МЕЖДУНАРОДНЫЙЖУРНАЛПРИКЛАДНЫХ ИФУНДАМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ №4,2018

111 СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕНАУКИ УДК636.1:619

ВИРУСНАЯ РИНОПНЕВМОНИЯ ЛОШАДЕЙ  И МЕТОДЫ ЕЕ ДИАГНОСТИКИ

Кадыкоев Р.Т., Кагермазов Ц.Б., Пежева М.Х.ФГБОУ ВО «Кабардино-Балкарский государственный аграрный университет им. В.М. Кокова»,

Нальчик, e-mail: mpiezhieva@mail.ru

Коневодческаяотрасль,вместесмолочнымимяснымскотоводством,являетсяоднимизприоритетныхнаправленийразвитияживотноводствавКабардино-БалкарскойРеспублике, гдедовольнопродолжитель-ноевремязанимаютсяразведениемнетолькокабардинскойпородылошадей,ноичистокровнойверховойи арабскойпород.Основойдля этого являютсяисторическиепредпосылкии особыеприродно-климати-ческие условия в республике с ее богатейшими высокогорными альпийскими пастбищами. Инфекцион-ныеболезнилошадейнаносятсущественныйущербконеводствуиособенноплеменномуконнозаводствувследствиесниженияплеменнойиспортивнойценностипереболевшихлошадей,затратналечение,каран-тинныхмероприятий,срываплановспортивныхсоревнованийидругихэкономическизначимыхпричин.Вируснаяринопневмониялошадей,относящаясякгерпесвируснойинфекциилошадейисамостоятельнаявиммуногенномотношении,встречаетсявконеводческиххозяйствахКабардино-Балкарии.Лабораторныеметодыеедиагностикиимеютопределенныенедостаткиисложности.Предлагаетсяболееспецифичныйичувствительныйметоддлядиагностикивируснойринопневмониилошадей–методполимеразнойцепнойреакции(ПЦР),основанныйнамногократнойрепликацииспецифическогоучасткануклеотиднойпоследо-вательности, катализируемый термостабильнойДНК-полимеразой.Приводятся результаты лабораторныхисследований для обнаружения вируса ринопневмонии в пробах из органов взрослых лошадей,жеребятиабортированныхплодовсподозрениемнавируснуюринопневмониюлошадейнаперевиваемыхклеткахМДВК,ПЭКриметодомполимеразнойцепнойреакции(ПЦР).

Ключевые слова: вирусная ринопневмония лошадей, метод полимеразной цепной реакции, герпесвирусные инфекций лошадей, ДНК вируса, Таg-полимераза, амплификация, праймер

VIRAL RHINOPNEUMONITIS HORSES AND METHODS OF ITS DIAgNOSTICSKadykoev R.T., Kagermazov Ts.B., Pezheva M.Kh.

Kabardino-Balkarian State Agrarian University named after. V.M. Kokov, Nalchik, e-mail: mpiezhieva@mail.ru

Thehorsebreeding industry, togetherwithdairyandmeatcattlebreeding, isoneof theprioritydirectionsoflivestockdevelopmentintheKabardino-BalkarianRepublicandforquitealongtimeareengagedinbreedingnotonly theKabardianbreedofhorses, but also thoroughbredhorse andArabbreeds.Thebasis for this is thehistoricalprerequisitesandspecialnaturalandclimaticconditionsintherepublicwithitsrichesthigh-altitudealpinepastures.Infectiousdiseasesofhorsescausesignificantdamagetohorsebreedingand,especially,pedigreehorsebreedingdue to thedecrease in thepedigreeandsportsvalueofsicklyhorses, thecostof treatment,quarantinemeasures,disruptionofsportscompetitionsandothereconomically important reasons.Viral rhinopneumoniaofhorses,relatedtoherpesvirusinfectionofhorsesandindependentinimmunogenicrelation,occursinhorsefarmsofKabardino-Balkaria.Laboratorymethodsfor itsdiagnosishavecertaindisadvantagesanddifficulties.Amorespecificandsensitivemethodforthediagnosisofviralrhinopneumoniainhorsesisproposed,thepolymerasechainreaction(PCR)methodbasedonmultiplereplicationofaspecificregionofthenucleotidesequencecatalyzedbyathermostableDNApolymerase.Theresultsoflaboratorytestsforthedetectionoftherhinopneumoniavirusinsamplesfromtheorgansofadulthorses,foalsandabortedfetuseswithsuspicionofviralrhinopneumoniaofhorsesontransducedcellsofMDVK,PECR,andpolymerasechainreaction(PCR)arepresented.

Keywords: viral rhinopneumonia of horses, polymerase chain reaction method, herpesvirus infections of horses,  DNA of virus, Tag-polymerase, amplification, primer

Коневодческая отрасль, вместе с мо-лочнымимяснымскотоводством,являетсяодним из приоритетных направлений раз-витияживотноводствавКабардино-Балкар-ской Республике.Основой для этого явля-ютсяисторическиепредпосылкииособыеприродно-климатические условия в респу-блике с ее богатейшими высокогорнымиальпийскимипастбищами.

Кабардино-Балкария является однойиз республикСеверногоКавказа, гдемно-го естественных угодий с богатым раз-нотравьем. Только естественные горныепастбища занимают около 260 тыс. га. Из

них труднодоступных территорий, где нетвозможности содержать молочных коров,свыше200тыс.га.Наэтихпастбищахвус-ловиях горного климата и рельефа можноэффективновыпасатьвтечениедлительно-гопериода (смаяпоноябрь)местных,ка-бардинскойпородылошадей[1].

В республике довольно продолжитель-ное время занимаются разведением нетолько кабардинской породы лошадей, ноичистокровнойверховойиарабскойпород.Последние используются в спортивныхцелях, и численность поголовья их посто-янно растет. Племенные лошади, предна-

INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED AND FUNDAMENTAL RESEARCH №4,2018

112 AgRICULTURAL SCIENCES значенные для гладких скачек, сосредото-ченывдвухконныхзаводах–МалкинскомиКабардинском,атакжеучастныхконеза-водчиков.Большойвкладвразвитиеотече-ственного коневодства внесли известныене только в Кабардино-Балкарской Респу-блике,ноивовсейРоссийскойФедерацииконевладельцы–В.К.Секреков,Р.Б.Фиров,А.З.Дышеков, А.Ж.Бифов, Д.А.Налоев.Вцеляхповышениягенетическогопотенци-алаплеменныхиспортивныхкачествунихв конюшнях сосредоточенывысокоценныескаковые племенные лошади, завезенныевразныегодывРоссиюизтакихстран,какАнглия,США,Франция,Аргентина.

Каждыйгод,вскаковойсезон,спортив-ныхлошадейпостоянновывозят запреде-лы Кабардино-Балкарии для испытанияиучастиявскачках.Вэтихусловияхвсегдавозрастает риск заноса инфекций, а затеми проявления различных заразных заболе-ваний лошадей. Инфекционные болезнилошадей наносят существенный ущербконеводству и особенно племенному кон-нозаводству вследствие снижения племен-нойиспортивнойценностипереболевшихлошадей, затрат на лечение, карантинныхмероприятий, срыва планов спортивныхсоревнований и других экономически зна-чимых причин. Наибольшую опасностьпредставляют высококонтагиозные массо-выезаболеваниявируснойибактериальнойприроды.Ктакимзаболеваниямможноот-нести сальмонеллезный аборт, лептоспи-роз,мыт,грипп,герпесвирусныеинфекциилошадей(ГВЛ).

Последниезаслуживаютособоговнима-ния,таккакдиагностикаипрофилактикаихимеютопределенныесложности.Герпесви-русылошадейразделяютнатритипа,само-стоятельные в иммуногенном отношении:1–возбудительринопневмонии–вирусно-гоаборталошадей(ГВЛ-1);2–латентныйвирус лошадей, относящийся ко второмутипу(ГВЛ-2);3–возбудителькоитальнолйполовойэкзантемы(ГВЛ-3).Изтрехтиповвирусовнаибольшийущербконеводствуна-носитГВЛ-1илиринопневмония.Экономи-ческий ущерб, наносимый инфекционнойринопневмониейлошадей,складываетсяизпотери воспроизводительной способностиконематок,выбраковкиценныхплеменныхживотных,затратнапроведениеветеринар-но-санитарных мероприятий. Вестествен-ных условиях вирус поражает лошадей,ословимуловнезависимоотпола,породыи возраста. Чистокровные лошади болеевосприимчивы к возбудителю, чем полу-кровкииместныепороды.Ринопневмониялошадей, возникнув в коневодческом хо-зяйстве,принимаетхарактерстационарной

инфекции.Остроетечениеинфекциичере-дуется с периодами стертого, атипичногопроявленияболезни,чтокрайнеосложняетпостановку диагноза.[2]. Респираторныештаммы ринопневмонии преимуществен-нопоражаюторганыдыхания,афетальныевызываютабортвовторойполовинежере-бости.Однаководнойпопуляциилошадей(отдельная конеферма, табун, коневодче-ское хозяйство) возможно существованиеи независимое друг от друга воспроизве-дениеобоихтиповГВЛ-1(респираторногои фетального). Каждый из них обуславли-вает вспышки заболевания, которыемогутнакладываться одна на другую[3]. Вирусраспространяетсяаэрогеннымиликонтакт-нымпутем.

Фетальные штаммы вируса передают-сяаэрогенно,контактно,трансплацентарноилиприслучкечерезполовыеорганы.

Немаловажное значение имеет такжеизучениедругихвидоизмененныхштаммовгерпесвирусов лошадей. Впоследнее вре-мяпоявляютсяновыевариантыиштаммывозбудителей известных инфекций. Ана-лизируя заболеваемость лошадей разноговозраста, можно предположить, что гам-магерпесвирусы играют существеннуюроль в патологии респираторных органовэтих животных. Гаммагерпесвирус типа 5лошадей был идентифицирован в Австра-лиив1970г.ужеребят,вСССРонвпервыебылобнаруженулошадейв1974г.Однако,этиологическаярольихвинфекционнойпа-тологииоставалосьнедостаточнопонятной.Впоследнее время появились доказатель-ства,чтогаммагерпесвирустипа5частовы-зывает поражение нижнего отдела органовдыханияулошадейразноговозраста.ВИта-лииГВЛ5идентифицировалиметодомПЦРвносовыхсмываху73%молодых(1–3-лет-них)лошадейиу80%старшеговозраста[4].Установлено,чтоГВЛ5ассоциируетсяспа-тологиейоргановдыхания(хроническаяилиподостраяпневмония),вызываядеструкциюлегочнойткани–интерстициальнаяилифи-брознаяпневмониипреимущественноуло-шадей2–6-летнеговозраста[5].

Раннийдиагноз,установленныйпривоз-никновении первых случаев заболевания,имеет большое значение для своевремен-ной организации мероприятий по борьбесинфекцией.Внастоящеевремясуществу-ют различные методы лабораторной диа-гностики вирусной ринопневмонии лоша-дей:выявлениевируса per se (электроннаямикроскопия),выявлениеиидентификациявирусов посредством взаимодействующихснимклеток(световаямикроскопия,куль-туральный метод), вирусологические ме-тоды (обнаружение антигена вируса с по-

МЕЖДУНАРОДНЫЙЖУРНАЛПРИКЛАДНЫХ ИФУНДАМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ №4,2018

113 СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕНАУКИ мощьюИФА,МФАидр.),выявлениеДНКинфекционного агента (полимеразная цеп-ная реакция,метод дот-гибридизации), се-рологическиеметодыдиагностики(выявле-ние специфических противогерпетическихантител).Вместестемнекоторыеизпере-численных методов диагностики даннойболезни имеют определенные недостатки.Так,серологическиеметодынеимеютдиа-гностической ценности при исследованиисывороток абортировавших кобыл. Объяс-няетсяэтотем,чтоабортнаступаетобычноспустя один-три месяца после инфициро-ваниядыхательныхпутейкобылыиктомувремени титр комплемент-связывающихантителостаетсяпримернонатомжеуров-не.Присутствиевирусавплоденевызываетукобылыувеличенияколичестваантител.

Гистологическое исследование наибо-лееширокоиспользуетсявпрактике,одна-ко его ценность относительно ограничена,таккаквисследуемомматериаленевсегдаудается обнаружить характерные внутрия-дерныетельца–включенияДимока.Чащевсего их обнаруживают в ядрах эпители-альныхклетокбронхиолиальвеол,атакжеклетокпечени.

Приведенныепричинныефакторы,свя-занные с несовершенством и некоторыминедостатками методов и средств диагно-стикиринопневмониилошадей,осложняютпроведение эффективных мероприятий пооздоровлениюнеблагополучныхпо данно-му заболеванию коневодческих хозяйств.Вместе с тем предварительная клинико-инструментальная диагностика респира-торной формы герпесвирусной инфекциитипаГВЛ-1 также затруднительна, так каксимптомы заболевания сходны с клиникойдругихвирусныхболезней,особенногрип-па. Подозрение на ринопневмонию можетлишь возникнуть при нарастании случаевабортоввовторойполовинежеребости.

Впоследниегодынаосноведостижениймолекулярнойбиологииученыеинтенсивноразрабатываютновыеметодыдиагностикивирусных болезней сельскохозяйстенныхживотных.Дляидентификациигерпесвиру-совживотныхширокоприменяюттакиевы-сокочувствительные методы исследованиягенома,какрестрикционныйанализ,поли-меразную цепную реакцию, секвенирова-ние,молекулярнуюгибридизацию.Изэтихметодов в настоящее время широкое рас-пространение в лабораторной диагностикеотдельныхвирусныхболезнейполучилме-тод полимеразной цепной реакции (ПЦР),в основе которой лежит многократная ре-пликация специфического участка нуклео-тидной последовательности, катализируе-мый термостабильной ДНК-полимеразой.

ПЦР-селективнаяамплификация (фактиче-скиклонирование)некоегофрагментаДНКin vitro.Являясьсамымчувствительнымнасегодняшний день методом обнаруженияинфекционных агентов, ПЦР не требуетиммунологическогоответанапроникнове-ниевозбудителяворганизмхозяина,чтопо-зволяетустановить заболеваниенараннихстадиях.СпецифичностьПЦРиколичествоамплифицируемой ДНК, которое опреде-ляет чувствительность, могут значительноварьировать в зависимости от концентра-ции и качества 5 основных компонентовреакционной смеси (ДНК-матрицы, Tag-полимеразы,праймеров,dNTPиионовMg)и температурного режима ПЦР. Неспеци- фичностьПЦР-амплификацииповышаетсяпри снижении температуры отжига нижеоптимальной,атакжеприувеличениикон-центрацийпраймеровиdNTP,температурыотжига (уменьшается выход специфиче-ской амплифицируемойДНКвплоть до ееполногоисчезновения)вышеоптимальныхзначений. Подбор праймеров – ключевоезвеноПЦР,именноониопределяютампли-фикацию и выявляют нужную последова-тельность,атакжечрезвычайнуюгибкостьметода. Для разработки праймеров требу-ется подобрать такой фрагмент молекулыДНК, который отличался бы генетическойконсервативностью и присутствовал толь-коуинтересующеговидамикроорганизмовиливисследуемомгене[6].Высокаяспец-ифичностьметодаплимеразнойцепнойре-акцииобусловленатем,чтовисследуемомматериале выявляется уникальный, харак-терный только для данного возбудителяфрагмент ДНК. Специфичность задаетсянуклеотидной последовательностью прай-меров, что исключает возможность полу-чения ложных результатов, в отличие отдругихметодовлабораторнойдиагностики,в частности метода иммуноферментногоанализа,гденередкиошибкивсвязиспере-крестнореагирующимиантигенами.Всвязисэтимнаосноверестрикционногоанализагеномареференс-штаммаКентуки-Двирусаринопневмониилошадейразработаннаборпрепаратов для проведения полимеразнойцепнойреакцииприидентификациивирусаринопневмониилошадей[2].

Цель данной работы – выявление ви-руса ринопневмонии лошадей с диагно-стическойцельюна перевиваемых культу-рах клетокМДВК путем культивированияипассированияиДНКвирусаметодомпо-лимеразной цепной реакции (ПЦР) в про-бахпатологическихматериалов, взятыхотпавшихжеребят, вынужденно забитых ло-шадейиабортированныхплодовсподозре-ниемнаринопневмонию.

INTERNATIONAL JOURNAL OF APPLIED AND FUNDAMENTAL RESEARCH №4,2018

114 AgRICULTURAL SCIENCES

Материалы и методы исследованияПатологический материал для проведения ла-

бораторныхисследованийвзялиотпавшихжеребят,вынужденно забитых лошадей и абортированныхплодовсподозрениемнаринопневмониювдвухко-нефермахЧегемскогорайонаКабардино-Балкарии.

Исследованиенавыявлениевирусаринопневмо-ниилошадейпроводилинаперевиваемыхкультурахклетокМДВК,ПЭКрпутемкультивированияипас-сирования.ДляобнаруженияДНКвирусаринопнев-мониилошадейвпробахпатологическогоматериалаиспользовали специальный набор препаратов дляпроведенияполимеразнойцепнойреакцииприиден-тификациивирусаринопневмониилошадей,разрабо-танный на основе рестрикционного анализа геномареференс-штамма Кентукки-Д вируса ринопневмо-ниилошадей.

Сцелью выделения ДНК к 0,1–0,5 мл вирус-содержащей суспензии в буфере ТЕ (20 мМ Трис-НСI, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) добавляли протеиназуК(100 мкг/мл), раствор саркозината натрия (0,5%)и30мининкубировалипритемпературе56°С.ПоследвукратнойэкстракциифеноломДНКизводнойфазыосаждали2,5объемамиперегнанногоэтанола.Полу-ченныетакимобразомпрепаратыДНКхранилипритемпературеминус20°С.

Для постановки полимеразной цепной реакциипробу исследуемой ДНК в объеме 5 мкл амплифи-цировалив50мклреакционнойсмеси,содержащей10 nM каждого праймера, 200 мкМ каждого дезок-синуклеотидтрифосфатов, 10 мМ трис-НСI, рН 8,3,50мМКСI,3,0мМMgCI²ии2,5ед.Таg-полимеразы.Вкачестве праймеров использовали нуклеотиднуюпоследовательность гена гликопротеина ВштаммаКентукки-Д вируса ринопневмонии лошадей. Дляамплификации в ПЦР фрагментов ДНК вируса ри-нопневмонии использовали две пары праймеров-«внешние»(Д1+Д2,размер602п.о.)и«внутренние»(Д3+Д4,размер472п.о.)Амплификациюпроводилив термоциклере «Touch Down», Hybaid (Англия) по

следующейпрограмме:денатурацияпри94°Свтече-ние30с,отжигпри55°С–30с,синтезпри72°С–50с.Всегопровели35циклов.АликвотыПЦРпро-дуктовобъемом5–10мкланализировалив2,0%-номагарозномгеле.

Результаты исследования  и их обсуждение

Результаты проведенных исследованийпредставленывтаблице.

Для обнаружения вируса ринопневмо-ниилошадейвисследуемыхпатологическихматериалахвзяликусочкиизразныхоргановмассой 100–150 мг, затем их гомогенезиро-валииразводиливбуфереТЕ(2,0%вес/об). Наличие вируса в полученной таким об-разом суспензии проверяли пассированиемна перевиваемых культурах клеток МДВКиПЭКр.Послепятипоследовательныхпас-сажей на перевиваемых культурах клетокМДВК и ПЭКр, инфекционный вирус ри-нопневмониилошадейневыявили.

Результаты дальнейших исследованийтакже показали, чтоДНК вируса ринопнев-мониилошадейобнаруженыв7пробах(селе-зенка,лимфатическиеузлы,легкие,головноймозг)павшихжеребятиз11проб.Ворганахвынужденно убитых лошадей с подозрени-емнаринопневмониюДНКвирусавыявилитолько после второй амплификации с гнез-довыми параметрами Д3+Д4, результатив-ность обнаружения ДНК составила 37,5%.Наибольшее количество положительно реа-гирующихпробвыявленовпробахпатологи-ческогоматериала,взятыхсоргановпавшихжеребятисоставил28пробили63,6%.Приэтом после первого цикла амплификации

РезультативностьвыявленияДНКвирусаринопневмонии приисследованиипроборгановлошадей

Животные Пробыорганов Иссл.проб

КультураклетокМДВК

ПЦРД1+Д2 Д3+Д4

пробы % пробы %Взрослыелошади

Головноймозг 8 8/0 8/0 0 8/3 37,5Лимфатическиеузлы 8 8/0 8/0 0 8/2 25,0

Всего 16 16/0 16/0 0 16/5 31,2Павшиежере-

бятаГоловноймозг 11 11/0 11/2 18,2 11/5 45,4

Лимфатическиеузлы 11 11/0 11/3 27,3 11/4 36,3Легкие 11 11/0 11/3 27,3 11/4 36,3

Селезенка 11 11/0 11/2 18,2 11/5 45,4Всего 44 44/0 44/10 22,7 44/18 40,9

Абортирован-ныеплоды

Головноймозг 12 12/0 12/2 16,6 12/4 33,3Лимфатическиеузлы 12 12/0 12/3 25,0 12/3 25,0

Легкие 12 12/0 12/4 33,3 12/2 16,6Селезенка 12 12/0 12/2 16,6 12/4 33,3

Всего 48 48/0 48/11 22,9 48/13 27,1

П р и м е ч а н и е .Числитель–количествоисследованныхпроб;знаменатель–положительныхпроб.

МЕЖДУНАРОДНЫЙЖУРНАЛПРИКЛАДНЫХ ИФУНДАМЕНТАЛЬНЫХИССЛЕДОВАНИЙ №4,2018

115 СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕНАУКИ спраймерамиД1+Д2составило22,7%,по-слевторогоциклаамплификацииспраймера-миД3+Д4выявлениеДНКвирусавпробахголовного мозга, средостенных лимфатиче-скихузлов,легкихиселезенки–40,9%.

Впробах абортированных плодов приисследовании методом полимеразнойцепной реакции с применением двух парпраймеров, обнаружение ДНК вируса ри-нопневмониисоставило22,9%и27,1%со-ответственно.

Выводы1.Эпизоотическиевспышкиразнойин-

тенсивности вирусной ринопневмонии на-рядусгриппомлошадейпроявляютсявко-неводческиххозяйствахКБР.

2.Проведенные исследования показы-вают, что для диагностики вирусной ри-нопневмонии у лошадей определенныепреимущества имеет метод полимеразнойцепнойреакции.

3.Данный метод является более прак-тичным, специфичным и чувствительнымдляопределенияДНКвирусаринопневмо-

нии лошадей в клинических образцах отинфицированныхживотныхиабортирован-ныхплодовипозволяетустановитьдиагнозв течение нескольких часов по сравнениюсдругимиизвестнымилабораторнымиме-тодами.

Список литературы 

1.КагермазовЦ.Б.,КадыкоевР.Т.Сохранениеиразви-тиекабардинскойлошади//Коневодствоиконныйспорт.–2006.–№2.–С.2–4.

2.ЦыбановС.Ж.,ЦыбановаЛ.Я.,КадыкоевР.Т.Кала-бековМ.И.ИдентификациявирусаринопневмониилошадейспомощьюПЦР//Ветеринария.–2000.–№4.–С.20–23.

3.ЮровК.П.,ЗаблоцкийВ.Т.,КосминковН.Е.Вирус-ныеболезнилошадей.–М.:Зоомедлит,2010.–256с.

4.Юров К.П., Алексеенкова С.В. Выявление новыхинетипичныхштаммоввирусовприреспираторныхболез-нях крупного рогатого скота и лошадей// Ветеринария. –2014.–№12.–С.8–12.

5.ЮровК.П.,АлексеенковаС.В.,ЮровГ.К.Герпесви-рус лошадей 5 – возбудитель фиброза легких// Ветерина-рия.–2013.–№3.–С.17–21.

6.Тупота Н.Л., Тупота С.Г., Донченко Н.А. Методымолекулярной биологии и их использование в диагности-ке туберкулезаживотных//Ветеринария. – 2012. –№3. – С.26–30.