rootreader2d v4 users guide

74
RootReader2D Users Guide For RootReader2D Version 4.3.2

Upload: others

Post on 15-Feb-2022

7 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: RootReader2D v4 Users Guide

RootReader2D Users Guide For RootReader2D Version 4.3.2

Page 2: RootReader2D v4 Users Guide

Contents 

4

5

6

6

8

15

18

26

I. About RootReader2D

II. System Requirements

III. Using RootReader2D

i. Obtaining and use ofRootReader2D

ii. Menus and Icons

iii. Processing an Image

a. Open an image file

b. Region of Interest

c. Thresholding

d. Modifying Threshold Points

e. Skeletonization

f. Building segments

g. Selecting Roots

h. Modifying Selected Roots

i. Measuring

iv. Setting Parameters

a. Set Pencil/Eraser Size

b. Set Threshold

c. Set Dust Removal Filter

d. Set Filling Filter

e. Set Scale

f. Set Error Criterion

v. Options

a. Image Processing

Page 3: RootReader2D v4 Users Guide

b. Root Selecting

c. Measuring

d. Saving

vi. View Functions 21

a. Zoom In/Zoom Out

b. Navigating an Image

c. View Thresholded Points

d. View Skeleton Points

e. View Vertex Points

f. View Selected Roots

vii. Batch Capabilities 32 

a. Batch Processing

b. Batch Printing Measurements to Log

c. Batch Adding File Info

viii. Logs and Information Window 37

a. Processing Log

b. Measurement Log

c. Image Information Window

ix. Saving 40

a. Saving the Image Processing Information

b. Saving the Measurement Log

c. Saving the Processing Log

x. Example I – Maize Primary, Basal, and Lateral 41 

Root Length Measurement 

xi. Example II – Sorghum Primary Root Length 55 

Measurement and Lateral Root 

Count off of Primary Root 

xii. Example III – Arabidopsis Primary Root Length 66 

Measurements 

Page 4: RootReader2D v4 Users Guide

xiii. Example IV – Rice Total Root System Length 67 

Measurement 

IV. Appendix 68

i. Lighting and Camera Arrangements 68

a. Polarized Light Setup

b. Unfiltered Light Setup

c. Oblique Light Setup

Page 5: RootReader2D v4 Users Guide

I. About RootReader2D

RootReader2D  V4.3.0 is a program designed to assist with root length 

measurement from digital images, specifically focusing on high‐throughput 

analysis of total root system length and selected root types of interest (eg. 

primary root length).  It incorporates several pre‐processing, processing and analysis features into a single intuitive and easy to use interface. 

RootReader2D has been expanded to perform lateral root counts from 

selected roots. It has been adapted to work roots systems that are grown in 

gellan gum, sand, agarose plate, or Hydroponics.

Current Version and Release Information: 

RootReader2D  

Current Version:  4.3.2

Last Update:  July 18, 2011 

Authors:  Dr. Randy Clark, Dr. Dave Schneider, Dr. Tyler Davis

PI:  Dr. Miguel Pineros 

Location:  Robert Holley Center, USDA‐ARS, Ithaca, NY, USA 

Email:  [email protected]

Website:  http://www.plantmineralnutrition.net/software/

rootreader2d/downloads/index.html

 Google Group:  http://groups.google.com/group/rootreader2d 

Page 6: RootReader2D v4 Users Guide

System Requirements 

RootReader2D requires that your computer system has Java version 6.0* (also called Java version 1.6) or higher.  To check which version of java your system is 

running go to:  

http://www.java.com/en/download/installed.jsp 

RootReader2D works optimally if your system has at least 2.0 GB of RAM.

RootReader2D also requires that your mouse (or touchpad) have both left click 

and right click buttons and a center mouse wheel.  Keyboard commands may be 

used in place of the center mouse wheel, but left and right click buttons are 

necessary.  For Macs with only one button mice configurations, right clicking can 

be achieved by holding the control key down and clicking. 

*Make sure that your JAVA security settings are set to a level less than thehighest level to ensure that your system will download and run theRootReader2d.jar file. Security Settings can be accessed through the JAVA controlpanel under the security tab.

Page 7: RootReader2D v4 Users Guide

II. Using RootReader2D

i. Obtaining and Using RootReader2D

RootReader2D can be downloaded directly: http://www.plantmineralnutrition.net/software/rootreader2d/downloads/index.html

The new stand-alone version of RootReader2D (version 4.3) no longer requires Java Web Start (JAWS) or access to our website. The previous functions of RootReader2D have remained the same. Users with older versions of RootReader2D will need to download this new version.

Installation help can be found here: http://www.plantmineralnutrition.net/software/rootreader2d/setup/ index.html

Page 8: RootReader2D v4 Users Guide

Page 9: RootReader2D v4 Users Guide

ii. Menus and Icons

File Menu: 

Open ‐ Open an image file (and .RR2Dat data if available) 

Save ‐ Save an .RR2Dat data file and a thresholded image if selected in Options menu 

Previous Image ‐ Close the current image and open the previous image in the current folder 

Reset ‐ Reset current image (removes all processing information that has not been saved) 

Next Image ‐ Close the current image and open the next image in the current folder 

Batch Process ‐ Batch process a folder of images 

Batch Print ‐ Batch print processing parameters and measurements from a folder of 

processed images with .RR2Dat files to the Measuring Log 

Batch Add Plant Info ‐ Batch add plant information (genotype, treatment and comments) to a 

folder of images  

View Menu: 

Page 10: RootReader2D v4 Users Guide

Show Processing Log checkbox ‐ Show/Hide Processing Log window 

Show Image Information Window checkbox ‐ Show/Hide Image Information window 

Show Measuring Log checkbox ‐ Show/Hide Measuring Log window 

Show Threshold Points checkbox ‐ Show/Hide threshold points on image 

Show Skeleton Points checkbox ‐ Show/Hide skeleton points on image 

Show Vertex Points checkbox ‐ Show/Hide vertex points on image 

Show Selected Roots checkbox ‐ Show/Hide selected roots on image 

Filters Menu: 

Threshold ‐ Threshold the image using set threshold parameters 

Skeletonize ‐ Skeletonize the threshold points 

Build Segments ‐ Build the segments from the skeleton points using set parameters 

Modify Menu: 

Set Region of Interest ‐ Set a region of interest to process 

Modify Roots ‐ Modify selected roots 

Next Root ‐ Switch to next selected root to modify 

Page 11: RootReader2D v4 Users Guide

10 

Erase Root ‐ Erase the current root from selected roots 

Measurement Menu: 

Set Threshold ‐ Set threshold parameters 

Set Dust Removal Filter ‐ Set dust removal filter parameters 

Set Filling Filter – Set filling filter parameters 

Set Scale ‐ Set the scale of the image 

Set Error Criterion ‐ Set error criterion used during segment length estimation 

Set Calibration Parameters ‐ Set parameters for checking calibration grid lengths 

Check Calibration Grid Lengths ‐ Measure the average grid length in selected region of a 

calibration grid image 

Measure ‐ Measure the root system 

Options Menu: 

Page 12: RootReader2D v4 Users Guide

11  

Image Processing Sub‐Menu: 

 

Dark roots on a bright background or 

Bright roots on a dark background radiobuttons ‐ Specified lighting conditions of the root image 

Fixed, Adaptive Min/Max, Double 

Adaptive, or Double Adaptive Blur Thresholding radiobuttons ‐ Specified root thresholding technique 

Use Dust Removal Filter checkbox ‐ Run a dust removal filter after thresholding the image 

Use Filling Filter checkbox ‐ Run a gap filling filter after thresholding and/or dust removal 

Reduce Unnecessary Endpoints checkbox ‐ Remove unnecessary endpoints before segment 

generation (typically will speed the program and 

reduce storage requirements when saving RR2Dat 

data files) 

Find Shortest Paths checkbox ‐ Find the shortest paths between all connected vertices (will 

slow the program and increase the storage requirements 

when saving RR2Dat data files, but will allow specific roots to 

be selected) 

 

 

 

 

 

Page 13: RootReader2D v4 Users Guide

12  

Root Selecting Sub‐Menu: 

 

Selected roots share a common endpoint radiobutton ‐ All selected roots will start from the 

same point/vertex 

Selected roots have independent endpoints radiobutton ‐ All selected will start from 

independent points/vertices 

Automatic prediction of furthest endpoint checkbox ‐ Automatically predict furthest end 

endpoint from the selected start points 

 

 

Measuring Sub‐Menu: 

 

Count number of laterals off selected roots checkbox ‐ The number of lateral roots that 

propagate from the selected roots will 

be counted 

Count number of laterals off selected roots checkbox – Total length of roots that are 

connected to a selected root, including 

the selected root 

 

 

 

Page 14: RootReader2D v4 Users Guide

13  

Saving Sub‐Menu: 

 

Save xml data file checkbox ‐ Save RR2Dat data file with processing and length information 

when saving 

Save thresholded image checkbox ‐ Save png image file of thresholded root system points 

when saving 

 

Batch Processing Sub‐Menu: 

 

Process all subfolders ‐ When batch processing RootReader2D will process all image  

subfolders of the selected folder  

 

Help Menu: 

 

RootReader2D Help ‐ Get help with using RootReader2D 

About RootReader2D ‐ Get information about RootReader2D 

 

 

Page 15: RootReader2D v4 Users Guide

14  

Toolbar Icons: 

 

 

 

  Open Image 

  Save 

  Previous Image 

  Reset Image 

  Next Image 

  Threshold 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Skeletonize 

  Build Segments 

  Modify Selected Roots 

  Next Selected Root 

  Erase Selected Root 

 Modify Threshold Points 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

  Region of Interest 

  Measure 

  Batch Process 

  Batch Print 

Page 16: RootReader2D v4 Users Guide

13  

iii. Processing an Image 

 a. Opening an Image File: 

 

To open an image file, go to the “File” menu and click “Open” or click the 

 icon.  In the Open navigation window that appears, navigate to and 

select the desired image file, then click the “Open” button at the bottom of 

the selection window.  If there is an associated RR2Dat data file in the same 

folder as the selected image file, it will be interpreted and opened as well.  

(Notes:  RootReader2D can open images of the following format ‐ tif, tiff, jpg, jpeg, gif, and 

png; RootReader2D works with both grayscale and RGB color image files, but operates 

faster using grayscale.  If color information is not needed, convert your images to 

grayscale before using RootReader2D to process and analyze them.) 

 

b. Region of Interest 

To specify a region of interest (ROI), click the   icon.  Then left click and 

drag a rectangle around the region of the image you would like to select for 

processing.  A blue border will be drawn around the region that will be 

processed.  All areas outside the border will not be included when 

processing.  To reset the specified area (reset to ROI to be whole image), click 

twice on the   icon.  (Note: a ROI can only be selected before thresholding or 

skeletonization of the image.) 

  

c. Thresholding  

To threshold the image file, go to the “Filters” menu and click “Threshold” 

or click the   icon.  Thresholding is used to separate the roots from the 

background in the image.  After thresholding, cyan points will be overlaid 

Page 17: RootReader2D v4 Users Guide

14  

on the root in the image.  See pages 18‐22 for details on selecting 

thresholding options. 

 

d. Modifying Threshold Points 

 

Occasionally the user will need to add or remove points from the threshold 

root points that were determined during thresholding (for instance, to fill in 

a broken section of the root).  To do so the user must modify the threshold 

points.  To begin modifying the threshold points, go to the “Modify” menu 

and click “Modify Threshold Points” or click the   icon.  The threshold 

root points will appear in bright cyan on the image.  To add points, left click 

and drag on the image.  Points that were added to the threshold root 

points will appear in bright cyan on the image.  To remove points, hold the 

shift key down and left click and drag on the image.  Points that were 

removed will no longer appear in bright cyan on the image.  To exit the 

modify threshold points, and finalize any changes go to the “Modify” menu 

and click “Modify Threshold Points” or click the   icon.  For details on 

how to set the pencil/eraser size when modifying the threshold points, see 

page 18.  (Note: Modify Threshold Point mode can be entered anytime after 

thresholding, but all previous skeletonization, segment building, and root selecting data 

will be lost) 

  

e. Skeletonization  

To skeletonize the thresholded root system, go to the “Filters” menu and 

click “Skeletonize” or click the   icon.  Skeletonization is a pixel erosion 

technique that simplifies the thresholded roots points into series of one pixel 

wide lines.  After skeletonization the skeleton lines will appear in red on the 

image. 

  

 

Page 18: RootReader2D v4 Users Guide

15  

f. Building Segments 

 

To build the segments from the skeleton, go to the “Filters” menu and click 

“Build Segments” or click the   icon.  This process breaks the skeleton into 

segments, calculates the length of those segments and determines the 

shortest path from all segment endpoints to all other connected segment 

endpoints* (*if the option is selected).  After building these segments, the 

segment endpoints will appear as green circles on the image.  In order to 

accurately estimate the length of each segment, the image scale and an error 

criterion parameter must be set before the segments are built.  See page 24 

for details on how to set the image scale and error criterion. 

     

g. Selecting Roots  

Selecting roots allows one to measure specific roots of interest (for example 

the primary or seminal roots).  To define a root at least two endpoints are 

needed, one for the start and one for the end of the root.  If the option is 

selected, RootReader2D will automatically predict the end of the root after 

each start point is provided.  To provide a start point, after building the root 

segments, hold the left click near the desired starting point of the root (for 

example the seed).  A yellow circle will appear on the image at the start 

endpoint.  If RootReader2D has not been set to automatically predict the end 

endpoint, hold the left click near the desired ending point of the root.  A blue 

circle will appear on the image at the end endpoint.  If desired RootReader2D 

can be set to use a common start endpoint for all selected roots or 

independent start endpoints for all selected roots.  For details on how to set 

root selecting options, see page 27‐28. 

  

 

 

 

 

Page 19: RootReader2D v4 Users Guide

16  

h. Modifying Selected Roots 

 

On occasion RootReader2D fails to determine the correct path along the 

desired root from the start to the end endpoint.  To correct this, the 

generated path must be modified by adding intermediary endpoints along 

the path.  To begin modifying the selected roots, go to the “Modify” menu 

and click “Modify Roots” or click the   icon.  The selected root that is to be 

modified appears blue in the image, with endpoints being represented as 

yellow, blue and orange numbers.  To activate another root, go to the 

“Modify” menu and click “Next Root” or click the   icon.  To erase the 

activated root, go to the “Modify” menu and click “Erase Root” or click the 

 icon.  To modify the path of the activated root, hold the shift key and 

select a segment endpoint along the path by left clicking and holding on the 

desired endpoint to modify.  Prior to selecting, the points able to be modified 

will appear encircled by a cyan ring as the mouse is moved and the shift key 

is pressed down.  When an endpoint is selected the ring will first turn white 

then pink and then the new intermediary endpoint will be added labeled 

with a new orange number.  (Note: Do not release the clicked left mouse button until you 

have moved the new intermediary endpoint to the desired position in the skeleton.)  To move 

the new endpoint, continue to the hold down the shift key and left mouse 

button, and drag the endpoint to the new position the in the skeleton.  The 

selected path will automatically be adjusted and displayed in real‐time as you 

move the new endpoint.  The new path will appear in blue on the image.  

Once all the selected roots have been correctly modified, the modify mode 

must be exited before any other operations can be performed.  To exit the 

modify mode, go to the “Modify” menu and click “Modify Roots” or click the 

 icon. 

   

 

 

Page 20: RootReader2D v4 Users Guide

17  

i. Measuring 

 

To measure the total root system and all selected roots, go to the 

“Measurement” menu and click “Measure” or click the   icon. 

 

 

Root traits that are currently measured: 

 

Longest Root Length – length of the longest selected root, (cm) 

 

Total of Selected Root Lengths – total length of all the selected roots, (cm) 

 

Total Root System Length – total length of the whole root system, (cm) (Note: this is also 

the total length of skeleton in the image) 

 

Individual Root Lengths – individual lengths of each selected root, (cm) 

 

Total Lateral Root Count – total number of lateral root that emerge from the all selected 

roots 

 

Individual Root Lateral Root Count – number of lateral roots that emerge from individual 

selected roots 

 

Connected Root Length – total length of roots that are connected to a selected root, 

 including the selected root, (cm) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 21: RootReader2D v4 Users Guide

18  

iv. Setting Parameters  

a. Set Pencil/Eraser Size 

 

To set the pencil/eraser size, go to the “Modify” menu and click “Set 

Pencil/Eraser Size”.  The Set Pencil/Eraser Size window will appear. 

 

  

The pencil/eraser size is used when modifying the threshold points.  The 

size that is entered will be half the size of the box drawn when the user 

drags the cursor on the image to add and/or remove threshold points. (Note: The maximum size that can be entered is 25.  If the size is set higher than 25, the pencil/eraser 

half size will be set by default to 25.)  

 

 

b. Set Threshold  

Before setting the threshold parameters, first go to the “Options” menu and 

indicate the lighting type and desired thresholding technique.  The two 

available lighting types are:  1) Dark roots on a bright background; 2) Bright 

roots on a dark background.  (Note: if the “Dark roots on a bright background” radiobutton is selected the pixel intensities will automatically be inverted before thresholding.)  

The four available thresholding techniques are: 1) Fixed thresholding; 2) 

Adaptive Min/Max thresholding; 3) Double adaptive thresholding; 4) Double 

adaptive blur thresholding.  After specifying the lighting type and threshold 

technique go to the “Measurement” menu and click “Set Threshold”.  A Set 

Threshold window corresponding to the selected thresholding technique will 

appear. 

 

Page 22: RootReader2D v4 Users Guide

19  

The thresholding techniques and the required parameters are briefly 

described in the following section: 

 

 

1) Fixed Thresholding  

  

This technique should be used when the background lighting is uniform 

and the intensity of all the roots in the image does not vary.   For this 

technique a fixed thresholding level between 0 and 255 is entered via the 

slider.  For dark root systems on bright backgrounds, if the pixel value is 

higher than (darker) the entered fixed threshold level, the pixel will be set 

as a root pixel, otherwise it will be set as a background pixel.  For bright 

root systems on dark backgrounds, if the pixel value is equal to or higher 

than (brighter) the entered threshold level, the pixel will be set as a root 

pixel, otherwise it will be set as a background pixel. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 23: RootReader2D v4 Users Guide

20  

2) Adaptive Minimum/Maximum Thresholding 

 

  

This technique should be used when the background lighting is not 

uniform and the intensity of the main root pixels are never equal to the 

intensity of any background pixels in the image.  These thresholding filters 

was designed isolate the roots from the background and prevent gaps 

from forming at root junctions during thresholding.  Four parameters are 

needed.  The first is “Maximum Threshold” which is the maximum pixel 

intensity value that can be set to be background.  If the pixel intensity is 

greater than the entered integer value, than it is automatically set as a 

root pixel.  The second is “Minimum Threshold” which is the minimum 

pixel intensity value that can be set to be a root pixel.  If the pixel intensity 

is less than the entered value, than it is automatically set as a background 

pixel.  The third is “Half Kernel Size” which is half the local kernel size.  The 

local kernel size is the size of a square region around the central pixel that 

is used to determine if the central pixel is part of the root system or 

background.  The forth is “Percent Above Local Average” which is used to 

determine if the central pixel should be set to be a root pixel or 

background pixel.  If the intensity value of the central pixel is the entered 

percentage or more greater than the average pixel intensity value of the 

local kernel region, than it is set to be root pixel, otherwise it set to be a 

background pixel. 

 

 

 

 

 

 

Page 24: RootReader2D v4 Users Guide

21  

3) Double Adaptive Thresholding  

  

This technique should be used when the background lighting is not 

uniform and the intensity of the main root pixels are occasionally equal to 

or less than the intensity of some background pixels.  This thresholding 

filter was designed to isolate the roots from the background and prevent 

gaps from forming at root junctions during thresholding.  This filtering 

method passes a local adaptive filter over the entire image then passes 

another local adaptive filter over the entire image again, this time 

excluding the root pixels determined during the first pass.  For each local 

adaptive filter pass, the kernel size (entered as “Half Kernel Size”) and a 

percentage above the local kernel pixel intensity average (entered as 

“Percent Above Local Average”) must be set. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 25: RootReader2D v4 Users Guide

22  

4) Double Adaptive Blur Thresholding  

  

This technique builds off the Double Adaptive thresholding technique 

should be used with fine root system images (eg. rice seedlings) where the 

background lighting is not uniform and the intensity of the main root 

pixels are occasionally equal to or less than the intensity of some 

background pixels.  This thresholding filter was designed to isolate the 

roots from the background, prevent gaps from forming at root junctions 

during thresholding and smooth any artifacts that may arise from the need 

for increased thresholding sensitivity when working with fine root 

systems.  Similar to the Double Adaptive thresholding technique this 

filtering method first passes a local adaptive filter over the entire image 

then passes another local adaptive filter over the entire image again (See 

Double Adaptive Thresholding above).  Next the filter, removes dust/root 

objects that are smaller than or equal to the entered integer number of 

connected pixel from the thresholded image and then passes a 3x3 

blurring filter   over the thresholded image the specified “Number of 

Blur Passes”.  Afterwards the filter uses a fixed thresholding technique and 

the user specified “Fixed Threshold Level” to produce the final thresholded 

image/root pixels.    

 

 

 

 

Page 26: RootReader2D v4 Users Guide

23  

c. Set Dust Removal Filter 

 

To set and use a dust removal filter, first go to the “Options” menu and select 

the “Use Dust Removal Filter” checkbox.  Then go to the “Measurement” 

menu and click “Set Dust Removal Filter”.  The Set Dust Removal Filter 

window will appear. 

 

 

 

The dust removal filter will remove any objects that are smaller than or equal 

to the entered integer number of connected pixel (specifically, 8‐connected 

pixels). 

 

d. Set Filling Filter  

To set and use a filling filter, first go to the “Options” menu and select the 

“Use Filling Filter” checkbox.  Then go to the “Measurement” menu and click 

“Set Filling Filter”.  The Set Filling Filter window will appear. 

 

 

 

This filter runs a square growing kernel then a square shrinking kernel of the 

same size on the threshold points.  This will help to smooth and fill any small 

holes or gaps in the thresholded root system.  The kernels dimension/sizes 

Page 27: RootReader2D v4 Users Guide

24  

are 2 times the entered integer plus 1 by 2 times the entered integer plus 1.  

For example: if 1 is the entered integer, the kernel sizes are 3x3; if 2 is the 

integer, the kernel sizes are 5x5.   

 

e. Set Scale  

To set the scale of the image, go to the “Measurement” menu and click “Set 

Scale”.  The Set Scale window shown below will appear. 

 

  

The scale of the image is also the resolution of the image in pixels per cm.  

The scale can be acquired from a calibration grid image or from an image of 

a ruler.  Note:  when the scale is set, the error criterion (next) will 

automatically be readjusted to correctly correspond with the new scale. 

 

f. Set Error Criterion  

To set the error criterion, go to the “Measurement” menu and click “Set 

Error Criterion”.  The Set Error Criterion window shown below will appear. 

 

  

The error criterion is used during the segment building.  It is a control 

parameter or constraint that is used during the curve estimation and 

segment length calculation.   Note: RootReader2D automatically adjusts the 

Page 28: RootReader2D v4 Users Guide

25  

error criterion for the entered scale, but it can also be manually modified 

after the scale has been set. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 29: RootReader2D v4 Users Guide

26  

v. Options  

a. Image Processing 

 

To set image processing options, go to the “Options” menu and then the 

“Image Processing” sub‐menu. 

 

  

Image lighting types – if the “Dark roots on a bright background” type is selected, 

RootReader2D will turn dark objects/pixels to root pixels and bright pixels to background 

pixels when thresholding.  If the “Bright roots on a dark background” type is selected, 

RootReader2D will turn bright objects/pixels to root pixels and dark pixels to background 

pixels when thresholding. 

 

Thresholding techniques – RootReader2D will use the selected thresholding technique 

during thresholding of the image.  See page 18‐22 for more details on the thresholding 

techniques. 

 

Post‐thresholding options – if the “Use Dust Removal Filter” option is selected, 

RootReade2D will run a dust removal filter after thresholding.  See page 23 for more 

details on the dust removal filter.  If the “Use Filling Filter” option is selected, 

RootReader2D will run a filling filter after thresholding or thresholding and dust removal.  

See page 23‐24 for more details on the filling filter. 

 

“Reduce Unnecessary Endpoints” option – if selected, RootReader2D will remove 

unnecessary endpoints that were created during skeletonization and segment generation.  

These unnecessary endpoints usually belong to cluster regions that contain multiple 

endpoints that can be simplified to one or a few endpoints.  This option should typically 

Page 30: RootReader2D v4 Users Guide

27  

be selected as it reduces the number segments in the graph which reduces the chances of 

over‐estimation of total root system lengths and processing time when calculating 

shortest paths. 

 

“Find Shortest Paths” option – if selected, RootReader2D will determine the shortest 

paths between all connected segment endpoints and all other connected segment 

endpoints during the segment building process.  This enables specific roots of interest to 

be selected.  Without this option selected, roots of interest cannot be selected and only 

the whole root system length can currently be measured. 

      

b. Root Selecting  

To set root selecting options, go to the “Options” menu and then the “Root 

Selecting” sub‐menu. 

 

  

Selection of root endpoints options – if the “Allow any skeleton point to be selected as a 

root endpoint” option is selected, all skeleton points can be selected as endpoints of root.  

If it not selected, only segment endpoints (or the green circles) can be selected as root 

endpoints.  In most cases it is not necessary to select this option, so it is not 

recommended, but sometimes it may be necessary when a segment endpoints are not 

created near the seed.  For example, when imaging Arabidopsis that have been grown 

hydropically and placed on agar plates, sometime the endpoints are not created near the 

seed, so this option must be used to accurately measure primary root lengths.  

 

Selection of root endpoints options – if the “Selected roots share a common endpoint” 

option is selected, all roots that are selected by the user will start from the first endpoint 

that was chosen.  For example, this option should be used if all the roots of interest start 

from a common point, eg. the seed.  Once the first endpoint has been selected, only the 

end endpoints for all roots of interest will need to be selected.  If the “Selected roots have 

independent endpoints” option is selected, then all selected roots have independent start 

and end endpoints. For each root of interest, a start endpoint and an end endpoint will 

Page 31: RootReader2D v4 Users Guide

28  

need to be specified/selected. For example, this option can be used if the roots of interest 

do not start from the same place on the plant or in the image.  

 

“Automatic prediction of furthest endpoint” option – if selected, this option has 

RootReader2D to predict and select the furthest end endpoint for each start endpoint 

that is provided.  For example, if one is interested in measuring the primary root, 

commonly the longest root coming from the seed, RootReader2D will predict the path of 

the primary root if the seed is selected as a start endpoint. 

 

  

c. Measuring 

 

To set measuring options, go to the “Options” menu and then the 

“Measuring” sub‐menu. 

 

  

“Count number of laterals off selected roots” option – if selected, RootReader2D count the 

number of laterals that emerge from the selected roots.  (Note: Overlapping roots will be 

counted as laterals.  This measure is typically not exact and should only be used as an estimate.) 

 

“Measure total root length connected to selected roots” option – if selected, 

RootReader2D will measure the total of roots connected to a given root or root segment. 

(Note: The length of the selected root or root segment will be included in the measurement.) 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 32: RootReader2D v4 Users Guide

29  

d. Saving  

To set saving options, go to the “Options” menu and then the “Saving” sub‐

menu. 

 

  

“Save RR2Dat data file” option – if selected, RootReader2D will save an RR2Dat data file 

when the image is saved.  This RR2Dat file will contain all measurement, processing and 

parameter information about the associated root system.  (Note:  The RR2Dat data files can get extremely large, >200 MB, if the root system in the image is complex and the “Find Shortest Path” image 

processing option is selected.)  

 

“Save thresholded image” option – if selected, RootReader2D will save the threshold 

points from the image to png image file when the image is saved.  The saved png image 

will have the same filename as the original image with “‐thresholded” appended onto the 

filename before the png extension.  This png image of the thresholded root system can be 

imported into other root analysis software for measurement. 

 

 

e. Batch Processing  

To set batch processing options, go to the “Options” menu and then the 

“Batch Processing” sub‐menu. 

 

  

“Process all subfolder” option – if selected, RootReader2D will also process any images 

that are contained in subfolders of the selected folder when batch processing. 

Page 33: RootReader2D v4 Users Guide

30  

vi. View Functions  

a. Zoom In/Zoom Out 

 

RootReader2D allows the user to efficiently navigate and zoom in and out on 

the image using only the mouse.  Some keyboard options are also available. 

 

Zoom In – to zoom in, place the mouse cursor over the image (or image 

window) and roll the center mouse wheel away from you or activate the 

image window and press the Alt and “+” key simultaneously.  

 

Zoom Out – to zoom out, place the mouse cursor over the image (or image 

window) and roll the center mouse wheel towards you or activate the image 

window and press the Alt and “‐“ key simultaneously. 

 

Zoom All – to zoom all, activate the image window and press the Alt and “a” 

key simultaneously.  

 

b. Navigating an Image 

 

RootReader2D allows the user to efficiently navigate around the image using 

only the mouse. 

 

Navigation – to navigate around the image, right click and drag in the image 

window.  The image will move with the dragging motion. 

 

 

 

 

 

 

Page 34: RootReader2D v4 Users Guide

31  

c. View Thresholded Points  

  

To show/hide the cyan threshold points overlay, go to the “View” menu and 

select/deselect the “Show Threshold Points” checkbox.  (Note: Image must be 

thresholded before the “Show Threshold Points” checkbox becomes functional.)  

 

d. View Skeleton Points  

To show/hide the red skeleton points, go to the “View” menu and 

select/deselect the “Show Skeleton Points” checkbox.  (Note: Image must be 

thresholded and skeletonized before the “Show Skeleton Points” checkbox becomes 

functional.)  

 

e. View Vertex Points  

To show/hide the green vertex points, go to the “View” menu and 

select/deselect the “Show Vertex Points” checkbox.  (Note: Image must be 

thresholded, skeletonized and segments built before the “Show Vertex Points” checkbox 

becomes functional.)  

 

f. View Select Roots  

To show/hide the orange selected roots, go to the “View” menu and 

select/deselect the “Show Selected Roots” checkbox.  (Note: Image must be 

thresholded, skeletonized and segments built and roots selected before the “Show 

Selected Roots” checkbox becomes functional.)  

 

Page 35: RootReader2D v4 Users Guide

32  

vii. Batch Capabilities  

Batch processing allows repetitive tasks to be performed on a group of files 

or images automatically.  For example, in RootReader2D thresholding, 

skeletonization, and segment building are repetitive tasks needed for 

analyzing and measuring images.  Batch processing allows many images to be 

processed (thresholded, skeletonized, and segments built) at one time using 

the same processing parameters.  This helps to save time as the user will not 

have to manually guide the software through each step for all the images. 

 

a. Batch Processing  

To batch process a set of images, first move all your root images into a blank 

folder and perform any pre‐processing of the images (eg. image file format 

conversion, conversion from RGB color to grayscale format, cropping, etc).  

Secondly set the threshold technique (fixed, adaptive min/max, double 

adaptive, or double adaptive blur) and related thresholding parameters, ie. 

the image scale, and the error criterion.  Then select and set any post‐

thresholding options. (Note: the setting should be checked and tested on at least one 

or two images prior to batch processing.)  Next, go to the “File” menu and click 

“Batch Process” or click the   icon.  The Batch Process window shown 

below will appear.  

 

  

Click the “Browse…” button and a Set Source selection window will appear.  

Navigate to the folder that contains the pre‐processed images and click the 

“Set Source” button.  (Note: if some desire images to be processed are also contained 

in subfolders of the selected folder, go to the “Options” menu and select the “Process all 

Page 36: RootReader2D v4 Users Guide

33  

subfolders” option.)  Now click the “Run” button in the Batch Process window 

and batch processing will begin.  (Notes:  the image files will not appear in the Set 

Source window when navigating to the folder containing the image files; when batch 

processing it may appear as if the program has frozen, if you think the program has 

unexpectedly frozen, check the source folder containing your image file to see if 

associated.RR2Dat data files are being generated, it may take several minutes to process 

and generate RR2Dat data files for each image.) 

 

b. Batch Printing Measurements to Log 

 

Once you have finished processing, selecting roots and saving your images, 

you may print out the root measurements to the Measuring Log as a batch.  

To print the root measurements to the Measuring Log, go to the “File” menu 

and click “Batch Print” or click the   icon.  The Measuring Log window 

shown below will appear. 

 

  

Click the “Browse…” button and a Set Source selection window will appear.  

Navigate to the folder that contains the images with associated RR2Dat data 

files and click the “Set Source” button.  Now click the “Run” button in the 

Batch Print window and batch printing will begin.   

 

If you would like to clear the Measuring Log of all data before batch printing 

new measurements, selected the Clear measuring log prior to printing 

checkbox.  If left unselected, the new measurement will be appended onto 

the bottom of the Measuring Log.  

 

 

Page 37: RootReader2D v4 Users Guide

34  

c. Batch Adding File Info  

Batch adding file info allows genotype and treatment information to be 

added to the associated RR2Dat data files and can be used to help keep track 

of any plant information from large scale screening/phenotyping 

experiments both during processing and further analysis.  These screening 

experiments usually contain 20 or more tubs that have been separated into a 

control and a treatment, with various arrangements of plant genotypes 

within these tubs.  (Note: The experimental layout from these experiments should be ordered and 

symmetric to use the batch adding info capabilities.) 

 

Once you have finished batch processing your images, you may batch add 

file/genotype/treatment info to the associated RR2Dat data files.  To batch 

add info to the RR2Dat data files, go to the “File” menu and click “Batch Add 

Plant Info”.  The Batch Add Information window shown below will appear. 

 

 

Page 38: RootReader2D v4 Users Guide

35  

 

Click the “Browse…” button and a Set Source selection window will appear.  

Navigate to the folder that contains the images and associated RR2Dat data 

files and click the “Set Source” button.   

 

Next, enter tub information in the Tub Information Section: 

 

Number of Tub – is the number of tubs used per treatment 

 

Number of Row – is the number of rows of plants in each tub 

 

Number of Columns – is the number of columns of plants in each tub 

 

Tub Layout Style – describes how the genotypes are arranged in the tubs.   

There are two choices: Random – indicates that there is no pattern 

and that the genotypes have been assigned to random spots in the 

tub; One Line Per Row – indicates that only one genotype/line was 

planted into each row of the tub 

Next, enter photography information in the Photography Information 

Section: 

Photography Tub Order – is the order in which the tubs were photographed.  There are 

two choices: Block – indicates that the pictures were taken in 

treatment blocks (ie. all the tub from one treatment were 

photographed together, then the tubs from the next 

treatment were photographed, etc…); Alternate – indicates 

that the treatment tubs were alternated during photography 

(ie. tub 1 of treatment 1, then tub 1 of treatment 2, … , then 

tub 2 of treatment 1, then tub 2 of treatment 2, etc…) 

Blank Photos – describes if and when blank photos were taken.  There are five choices: 

None – means that no blank photos were taken; Every Plant (Before 

Plant) – means that a blank photo was taken before every plant was 

photographed; Every Plant (After Plant) – means that a blank photo was 

taken after every plant was photographed; Start/End of Every Row – 

means that a blank photo was taken at the start and end of every row (Note: within the same tub, the blank photo at the end of one row acts as the blank 

Page 39: RootReader2D v4 Users Guide

36  

photo for the start of the next row, ie. if there are 10 rows in the tub, than 11 blank 

photos will be taken.); Start/End of Tub – means that a blank photo was 

taken before and after taking the picture of plants in the tub 

Number of Treatments – is the number of treatments levels used, including the control 

 

Next, enter the information you would like to add in the Information to Add 

Section: 

List of Lines Corresponding  

    to Tub Order and Layout – the list of genotypes in the tubs is entered here.  If you selected Random for the Tub Layout Style, then you will have to enter a comma separated list of all the genotypes in the order that they were photographed, excluding preset blanks.  If you selected One Line per Row for the Layout Style, then you will have to enter a comma separated list of the genotypes in each row in the order that the rows were photographed 

List of Treatments – the comma separated list of treatments is entered here.  This list 

should be entered in the order that the treatments where 

photographed, including the control 

Comments – any comments about the whole experiment can be entered here  (Note: These comments will be added to every RR2Dat data file.) 

 

After you have entered the source folder, tub layout information, 

photography information, and the information you would like to add, click 

the “Run” button at the bottom of the Batch Add Information window and 

the entered information will be added to the existing RR2Dat data files in the 

folder.  (Note: If any entry mistakes were detected, the error will appear in the 

Processing Log.)  

 

 

 

Page 40: RootReader2D v4 Users Guide

37  

viii. Logs and Information Window 

 

a. Processing Log  

The Processing Log is a log where RootReader2D records all the users 

processing actions.  An example of the Processing Log is shown below. 

 

  

To show/hide the Processing Log, go the “View” menu and select/deselect 

the “Show Processing Log” checkbox. 

 

To clear the information in the Processing Log, click the “Clear” button at the 

bottom of the Processing Log. 

 

 

b. Measurement Log 

 

The Measuring Log is a log where RootReader2D records the measurements 

when the user either measures or batch prints the root measurements.  An 

example of the Measuring Log is shown below. 

 

Page 41: RootReader2D v4 Users Guide

38  

 

 

To show/hide the Measuring Log, go the “View” menu and select/deselect 

the “Show Measuring Log” checkbox. 

 

To clear the information in the Measuring Log, click the “Clear” button at the 

bottom of the Measuring Log.   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 42: RootReader2D v4 Users Guide

39  

c. Image Information Window 

 

The Image Information window displays pixel information and details about 

the image that has been saved in the associated .RR2Dat data file.  This 

information includes the pixel coordinates and value, image scale, genotype, 

treatment, and comments about the plant in the image.  An example of the 

Image Information window is shown below. 

 

  

To show/hide the Image Information window, go the “View” menu and click 

the “Show Image Info Window” checkbox.  

 

To add/remove plant information to the Image Information window and to 

the associated RR2Dat data file, use the Image Information window to add 

the new information in the Genotype, Treatment, or Comments section of 

the Image Information window.  Then click the “Update” button to update 

the active data that is associated with the current image.  After updating the 

information, go to the “File” menu and click “Save” or click the   icon to 

save the new plant information to associated RR2Dat data file.  

Page 43: RootReader2D v4 Users Guide

40  

ix. Saving  

a. Saving the Image Processing Information 

 

The processed image data and information can be saved in RR2Dat data files.  

These RR2Dat data files contain processing information and parameters as 

well as root measurement information.  These RR2Dat data files will have the 

same file name and will be stored in the same folder as their associated 

image files.  No changes will be made to the original image files when the 

processing is performed and saved.  If the option is selected, a color png 

image file with the thresholded root system may also be saved, see page 27 

for detail on saving options.  

 

To save the processed image data (and/or the thresholded root system a png 

image file), go to the “File” menu and click “Save” or click the   icon.  

(Note: Any existing RR2Dat data or png image files with the same filename will 

automatically be overwritten.)     

 

b. Saving the Measurement Log 

 

The measurement in the Measuring Log can be saved as a comma delimited 

csv file.  This file can be opened in spreadsheet and statistical analysis 

programs for modification and data analysis. 

 

To save the measurements in the Measuring Log, click the “Save” button 

located at the bottom of the Measuring Log.  In the Save selection window 

that appears, choose the folder where to store the txt measurement file and 

click the “Save” button.  (Note: The saved measurement filename can be changed but 

must have a .csv extension to be open and delimited properly.) 

 

 

 

Page 44: RootReader2D v4 Users Guide

41  

c. Saving the Processing Log  

RootReader2D will record all the user actions to a processing log.  To save the 

recorded processing steps from the Processing Log, click the “Save” button 

located at the bottom of the Processing Log.  In the Save selection window 

that appears, choose the folder where to store the txt processing file and 

click the “Save” button. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 45: RootReader2D v4 Users Guide

42  

x. Example I – Maize Primary, Seminal and Lateral Root  

Length Measurement  

In this section, a step by step example will be provided on how to measure 

the primary, seminal, and lateral root length from a sample maize root image 

with the RootReader2D software. 

 

Background Information: 

 

1) The sample maize plant in the image was 4 days old.  Grown in a  

replete hydroponic nutrient solution system at the Robert W Holley 

Center for Agriculture and Health in Ithaca NY, USA 

2) The image was taken with a digital SLR camera with a custom polarized 

imaging setup 

3) The resolution of the image is 120 pixels per centimeter, measured with 

a calibration grid 

4) The backlighting is dark and uniform with bright white roots 

5) The image has been converted from RGB color to 8‐bit grayscale format 

6) Any part of the shoot that was captured in the original image has been 

erased. 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 46: RootReader2D v4 Users Guide

43  

Sample image filename: Tub01_0uM Al_Day3_071708_31‐grayscaled.tif 

 

 

Step 1: Thresholding, Skeletonization and Segment Building (Note: these steps can be performed on many images with batch processing functions.)   

 

1) Start RootReader2D and open the image by clicking on the   icon and 

selecting the root image with the Open window that appears. 

 

2) Threshold the image – since the backlighting is uniformly dark with 

bright roots, the fixed thresholding technique should work fine.  Go to 

the Options menu and select “Bright roots on a dark background” and 

the Fixed Thresholding option.  Then go to the Measurement menu, and 

click on Set Threshold.  In Set Threshold window, set the parameters and 

Page 47: RootReader2D v4 Users Guide

44  

threshold the image by clicking on the   icon.  See the thresholded 

image below for parameters and thresholded levels. 

 

 

 

3) Skeletonize the thresholded image by clicking the   icon.  See 

Skeletonized image below.  (Note: the thresholded points were hidden from the 

view.) 

Page 48: RootReader2D v4 Users Guide

45  

 

 

4) Set the scale and error criterion.  See Set Scale and Set Error Criterion 

windows below for inputs used in current example. 

 

  

  

5) Check to make sure the “Find Shortest Paths” option is selected in the 

Options Menu in the Image Processing Sub‐Menu. 

 

6) Build the segments by clicking the   icon.  See image with skeleton 

and built segments and endpoints below. 

Page 49: RootReader2D v4 Users Guide

46  

 

 

 

 

Step 2: Root Selecting and Modification 

 

1) Check to make sure the “Selected roots share a common endpoint” and 

the “Automatic prediction of furthest endpoint” options are selected.  

See the Root Selecting options shown below. 

 

  

2) Zoom in and drag the maize seed towards the center of the image.  See 

the image below. 

 

Page 50: RootReader2D v4 Users Guide

47  

  

3) Select the start endpoint by holding the shift key down and left clicking 

on the image where the primary root emerges from the seed. 

 

4) After selecting the start endpoint (left click), the path of the primary 

root will be predicted and will appear in yellow/orange.  Zoom out to 

view the whole predicted path.  See the image below. 

 

Page 51: RootReader2D v4 Users Guide

48  

  

5) Since the “Selected roots share a common endpoint” option was 

selected, to select the two basal roots in the image, left click on the 

image where the two basal roots end.  See the image below. 

 

 

Page 52: RootReader2D v4 Users Guide

49  

6) Since RootReader2D did not correctly select the path of the primary and 

basal roots, the selected roots will have to be modified.  To begin 

modifying the selected roots, click the   icon.  The first root that was 

selected will appear in blue. 

 

  

7) Zoom in/zoom out and drag the image to navigate and move the image 

for better viewing.  

 

Page 53: RootReader2D v4 Users Guide

50  

  

8) To correct the path of the selected root, a new intermediary endpoint 

will have to be added to the path.  To add a new intermediary endpoint 

to the path, hold down the shift key and left click and hold then drag the 

new endpoint to the desired new position in the image.  (Note: when 

adding multiple endpoints, select endpoints that come from section of the path that 

you would like to modify.)  Endpoints that are permanently part of the path 

appear as orange numbers when in the modify mode.  

 

Page 54: RootReader2D v4 Users Guide

51  

  

9) Next, switch to the second selected root, click the   icon.  Zoom in on 

the root and correct the path by adding an intermediary endpoint(s) to 

the path. 

 

 

 

Page 55: RootReader2D v4 Users Guide

52  

  

10) Switch to the third root and correct the path by adding an 

intermediary endpoint(s) to the path.  See the images below. 

 

  

Page 56: RootReader2D v4 Users Guide

53  

  

11) Now that the paths of all three selected roots have been corrected, 

the modify mode can be exited by clicking the   icon.  See the 

image below. 

 

 

 

Page 57: RootReader2D v4 Users Guide

54  

 

Step 3: Saving Image Processing, Measuring Roots and Saving 

Measurements. 

 

1) Save the processing of the image in an associated RR2Dat data file by 

clicking the   icon. 

 

2) Measure the root system by clicking the   icon.  The measurements 

will be printed to the Measuring Log. 

 

3) Save the Measuring Log data by clicking the Save button on the bottom 

of the Measuring Log window.  The data will be saved to a .csv file 

(comma separated file) which may be opened with spreadsheet and 

statistical analysis software. 

 

 

Step 4: Calculating Primary, Seminal and Lateral Root Lengths 

 

1) In most cases, the primary root length is Longest Root Length and the 

primary root is also selected first (ie. Root 0). 

 

2) To get the total of the seminal root lengths, subtract the primary root 

length from the Total of Selected Root Lengths. 

 

3) To get the total lateral root length in root system, subtract the total 

selected root length from the Total Root System Length. 

 

4) Individual root lengths of the primary and two seminal roots can also be 

found in the saved .csv file as Root 0, Root 1 and Root 2, respectively. 

 

 

Page 58: RootReader2D v4 Users Guide

55  

xi. Example II ‐  Sorghum Total and Primary Root  

Length Measurement and Lateral Root 

Count off of Primary Root  

In this section, a step by step example will be provided on how to measure 

the total root system and primary root lengths from a sample sorghum root 

image with the RootReader2D software. 

 

Background Information: 

 

1) The sample sorghum plant in the image was 6 days old. Grown in a 

replete hydroponic nutrient solution at EMBRAPA Maize and Sorghum 

in Sete Legoas, MG, Brazil. 

2) The image was taken with digital SLR camera with a lightbox for 

backlighting 

3) The resolution of the image is 164 pixels per centimeter measured with 

a calibration grid 

4) The backlighting is bright and non‐uniform with dark roots 

5) The image has been converted from RGB color to 8‐bit grayscale format 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 59: RootReader2D v4 Users Guide

56  

Sample image filename: Tub02_Nov 6_Control_04‐grayscaled.tif 

  

Step 1: Thresholding, Skeletonization and Segment Building (Note: these steps can be performed on many images with batch processing functions.)   

 

1) Start RootReader2D and open the image by clicking on the   icon and 

selecting the root image with the Open window that appears. 

 

2) Threshold the image – since the backlighting is non‐uniform with dark 

roots of varying darkness, the fixed thresholding technique will not be 

suitable, so the double adaptive thresholding technique will be used.  In 

Options menu in the Image Processing sub‐menu set the following 

options.  Then go to the Measurement Menu and click on Set Threshold, 

then Set Dust Removal Filter, then Set Filling Filter and set the following 

Page 60: RootReader2D v4 Users Guide

57  

parameters shown below.  Next, threshold the image by clicking on the 

 icon.  See the thresholded image below. 

 

 

 

 

 

Page 61: RootReader2D v4 Users Guide

58  

 

3) Skeletonize the thresholded image by clicking the   icon.  See 

Skeletonized image below.  (Note: the thresholded points were hidden from the 

view.) 

 

 

Page 62: RootReader2D v4 Users Guide

59  

4) Set the scale and error criterion.  See the Set Scale and Set Error 

Criterion windows below for inputs used. 

 

  

  

 

5) Check to make sure the “Find Shortest Paths” option is selected in the 

Options Menu in the Image Processing  Sub‐Menu. 

 

6) Build the segments by clicking the   icon.  See image with skeleton 

with built segments and endpoints below. 

 

 

Page 63: RootReader2D v4 Users Guide

60  

Step 2: Root Selecting and Modification 

 

1) Check to make sure the “Selected roots share a common endpoint” and 

the “Automatic prediction of furthest endpoint” options are selected.  

See the Root Selecting options shown below. 

 

  

2) Check to make sure the “Count number of laterals off selected roots” 

option is selected.  See the Measuring options shown below. 

 

  

3) Zoom in and drag the sorghum seed towards the center of the image.  

See the image below. 

 

Page 64: RootReader2D v4 Users Guide

61  

  

4) Select the start endpoint by holding the shift key down and left clicking 

on the image where the primary root emerges from the seed. 

 

5) After selecting the start endpoint (Shift –left click), the path of the 

primary root will be predicted and will appear in yellow/orange.  Zoom 

out to view the whole predicted path.  See the image below. 

 

Page 65: RootReader2D v4 Users Guide

62  

 

 

6) Since RootReader2D did not correctly select the path of the primary 

root, the path of the primary root will have to be modified.  To begin 

modifying the primary root, click the   icon.  The selected primary 

root that will appear in blue. 

 

7) Zoom in/zoom out and drag the image to navigate and move the image 

for better viewing.  See the image below. 

 

Page 66: RootReader2D v4 Users Guide

63  

  

8) To correct the path of the selected primary root, a new intermediary 

endpoint will have to be added to the path.  To add a new intermediary 

endpoint to the path, hold down the ctrl key left click and hold, then 

drag the new endpoint to the desired position in the image.  (Note: when 

adding multiple endpoints, select endpoints that come from section of the path that 

you would like to modify.)  Endpoints that are permanently part of the path 

appear as orange numbers when in the modify mode.  See the image 

with corrected path for the second root below. 

 

Page 67: RootReader2D v4 Users Guide

64  

  

9) Now that the path of the selected primary root has been corrected, 

the modify mode can be exited by clicking the   icon.  See the 

image below. 

 

 

 

Page 68: RootReader2D v4 Users Guide

65  

Step 3: Saving Image Processing, Measuring Roots and Saving 

Measurements. 

 

1) Save the processing of the image in an associated xml data file by 

clicking the   icon. 

 

2) Measure the root system by clicking the   icon.  The measurements 

will be printed to the Measuring Log. 

 

3) Save the Measuring Log data by clicking the Save button on the bottom 

of the Measuring Log window.  The data will be saved to tab‐delimited 

txt file which may be opened in Microsoft Excel. 

 

 

Step 4: Calculating Primary and Total Root Lengths and Lateral Root 

Number off the Selected Primary Root 

 

1) The primary root length is the Longest Root Length and is also labeled as 

Root 0. 

 

2) The total root system length is Total Root System Length. 

 

3) The lateral root count off the selected primary root is the Total Selected 

Root Lateral Count or Root 0 – Lateral Count. 

 

 

 

 

 

 

Page 69: RootReader2D v4 Users Guide

66  

xii. Example III ‐  Arabidopsis Primary Root Length  

Measurements. 

 

Coming soon. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 70: RootReader2D v4 Users Guide

67  

xiii. Example IV ‐  Rice Total Root System Length 

Measurement 

 

Coming soon. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Page 71: RootReader2D v4 Users Guide

68  

III. Appendix  

More details on underlying processing and analysis algorithms coming 

soon. 

 

I.  Lighting and Camera Arrangements 

i.  Polarized Light Setup 

   

 

 

Page 72: RootReader2D v4 Users Guide

69  

Currently used for: Maize, Sorghum, Rice, Soybean and Wheat. 

ii.  Unfiltered Light Setup 

 

 

 

Currently used for: Maize and Sorghum and Rice. 

 

 

 

 

Page 73: RootReader2D v4 Users Guide

70  

 

iii.  Oblique Light Setup 

  A setup diagram coming soon.  Note: we have used an oblique lighting setup to image 

Arabidopsis plants that were grown or placed on agarose plates. 

 

Page 74: RootReader2D v4 Users Guide

Downloads - RootReader2D

http://www.plantmineralnutrition.net/software/rootreader2d/downloads/index.html[11/15/2017 10:40:39 AM]

Next

Docs » Downloads

RootReader2D is available to download from the linkbelow. For additional help, please also download theUser Guide.

File Type Version

RootReader2Dv4_3.jar JAR 4.3.1

RootReader2Dv4_User_Guide.pdf PDF 4.0.0

Previous

This software is provided by the USDA-ARS RootSystem Architecture Group at the Robert W. HolleyCenter for Agriculture & Health, Ithaca, NY.

Built with MkDocs using a theme provided by Readthe Docs.

RootReader2D

Home

Downloads

Setup

References

« Previous Next »