seleccion de coliformes

LABORATORIO de MICROBIOLOGÍA SANITARIa N°6: IDENTIFICACIÓN DEL GRUPO COLIFORME

Índice:

1 Introducción...............................................................................................................................2

2 Técnica de fermentación de tubos múltiples: Fase presuntiva (Determinación del NMP de coliformes totales y recuento de bacterias heterotróficas)...............................................................4

2.1 Objetivo:.............................................................................................................................4

2.2 Fundamento Teórico..........................................................................................................4

2.2.1 PRUEBAS BACTERIOLOGICAS DE CONTAMINACION...................................................4

2.2.2 TECNICAS BACTERIOLOGICAS.....................................................................................5

2.2.3 CUENTA ESTÁNDAR EN PLACA....................................................................................6

2.2.4 CALIDAD DEL AGUA POTABLE.....................................................................................6

2.2.5 CALIDAD DE AGUAS NO POTABLES.............................................................................7

2.2.6 OTRAS MUESTRAS......................................................................................................7

2.2.7 TECNICAS ESTANDARIZADAS DE FERMENTACION EN TUBO MULTIPLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES...............................................................................................................8

2.2.8 FASE PRESUNTIVA.......................................................................................................8

2.3 Procedimiento:...................................................................................................................9

2.3.1 Procedimiento de NMP para coliformes fecales.........................................................9

2.3.2 Cálculo y registro del NMP.........................................................................................10

2.3.3 PRUEBA DE PRESENCIA O AUSENCIA (P-A) DE COLIFORMES....................................13

2.3.4 Procedimiento..........................................................................................................14

2.3.5 Procedimiento de filtro de membrana para coliformes fecales................................15

2.3.6 Procedimiento de incubación retardada para coliformes fecales.............................16

2.4 Cálculo de la densidad de coliformes fecales...................................................................18

2.4.1 RESULADOS DE LA FASE PRESUNTIVA:.....................................................................19

2.5 Conclusiones.....................................................................................................................20

2.6 Recomendaciones............................................................................................................20

3 Técnica de Fermentación de tubos múltiples: Fase confirmativa y Prueba de Coliformes Fecales y Termotolerantes...............................................................................................................20

3.1 Objetivos..........................................................................................................................20

3.2 Fundamento Teórico........................................................................................................20

1


3.2.1 Verde Brillante Bilis 2% Caldo...................................................................................20

3.2.2 Siembra....................................................................................................................21

3.2.3 Incubación................................................................................................................22

3.2.4 Resultados................................................................................................................22

3.3 Procedimiento..................................................................................................................22

3.4 2.4. Resultados.................................................................................................................24

3.5 Conclusiones.....................................................................................................................24

4 Identificación del Grupo Coliforme, Técnica de Fermentación en tubos múltiples; Prueba complementaria...............................................................................................................................25

4.1 Objetivos..........................................................................................................................25

4.2 Fundamento Teórico........................................................................................................25

4.2.1 EL GRUPO COLIFORME.............................................................................................25

4.2.2 TECNICA DE FILTRACION POR MENBRANAS.............................................................26

4.2.3 TECNICA DEL FILTRO DE MENBRANA PARA MIENBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES............................................................................................................................27

4.2.4 Procedimiento estándar de filtro de membrana para coliformes totales.................29

4.2.5 Procedimiento de filtro de membrana para Klebsiella.............................................32

4.2.6 Procedimiento de incubación retardada para coliformes totales.............................33

4.2.7 Prueba del indol........................................................................................................35

4.2.8 Prueba del rojo de metilo.........................................................................................35

4.2.9 Prueba de Voges-Proskauer......................................................................................36

4.2.10 DIFERENCIACIÓN......................................................................................................37

4.2.11 DIFERENCIACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES.........................................................38

4.3 Procedimiento..................................................................................................................40

4.4 Resultados........................................................................................................................41

5 Conclusiones............................................................................................................................41

6 Recomendaciones....................................................................................................................42

7 Bibliografía..........................................................................................................................43

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1 Introducción

El propósito de este Laboratorio fue determinar el contenido microbiológico específicamente de coliformes de cada muestra, mediante los procedimientos expuestos en clase y con eso también ver las diferentes enfermedades y riesgos que causan la presencia de coliformes en agua.

El grupo coliforme está formado por todas las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativas, no formadoras de esporas y con forma de bastón que fermentan la lactosa, produciendo gas y acido en 48 horas a 35 °C

La prueba estándar para el grupo coliforme puede realizarse mediante una técnica de fermentación en tubos múltiples (a través de las fases supuestas y confirmatorias o prueba completa) o por la técnica de filtro de membrana (FM) son aplicables todos estos métodos, teniendo en cuenta las limitaciones que se especifican y el propósito de estudio.

En el caso de la técnica de fermentación de tubos múltiples, los resultados del estudio de los tubos múltiples, los resultados del estudio de los tubos y las diluciones replicados se comunican en términos del Numero Más Probable (NMP) de microorganismos existentes .Este número basado en determinadas fórmulas de probabilidad, es un cálculo de densidad media de coliformes en la muestra.

La precisión de cada prueba depende del número de tubos utilizados .Se obtiene una información más satisfactoria cuando el mayor inoculo de muestra estudiado muestra gas en alguno o en todos los tubos , y el más pequeño muestra gas en ninguno o en la mayoría de los tubos .La densidad bacteriana puede calcularse mediante la fórmula facilitada o promedio de la tabla que utiliza el número de tubos positivos en las diluciones múltiples .El número de porciones de la muestra depende de la precisión requerida .Las tablas de NMP se basan en la hipótesis de una distribución de Poisson (dispersión aleatoria). Sin embargo, si la muestra no se ha agitado adecuadamente antes de hacer las porciones o si existe agrupamiento de bacterias, el valor del NMP podrá resultar menor que el número real de densidad bacteriana.

Sin embargo, el interés por la técnica de tubos múltiples, las numerosas investigaciones realizadas sobre la precisión del NMP y la expresión de los resultados de la prueba en forma de NMP no deben llevar a considerar este método como un ejercicio estadístico en lugar de como un medio de valorar la densidad de coliformes en un agua y su calidad sanitaria.

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La mejor valoración de la eficacia de un tratamiento de agua o de la calidad sanitaria de un agua no tratada depende de la interpretación de los resultados bacteriológicos y de las restantes informaciones obtenidas mediante encuestas sanitarias o de ingeniería.

2 Técnica de fermentación de tubos múltiples: Fase presuntiva (Determinación del NMP de coliformes totales y recuento de bacterias heterotróficas).

2.1 Objetivo:

Evidenciar y observar la existencia de coliformes y determinar el N.M.P en las muestras que se encontraron en los diferentes ambientes de UNI.

2.2 Fundamento Teórico

2.2.1 PRUEBAS BACTERIOLOGICAS DE CONTAMINACION

Se presupone que el objetivo de los análisis rutinarios son para determinar la existencia de microorganismos patógenos en el agua .Sin embargo, esto no es verdad, por las siguientes razonesLos microorganismos patógenos llegan al agua en forma esporádica y no sobreviven mucho tiempo, por lo tanto, pueden no estar en una muestra que se envié al laboratorio.Si se encuentran en pequeñas cantidades pueden pasar desapercibidos a los procedimientos empleados.Se necesitan 24 horas a más para obtener resultados de los exámenes y si se encuentran microorganismos patógenos, muchas personas pueden haber tomado agua antes de que se conozcan resultados, y así haberse expuesto a la infección.

Se sabe que los microorganismos patógenos que llegan a los depósitos de agua, proceden de las descargas intestinales de hombres y animales, además ciertas especies de bacterias, particularmente Escherichia coli, y varios microorganismos similares, denominados coliformes, estreptococos fecales (como streptococus faecales,clostridium perfringes, son habitantes principales del intestino grueso y animales, y en consecuencia siempre están en los desechos fecales.

Así pues la presencia de cualquiera de estas especies en el agua es evidencia de una contaminación fecal y el camino está abierto a los patógenos ya que se encuentran en las materias fecales.

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Puesto que los exámenes de laboratorio para encontrar microorganismos patógenos en el agua tiene las desventajas enumeradas, se han desarrollado técnicas para detectarlos en las excretas, particularmente los del grupo coliforme. Este propósito ha probado ser satisfactorio en la práctica y tiene las siguientes ventajas:

Los microorganismos coliformes, sobre todo E. coli, habitan constantemente en el intestino humano con grandes cantidades .Se estima que una persona, e n promedio, excreta al día miles de millones de estos microorganismos.

Es tos microorganismos viven más tiempo en general, no elimina microorganismos patógenos, pero puede desarrollársele una infección intestinal y esos microorganismos aparecerán en las materias fecales.

Obviamente, una persona sana en general no elimina microorganismos patógenos, pero puede desarrollársele una infección intestinal y esos microorganismos aparecerán en las materias fecales. Así, la presencia de coliformes en el agua se toma como señal de alarma, pues ha sido contaminada peligrosamente.

2.2.2 TECNICAS BACTERIOLOGICAS

Los métodos para el examen bacteriológico del agua están descritos en el libro Standard Methos for the examination of wáter and Wastewater, preparado y publicado en conjunto por la ‘’American Public Health Asociation´´, la ´´American wáter Works Asociation´´ y la´´Federation of sewage and industrial Waste Asociation´.

Como lo dice el título del libro, los métodos son tipo establecido y los detalles deben seguirse al pie de la letra si se quiere que los resultados tengan significado oficial. Es necesario cuidar los siguientes detalles cuando se sometan pruebas de agua a análisis bacteriológicos:La muestra se tomara en frasco estéril.

La muestra ha de ser representativa de la fuente original.

Se evitara la contaminación de la muestra durante y después de obtenerla.

La muestra se analizara lo más pronto posible.

Si no es posible examinar la muestra en seguida deberá guardarse en refrigeración entre 0 y 10 °C

Los procedimientos bacteriológicos de rutina son:5


Cuenta en placa para determinar el número de bacterias

Pruebas que revelen la presencia de bacterias coliformes.

2.2.3 CUENTA ESTÁNDAR EN PLACA

Se efectúan cuentas de colonias después de haber sembrado en placa cantidades alícuotas de la muestra. La cuenta estándar en placa no se recomienda para el caso del agua porque la que contiene pocas bacterias patógenas obviamente es más peligrosa que la que contiene muchas saprofitas .Sin embargo, lo usual es que el agua de buena calidad tenga cuentas bajas, menos de 100 por mililitro. Las cuentas en placa útiles para determinar la eficiencia de las operaciones para eliminar microorganismos, como la sedimentación, filtración y cloración .Las cuentas se deben hacer antes y después del tratamiento específico. Los resultados indicaran la medida en que ha sido reducida la población microbiana.

Pruebas para determinar la presencia de bacterias coliformes

Varios medios selectivos diferenciales facilitan mucho el proceso para examinar muestras de agua en busca de microorganismos coliformes.El examen supone tres pasos sucesivos.

a) Prueba de presunción o Prueba presuntiva

b) Prueba de confirmación

c) Prueba de consumación

2.2.4 CALIDAD DEL AGUA POTABLE

Cuando se analiza el agua potable para determinar si su calidad cumple l a s normas del organismo estadounidense Enviromental Protection Agency (EPA), utiliza cinco porciones de 10 ml .En caso de que empleen porciones de 100 ml de muestra, se inocularan en 5 botellas de cultivo. Para conseguir un cálculo más preciso del número de bacterias en el agua potable tratada, que no debe contener coliformes por 100 ml, se utilizaran 10 tubos duplicados con porciones de 10 o 100 l de muestra.

Al estudiar todo tipo de aguas potables, aguas naturales y efluentes, se realizara la fase confirmatoria.

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La prueba completa es el estándar de referencia que se aplicara en muestras seleccionadas con carácter estacional para controlar la calidad del agua y debe tener una periodicidad al menos trimestral.

En los estudios habituales que se llevan a cabo en la mayoría de los suministros públicos de agua, sobre todo en los que están desinfectados, el objetivo de las pruebas de coliformes consiste en determinar su grado de adecuación a las normas de la EPA, como medida de eficacia de la planta de tratamiento o de la calidad de agua y diluyentes. Una elevada proporción de los coliformes que existen en los sistemas de distribución no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta o en la fuente, sino a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones .Dado que es difícil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestra lo contrario. Es de esperar que más de 95 por 100 de las muestras estudiadas den resultados negativos. Un resultado positivo ocasional, a menos que se repita en el mismo punto de toma, suele tener un valor limitado, aunque no puede ser ignorado .Un incremento del número de muestras positivas durante un determinado periodo o un brusco aumento en un periodo corto, indican la inducción de un cambio de la calidad del agua, cuyo significado debe determinarse mediante un estudio sanitario. Háganse rápidamente las correcciones necesarias, teniendo en cuenta el resultado del estudio sanitario y compruébese la eficacia de las mismas por medio de nuevos análisis bacteriológicos.

2.2.5 CALIDAD DE AGUAS NO POTABLES

Para estudiar aguas no potables, inocúlese una serie de tubos con adecuadas diluciones decimales de la muestra de agua (múltiplos y submúltiplos de a0 ml), teniendo en cuenta la densidad probable de coliformes. Utilícese la fase supuesta confirmatoria del procedimiento de tubos múltiples .Como control de calidad, utilícese en cada estación la prueba completa más intensiva en un mínimo del 10 por 100 de las muestras de agua no potable que contengan coliformes. El objetivo del estudio del agua no potable suele consistir en calcular la densidad de contaminación bacteriana, determinar la fuente de la misma, reforzar los estándares de calidad del agua o rastrear la supervivencia de los microorganismos.Cada uno de estos objetivos requiere una valoración numérica para comunicar los resultados .La Técnica de la fermentación en tubos múltiples puede utilizarse para conseguir un cálculo estadísticamente valido del NMP de densidad de coliformes. Es preciso estudiar un número suficiente de muestras que permita alcanzar resultados representativos del lugar en que se ha efectuado la toma.Por lo general, la media geométrica o el valor medio de los resultados de un determinado número de muestras pueden proporcionar un valor en el que se reduzca al mínimo el efecto de la variación entre muestras .Para conseguir este objetivo, puede ser más adecuado un recuento directo con una técnica de filtro de membrana

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2.2.6 OTRAS MUESTRAS

La técnica de fermentación en tubo múltiple es aplicable al análisis de aguas o salobres y a lodos, sedimentos y fangos .Téngase en cuenta las precauciones antes aludidas sobre el tamaño de las porciones y el número de tubos por dilución.

Para preparar muestras solidas o semisólidas, pésese la muestra y añádase el líquido de dilución hasta conseguir una de. Por ejemplo, introdúzcanse 50 g de la muestra en una jarra mezcladora estéril, añádase 450 ml de tampón de fosfato estéril o de agua de dilución con peptona al 1 por 100 y mézclese durante 1 a 2 minutos a baja velocidad (800 rpm) .Prepárense las diluciones decimales correspondientes del homogeneizado resultante lo antes posible para reducir al mínimo la sedimentación.

2.2.7 TECNICAS ESTANDARIZADAS DE FERMENTACION EN TUBO MULTIPLE (NMP) DE COLIFORMES TOTALES

2.2.8 FASE PRESUNTIVA

Utilícese un medio liquido de lauril triptosa en la porción presuntiva de la prueba de tubo múltiple .Como alternativa, puede emplearse un medio liquido de lactosa, siempre que se haya demostrado que no aumenta la frecuencia de resultados positivos falsos ni enmascara los coliformes que existen en las muestras de agua potable .Si se ha refrigerado al medio después de su esterilización, se incubara de un dia a otro a 35 °C antes de utilizarlo. Rechácense los tubos que muestren crecimiento, burbujas o ambas cosas

Añádanse los ingredientes deshidratados al agua destilada, mézclese cuidadosa mente y caliéntese para disolverlos. El pH debe ser 6.8 después de la esterilización .Antes de esterilizarlo, colóquese en tubos de fermentación con un vial invertido una cantidad suficiente de medio como para que cubra este, al menos parcialmente, después de la esterilización. También es posible prescindir del vial invertido y añadir 0,01 G/L de purpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido, lo que indicaría un resultado positivo en esta parte de la prueba.

Ciérrense los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.

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Hágase el medio de lauril triptosa con fuerza suficiente como que para que al añadir 100 ml o 10 ml de muestra, la concentración de los ingredientes no sea menor que la del medio estándar. Ciérrese los tubos con tapones de metal o de plástico resistente al calor.

Añádanse los ingrediente deshidratados al agua, mézclese cuidadosamente y caliéntese para disolverlos .El pH debe ser de 6.9 después de la esterilización.Previamente colóquese la mezcla en tubos de fermentación en unas dimensiones que permitan que el líquido, en el tubo ya inoculado, cubra al menos parcialmente el vial invertido después de la esterilización. Se puede también prescindir del vial y añadir 0.01 g/l de purpura bromocresol al medio presuntivo para determinar la producción de ácido, lo que indicaría un resultado positivo en esa parte de la prueba. Ciérrese con tapones de metal o de plástico resistente al calor.

Hágase el medio de lactosa con fuerza suficiente como para que , al añadir 100 ml o 10 ml de la muestra al medio .La concentración con las directrices de la tabla anterior.

2.3 Procedimiento:

Agrúpese los tubos de fermentación en hileras de cinco en una gradilla para tubos de ensayo .El número y el volumen de los tubos de muestra seleccionados dependen de la cantidad y de las características del agua que se vaya a estudiar.Para agua potable, utilícense 5 porciones de 10 ml 0 10 porciones de 10 ml; si se trata de agua no potable, se utilizaran cinco tubos por dilución (de 10, 1 o 0,1 ml, etc.)

Al hacer las diluciones, mídanse los volúmenes de muestra diluida, Agítese enérgicamente la muestra y las diluciones unas 25 veces .Inocúlese cada tubo con volúmenes duplicados de muestra (en diluciones decimales crecientes, si se utilizan cantidades decimales de la muestra).

Mézclense las porciones a estudiar con el medio mediante agitación suave.Los tubos inoculados se incuban a 35. Tras 24 agítese cada tubo suavemente y se observa si se produce gas o un crecimiento acido (color amarillo) y , en caso contrario, re incúbese y vuélvase a examinar al final de 48 horas. Regístrese la presencia o ausencia de gas o acido .Sino se ha utilizado el vial, un crecimiento con acidez significa una presunta reacción positiva.

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2.3.1 Procedimiento de NMP para coliformes fecales

Existen procedimientos de alta temperatura para separar microorganismos delGrupo coliforme procedentes de fuentes fecales o no fecales. Las modificaciones de los procedimientos técnicos, la estandarización de los métodos y los detallados estudios de los miembros del grupo coliforme que se encuentran en las heces de algunos animales de sangre caliente comparados con los procedentes de otras fuentes ambientales, han reafirmado la importancia para determinar los coliformes fecales. La prueba puede hacerse con uno de los métodos de tubos múltiples aquí descritos o por medio de los métodos de filtro de membrana que se describen en el laboratorio último .El procedimiento en el que se emplea el medio EC proporciona una información adecuada sobre el origen del grupo coliforme (fecal o no fecal) cuando se utiliza en la prueba de confirmación .No debe utilizarse para el aislamiento directo de coliformes en el agua, ya que es necesario un enriquecimiento previo de un medio que se presuma infectado para conseguir un aislamiento óptimo de coliformes fecales .El procedimiento con medio liquido A-1 es un método de un solo paso que no requiere confirmación.

La prueba para coliformes fecales (con medio EC) es aplicable al estudio de la contaminación de corrientes , aguas naturales sistemas de tratamiento de aguas residuales ,aguas de baño, aguas marinas y para el control general de la calidad de todo tipo de agua .Sin embargo, no se recomienda como sustituto de la prueba completa para coliformes en el estudio de las aguas potables, ya que en las mismas no se pueden tolerar la presencia de ningún tipo de bacterias coliformes .La prueba utilizando medio A-1 es aplicable al agua de mar y a las aguas residuales tratadas.

2.3.2 Cálculo y registro del NMP.

Calcúlese y regístrese el número de hallazgos positivos de microorganismos del grupo coliforme (ya sea en las pruebas confirmatorias o completas) En términos del número más probable (NMP).Las tablas indican los valores del NMP para distintas series de siembras y resultados .En estas tablas , se contemplan límites de confianza del 95 por 100 para cada valor del NMP .Si los volúmenes de la muestra utilizados son los contenidos en las tablas ,comuníquese el valor correspondiente al número de resultados positivos y negativos en las series de forma de NMP/100 ml.

Los volúmenes de la muestra indicados en las tablas están relacionados de forma más específica con las aguas terminales. En la tabla ilustra los valores del NMP para combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se estudian volúmenes de cinco muestras de 10, 1.0 y 0.1 ml. En caso de que las series de diluciones decimales

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sean distintas de las de la tabla, selecciónense los valores del NMP de la tabla 9221:V por la combinación de tubos positivos.Tabla 9221: III Índice de NMP y Limites de aceptación del 95 por 100 para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean cinco porciones de 10 ml

Numero de tubos que dan reacción positiva de un total de cinco

Indice NMP/100 ml

Límites de confianza del 95 % (aproximados)

SUPERIOR INFERIOR

0 < 2.2 0 6.01 2.2 0.1 12.62 5.1 0.5 19.23 9.2 1.6 29.44 16.0 3.3 52.95 >16.0 8.0 Infinito

Tabla 9221: IV Índice de NMP y límites de aceptación del 95 por 100 para distintas combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se emplean diez porciones de 10 ml.

Numero de tubos que dan reacción positiva de un total de cinco de 10 ml cada

Indice NMP/100 ml

Límites de confianza del 95 % (aproximados)

SUPERIOR INFERIOR

0 < 1.1 0 3.01 1.1 0.03 5.92 2.2 0.26 8.13 3.6 0.69 10.64 5.1 1.3 13.45 6.9 2.1 16.86 9.2 3.1 21.17 12.0 4.3 27.18 16.1 5.9 36.8

9 23.0 8.1 59.510 <23.0 13.5 Infinito

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Cuando se utilicen más de tres diluciones en series de diluciones decimales, solo se tomaran los resultados de tres de ellas para calcular el NMP .Para seleccionar las tres diluciones a utilizar en la determinación del índice del NMP, enlijándose la dilución más alta con resultado positivo entre las cinco estudiadas (no hay ninguna dilución menor que hay dado un resultado negativo) y las dos siguientes diluciones más altas. Para calcular el índice del NMP, utilícense los resultados de estos tres volúmenes .En el ejemplo siguiente, los resultados de la dilución significativa se ofrecen en negritas. El numerador representa los tubos positivos y el denominador, el total de tubos estudiados, la combinación de positivos indica únicamente el número total de tubos positivos por dilución:

Tabla 9221: V Índice de NMP y límites de aceptación de 95 por 100 para distintas combinaciones de resultados positivos cuando se usan cinco tubos por dilución (10 ml, 1.0 ml, 0.1 ml, etc.)

Combinacion de positivos

Indice NMP/100

ml

Limites de confianza 95%

Combinacion de positivos

Indice NMP/100

ml

Limites de confianza 95%

Superior

Inferior

Superior

Inferior0-0-0

0-0-10-1-00-2-0

<2224

-1.01.01.0

- 101013

4-2-04-2-14-3-04-3-14-4-4

2226273334

9.012121516

5665677780

1-0-01-0-11-1-01-1-11-2-0

24466

1.01.01.02.02.0

1115151818

5-0-05-0-15-0-25-1-05-1-15-1-2

233040305060

9.01020102030

86110140120150180

2-0-02-0-12-1-02-1-12-2-02-3-0

4779912

1.02.02.03.03.05.0

172021242529

5-2-05-2-15-2-25-3-05-3-15-3-2

50709080110140

203040304060

170210250250300360

12


3-0-03-0-13-1-03-1-13-2-03-2-1

81111141417

3.04.04.06.06.07.0

242929353540

5-3-35-4-05-4-15-4-25-4-35-4-4

170130170220280350

805070100120160

410390480580690820

4-0-04-0-14-1-04-1-14-1-2

1317172126

5.07.07.09.012

3845465563

5-5-05-5-15-5-25-5-35-5-45-5-5

2403005009001600>=1600

100100200300600-

9401300200029005300-

2.3.3 PRUEBA DE PRESENCIA O AUSENCIA (P-A) DE COLIFORMES

La prueba de presencia-ausencia (P-A) de coliformes es una sencilla modificacióndel procedimiento de tubos múltiples. La simplificación que se deriva de utilizar una sola porción grande (100 ml) en una sola botella de cultivo para obtener una información cualitativa sobre la presencia o ausencia de coliformes, se justifica por la teoría de la falta de estos microorganismos en una muestra de 100 ml de agua potable. La prueba de P-A proporciona además una oportunidad opcional para hacer una detección sistemática posterior del cultivo y aislar otros indicadores (coliformes fecales, Aeromonas, Staphylococcus, Pseudomonas, estreptococos fecales y Clostridium), también de manera cualitativa. Otras ventajas son la posibilidad de estudiar un mayor número de muestras por unidad de tiempo y hacer estudios comparativos con el procedimiento de filtro de membrana, que indica que la prueba de P-A puede aumentar al máximo la detección de coliformes en muestras que contiene microorganismos que podrían sobrepasar en su crecimiento al de las colonias de coliformes, provocando problemas para su detección.

La prueba de P-A se recomienda para el estudio habitual de las muestras obtenidas en los sistemas de distribución o en las plantas de tratamientos de aguas. En principio, se estudian alrededor de 100 muestras por los métodos del filtro de membrana o de los tubos múltiples, además de la prueba de P-A. Una vez establecidos que los métodos cuantitativos suelen dar resultados negativos para coliformes, se pueden utilizar únicamente la prueba de P-A.Cuando una muestra produce un resultado positivo en esta prueba, se estudiaran las posteriores muestras repetidas mediante un método cuantitativo, hasta que se vuelvan a obtener resultados negativos en dos muestras consecutivas. Las muestras tomadas en

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localizaciones poco habituales, como los pozos privados, se analizaran con métodos de tubos múltiples o de filtro de membrana.

Prueba de P-A para coliformes, hágase la formula con una fuerza triple en caso de que vayan a estudiarse muestras de 100 ml .Disuélvanse los ingredientes del medio de lactosa y el de lauril triptosa, uno tras otro, en agua destilada sin calentar ,utilizando un instrumento de agitación. Disuélvase el púrpura bromocresol en 10 ml de NaOH al 0.1 N y añádase a la solución del medio.

Viértanse 50 ml del medio en una botella de dilución con tapón de rosca de 250 ml de volumen .No es necesario introducir un tubo de fermentación .Se pasa 12 minutos por el autoclave a 121 °C , limitando el tiempo total de autoclave a 30 minutos o menos. El pH debe ser de 6.8 después de la esterilización.

Procedimiento: Agítese la muestra unas 25 veces e inocúlese 100 ml en el medio de cultivo P-A .Mézclese cuidadosamente, invirtiendo la botella cuatro o cinco veces para conseguir una distribución uniforme del medio en la totalidad de la muestra .Incúbese a 35 y obsérvese a las 24 y 48 horas para detectar posibles reacciones acidas. Cuando se producen, la fermentación de la lactosa adquiere un claro color amarillo. Si también se producen gas, la suave agitación de la botella producirá espuma. Cualquier cantidad de gas acido o ambos constituyen un resultado presuntamente positivo, que requiere confirmación. Todos los cultivos que muestran reacción acida o formación de gas se pasan a un medio de verde brillante lactosa bilis (VBLB), que se incuba a 35 .C) INTERPRETACION: La aparición de gas en el medio VBLB en 48 horas confirma la presencia de bacterias coliformes, los resultados se comunican como prueba de presencia-ausencia positiva o negativa para coliformes totales en 100 ml de muestra.

Pruebas opcionales de p-a, la detección de coliformes fecales, estreptococos fecales u otras bacterias indicadores puede hacerse mediante una prueba de P-A, seleccionando adecuadamente los medios confirmatorios y el tiempo y temperatura de incubación. El tratamiento del agua y otras condiciones ambientales adversas suelen provocar alteraciones en las bacterias indicadoras, ampliando su fase de reposo antes de que se produzca el crecimiento logarítmico.

Si se amplía la incubación de la prueba de P-A a 72 o 96 horas, es frecuente que puedan aislarse otros microorganismos indicadores .No se deben aislar bacterias indicadoras .No se deben aislar bacterias indicadoras para regularlas después de los habituales 48 horas de incubación .No obstante, esta información podrá servir al laboratorio para advertir a la planta de tratamiento del agua de que esta presenta potenciales problemas de calidad.

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2.3.4 Procedimiento

Conservación y transporte de la muestra: Sitúese una compresa absorbente en el suelo de una placa de Petri estéril y satúrese con el medio de conservación de coliformes seleccionado (véase sección 9222C.2). Retírese el filtro de membrana de la unidad de filtración por medio de pinzas estériles y arróllese con el lado de la matriz hacia arriba, en la superficie del medio de conservación elegido. Protéjase la membrana de la pérdida de humedad cerrando bien la placa de Petri de plástico. Evítese la deshidratación de la membrana durante el transporte. Colóquese el disco de cultivo que contiene la membrana en un envase adecuado y envíese al laboratorio para completar el estudio. Puede mantenerse la muestra sin crecimiento visible durante un máximo de 72 horas en este medio de conservación/mantenimiento. Este tiempo suele bastar para su envío por correo o medio de transporte habitual. Si las temperaturas son elevadas, durante el trayecto aparecerá a veces crecimiento visible en el medio de transporte.

Transferencia: En el laboratorio, la membrana del disco de plástico en el que ha sido enviada se transfiere a una segunda placa de Petri estéril con medio M-Endo o LES Endo.

Incubación:Método M-Endo. Transfiérase la membrana del medio de conservación M-Endo a una compresa y a una placa de Petri con medio M-Endo sin los reactivos inhibidores del crecimiento e incúbese a 35 ± 0,5 "C durante 20-22 horas.Método LES. Transfiérase la membrana del medio de conservación LES MF al agar LES Endo (véase sección 9222B.2) e incúbese a 35 ± 0,5 ºC durante 20-22 horas. Si en el momento de la transferencia se observan colonias sin necesidad de aumento, consérvese la placa de Petri que contiene la membrana transferida a 5 -10 ºC hasta que pueda ser incubada a 35 ± 0,5 ºC durante 16 -18 horas. Esta manipulación del tiempo de incubación permite controlar los problemas de crecimiento excesivo y disipación del brillo que pueden interferir con el recuento de las colonias de coliformes.

Cálculo de la densidad de coliformesPrecédase como se indica en la anterior sección 9222B.6. Regístrese el momento de la toma de la muestra, de la filtración y del estudio en el laboratorio, y calcúlese el intervalo temporal transcurrido, que constará en el informe junto con los resultados.

2.3.5 Procedimiento de filtro de membrana para coliformes fecales

La densidad de bacterias coliformes fecales puede determinarse por un procedimiento de tubos múltiples o por una técnica de filtro de membrana (FM). Si se utiliza esta última para efluentes clorados, antes de aceptarla como alternativa válida hay que comprobar que suministre una información comparable a la que se obtiene por el análisis de tubos múltiples.

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En la técnica de FM se utilizan un medio de lactosa enriquecido y una temperatura de incubación de 44, 5 ± 0,2 ºC para conseguir selectividad, obteniéndose una exactitud del 93 por 100 en la diferenciación entre los coliformes que se encuentran en las heces de los animales de sangre caliente y los procedentes de toras fuentes ambientales. Dado que la temperatura de incubación es esencial, sumérjanse los cultivos de FM a prueba de agua (metidos en bolsas de plástico) en un baño de agua para poder incubarlos a esta elevada temperatura o utilícese una adecuada y exacta incubadora.

1. Materiales y medios de cultivo

a) Medio M-FC: La necesaria uniformidad obliga a emplear medios deshidratados. Nunca se preparan medios a partir de sus ingredientes básicos, si se dispone de medios deshidratados adecuados. Para la rehidratación, síganse las instrucciones de los fabricantes. También pueden utilizarse medios comerciales en forma líquida (ampollas estériles u otros), siempre que se sepa que sus resultados son equivalentes.

b) Medio M-FC:Triptosa o biosate 10,0 gProteosa peptona nº 3 o polipeptona 5,0 gExtracto de levadura 3,0 gCloruro Sódico, NaCl 5,0 gLactosa 12,5 gSales biliares nº 3 o mezcla de sales biliares

1, 5 g

Azul anilina 0,1 gAgua destilada 1 l

Rehidrátese en agua destilada con 10 ml de ácido rosólico al 1 por 100 en NaOH al 0,2 N. Caliéntese hasta casi ebullición, retírese rápidamente del calor y enfríese a menos de 50ºC. No se esteriliza en autoclave. Divídase en porciones de 5-7 ml y colóquese en placas de Petri de 50 x 12 mm donde se deja solidificar si se utiliza agar. El pH final debe ser de 7,4. Consérvese el medio preparado a 2-10ºC, rechazándose a las 2 semanas el no utilizado.

Compruébese cada lote de medio en función de su productividad, preparando diluciones de un cultivo de Escherichia coli (sección 9020) y filtrando volúmenes adecuados para obtener 20-80 colonias por filtro. Verifíquense en cada nuevo lote de medio 10 o más colonias obtenidas a partir de varias muestras naturales con objeto de establecer la ausencia de resultados positivos falsos.

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En la mayoría de las muestras se puede utilizar el medio M-FC sin necesidad de añadir ácido rosólico al 1 por 100, siempre que no se produzcan interferencias debidas al crecimiento de fondo. Estas interferencias son de esperar en aguas de lluvia que formen

2.3.6 Procedimiento de incubación retardada para coliformes fecales

Este procedimiento de incubación retardada es similar al que se utiliza para los coliformes totales (sección 9222C). No hay necesidad de disponer de un baño de agua de campo para hacer la incubación y libera al analista de la larga tarea que supone el recuento de las colonias. El estudio en el laboratorio central, en vez de hacerlo en el campo, permite confirmar las colonias e identificar por completo los microorganismos por medios bioquímicos, en caso necesario.

Los resultados que consigue este método retardado concuerdan con los obtenidos en pruebas estándar inmediatas en distintos laboratorios y en diversas condiciones de uso en el campo. Sin embargo, se deberá determinar la aplicabilidad de la prueba para una fuente de agua específica, comparándola con la estándar de filtro de membrana, sobre todo en casos de agua salada, aguas residuales cloradas y aguas que contengan sustancias tóxicas. La prueba retardada sólo se utilizará cuando no sea posible realizar la prueba habitual inmediata para coliformes fecales.

Para llevarla a cabo, fíltrese la muestra en el campo inmediatamente después de hacer la toma, colóquese el filtro en un medio de mantenimiento M-VFC (véase 2a, más adelante) y envíese al laboratorio. La prueba para coliformes fecales se completa pasando el filtro a un medio M-FC, incubándolo a 44,5 °C durante 24 + 2 horas y haciendo un recuento de las colonias de coliformes fecales.

El medio M-VFC mantiene viables los microorganismos coliformes fecales, pero evita UN crecimiento visible durante el transporte. El medio de mantenimiento M-VFC permite conservar los filtros de membrana hasta 3 días, sin que ello produzca un efecto importante sobre el recuento de estas bacterias.

Procedimiento, transporte del filtro de membrana: Colóquese una compresa absorbente en una placa Petri de plástico que cierre bien y satúrese con medio de mantenimiento M-VFC. Tras filtrar la muestra, retírese el filtro de membrana de la unidad de filtración y colóquese en la compresa saturada de medio.

Utilícense placas con cierre hermético para evitar la pérdida de humedad en la placa, aunque también hay que tener cuidado de que no haya exceso de líquido. Sitúese la placa con la membrana en un envase de transporte adecuado y envíese al laboratorio.

Las membranas pueden permanecer en el medio de transporte a temperatura ambiente 17


durante un máximo de 72 horas, sin que ello afecte de forma importante al recuento de coliformes fecales.

Transferencia: En el laboratorio, retírese la membrana del medio de mantenimiento y colóquese en otra placa con medio M-FC.

Incubación: Una vez situado el filtro en el medio M-FC, introdúzcanse las placas herméticas en bolsas de plástico sumergibles y sumérjanse en un baño de agua a 44,5 ± 0,2ºC durante 24 ± 2 horas, o bien utilícese una incubadora.

Recuento: Las colonias producidas por los coliformes fecales presentan distintos tonos de azul. Las colonias de coliformes no fecales son de color gris a cremoso. El recuento se realiza por medio de una lupa estereoscópica binocular de campo amplio y 10 a 15 aumentos.

2.4 Cálculo de la densidad de coliformes fecales

Regístrese el momento de la toma de la muestra, el de la filtración y el del estudio en el laboratorio, calculándose el intervalo de tiempo, que se hará constar en el informe.

En vez de tres muestras de cada concentración el este laboratorio haremos cinco.

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2.4.1 RESULADOS DE LA FASE PRESUNTIVA:

MUESTRA DILUCION N.M.P.(Coliformes totals) / 100ml1 ml 10-1 ml 10-2 ml

4/ 5 2 / 5 0 / 5 22*10=220Estanque de Arquitectura

4 / 5 0 / 5 0 / 4 13*10=130Estanque de Electrónica

DATOS DE IDENTIFICACIÓN:

Estanque de Arquitectura: Estanque de Electrónica:

Día: 24/10 Día: 24/10

Hora: 5:40 PM Hora: 5:40 PM

Temperatura: 20°C Temperatura: 18°C

MUESTRA DILUCION U.F.C/ 100ml1 ml 10-1 ml 10-2 ml142 57 6 57*1/(10^-1)Estanque de

Arquitectura

0 0 4 ------Estanque de Electrónica

U.F.C= N°Colonias/ Disolución

Si se observa turbidez y producción de gas: Prueba presuntiva positiva. Efectuar prueba confirmativa para todos los tubos positivos.

Ausencia de gas para todos los tubos aun cuando haya turbidez:

Prueba presuntiva negativa, por lo tanto, grupo coliforme ausente. Esquema de la prueba completa para la detección de los coliformes totales.

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2.5 Conclusiones

En la prueba de presunción (si se considera los resultados tras un supuesto monitoreo), se dé a presumir la presencia de coliformes en el ambiente de los estanques.Como se encontró tubos positivos en las muestras se tendrá que proceder a la prueba confirmativa en aquellos tubos positivos mencionados (en medio BVLB).

2.6 Recomendaciones

Tener precauciones Con el manejo del agar Realizar el procedimiento como se indicó. Las disoluciones de agua identificarlas bien.

3 Técnica de Fermentación de tubos múltiples: Fase confirmativa y Prueba de Coliformes Fecales y Termotolerantes.

3.1 Objetivos

Confirmar la presencia de los microorganismos (bacterias) presentes en los tubos positivos tras una prueba en el agar BVLB.


3.2.1 Verde Brillante Bilis 2% Caldo.

Este medio está recomendado para el recuento de coliformes totales y fecales, por la técnica del número más probable.

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En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepción de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentación de la lactosa con producción de ácido y gas.

Fórmula (en gramos por litro)Instrucciones

Bilis de buey 20.0 Suspender 40 g del polvodeshidratada deshidratado por litro de agua

Lactosa 10.0 destilada. Disolver y distribuir 10 mlPeptona 10.0 por tubo con campanita de Durham.Verde brillante 0.013

3Preparar además, el medio a dobleconcentración. Esterilizar enautoclave a 121°C durante 15minutos.

3.2.2 Siembra

a.- Para el análisis de coliformes totales en muestras fluidas, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo doble concentración y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentración.

Número de tubos

Volumen de la muestra

Volumen de medio

Concentración del medio

3 10 ml 10 ml Doble3 1 ml 10 ml Simple3 0.1 ml 10 ml Simple

b.- Para el análisis de coliformes totales en muestras sólidas (alimentos, cosméticos,

fármacos), efectuar diluciones seriadas 10-1, 10-2 y 10-3 y sembrar cada dilución por triplicado en medio de cultivo simple concentración.

Número de tubos

Dilución de la muestra

Volumen de la muestra

Volumen de medio

Concentración del medio

3 10-1 1 ml 10 ml Simple3 10-2 1 ml 10 ml Simple3 10-3 1 ml 10 ml Simple

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c.- Para análisis de coliformes fecales, a partir de cada tubo positivo en el test presuntivo de coliformes totales (proveniente de Verde Brillante y Bilis 2% Caldo o Mac Conkey Caldo ó Lauril Sulfato, utilizando la técnica del NMP), o a partir de colonias presentes en diferentes medios, que se presume sean coliformes, transferir una ansada a un tubo con Verde Brillante y Bilis al 2% caldo fresco, incubando a 45 +/- 0.5 ºC y otra en Agua Triptona con incubación a 35-37ºC, para detectar la producción de indol.

3.2.3 Incubación

Para de coliformes totales: a 35-37 °C durante 24 horas.Para coliformes (fecales): a 44.5-45.5 °C durante 24 horas.

3.2.4 Resultados

-Positivo: presencia de gas.Con el número de tubos positivos, calcular el número más probable. El resultado se expresa por gramos ó 100 ml de producto-Negativo: ausencia de gas.Características del medioMedio preparado: verde esmeralda, transparente

3.3 Procedimiento

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3.4 2.4. Resultados

Para Coliformes Fecales:

b) Prueba Confirmativa (media verde brillante bilis)

MUESTRA DILUCION1 ml 10-1 ml 10-2 ml4/ 5 * *Estanque de

Arquitectura

4 / 5 * *Estanque de Electrónica

* No se analizaron tubos con disoluciones 10^-1, ni 10^-2 de la muestra de agua de estanque, por los resultados de la prueba presuntiva.

3.5 Conclusiones

Se confirma la presencia de coliformes en la muestra obtenida del Estanque de Arquitectura y Electrónica.Dado los resultados tendremos que determinar el tipo de coliforme mediante una PRUEBA COMPLEMENTARIA.

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4 Identificación del Grupo Coliforme, Técnica de Fermentación en tubos múltiples; Prueba complementaria.

4.1 Objetivos

Determinar la presencia de bacterias gran no esporuladas procedentes de los cultivos con agar (Demostración del grupo coliforme)

Ver si el tipo de coliforme es del tipo fecal o no fecal.

Ver qué tipo de bacteria se presenta en las muestras mediante una prueba IMVIC


4.2.1 EL GRUPO COLIFORME

Este grupo de bacterias comprende todos los bacilos aerobios y anaerobios facultativos, Gram negativos, no esporulados que producen ácido y gas al fermentar la lactosa. Las especies clásicas de este grupo son Escherichia Coli y Enterobacter aerogenes.

La relación de estos microorganismos con otros del grupo enterico –Salmonella, Shigella, Proteus, pseudomonas y alcaligenes, todos los cuales son bacilos Gram negativos no esporulados coli, como ya había sido señalado, es un habitante normal del intestino humano y de los animales. Ent aerogenes es más frecuentemente en granos y plantas pero también en las materias fecales. Como estas especies tienen gran semejanza en su aspecto morfológico y características de cultivo, es necesario recurrir a pruebas bioquímicas para diferenciarlas. Reacciones que tengan las siguientes cuatro características son muy importantes para lograr este propósito:Capacidad para producir indol.E. coli lo produce, y Ent aerogenes no.

Cantidad de ácido producida en un medio especial de caldo glucosado adicionado del indicador rojo de metilo .Los dos microorganismos producen acido de la glucosa .Sin embargo, E coli produce pH más bajo, lo que hace que vire al rojo de metilo ,mientras que Ent aerogenes no cambia el color.

Capacidad para producir acetilmetilcarbinol en un medio de peptona glucosado. Este compuesto químico se detecta por la reacción de Vogues-Proskauer E. coli no produce acetilmetilcarbinol mientras que Ent. Aerogenes si lo hace.

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Utilización del citrato de sodio. Ent aerogenes es capaz de utilizar el citrato de sodio como su única fuente de carbono, esto es, se desarrollara en un medio de cultivo químicamente definido en el cual el citrato de sodio es el único compuesto de carbono .E. coli no se desarrollara en estas circunstancias.Por conveniencia, a estas pruebas se le ha designado de forma colectiva reacciones IMVIC (I=indol, M=rojo de metilo, Vi=reacción vogues-Proskauer y C= Citrato).En la tabla mostrada a continuación se aprecia las reacciones de cada una de las especies típicas .Las reacciones de los microorganismos del grupo coli-aerogenes.

ORGANISMOREACCIONINDOL ROJO

DE METI

VOGES- PROSKAUER

CITRATO

Escherichia coli

+ + - -

Enterobacter aerogenes

- - + +

Diferenciación de las cepas típicas de Escherichia coli de enterobacter aerogenes en base de las reacciones IMVIC

Desafortunadamente no son tan claras como las que describen aquí. Algunos cultivos responden con otras combinaciones de reacciones a este esquema de pruebas y generalmente se les conoce como tipos intermedios. Además, hay especies del género Klebsiella y Citrobacter que se parecen a los coliformes y de las cuales es necesario obtener datos bioquímicos y serológicos más detallados para poder diferenciarlas.

4.2.2 TECNICA DE FILTRACION POR MENBRANAS

La técnica de filtración por membrana para el examen bacteriológico del agua, que consiste en los siguientes pasos:Un disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración.

Se hace pasar un volumen de agua por el disco filtrante, las bacterias serán detenidas en la superficie de la membrana.

Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorbente que previamente se ha saturado con el medio de cultivo apropiado. Las almohadillas absorbentes con los discos filtrantes se acomodan en cajas de Petri de tamaño especial, las cuales se incuban.

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Después de la incubación, se desarrollaran colonias sobre el disco filtrante en cualquier lugar donde hayan quedado bacterias atrapadas donde hayan quedado bacterias atrapadas durante el proceso de filtración

Esta técnica tiene muchas aplicaciones útiles, algunas de ellas de las cuales son:

Se pueden examinar grandes volúmenes de agua; teóricamente casi cualquier volumen de agua se puede filtrar a través del disco y los microorganismos de cualquier volumen quedaran en el disco.

La membrana se puede pasar por un medio a otro con un propósito de seleccionar y diferencias los microorganismos.

Se obtienen resultados más rápidos que con los métodos convencionales.

Se logran estimaciones cuantitativas de ciertos tipos de bacterias, como coliformes, cuando se usan los medios apropiados.

Esta técnica con algunas modificaciones, ha sido adoptada para muchos procedimientos microbiológicos diferentes a los del examen del agua.

4.2.3 TECNICA DEL FILTRO DE MENBRANA PARA MIENBROS DEL GRUPO DE LOS COLIFORMES

La técnica de filtro de membrana (FM) es altamente reproducible, puede utilizarse para estudiar volúmenes relativamente grandes de muestra y proporciona resultados numéricos más rápidos que el método de los tubos múltiples. La técnica del filtro de membrana es extraordinariamente útil para controlar las posibles situaciones de urgencia en relación con el agua potable y para estudiar distintas aguas naturales .Sin embargo, esta técnica tiene limitaciones, s o b r e todo para estudiar aguas con elevada turbidez o que contenga bacterias no coliformes. Para esta agua, y también en caso de que no se haya utilizado anteriormente la técnica de filtro de membrana, es preferible llevar a cabo pruebas paralelas mediante la técnica de fermentación en tubos múltiples demostrar la aplicabilidad y comparabilidad de aquella.

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1 DEFINICION

En lo que se refiere a la técnica de filtro de membrana, el grupo coliforme puede definirse como el formado por las bacterias aerobias y anaerobias facultativas, Gram negativas, no esporuladas y de forma alargada, que desarrollan una colonia roja con un brillo metálico en un medio tipo Endo que contenga lactosa tras una incubación de 24 horas a 35°C .Al estudiar cultivos purificados de bacterias coliformes , se observa una reacción de citocromo oxidasa(CO) negativa y una de (ONPG) positiva. En esta técnica, todas las colonias rojas, rosadas, azules blancas o incoloras que no tienen brillo suelen ser consideradas como no coliformes.

2. APLICACIONES

La turbidez producida por la existencia de algas u otro tipo de material puede impedir el estudio de un volumen de muestra suficiente para obtener resultados significativos. La presencia de un elevado número de no coliformes o de sustancias toxicas puede dar lugar a un cálculo de coliformes inferior al real .La técnica del FM es aplicable al estudio de las aguas saladas, pero no al de aguas residuales que solo han recibido un tratamiento primario, seguido de cloración, debido a su turbidez en muestras de grandes volúmenes o a su contenido en metales o compuestos orgánicos tóxicos del tipo de los fenoles.

Para detectar los coliformes totales alterados en el agua potable tratada y en las aguas residuales secundarias o terciarias cloradas, utilícese el método destinado a recuperar los microorganismos en condiciones anómalas para los coliformes fecales , se recurre a la técnica de fermentación en tubos múltiples, siempre que los resultados deban utilizarse para obligar al cumplimiento de las normas.Puede emplearse una modificación para coliformes fecales de la técnica del filtro de membrana, si los estudios paralelos con la técnica de fermentación en tubos múltiples muestran resultados comparables para tipos de muestra específicos de una localización.El volumen estándar que se va a filtrar en las muestras de agua potable es de 10 ml que, si es necesario, puede distribuirse a lo largo de varias membranas. El agua potable tratada no debe contener coliformes por 100 ml, por lo que las plantas de tratamiento de agua deben tomar en consideración el estudio de muestras de 1.1 de agua terminal, siempre que no existan partículas que interfieran en la filtración o el desarrollo de colonias aisladas.

En estos casos, divídase las m u e s t r a s en cuatro porciones de 250 ml y comuníquese la totalidad de coliformes observados en todas las membranas .Para otro tipo de aguas o en análisis especiales, pueden utilizarse muestras de mayor o menor volumen.

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La comparación estadística de los resultados obtenidos con el método de los tubos múltiples y el de filtro de membrana muestran la mayor precisión de este último, Aunque los datos de ambas pruebas den resultados bastante precisos sobre la calidad del agua , los resultados numéricos no son idénticos. En el caso de aguas naturales, es lógico esperar que el 80 por 100 de los análisis de filtro de membrana estén dentro de los límites de confianza del 95 por 100 de los resultados de la prueba completa de tubos múltiples .Es de esperar que los resultados de la prueba de tubos múltiples superen los del filtro de membrana, debido a una desviación estadística positiva.

4.2.4 Procedimiento estándar de filtro de membrana para coliformes totales

Instrumental de Laboratorio

Los análisis del filtro de membrana requieren instrumental de vidrio y otros aparatos fabricados sin agentes que pueden producir efectos adversos sobre el crecimiento bacteriano. Anótense cuidadosamente todas las desviaciones que se produzcan sobre las recomendaciones expuestas más adelante y háganse pruebas cuantitativas para demostrar que estas desviaciones no han introducido agentes o factores que den lugar a condiciones menos favorables para el crecimiento bacteriano.

Esterilícese el instrumental de vidrio como se describe en Lavado y Esterilización, sección 9040.

Antes de esterilizarlos, tápese la boca de los cilindros graduados con papel metálico u otro papel adecuado.Envases del medio de cultivo: Para reducir la contaminación bacteriana, utilícense matraces de vidrio boro silicato limpios y pre esterilizados. Se pueden utilizar matraces de cualquier forma y tamaño, pero para conseguir una buena mezcla del medio y para su conservación los más recomendables son los erlen meyer de tapones metálicos, los cubiertos con papel metálico o los que tienen tapón de rosca.

Placas de cultivo: Utilícense placas estériles de vidrio boro silicato o desechables del tipo Petri de 60 mm u otro tamaño adecuado. Las placas de vidrio para cultivo, limpias y envueltas por separado o en número adecuado en papel metálico, se esterilizan con calor seco o en papel adecuado en caso de que la esterilización se realice en autoclave.

Las placas de cultivo de vidrio y algunas de plástico desechables tienen a veces tapaderas mal ajustadas, lo que se procurara evitar durante perdida de humedad por evaporación, que provocaría la desecación del medio y la pérdida del ambiente húmedo adecuado para un óptimo desarrollo de las colonias.

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También pueden utilizarse placas de plástico desechables que ajustan bien y cumplan las normas antes expuestas.

Existen en el mercado placas de plástico estériles que son adecuadas para este método.Unidades de filtración: El equipo de soporte de filtro (fabricado en vidrio, plástico resistente al autoclave, porcelana o acero inoxidable) consiste en un embudo sin junturas, unido a una base por un artefacto de cierre o manteniendo en su lugar mediante una fuerza magnética. El diseño debe permitir que el filtro de membrana se mantenga con seguridad sobre la placa porosa del receptáculo, sin que sufra daño mecánico, de manera que todo el líquido pase a través de la membrana durante la filtración.Para esterilizarlo en el autoclave antes de guardarlo, ensuélvase en papel fuerte, separando ambas partes del equipo.

También se puede tratar con luz ultravioleta (sin envuelto en papel) antes de volver a utilizarlo, en caso de que se estén llevando a cabo serie de filtraciones.Las unidades de campo pueden desinfectarse con una llama de alcohol metílico o sumergiéndolas en agua hirviendo durante 5 minutos .Las partes plásticas no se esterilizan a la llama. Pueden utilizarse unidades de campo estériles desechables.

Para la filtración, móntese el receptáculo del equipo del soporte del filtro en un matraz de 1.1 con un tubo latral y presión diferencial (34-51 KPa) sobre el filtro de membrana. Conéctese el matraz a una bomba eléctrica de vacío con un filtro de bomba actuando sobre la presión del agua, un aspirador manual u otro medio para asegurar la presión diferencias (138-207 kPa). Conéctese un matraz de la misma capacidad entre el matraz de filtración y la fuente de vacío para atrapar el agua que se escape.Filtro de membrana: Utilícense filtros de membrana (para otras características, véase la sección 9020) con un diámetro de poro que permita una completa retención de las bacterias coliformes.

Solo se emplearan filtros en los que se dé una velocidad de filtración satisfactoria (en 5 minutos), ausencia de influencias significativas sobre el pH del medio (no más de y que no produzca un aumento en el número de colonias confluentes o expansivas, en comparación con los filtros de membrana de control .Las membranas marcadas con una trama se utilizaran de forma que no inhiban ni estimulen el crecimiento bacteriano cuando se incuben con las bacterias retenidas en un medio adecuado.

Es preferible utilizar filtros de membrana recientes y, si es necesario guardarlos, se hará en un ambiente sin cambios extremos de temperatura o humedad. No deberán comprarse en cantidades anuales superiores a las necesarias.

Es preferible utilizar filtros de membrana pre esterilizado cuyos fabricantes garanticen que la técnica de esterilización no ha inducido toxicidad no alterada las propiedades físicas o químicas de la membrana. Si se esterilizan las membranas en el

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laboratorio .Pásense 10 minutos por la autoclave a 121 ° C .Al finalizar la esterilización, déjese que el vapor escape rápidamente para reducir en lo posible la acumulación de agua de condensación en los filtros.

Las almohadillas absorbentes consisten en discos de papel de filtro u otro material garantizado por el fabricante en lo que se refiere a la alta calidad y a la ausencia de sulfitos u otras sustancias que puedan inhibir el crecimiento bacteriano .Utilícense almohadillas de 48 mm de diámetro y un grosor suficiente para absorber 1,8-2,2 ml de medio. Las almohadillas absorbentes esterilizadas o las esterilizadas posteriormente en el laboratorio deben liberar menos de i mg de acidez total (calculada como) al titularlas titularlas al punto extremo de fenolftaleína, pH 8.3 utilizando NaOH al 0.02 N Y producir valores de pH 7 las almohadillas se esterilizan al mismo tiempo que los filtros de membrana envueltos en papel fuerte resellable o bien de forma separada en envases adecuados.

Antes de utilizarlas, deben estar secas y sin restos visibles de humedad.Pinzas. Utilícense pinzas sin dientes, que se esterilizaran antes de utilizarlas, sumergiéndolas en alcohol etílico al 95 por 100 o en alcohol metílico absoluto y a la llama.Incubadoras: Utilícense incubadoras a una temperatura de 35 que mantengan una humedad elevada (alrededor de un 90 por 100 de humedad relativa).

Microscopio y fuente de luz: El recuento de las colonias que existen en los filtros de membrana se realiza mediante una lupa de 10 a 15 aumentos y bajo una fuente de luz fluorescente fría ajustada para que de un discernimiento máximo del brillo .Lo mejor es emplear una lupa estereoscópica binocular de campo amplio.No se debe utilizar un iluminador de microscopio con un sistema óptico de concentración de luz por una fuente de luz incandescente cuando se trata de estudiar las colonias de coliformes en un medio de tipo Endo.

MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

La necesidad de uniformidad obliga a emplear medios deshidratados .Siempre que existan medios deshidratados adecuados, no se utilizaran medios preparados a partir de sus ingredientes básicos.Para rehidratar y esterilizar los medios se seguirán las instrucciones de los fabricantes. También pueden utilizarse medios líquidos comerciales (ampollas estériles u otros), si se sabe que ofrece resultados equivalentes. Para que las características del control de calidad de los medios.

Compruébese la productividad de cada nuevo lote de medios preparando diluciones de un cultivo de enterobacter aerogenes y filtrando volúmenes adecuados que permitan obtener 20-80 colonias por filtro. Compruébese para cada nuevo lote de medio Endo , un mínimo de 10 por 100 de colonias de coliformes obtenidas a partir de muestras naturales, con objeto de establecer la exactitud diferencial del lote del medio.

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4.2.5 Procedimiento de filtro de membrana para Klebsiella

Klebsiella, un género incluido en el grupo de coliformes fecales según se ha definido aquí, puede producir crecimientos de coliformes en los sistemas de distribución del agua y suele ser un componente importante de la población de coliformes en la pulpa de papel, textil y otros residuos industriales. La población coliforrne normal de las heces del hombre y de otros animales de sangre caliente puede contener de un 30-40 por 100 de cepas de Klebsiella. Alrededor de un 4 por 100 de los casos de neumonía bacteriana y de un 18 por 100 de las infecciones urinarias se deben a cepas patógenas de Klebsiella.Un 85 por 100 de estas cepas clínicas son coliformes fecales. Las fuentes ambientales, como la vegetación, las pulpas de papel, la producción textil, la caña de azúcar y los productos de las granjas, contribuyen con un 71-80 por 100 a la población total de Klebsiella en los coliformes totales. Esla bacteria se encuentra a veces en los sedimentos de las redes de distribución de agua, como consecuencia de una inadecuada protección de las fuentes, tratamientos insatisfactorios o alteraciones en los sistemas de conducción.

Un procedimiento de filtro de membrana permite llevar a cabo cuantificaciones rápidas mediante una modificación de la base de agar M-FC, sustituyendo la lactosa por inositol y añadiendo carbenicilina, o bien utilizando un medio de agar M-Kleb. Estos métodos disminuyen la necesidad de someter las cepas puras a pruebas bioquímicas.

Se recomienda una verificación preliminar de las colonias diferenciadas.

1. InstrumentalPlacas de cultivo: Véase la sección 9222B.1e para las especificaciones.Unidades de filtración: Véase la sección 9222B.1f.

2. Materiales y medios de cultivoAgar M-FC modificado (agar M-FCIC): Este medio no se encuentra a veces en forma deshidratada, por lo que habrá que prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

Caliéntese et medio hasta ebullición y añádanse 10 ml de ácido rosólico disuelto en NaOH al 0,02 N. Enfríese por debajo de 45ºC y añádanse 50 mg de carbenicilina. No esterilizar en el autoclave. El pH debe ser de 7,4.

Esterilícese en autoclave durante 15 minutos a 121 °C. A continuación, enfríese a 50°C en un baño de agua; añádanse 20 ml de alcohol etílico al 95 por 100 (no desnaturalizado) y 0,05 g de carbenicilina/l. Agítese con cuidado y divídase asépticamente en placas de

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cultivo de plástico de 50 x 9 mm. El pH final debe ser de 7,4 ± 0,2. El medio preparado puede conservarse durante 20 días a 4°C.

Procedimiento

Para elegir et tamaño de la muestra y el procedimiento de filtración, véase sección 9222B.5. Colóquese el filtro de membrana sobre la superficie del agar e incúbese durante 24 ± 2 horas a 35 ± 0,5 °C. Las colonias de Klebsiella en el agar M-FCIC son azules o gris azuladas. La mayoría de las colonias atípicas son marrones o pardas. En ocasiones se dan resultados positivos falsos debidos a especies de Enterobacter. Las colonias de Klebsiella en el medio de agar M-Kleb son de colores azul escuro o azul grisáceo, mientras que las demás suelen ser rasadas o, a veces, amarillo pálido. Hágase el recuento con una lupa estereoscópica de campo amplio de bajo aumento (10-15) o cualquier otro instrumento óptico.

Verificación.

Compruébense las colonias de Klebsiella del primer lote de muestras de aguas ambientales y efluentes y también cuando se sospeche su presencia en los sistemas de distribución de agua. Compruébese un mínimo de cinco colonias típicas, pasando el crecimiento de la colonia o cultivo puro a un sistema comercial de multiprueba para especificación de Gram negativos. Las pruebas claves para Klebsiella son citrato (positivas), indol (negativas), motilidad (negativas), lisina decarboxilasa (positivas), ornitina decarboxilasa (negativas) y ureasa (positivas). La Klebsiella de origen no fecal puede identificarse mediante correlación entre la producción de indol y la licuefacción de pectina con la capacidad para crecer a 10 "C y una respuesta negativa a las pruebas de coliformes fecales

4.2.6 Procedimiento de incubación retardada para coliformes totales

La modificación de la técnica estándar del filtro de membrana permite transportar la membrana tras la filtración hasta un laboratorio alejado donde sea posible incubarla y finalizar la prueba. Esta prueba de incubación retardada resulta conveniente en los casos en que no sea posible poner en práctica los procedimientos habituales. También se puede recurrir a ella:

a) cuando sea imposible mantener la temperatura deseada de la muestra durante su transporte;

b) si el tiempo transcurrido entre la toma de la muestra y su análisis supera el límite de tiempo admitido;

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c) cuando la toma de muestra se realiza en un lugar lejano al laboratorio; d) en caso de que sea necesario controlar la calidad de las aguas de efluentes o que se lleve a cabo actividades de control de contaminación por un procedimiento estándar, o e) por cualquier razón que impida el análisis de la muestra en o cerca del lugar de la toma. Para comparación de los datos de las muestras de incubación retardada haciendo que sus resultados son concordantes con los de la prueba inmediata en estudios independientes de muestras realizadas en aguas dulces y saladas. Determínese la aplicabilidad de la prueba de incubación retardada para un tipo concreto de agua, comparando los resultados con los del análisis realizado con Ion métodos habituales.

Para realizar la prueba de incubación retardada, fíltrese la muestra sobre el campo inmediatamente después de hacer la toma, colóquese el filtro en el medio de transporte y envíese al laboratorio. Complétese en éste la determinación de coliformes pasando la membrana a un medio M-Endo o LES-Endo e incubándola a 35 ± 0,5 "C durante 20 -22 horas, para, por último, hacer el recuento de colonias típicas de coliformes. El medio de transporte está pensado para mantener viables los microorganismos coliformes y, en general, impedir un crecimiento visible durante el mismo. Los agentes bacteriostáticos de los medios de mantenimiento/conservación inhiben el crecimiento de los microorganismos, pero permiten un crecimiento normal de coliformes una vez pasados a un medio fresco.

La prueba de incubación retardada es semejante al método descrito para coliformes totales según el procedimiento del filtro de membrana, salvo en lo que se indica seguidamente. Se exponen dos métodos alternativos, uno con medio de conservación M- Endo y otro con medio de mantenimiento LES MF.

Métodos M-Endo:

Medio de conservación M-Endo: Prepárese de la forma descrita en la sección 9222B.26. Tras el enfriamiento a menos de 45 °C, añádanse asépticamente 3,84 g de benzoato de sodio (calidad USP) por 1 o 3,2 ml de una solución de benzoato de sodio al 12 por 100 a 100 ml de medio. Mézclense los ingredientes y divídanse en porciones de 5 - 7 ml, que se colocan en placas de Petri de 50 x 12 mm. Manténganse las placas a 2 – IO °C rechazando las no utilizadas después de 96 horas.

Solución de benzoato de sodio: Disuélvanse 12 g de NaC7H5O2 en suficiente agua destilada para obtener 100 ml. Esterilícese en autoclave o por filtrado a través de un filtro de membrana con poros de 0,22 m de diámetro. Deséchese después de 6 meses.

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Método LES

Medio de mantenimiento LES MF:Rehidrátese en agua destilada. Caliéntese hasta casi ebullición para disolver el agar, retirándose rápidamente del calor y enfriándolo a menos de 50 °C. Añádanse asépticamente 1,0 g de benzoato de sodio, 1,0 g de sulfanilamida y 0.5 g de cicloheximida. Tras mezclarlo, repártase en porciones de 5 – 7 ml que se vierten en placas de Petri de 50 x 12 mm. Éstas se guardan a una temperatura de 2 – 10ºC y se eliminan a las 2 semanas. El pH final debe ser de 7,1 0,1.

4.2.7 Prueba del indol

El indol es un producto del metabolismo del triptófano.Reactivos:

Medio: Utilícese medio líquido con triptófano. Disuélvanse 10,0 g de triptona o tripticasa/I de agua destilada. Divídase en porciones de 5 ml en tubos de ensayo y esterilícese.

Reactivo de prueba: Disuélvanse 5 g de parametil aminobenzaldehído en 75 ml de alcohol isoamílico (o amílico normal) de calidad ACS y añádanse 5 ml de HCL conc. El reactivo debe ser amarillo. Algunos lotes de paradimetil aminobenzaldehído no son satisfactorios y los aceptables se estropean con el paso del tiempo.La solución de alcohol amílico debe tener un pH inferior a 6,0. Tanto el alcohol amílico como el compuesto de benzaldehido deben comprarse en pequeñas cantidades en función del volumen de trabajo que se vaya a realizar.

Procedimiento: Inocúlense porciones de 5 ml de medio con un cultivo puro e incúbense a 35 ± 0,5 °C durante 24 ± 2 horas. Añádanse 0,2-0,3 ml del reactivo y agítese. Déjese reposar unos 10 minutos y obsérvense los resultados.Existe reacción positiva a la prueba del indol cuando aparece un color rojo oscuro en el alcohol amílico; si se mantiene el color original del reactivo, la prueba es negativa. Un color naranja indica probable presencia de escatol, un producto de la degradación del indol.

4.2.8 Prueba del rojo de metilo

La prueba del rojo de metilo mide el pH terminal, es decir, marca la producción por las bacterias de ácido a partir de la glucosa. Las reacciones metabólicas demostradas por la aparición de gas y rojo de metilo, y la prueba de Voges-Proskauer están relacionadas entre sí y resultan útiles para diferenciar los miembros del grupo de los coliformes.

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Reactivos:

Medio: Utilícese medio líquido tamponado de glucosa. Disuélvanse 5,0 g de proteasa peptona o peptona equivalente, 5,0 g de glucosa y 5,0 g de fosfato de hidrógeno dipotasio (K2HPO4) en 1l de agua destilada. Divídase en porciones de 5 ml en tubos de ensayo y esterilícese en la autoclave a 121 ° C durante 12-15 minutos, asegurándose de que el tiempo total de exposición al calor no supera los 30 minutos.

Solución indicadora: Disuélvanse 0,1 g de rojo de metilo en 300 ml de alcohol etílico al 95 por 100 y dilúyanse hasta 500 ml en agua destilada.

Procedimiento: Inocúlense con un cultivo puro porciones de 10 mi del medio. Incúbense a 35 °C durante 5 días. Añádanse 5 gotas de la solución indicadora de rojo de metilo a 5 ml del cultivo.

En la mayoría de los casos, basta con una incubación de 48 horas, pero no deben hacerse incubaciones inferiores a este tiempo. Si los resultados de la prueba son equívocos a las 48 horas, repítase la misma con cultivos incubados durante 4-5 días. En estos casos, incúbense cultivos duplicados a 22 a 25 °C. Compruébense los cultivos a los 2, 3, 4 y 5 días, ya que el resultado positivo puede aparecer antes del último día.

Comuníquese como resultado positivo la aparición de un color rojo, mientras que un color claramente amarillo constituye un resultado negativo. Los matices intermedios son resultados cuestionables, que indican posiblemente una purificación incompleta del cultivo.

4.2.9 Prueba de Voges-Proskauer

Esta prueba detecta la acetoína, producida metabólicamente por determinadas bacterias coliformes en un medio de peptona glucosa.

Reactivos

Medios: Utilícese el medio descrito para la prueba diferencial del rojo de metilo o un medio de sal peptona glucosa. Disuélvanse 10,0 g de polipeptona o proteasa peptona, 5,0 g de cloruro de sodio (NaCl) y 10,0 g de glucosa en 1l de agua destilada; el pH debe ser de 7,0-7,2.

Prepárense porciones de 5 ml en tubos de ensayo, que se esterilizan en el autoclave a 121 °C durante 12-15 minutos, comerciales de un solo uso de este reactivo

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son cómodas y económicas, pero hay que utilizarlas con precaución. Cuando sea preciso hacer gotear directamente el reactivo sobre las colonias, utilícense placas de agar soja tríptica, ya que las de agar nutritivo dan resultados inconsistentes; al extender una porción de una colonia sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo, hay que tener cuidado de que no lleve medio.

Procedimiento: Tómese con un asa de platino o aplicador de madera o plástico, o con una barra de vidrio, alguna de las colonias del agar y extiéndase sobre la tira de papel. No debe utilizarse hierro u otro alambre reactivo, ya que pueden producir resultados positivos falsos. La reacción a la oxidasa es positiva si a los 10 segundos se desarrolla un intenso color púrpura. Deben probarse al mismo tiempo cultivos positivos y negativos. Cuando se utiliza el reactivo en forma líquida, se hace gotear sobre las colonias de la placa de cultivo. Las colonias positivas desarrollan un color rosa, que vira progresivamente a marrón, rojo oscuro y, por último, negro.

4.2.10 DIFERENCIACIÓN

Se definen los coliformes como bacilos Gram negativos no esporulados que fermentan la lactosa, dando lugar a la formación de gas en 48 horas a 35 °C, o que cuando se utiliza el método del filtro de membrana, producen colonias rojo oscuro con brillo metálico a las 24 horas de incubación en un medio tipo Endo con lactosa. Sin embargo, pueden encontrarse cepas anaerogénicas (no productoras de gas) que fermentan la lactosa de Escherichia coli, así como coliformes no productores de brillo metálico en medio Endo. Estos microorganismos, así como los coliformes típicos, pueden ser considerados como organismos indicadores, pero se excluyen de la definición actual de coliformes para distinguirlos, es necesario recurrir a pruebas distintas de las aquí presentadas.Características y pruebas

Se presentan las características de los microorganismos indicadores sobre varios sustratos que constituyen la base para su mayor diferenciación. No todas las especies muestran siempre las reacciones características. Las pruebas IMViC pueden bastar en algunos casos, aunque por lo general sólo permiten una identificación parcial.

Las pruebas de decarboxilasa con útiles, las de Usina decarboxilasa ayudan a distinguir las Citrobacter de Arizona y las de ornitina decarboxilasa, pendiente de agar urea y motilidad, son adecuadas para diferenciar Klebsiella de Enterobacter. La preparación de los medios y reactivos diferenciales puede ser más costosa para muchos laboratorios que la utilización de equipos multiprueba comerciales ya preparados y envasados, que permiten reducir el trabajo de control de calidad.

Los equipos pre-empaquetados son fáciles de conservar y utilizar, y ofrecen resultados reproducibles y exactos; sin embargo, hay que comprobar periódicamente sus reacciones

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con cultivos conocidos de bacterias para asegurar la exactitud y reproducibilidad de los resultados. Si estos equipos dan resultados equívocos, hay que realizar nuevas pruebas. Más adelante se citan varios equipos comerciales ampliamente evaluados.

4.2.11DIFERENCIACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES

En ocasiones, es necesario identificar a las bacterias que forman el grupo de coliformes fecales para Establecer la naturaleza de la contaminación. Pueden utilizarse las pruebas diferenciales sabiendo que todas las cepas taxonómicamente asignadas al grupo de los coliformes no se ajustan necesariamente a la definición de coliformes establecida en el manual, ya que a veces no fermentan la lactosa o, si lo hacen, pueden no producir gas. Además, existen otras bacterias Gram negativas que, como los coliformes, fermentan la lactosa y producen brillo (por ejemplo, Aeromonas spp.) y no todas las cepas de una especie reaccionan en el medio de manera uniforme. Los microorganismos lesionados o mutados no dan a veces las respuestas clásicas. Las tradicionales pruebas IMViC (es decir, utilización del indol, el rojo metilo, el Voges-Proskauer y el citrato) son útiles para diferenciar los coliformes, pero no proporcionan una total identificación, siendo necesario recurrir a pruebas bioquímicas adicionales. Los equipos comerciales de identificación son alternativas útiles y económicas a los tradicionales medios de diferenciación.

SIGNIFICACION DE LOS DISTINTOS TIPOS DE COLIFORMES

El significado de los distintos tipos de coliformes que existen en el agua ha sido y es objeto de amplios estudios. En conjunto, se considera a los coliformes como indicadores, ya que indican la existencia de heces humanas o animales. En las heces se pueden encontrar todo tipo de coliformes. Aunque E. coli se encuentra casi siempre en las contaminaciones recientes procedentes de animales de sangre caliente, también pueden hallarse otros coliformes en casos de contaminación en los que aquél no existe. Los géneros Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter y Escherichia suelen representar la mayor parte de los microorganismos aislados en aguas naturales y suministros de aguas municipales tratadas, siendo Enterobacter el que se aísla con mayor frecuencia, si bien no todos los coliformes tienen necesariamente su origen en las aguas de alcantarilla. E. coli es el coliforrne más afectado por los tratamientos habituales del agua. Los microorganismos coliformes, algunos de los cuales son saprofitos de vida libre, pueden multiplicarse en la- vaderos de cuero, madera, cuerdas de piscina y empaquetadoras de yute, y producir a veces cienos en el interior de las tuberías. La diferenciación de los coliformes tiene valor en el momento de determinar la fuente de la que procede el aumento de su densidad y que es consecuencia de la multiplicación de microorganismos sobre o dentro de materiales orgánicos. La presencia de un gran número de coliformes del mismo tipo en el agua de un pozo o manantial o en un solo grifo de un sistema de distribución sugiere que se ha producido la citada multiplicación.

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Los residuos industriales contienen elevadas concentraciones de elementos nutritivos para las bacterias y pueden favorecer grandes sobre crecimiento de coliformes en aguas efluentes y afluentes. Estos crecimientos pueden también aparecer en los sistemas de distribución de aguas tratadas. Aero monas y otras bacterias Gram negativas oxidasa positivas y Erwinia pueden encontrarse en las aguas naturales y tratadas. Estos dos géneros no son bacterias indicadoras, según la definición aquí utilizada.

Tras la detección del gas. Siémbrense las placas de forma que se asegure la existencia de algunas colonias aisladas separadas por al menos 0,5 cm .Si existen coliformes y se quiere obtener una elevada proporción de aislamientos satisfactorios, se deben tomar las siguientes precauciones:

Utilícese un asa estéril de 3 mm de diámetro o una aguja de inoculación ligeramente curvada en la puntaAbrase e inclínese el tubo de fermentación evitando la toma con el aguja de cualquier membrana o espumaIntrodúzcase el extremo del asa o la aguja en el líquido del tubo a una profundidad de alrededor de 0.5 cmSiémbrese la placa con la parte curvada de la aguja en contacto con el agar para no arañar la superficie .Se flameara el asa entre los cuadrantes segundo y tercero para mejorar el aislamiento de las colonias.

Incúbense las placas invertidas a 35 0.5 °C durante 24 2 horas

Las colonias que se desarrollan en el agar LES Endo pueden ser típicas (rosas a rojo oscuras con un brillo metálico verde superficial),atípicas(rosas, rojas ,blancas o incoloras sin brillo ) a las 24 horas de incubación o negativas(todas las demás).Tómense de cada placa una o más colonias típicas bien definidas o, si no existen , dos o más entre las que se consideran como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se pasan a un tubo de fermentación con medio de lauril triptosa y a uno con agar en pendiente (Este último no es necesario si se trata de muestras de agua potable.)

Si se considera adecuado, utilícese una lupa para colonias a fin de conseguir un aumento optimo a la hora de tomarlas de las placas de agar LES Endo .Al transferir las colonias hay que elegir las que están bien aisladas y tocar apenas su superficie con una aguja esterilizada a la llama y enfriada al aire para evitar en lo posible el peligro de transferir un cultivo mixto.

Incúbese los tubos con el medio secundario (medio liquido de lauril triptosa con viales de fermentación invertidos) a 35 durante 24 2 horas; si no se produce gas en este periodo se prolonga la incubación hasta 48 .

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Estúdiese microscópicamente las preparaciones teñidas con GRAM y obtenidas en los cultivos de pendiente de agar a las 24 horas, correspondientes a los tubos secundarios que muestres gas.

Tinción de Gram. Si se trata de muestras de agua potable, se puede prescindir de la tinción de Gram en la prueba completa, ya que es raro que existan bacterias gran positivas y microorganismos esporulados sobrevivientes en este método de detección selectiva.

Existen varias modificaciones de la técnica de Gram. Utilícese la modificación de Hucker para teñir las extensiones de cultivos puros: Inclúyase un control para organismos Gram positivos y otro para Gram negativos.

Prepárense emulsiones distintas de los crecimientos bacterianos en estudio y de los cultivos de control positivos y negativos sobre la misma porta, utilizando para ello gotas de agua destilada colocadas en el cristal. Déjense secar al aire y Fíjense pasando el porta sobre una llama para después teñirlo con la solución de Oxalato de amonio-cristal violeta.

A continuación, aclárense con agua corriente y aplíquese la solución de Lugol durante un minuto.

Lávese de nuevo el porta teñido con agua corriente. Decolórese durante 15-30 segundos con alcohol acetona, manteniendo el porta entre los dedos y dejando que el alcohol acetona fluya por la extensión teñida hasta obtener un líquido incoloro. No debe decolorarse en exceso. Contrástese con safranina durante 15 segundos, lávese con agua corriente, séquese con papel de filtro o al aire y estúdiese al microscopio .Los microorganismos Gram positivos son azules y los Gram negativos rojos. Los resultados solo son aceptables cuando los controles dan la reacción adecuada.

4.3 Procedimiento

Las colonias que se desarrollan en el agar LES-Endo pueden ser típicas (rosa o rojo oscuro con brillo metálico superficial), atípicas (rosas, rojas, blancas o incoloras sin brillo) a las 24 horas de incubación o negativas (todos los demás)Tomar de cada placa una o más colonias típicas bien definidas y si no existen, dos o más entre los que se consideran como probablemente formadas por microorganismos del grupo coliforme y se pasan a un tubo de fermentación con medio caldo lauril-triptosa y a uno con agar en pendiente.Sembrar las placas de forma que se asegure la existencia de algunas colonias aisladas, separadas por al menos 0.5 cm.

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Escoger una colonia discreta típica o atípica separadas 0.5cm.Tubo con Lauril Triptosa. Tubo con Agar Nutritivo. Incubar los Tubos con el medio caldo Lauril Triptosa invertido a 35ªC durante 24hrs

4.4 Resultados

MEDIO LES ENDO OBSERVACIONGrupo Baño FIA Colonias atípica Sin Brillo verde metálico

Bebedero de Química Colonias atípica Sin Brillo verde metálico

Estanque de Arquitectura Colonias atípica Sin Brillo verde metálico

Filtro de Membrana:

MUESTRA RESULTADO LAURIL

Baño FIA Hubo crecimiento de colonias rosadas en el Medio Les- Endo

Bebedero de Química

Hubo crecimiento de colonias rosadas en el Medio Les- Endo

Estanque de Arquitectura

Hubo crecimiento de colonias rojas en el Medio Les- Endo

MUESTRAS FORMACION DE GAS EN CALDO

COLORACION GRAM

Estanque de Arquitectura

+ Gram ( - ) bacilos cortos no esporulados

Estanque deElectrónica

+ Gram (+) diplococos

5 Conclusiones

Se debe realizar de nuevo la prueba ya que en la última parte experimento se utilizaron muestras distintas los bebederos de química y del baño de la FIA.

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Se presume que hay presencia de bacterias escherichia coli en el estanque debido a que en el día del muestreo se encontró fauna acuática (presencia de peces).

La filtración mediante el método de filtro de membrana se realizó con total satisfacción logro separar del agua a la sustancia considerada coliforme.En la prueba complementaria se encontraron bacilos cortos gran negativos pero en las pruebas no se pudo determinar debido a algunas incongruencias, lo cual debe levantarse lo más antes posible con un intento adicional de dicha prueba, además de eso no se dieron los resultados en la parte de la Determinación del Grupo Coliforme.

El demorarnos semanas haciendo las pruebas probablemente influencio en los resultados al momento de la observación.

6 Recomendaciones

Debemos extender el cultivo para una mejor observación en el microscopio ya sea para el caso del Gram +, Gram – o cualquier otro.

Las pruebas no deben durar mucho ya que la mayoría de ellas solo está hecha para hacerla en un par de días y no semanas como nosotros demorábamos.

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7 Bibliografía

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http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/es/

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Métodos Normalizados en el análisis de Agua y desagües.

Elementos de Microbiología –MICHAEL PELCLZAR.

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seleccion de coliformes

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