réparation réplication - freemayamax.free.fr/partage/upload/biochimie_beaune_cours3b.pdf ·...
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ARNm
ARNt et r
Protéines
ADN
Réparation Réplication
TranscriptionTranscription inverse
Traduction
ADN ARN ARNm Protéines
ARNtARNrRéplication
Réparation
Transcription-maturation
transcription maturation Traduction
Expression des gènes
Transcription Inverse (RT)
RéplicationADN + dNTP ADN + dNMP + Pi
ADN polymérase
- la réplication est semi-conservative- la synthèse de l’ADN s’effectue de 5’en 3’ sur les 2 brins (le brin matrice est toujours lu de 3’ en 5’)- de nombreuse enzymes et protéines sont nécessaires- la synthèse démarre toujours à une origine de réplication (plusieurs chez les eucaryotes)- les eucaryotes possèdent de nombreuses ADN polymérases (α, β, γ, δ, ε, ζ ...)- tout l’ADN doit être répliqué en une seule fois au cours du cycle cellulaire- le super-enroulement de l’ADN, la structure chromatinienne et les nucléosomes posent problème pour la réplication- il faut répliquer aussi les extrémités- toujours 3 étapes: initiation, élongation, terminaison.
Réaction catalysée par les ADN polymérases• toutes les ADN polymérases ont besoin d’une amorce avec un groupe 3’ OH libre• toutes les ADN polymérases catalysent l’élongation dans la diretion 5’ vers 3’ • quelques ADN polymérases ont une activité de correction de 3’ en 5’ (exonucléase)
DNA DNA
amo
rce
amo
rce
T
Cm
atri
ce
T
C
mat
rice
ADN Polymérase
Elongation
3’
5’ 3’
Amorce ARN
ADN néosynthétisé
5’
5’
ADN polymérase
ADN polymérases eucaryotes
Propri-étés α β γ ∂ ε ζLocali-sation
noyau noyau mito noyau noyau
Fonc-tion
Répli-cation
BER Répli.Répar.
Répli.BER,NER
RépliBERNER
Σ trans-lésion
Exonu. - - + + + -
Proces-sivité
Faible Faible Forte Forte forte faible
Fidélité forte faible forte forte forte ?
+ …
La réplication de l’ADN est semi-conservative
Brins d’ADN Parentaux
En rouge brins fils
Chaque brin parental sert de matrice pourla synthèse d’un brin-fils
Voir expérience de Meselson et Stahl
5’3’ 5’ 3’
Fourche de réplication
Amorce ARN
5’3’
3’5’
3’5’
direction de la synthèse du brin “leader”
direction de la synthèse du brin “tardif”
3’
Amorce ARN5’
L’ADN polymérase α initie la réplication andSynthétise l’ADN jusqu’à la prochaine amorce d’ARN
5’
5’3’
5’
(Fragment d’Okazaki, 100-1000 bases)5’
3’L’ADN polymérase ε initie à la fin d’un fragment d’Okazakiet poursuit l’élongation tout en détruisant l’amorce par son activité exonucléasique 5’-3’
pol α
pol I
5’3’ 5’
3’
Mouvement de la fourche de réplication
Mouvement de la fourche de replication
Amorce ARNFragment d’Okazaki
5’
Amorce ARN
(fragment d’Okazaki)5’
3’
5’3’
La DNA ligase referme le “gap” en recréant une liaison phosphodiester avec de l’ATP
DNA ligase
3’OH P5’
5’3’
3’5’
Protéines à la fourche de replication chez l’homme
hélicase
SSB
pol α
DNA ligase
topoisomerases I and II
PCNA
Activité primaseassociée avec pol α
pol δ
Brin précoce
Brin tardif
pol ε
Synthèse discontinue de l’ADN
3’5’
5’ 3’
3’ 5’
5’3’
3’5’
5’3’
Origine de réplication
Fourche de réplicationFourche de réplication
Origines de réplication de l’ADN (toutes les ~150 kb)
Bulle de réplication
Chromosomes fils
fusion des bulles
Réplication bidirectionelle
Origines de réplication de l’ADN sur les chromosomes de mammifères
5’3’
3’5’
5’3’
3’5’
3’5’
5’3’
Réplication
*Procaryotes : 1 seule origine deréplication
*Eucaryotes : plusieurs origines deréplication
*Une zone d’ADN répliquée à partird’une OR
*Asynchronie mais régulation carl’ADN n’est répliqué qu’une seule foispar cycle cellulaire.
*Association avec des protéines ;importance des nucléosomes
Enzymes nécessaires à la réplication
• Hélicases
• Protéines de stabilisation de l’ADN simple brin
• Protéines constituants le primosome
• Primase
• ADN polymérases
• Ligase
• RNase
• Autres protéines accessoirs de la réplicatin PCNA, facteurs de réplication A et C
• Topoisomérases
Topoisomérases
Télomères 1
3’ AACCCCAACTTGGGGTTG
5’
3’ AACCCCAACTTGGGGTTGGGGTTG
5’
3’ AACCCCAACTTGGGGTTGGGGTTG
5’
3’ AACCCCAACTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTG
télomères riches en G
Télomères 23’ télomères riches en G 3’
5’ 5’AmorceARN
3’ Télomères riches en G 3’
5’
Télomères
- équilibre élongation/dégradationdes télomères
- dégradation :exonucléases/échangesintrachromatinien
- élongation par télomérase (ARN,homme TTGGGG)
- élongation par échangeréciproque
Réplication
ADN + dNTP ADN + dNMP + PiADN
polymérase
- la réplication est semi-conservative- la synthèse de l’ADN s’effectue de 5’en 3’ sur les 2 brins (le brin matrice est lu de 3’ en 5’)- de nombreuse enzymes et protéines sont nécessaires- la synthèse démarre toujours à une origine de réplication (plusieurs chez les eucaryotes)- les eucaryotes possèdent 6 ADN polymérases (α, β, γ, δ, ε, ζ)- tout l’ADN doit être répliqué en une seule fois au cours du cycle cellulaire- le super-enroulement de l’ADN, la structure chromatinienne et les nucléosomes posent problème pour la réplication- il faut répliquer aussi les extrémités- toujours 3 étapes: initiation, élongation, terminaison.
ADN ARN ARNm Protéines
ARNtARNrRéplication
Réparation
Transcription-maturation
transcription maturation Traduction
Transcription Inverse (RT)
* Modifications de l’ADN:
- stress oxydant- radiations, UV- produits chimiques
réplication mésappariements, microsatellitesréplication: 10-5, réparation 10-10
* 1 molécule ADN: ~ 100 000 modifications/jour Réparation ADN indispensable
Maintien de l’intégrité du génome
* Contrôle strict : protection contre les mutations pas d’évolution
* Contrôle lâche : phénotype mutateur mutations---> mort, pathologies cancer évolution
Type Mécanisme Fréquence
Chromosome mis-ségregation 10-2 par division chromosomique cellulaire
(ex: aneuploidie)
Chromosome réarrangement 6 X 10-4 par division chromosomique cellulaire (ex: translocation)
Gene mutation au niveau 10-10 par pb et par d’une paire de base, division cellulaire ou
(ex: mutation ponctuelle 10-5 - 10-6 par locus par ou délétion ou insertion generation
de petite taille)
Type et fréquence des Mutations
Lésions de l’ADN
Base manquante dépurination par la chaleur ou par les acides (~104 purines, par jour par cellule chez l’homme)
Base altérée radiations ionisantes ; agents alkylants
Base incorrecte désamination spontanéeex: cytosine en uracile ou adenine en hypoxanthine
Déletion-insertion agents intercalants (acridines)
Formation de dimères irradiation par lesUV Coupure des brins radiations ionisantes;
agents chimiques (bléomycine) cross-links entre brins Psoralènes; mitomycin C
Formation de tautomères Spontanée et transitoire
Les Mutations sont perpétuées au cours de la réplication
• réplication normale des C-G ---> deux brins fils avec chacun un C-G
• en cas de mésappariement C=A au cours de la réplication un des brins fils aura un C=A et l’autre un C=G
AC• au cours de la réplication suivante cet appariement donnera un brin C=G et un brin T=A engendrant ainsi une mutation fixée
C G C G et C G
C G C A et C G
T A
* les mutations qui apparaissent au cours de la réplication sont réparées par:
• “proofreading” (correction d’épreuves, au moment de la réplication)• réparation des mésappariements
* les mutations qui apparaissent “spontanément” à n’importe quel moment sont réparées par:
• excision-réparation (base ou nucleotide)• +
Mécanismes de la réparation
Réparation
1- réversion de la lésion (transférases)
2- recherche de l’information sur le brincomplémentaire (excision)excision de baseexcision de nucléotidesréparation des mésappariements
3- to lérancesynthèse translésionnelle
4- recherche de l’information sur uneautre moléculerecombinaison homologue et nonhomologue
L’information perdue sur un brinpersiste sur l’autre
Reconnaissance de la lésion
Coupure
Resynthèse
Ligation
Restauration
MMR, Réparation des mésappariements
-réparation des “mismatch” (G/T)
- instabilité des microsatellites, (boucles, dérapage)
-reconnaissance de la lésion
- Muts S: hMSH2, 3, 6: reconnaisance de la lésion GTBP
- MutL: hMLH1, hPMS1, 2
- MutH: endonucléase se fixe sur le complexe
- reconnaissance du brin néosynthétisé
Réparation des mésappariementsRéparation des mésappariements
T
C
MSH2/GTBP
T
C
MLH1/PMS2
Reconnaissancede la lésion
Excision du brinContenant la coupure
ADN pol. ∂,ε
Réparation
Base 1
Base 2
Base modifiée
ARN
ADN
ADN Glycosylase
Réparation par excision deBase (BER)
Basemodifiée
GLYCOSYLASE (OGG1: 8oxoG)
AP-Endonucléase
Ligase
Polymérase
nucléase
Polymérase
Pase
XRCC1
Dimères de thymine formés par la lumière UV
Cycle cyclobutane
DNA polymerases ε / δ, PCNA,.....
XP-G 3' incision
5'
XP-F/ERCC1
5' incision 3'
DNA ligase
GENERAL SCHEME OF NUCLEOTIDE EXCISION REPAIR OF UV-INDUCED DNA LESIONS (TCR and GGR)
AS1013'
XP-E
5' 3'::::::
RNA Pol II
TFIIH
5'
3'
CS ACS BXP-G
::::::::
XP-F/ERCC1
5'XP-B
XP-D
3'
XP-C/HR23B
XP-C/hHR23B XP-E
XP-G
RPA/XP-A
DDB1DDB2
RPA/XP-A
XP-A
Schéma général de la réparation (NER) dépendant de la transcription d’une lésion induite par les UV
Couplage réparation / transcription
REPARATION
LESIONSde l'ADN
CANCER
APOPTOSIS
MUTATIONS
EXPOSITION SOLAIRE
UVB / UVA
PEAU NORMALE
MORT CELLULAIRE
"SUNBURN CELLS"
p53rasPTCHc-mycp16/p14
-
Effets de l'exposition solaire sur les cellules de patients Xeroderma pigmentosum
AS1128'.Fr
XP
XP
-
+
+REGULATIONdu CYCLE CELLULAIRE
DIFFERENCIATIONCELLULAIRE
CONTROLEde la CROISSANCE{
ADN polymérases
A côté des ADN polymérases « fidèles »d’autres ADN polymérases « infidèles »,« error-prone » ont été découvertesrécemment.
Sur de l’ADN non endommagé, ellesproduisent des erreurs en incorporant unnucléotide non consensuel (A=T, G_C).
Cependant, ces polymérases sont trèsimportantes pour la synthèsetranslésionnelles d’ADN endommagés enrétablissant la séquence initiale correcte(ex : dimères de thymine, 80H-G, T-->C=A).
Ce sont le Y-polymérases (η, ζ, ι, _, θ…).
C-C
C-CG-G
C-C
C-C
A-A
UV
C-C
G-G
T-C
A-G
T-C
T-CA-G
T-C
T-C
A-A
T-TA-A A-A
T-T
C to TTRANSVERSION
CC to TT TANDEM TRANSVERSIONS
NTS
TS
1
2
3
4
5
Pol δ /ε
Pol η / ζ
AS1000'''.ppt
Pol η / ζ
MOLECULAR FORMATION OF UV-INDUCED MUTATIONS
MAJOR CHARACTERISTICS
1) Targeted at Py-Py
2) Mostly C to T
3) Tandem mutations C-C to T-T
4) Transcribed/non transcribed strands
Formation de mutations à partir d’irradiations UV
Polymérases infidèles
Recombinaison
*Recombinaison homologue-méiose (cross-over)-réparation
*Recombinaison spécifique de site- reconfiguration ADN(Ig, intégration virus)
*Transposition de l’ADN
** Nombreux enzymes nécessaires-résolvases-polymérases-ligases-topoisomérases-rec A B C D E.Coli
Recombinaison génétique et cross-over au cours de la méiose
métaphase I
cross-over entrechromosomes homologues
Cross-overs4 gamètes différents
Chromosomes après cross-overet échange d’information génétique (ADN)
Recombinaison Homologue• dépend de l’identité de séquence• la recombinaison est réciproque• modèle de Holliday
modèle de Holliday
1
2
3
4
1
2
3
4
Recombinaison
1
2
3
4
coupure
1
2
3
4
coupure
Echange d’ADN Chromosomesrecombinants
Recombinaison
Recombinaison
*Recombinaison homologue-méiose (cross-over)-réparation
*Recombinaison spécifique de site- reconfiguration ADN(Ig, intégration virus)
*Transposition de l’ADN
Nombreux enzymes nécessaires-résolvases-polymérases-ligases-topoisomérases-rec A B C D E.Coli
ARNm
ARNt et r
Protéines
ADN
Réparation Réplication
TranscriptionTranscription inverse
Traduction
Synthèse d’ARN, Transcription
A = T
U = A
A = T
U = A
ARN ARNExtrémité 3’de la matrice
Extrémité 3’de la matrice
ARN polymérase
Extrémité 3’
Nucléotide pyrophospatase
5’ 5’
Mat
rice
(A
DN
)
Mat
rice
(A
DN
)
OH en 2’
+1
TBP
TFIIDB
E F
H
J RNA pol II
initiation
L’ARN pol II est phosphorylée sur le domaine carboxy-terminal (CTD); elle est relachée et démarre la synthèse d’ARN
Démarrage de la transcription
P
PP
CTD Démarrage de la transcription
ARNmARNt et r
Protéines
ADNRéparation Réplication
TranscriptionTranscription inverse
Traduction
Traduction: 4 étapes
- Activation
- Initiation
- Elongation
- Terminaison
H2N-C-C-OH
H
R
--
O
=
ATP
H2N-C-C-O-P-O-ribose-adenine
H
R-
-O
=
Amino-acide
Amino-acide adénylé(activé)
PPi
ARNt non chargé
H2N-C-C-O
H
R
--
O
=
Amino-acylARNt
(chargé)
AMP
3’
Activation des amino-acideset
charge des ARNt
mRNA5’
M
AUG GCC
A
mRNA5’
M
AUG GCC
A
Fixation de l’AA-ARNtsur le site A
Formation de la première liaison peptidique
A
UCA GCA GGG UAG
AAA
A
Terminaison• Quand le ribosome arrive à un codon stop, un facteur RF se fixe sur le site A
RF
UCA GCA GGG UAG
Ce facteur libère par hydrolyse la chaîne peptidique de l’ARNt et le complexe ribosomique se dissocie
AAAA
A
Code génétique
La seconde lettre des codons
U C A G
U
UUU PheUUC Phe
UUA LeuUUG Leu
UCU SerUCC Ser
UCA SerUCG Ser
UAU TyrUAC Tyr
UAA StopUAG Stop
UGU CysUGC Cys
UGA StopUGG Trp
C
CUU LeuCUC Leu
CUA LeuCUG Leu
CCU ProCCC Pro
CCA ProCCG Pro
CAU HisCAG His
CAA GlnCAG Gln
CGU ArgCGC Arg
CGA ArgCGG Arg
A
AUU IleAUC Ile
AUA IleAUG Met
ACU ThrACC Thr
ACA ThrACG Thr
AAU AsnAAC Asn
AAA LysAAG Lys
AGU SerAGC Ser
AGA ArgAGG Arg
G
GUU ValGUC Val
GUA ValGUG Val
GCU AlaGCC Ala
GCA AlaGCG Ala
GAU AspGAC Asp
GAA GluGAG Glu
GGU GlyGGC Gly
GGA GlyGGG Gly
A : ALA C: CYS D: ASP F: GLU F : PHE G : GLY H : HIS I : ILEK : LYS L: LEU M: MET N: ASN P : PRO Q : GLN R : ARGS : SER T: THR V : VAL W: TRP Y : TYR
Lapremièrelettre descodons(extré-mité 5’)
MON BON AMI BAT MON BLE QUI EST DUR
M ONB ONA MIB ATM ONB LEQ UIE STD UR
MO NBO NAM IBA TMO NBL EQU IES TDU R
- 1 seul cadre ouvert de lecture (ORF, open reading frame)- lecture non chevauchante- insertion délétion de 1 ou 2 bases décale le
cadre de lecture- insertion ou délétion de 3 bases moins grave- changement d’une base : mutation faux sens ou
pas de conséquence MON ---> TON, BAT ---> BAS
Modifications post-traductionnellesUne fois traduite la protéine n ’est pas « finie » ninécessairement active. Elle doit être « adressée » (souvent co-traductionnel), elle peut subir ensuite des modifications covalentes et enfin elle doit être dégradée.
Adressagesynthèse cytoplasmique * noyau * lysosomes * réticulum endoplasmique * mitochondries * membranes * exportation
Modifications covalentes
* cf. cours sur lesprotéines
Dégradation
* cf. cours sur lesprotéines
ARNmARNt et r
Protéines
ADNRéparation Réplication
TranscriptionTranscription inverse
Traduction