliotecas de fagos são mais fáceis de manipular que as bibliotecas de plasmídeos;

• No entanto, os fagos não são favoráveis para procedimentos de sequenciamento de DNA e de mutagénese

dirigida.

Para ultrapassar esta limitação idealizaram-se os fagemídeos que são plasmídeos contendo porções do genoma

do fago, reunindo assim as vantagens dos dois vetores.

Para efetuar a ligação entre o vetor e o cDNA são necessários alguns procedimentos preparatórios, como por

exemplo polir as extremidades das moléculas de cDNA de cadeia dupla com a enzima Klenow, de maneira a ficarem

blunt e ligadas a locais blunt de vetores de clonagem.

No entanto, este processo não se revela muito eficiente, existindo outros que transformam as extremidades do

cDNA em extremidades coesivas, compatíveis com a ligação ao local de clonagem de um vetor. Estes processos

consistem na adição de adaptadores, sendo o seguinte método um exemplo destes:

1- Metilação dos sítios de EcoRI com o tratamento do cDNA com EcoRI, na presença de S-adenosil metionina. É

essencial para proteger os sítios de EcoRI que possam existir no cDNA, contra a digestão da EcoRI, que se vai realizar

uns passos à frente;

2- Adição de adaptadores, com o sítio EcoRI, nas duas extremidades do cDNA. Estes adaptadores são pequenos

oligo-nucleotídeos que têm uma extremidade em cadeia dupla, ligando-se às extremidades do cDNA, e têm outra

extremidade coesiva, igual à produzida por uma enzima de restrição, permitindo a ligação a um vector preparado

com a mesma enzima de restrição. Esta adição de adaptadores resulta na obtenção de moléculas de cDNA com

adaptadores múltiplos ligados nas duas pontas;

3- Apenas é produzido um sítio de EcoRI em cada ponta do cDNA pela digestão com EcoRI, libertando o excesso de

adaptadores ligados na molécula. Não ocorre digestão interna do cDNA devido à metilação previamente efetuada;

4- Através da filtração em colunas de Sephadex, o cDNA é separado do excesso de adaptadores, antes de ser

inserido no vetor;


5- A T4 ligase permite a ligação das moléculas de cDNA ao vetor;

6- O produto da ligação junta-se com as proteínas que formam o capsídeo do fago;

7- Os fagos assim produzidos vão infectar bactérias de uma linhagem que favoreça o crescimento dos

recombinantes;

8- A biblioteca é obtida após infecção da bactéria com os cDNA recombinantes, devendo conter cópias de todas as

sequências de mRNA da população original.

9- Pode depois ser congelada ou ser submetida a um processo de isolamento do clone de um determinado gene de

interesse.

Considerando que as moléculas de cDNA representam o mRNA total de um organismo ou tecido específico -

expressão genética – estas bibliotecas são muito úteis para obter genes diferencialmente expressos. Para isso,

procede-se ao isolamento de genes expressos apenas em determinados tecidos, ou de genes expressos em estádios

específicos de desenvolvimento ou em determinadas condições ambientais. Pode-se assim construir bibliotecas

através de hibridização subtrativa. Estas bibliotecas são enriquecidas em genes expressos diferentemente em

determinadas condições selecionadas:

Obtêm-se preparações de duas populações de mRNA (ligeiramente)diferentes como por exemplo, células do

mesmo tipo mas cultivadas a temperaturas diferentes;

A primeira cadeia de cDNA de uma das populações de mRNA é preparada e depois hibridada com um

excesso da outra população de mRNA;

Ocorre a formação de híbridos entre o cDNA e mRNA complementares, respeitantes a genes das duas

populações;

A cromatografia em colunas de materiais que ligam especificamente moléculas de cadeia dupla, permitirá a

remoção dos híbridos;

O cDNA específico da primeira população permanece em cadeia simples e não se liga à coluna;

Depois é utilizado para a preparação de uma biblioteca de cDNA enriquecida em determinados genes

específicos ou marcado radioativamente para ser utilizado diretamente como sonda, para se proceder ao

rastreio de uma biblioteca de genes.

BIBLIOTECA GENÔMICA

Uma biblioteca genômica deve conter várias cópias/clones representativos de cada fragmento de DNA para

aumentar a probabilidade de se conseguir isolar genes de cópia única, ou seja, a maior parte dos genes codificantes

de proteínas. A utilização de uma biblioteca é o modo mais eficiente para se conseguir isolar uma determinada

porção de DNA. A separação da porção do DNA genômico que contem toda a unidade de transcrição com as regiões

limitadoras onde estão localizados os elementos controladores da expressão desse gene, permite-nos obter

informações acerca da estrutura molecular de um determinado gene de eucariotas. O ponto ao qual se dá mais

relevo na construção de uma biblioteca genômica é a obtenção aleatória de um elevado número de clones contendo


fragmentos do genoma. Para garantir que um dado fragmento de interesse esteja entre os fragmentos clonados, é

necessário estimar o tamanho necessário da biblioteca através do tamanho do fragmento clonado e do tamanho do

genoma. Para isso utiliza-se a seguinte fórmula, com base na distribuição de Poisson:

N=log (l-P) /log (l-l/n),

em que P é a probabilidade de se encontrar um fragmento único e n representa a razão entre o tamanho do genoma

do organismo e o tamanho da inserção de DNA clonado. N (número de clones independentes que precisam de ser

separados para se isolar uma sequência específica) é diretamente proporcional à probabilidade e ao tamanho do

genoma, em pares de bases (G) e inversamente proporcional ao tamanho médio dos clones, em pares de bases (I).

Considera-se aceitável uma probabilidade acima de 95%. O seguinte exemplo ilustra a situação referida: partindo de

uma biblioteca cujas inserções de DNA são de 20 kb, para isolar um gene humano de cópia única, torna-se

necessário fazer o rastreio de cerca de um milhão de clones recombinantes (o tamanho total do genoma humano é

aproximadamente 3x109. Deste modo, para termos 99% de probabilidade de isolar uma dada sequência presente

numa única cópia de um gene de mamífero, temos que analisar cerca de 690.000 clones de uma biblioteca que usa

como vector o fago λ:

N= ln (1-0.99) /ln [1- (2x104/3x109)] = 690.000

Assim, na construção destas bibliotecas o objectivo básico é procurar reduzir o número de clones necessários,

aumentando o máximo possível o tamanho dos fragmentos de DNA clonados, e, utilizando vectores de clonagem

baseados no fago λ, maximizar a eficiência da clonagem.

A construção de uma biblioteca genômica envolve basicamente os seguintes passos:

1º isolamento de DNA de alto peso molecular, que posteriormente é quebrado de modo a produzir fragmentos de

tamanho compatível com o vetor.

▲ Figura B1: Bibliotecas

genómicas. Biblioteca de plasmídeos

(a) e biblioteca de fagos (b) .

2º ligação desses fragmentos

ao vector e introdução dos

recombinantes obtidos nas células

hospedeiras.

PREPARAÇÃO DO DNA A SER INSERIDO

Para que não haja exclusão sistemática de nenhuma sequência, a representatividade de uma biblioteca genômica

está muito dependente da aleatoriedade com que os fragmentos a serem clonados são gerados. O método que

permite obter completa aleatoriedade na fragmentação do DNA é o fracionamento mecânico. No entanto, este não

é muito utilizado pois implica uma complicada manipulação para que os fragmentos assim obtidos possam ser

inseridos no vetor. Aplicando os cuidados necessários, é possível ultrapassar este obstáculo através de digestões

parciais de DNA usando enzimas de restrição. Este processo apresenta uma vantagem pois permite obter


fragmentos com pontas coesivas, o que facilita a inserção direta do vetor. Para ter a garantia que esta digestão

atinge todo o genoma, são utilizadas enzimas de restrição que cortam frequentemente o DNA, não apresentando

desvios de preferência de sítios. Com este fim, a enzima Sau3A I é utilizada frequentemente pois reconhece o sítio

de 4 bases GATC, gerando fragmentos compatíveis com sítios de clonagem de

vários fagos e cosmídeos(estatisticamente, uma sequência de 4 nucleotídeos aparece, em média, cada 256 pares de

bases). Há secções de DNA que possuem as sequências de conhecimento muito espaçadas, especialmente as de

enzimas que cortam menos frequentemente, o que leva a uma maior probabilidade de gerar fragmentos de certas

zonas de DNA, muito grandes para serem clonados e os genes aí existentes não estariam representados na biblioteca

genômica. O corte parcial do DNA é feito em condições (relação enzima/DNA baixa ou tempo de digestão limitado)

que maximizem a obtenção de fragmentos com um tamanho de cerca de 20 kb, um tamanho razoável para substituir

o fragmento central do fago. Como resultado deste corte parcial são gerados fragmentos de DNA parcialmente

sobrepostos. Estes precisam de ser tratados para evitar que fragmentos pequenos se liguem entre si, produzindo

falsos recombinantes e clones artificiais que não correspondem à verdadeira estrutura genômica. Para impedir essas

ligações pode-se tratar o DNA com fosfatase, ou efetuar um fracionamento. Este último evita também que,

fragmentos muito grandes que não permitem o crescimento do fago, se liguem aos braços deste, o que alteraria as

relações entre as quantidades de DNA inserido e vetor. Um método que é frequentemente utilizado é o

fracionamento por centrifugação em gradiente de sacarose, no qual a solução de DNA anteriormente digerida, é

aquecida para que ocorra a dissociação de possíveis fragmentos agregados. Depois é aplicada sobre um gradiente de

sacarose de alta salinidade. Este gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristáltica. A

porção mais densa do gradiente que contem o DNA de maior molecular, é aspirada primeiro. Após a centrifugação,

as fracções desse gradiente são coletadas e analisadas por eletroforese num gel de agarose e as frações contendo os

fragmentos de DNA de tamanho apropriado são utilizadas para a ligação com o vetor.

▲ Figura B2: Método para fracionamento do DNA por centrifugação em gradiente de sacarose.

O gradiente é aspirado, de baixo para cima, com ajuda de uma bomba peristáltica. A porção mais densa do

gradiente contendo o DNA de maior peso molecular, é aspirada primeiro.

Garante-se assim, com todo este processo, a aleatoriedade dos fragmentos clonados, pelo que a probabilidade de

uma dada sequência estar presente numa biblioteca genômica pode ser estudada estatisticamente - pelo método

que foi acima referenciado.

APLICAÇÕES

A elaboração de bibliotecas de genes de diferentes organismos/tecidos permitiu grandes avanços na análise da

estrutura e expressão de genes eucarióticos bem como uma revolução tecnológica na indústria farmacêutica e de

alimentos e à produção em massa de polipeptídeos importantes na área de pesquisa e na área aplicada.


Os clones são usados para produzir produtos, para estudo ou mesmo visando a alteração fenotípica de um dado

organismo.

Na área da terapia médica uma importante aplicação consistiu na transformação de bactérias E.

coli com plasmídeos que lhe conferem a capacidade de segregar os dois polipeptídeos usados para obter insulina

humana; analogamente, podem inserir-se em vírus animais clones de determinados genes responsáveis pela

produção de proteínas membranares patogénicas – quando o vírus é utilizado como vacina, o hospedeiro

desenvolve imunidade para o agente patogénico.

▲ Figura E1: Transformação de E. coli com plasmídeos recombinantes dotados de sequência que codifica para o

gene da insulina. O plasmídeo é cortado com enzimas de restrição e misturado com uma amostra contendo

fragmentos de restrição (que contêm o gene que codifica para a insulina) produzidos por clivagem de DNA com a

mesma enzima de restrição. Formação de plasmídeos recombinantes, com auxílio de uma DNA ligase.

Transformação bacteriana e produção de insulina pelas bactérias.

Surgem ainda diversas aplicações científico-médicas, nomeadamente com o aumento da compreensão sobre o

DNA, genetic fingerprinting e terapia génica; sequenciação de nucleotídeos com o auxílio de máquinas (com

expoente máximo no Projecto Genoma Humano); descoberta de mutações responsáveis por doenças hereditárias

em humanos, através de screening, recurso à terapia génica para curar doenças genéticas, substituindo o gene com

defeito (ou ausente); por recurso a Southern blotting, aproveitamento do DNA fingerprinting para comparar DNA

recolhido em cenas de crime com as do(s) suspeito(s); uso de sondas de DNA para efectuar diagnósticos e identificar

os agentes patogénicos no sangue ou alimentos.

Algumas aplicações agrícolas consistem na recolha das células de plantas com características desejáveis e posterior

clonagem; engenharia genética de plantas para aumentar qualidade e quantidade de produção: por

exemplo, Rhizobium foi trabalhado de forma a obter uma fixação de nitrogénio melhorada; Pseudomonasfoi


trabalhada para produzir Bacillus thuringiensis, um insecticida natural. Resumindo, todo um desenvolvimento no

sentido da obtenção de plantas resistentes aos stresses bióticos e abióticos (vírus, herbicidas, seca, pestes,

nemátodes).

No domínio da pecuária, a E. coli foi utilizada para produzir hormonas de crescimento bovino.

As bibliotecas de genes permitiram ainda o o aparecimento de uma nova estratégia de investigação, chamada

genética reversa (reverse genetics). De facto, é actualmente possível começar no "gene" e alcançar a "proteína" e

vice-versa, através da obtenção de clones e determinação das sequências dos genes que estes apresentam. Estas

sequências de DNA permitem deduzir as sequências das respectivas proteínas. Estas, por sua vez, podem ser

comparadas com as sequências de outras proteínas para inferir a sua função, ou podem ser expressas em

quantidades que permitam a sua caracterização experimental.

A genética reversa começa com um gene ou uma proteína, às vezes hipotéticos, cuja função pode ser

completamente desconhecida. De facto, a sequenciação completa de genomas tem revelado muitos genes que não

têm semelhança com qualquer outro gene conhecido. Por outro lado, uma proteína pode ter sido isolada em função

de uma actividade ou por pertencer a uma qualquer estrutura celular. Com base na sequência da proteína, mesmo

que parcial, é possível desenhar e sintetizar oligonucleotídeos correspondentes à sequência do gene. Estes

oligonucleotídeos podem ser utilizados como sondas para isolar o gene. Finalmente, para além de outras

caracterizações como a sequenciação de DNA, o gene pode ser alterado para induzir mutantes e caracterizar o seu

efeito fenotípico.

Fonte: http://users.med.up.pt/med05009/bcm/bibliogenom.htm

resumo biomol diagnostica 2

Health & Medicine

dna enzimas

dna inserto

dna recombinante

vetorinserto dna vetor

o mtodo

dna dupla fita refazendo

o vetor deve

utilizar o pcr