sequence and structural elements emcv

8/2/2019 Sequence and Structural Elements EMCV

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1992, 66(3):1602.J. Virol.

G M Duke, M A Hoffman and A C Palmenbergvirus RNA translation.contribute to efficient encephalomyocarditisSequence and structural elements that

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J O U R N A L O F V I R O L O G Y , M a r . 1 9 9 2 , p . 1 6 0 2 - 1 6 0 9 V o l . 6 6 , N o . 30 0 2 2 - 5 3 8 X / 9 2 / 0 3 1 6 0 2 - 0 8 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t 1 9 9 2 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

S e q u e n c e a n d S t r u c t u r a l E l e m e n t s T h a t C o n t r i b u t e t o E f f i c i e n tE n c e p h a l o m y o c a r d i t i s V i r u s RNA T r a n s l a t i o nGREGORY M. DUKE, MICHAEL A . HOFFMAN, AND ANN C . PALMENBERG*I n s t i t u t e f o r M o l e c u l a r V i r o l o g y a n d D e p a r t m e n t o f V e t e r i n a r y S c i e n c e , U n i v e r s i t y o f W i s c o n s i n ,M a d i s o n , W i s c o n s i n 5 3 7 0 6

R e c e i v e d 2 3 A u g u s t 1 9 9 1 / A c c e p t e d 2 5 N o v e m b e r 1 9 9 1T h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e 5 ' n o n t r a n s l a t e d r e g i o n o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s ( E M C V - R u e c k e r t ) w a sd e t e r m i n e d , a n d a c o n s en s u s RNA s t r u c t u r a l m o d e l f o r t h i s s e q u e n c e ( 8 5 0 b a s e s ) a n d t h r e e o t h e r p o l y ( C ) -c o n t a i n i n g c a r d i o v i r u s e s ( m e n g o v i r u s , EMCV-B, a n d EMCV-D) w a s c r e a t e d t h r o u g h r e i t e r a t i v e u s e o f am i n i m u m - f r e e - e n e r g y f o l d i n g a l g o r i t h m . T h e RNA e l e m e nt s w i th i n t h i s r e g i o n w h i c h c o n t r i b u t e t o t r a n s l a t i o no f EMCV p r o t e i n s w e r e m a p p e d i n c e l l - f r e e r e a c t i o n s p r o g r a m m e d w i t h c D N A - d e r i v e d RNA t r a n s c r i p t s . T h ed a t a p r o v i d e e v i d e n c e t h a t s t e m - l o o p m o t i f s I , J a n d K , f o r m e d b y v i r a l b a s e s 4 5 1 t o 7 8 5 , a r e i m p o r t a n tc o m p o n e n t s o f c a p - i n d e p e n d e n t t r a n s l a t i o n . I n c o n t r a s t t o o t h e r r e p o r t s , a m i n i m a l r o l e f o r s t e m - l o o p H ( b a s e s4 0 6 t o 4 4 4 ) i n t r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y i s i n d i c a t e d . S m a l l 5 ' n o n t r a n s l a t e d r e g i o n f r a g m e n t s ( b a s e s 6 6 7 t o 7 9 7 )c o n t a i n i n g t h e J a n d K m o t i f s p r o v e d s t r o n g c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r s w h e n a d d e d t o c e l l - f r e e r e a c t i o n s

p r o g r a m m e d w i t h e x o g e n o u s c a p p e d o r u n c a p p e d mRNAs. T h e p u t a t i v e s e q u e s t e r i n g o f r e q u i r e d t r a n s l a t i o n a lf a c t o r s b y t h i s s e g m e n t c l e a r l y c o n t r i b u t e s t o t r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y , b u t a l s o s u g g e s t s a p o s s i b l e c o m p e t i t i v em e c h a n i s m f o r t h e down r e g u l a t i o n o f h o s t p r o t e i n s y n t h e s i s d u r i n g v i r a l i n f e c t i o n .U n l i ke m o s t e u c a r y o t i c mRNAs, t h e p o s i t i v e - s t r a n d g e -n o m e s o f p i c o r n a v i r u s e s a r e u n c a p p e d a n d h a v e v e r y l o n g 5 'n o n t r a n s l a t e d r e g i o n s ( 6 0 0 t o 1 , 3 0 0 b a s e s ) , w h i c h c o n t a i ne x t e n s i v e s e c o n d a r y s t r u c t u r e a n d m u l t i p l e n o n i n i t i a t i n gAUG t r i p l e t s ( 9 , 3 6 ) . T h e s e uncommon f e a t u r e s , c o m b i n e dw i t h t h e k n o w l e d g e t h a t p o l i o v i r u s i n f e c t i o n l e a d s t o i n h i b i -t i o n o f c a p - d e p e n d e n t t r a n s l a t i o n o f n o r m a l c e l l u l a r mRNAs,h a v e l o n g w a r r a n t e d s u s p i c i o n a b o u t a l t e r n a t e t r a n s l a t i o n a lm e c h a n i s m s ( 9 , 3 6 ) . O u r r e c e n t r e p o r t s a n d t h o s e o f o t h e r sh a v e i n d e e d c o n f i r m e d t h a t 5 ' n o n - t r a n s l a t e d r e g i o n s ( 5 'NTRs) o f p o l i o v i r u s , e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s (EMCV)

a n d f o o t - a n d - m o u t h d i s e a s e v i r u s p r o m o t e c a p - i n de p e n d e n tt r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n , w h e r e b y r i b o s o m e b i n d i n g o c c u r s v i ai n t e r n a l e n t r y o n t o t h e 5 ' NT R w i t h o u t s c a n n i n g f r o m t h e 5 't e r m i n u s . I n t e r n a l e n t r y , r e l a t i v e t o t h e 5 ' t e r m i n u s , h a s b e e nc l e a r l y d e m o n s t r a t e d w i t h m o n o c i s t r o n i c a n d d i c i s t r o n i cc D N A - d e r i v e d t r a n s c r i p t RNAs ( 5 , 1 0 - 1 2 , 1 5 , 1 6 , 3 0 ) , a sw e l l a s w i t h v i r i o n RNA ( 3 6 ) . T h e b i n d i n g s i t e h a s b e e nv a r i o u s l y d e s c r i b e d a s a r i b o s o m a l l a n d i n g p a d , t r a n s l a t i o n a le n h a n c e r , o r i n t e r n a l r i b o s o m e e n t r y s i t e .D u r i n g p o l i o v i r u s i n f e c t i o n , c a p - i n d e p e n d e n t t r a n s l a t i o no c c u r s i n c o n j u n c t i o n w i t h v i r a l 2A p r o t e a s e - i n d u c e d d e g r a -d a t i o n o f c e l l u l a r p r o t e i n p 2 2 0 , a c o m p o n e n t o f t h e e u c a r y -o t i c i n i t i a t i o n f a c t o r 4 F ( e I F - 4 F ) c a p - b i n d i n g c o m p l e x . T h es y n e r g i s t i c p r o c e s s e s p r e s u m a b l y p r o m o t e v i r a l t r a n s l a t i o nw h i l e down r e g u l a t i n g t h a t o f t h e h o s t ( 1 8 ) . F o o t - a n d - m o u t hd i s e a s e v i r u s i n f e c t i o n a l s o i n d u c e s d e g r a da t i o n o f p 2 2 0 ,a l t h o u g h a d i f f e r e n t v i r a l p r o t e a s e ( L r a t h e r t h a n 2 A ) may b er e s p o n s i b l e ( 3 ) . W i t h EMCV, t h e t r a n s l a t i o n a l s h i f t f r o mh o s t t o v i r a l mRNA i s l i k e w i s e v e r y p r o f i c i e n t , b u t s e e m s t or e s u l t f r o m a h i g h l y e f f e c t i v e c o m p e t i t i o n f o r c e l l u l a r t r a n s -l a t i o n a l c o m p o n e n t s r a t h e r t h a n s e l e c t i v e d e g r a d a t i o n o fp 2 2 0 ( 1 7 , 2 1 , 3 9 ) .T h e t r a n s l a t i o n a l e f f i c i e n c y o f EMCV RNA i s e s p e c i a l l y* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y / I m m u n o l o g y ,S t a n f o r d U n i v e r s i t y , S t a n f o r d , CA 9 4 3 0 5 - 5 4 0 2 .

a p p a r e n t i n c e l l - f r e e e x t r a c t s , i n w h i c h 8 t o 1 0 c o p i e s o f v i r a lp o l y p r o t e i n a r e t y p i c a l l y o b t a i n e d f r o m e a c h t e m p l a t e ( 3 7 ) .We h a v e s h o w n t h a t t h e a c t i v e n a t u r e o f t h e s e t e m p l a t e s i sn o t u n i q u e t o e x p r e s s i o n o f v i r a l c o d i n g s e q u e n c e s , b u t i s ap r o p e r t y t h a t c a n b e q u a l i t a t i v e l y t r a n s f e r r e d t o n e a r l y a n ye u c a r y o t i c c i s t r o n t h r o u g h l i g a t i o n w i t h v i r a l f r a g m e n t sc o n t a i n i n g t h e i n t e r n a l r i b o s o m e e n t r y s i t e e l e m e n t ( 1 2 , 2 7 ) .T h e m e t h o d h a s b e e n w i d e l y u s e d t o o b t a i n h i g h - l e v e lp r o t e i n e x p r e s s i o n i n a v a r i e t y o f e u c a r y o t i c c e l l s ( 5 , 4 1 ) .T h e t r a n s f e r r e d EMCV e l e m e n t u s u a l l y i n c l u d e s b a s e s 3 3 5t o 8 3 7 ( t r a n s l a t i o n b e g i n s a t b a s e 8 3 4 ) ( 5 , 1 2 ) , a l t h o u g hd e l e t i o n a n a l y s e s w i t h d i c i s t r o n i c c h i m e r i c mRNAs s u g g e s tt h a t b a s e s 4 0 3 t o 8 1 1 may p r o v i d e t h e c o r e f r a g m e n t f o re f f i c i e n t t r a n s l a t i o n ( 6 , 1 4 ) .I n t h i s r e p o r t , EMCV e n h a n c e r s e q u e n c e s a r e f u r t h e rd e f i n e d t h r o u g h n e s t e d m o n o c i s t r o n i c RNA t r a n s c r i p t s d e -r i v e d f r o m cDNA c l o n e s a n d e x p r e s s e d i n r e t i c u l o c y t el y s a t e s . L i n k e r i n s e r t i o n a n d d e l e t i o n m a p p i n g s h o w t h a tt r a n s l a t i o n a l f u n c t i o n a l i t y i s a c h i e v e d a p p a r e n t l y t h r o u g hc o n c e r t e d c o n t r i b u t i o n s o f s e v e r a l s t r u c t u r e s a n d s e q u e n c e sw i t h i n t h e r e q u i r e d r e g i o n . M o r e o v e r , t h e p o t e n t i n h i b i t o r ye f f e c t s o f o n e p a r t i c u l a r s t e m - l o o p e l e m e n t ( t h e J - K d o m a i n ,b a s e s 6 8 0 t o 7 8 5 ) o n e x o g e n o u s l y t r a n s l a t i n g c a p p e d mRNAss u g g e s t f u r t h e r b i o l o g i c a l i n v o l v e m e n t i n p u t a t i v e h o s t -p r o t e i n s h u t o f f m e c h a n i s m s d u r i n g n a t u r a l v i r a l i n f e c t i o n .

MATERIALS AND METHODSS e q u e n c e d e t e r m i n a t i o n . EMCV R u e c k e r t s t r a i n( E M C V - R ) w a s p a s s a g e d i n HeLa c e l l s , a n d vRNA w a sp u r i f i e d a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 3 3 ) . C o m p r e h e n s i v e s e -q u e n c e d a t a f o r t h e 5 ' n o n c o d i n g r e g i o n o f EMCV-R w e r eg e n e r a t e d b y t h r e e s e p a r a t e t e c h n i q u e s : ( i ) p r i m e r e x t e n s i o nd i d e o x y n u c l e o t i d e r e a c t i o n s w i t h r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , u s -i n g EMCV vRNA t e m p l a t e s a n d 5 ' - l a b e l e d ( 3 2 p o r 3 5 S )o l i g o n u c l e o t i d e p r i m e r s ; ( i i ) M a x a m - G i l b e r t d e t e r m i n a t i o n so f cDNAs s y n t h e s i z e d f r o m EMCV vRNA [ p o l y ( C ) r e g i o n ] ;a n d ( i i i ) p r i m e r e x t e n si o n d i d eo x y n u c l e ot i d e r e a c t i o n s w i t hK l e n o w p o l y m e r a s e , u s i n g EMCV c D N A - c o n t a i n i n g p l a s -

1 6 0 2


3/9

EMCV TRANSLATION 1 6 0 3m i d s a s t e m p l a t e s ( 2 0 , 2 5 , 3 8 ) . A l l n u c l e o t i d e s w e r e c o n -f i r m e d b y m u l t i p l e d e t e r m i n a t i o n s .A c o n s e n s u s RNA s e c o n d a r y s t r u c t u r e f o r t h e 5 ' n o n c o d -i n g r e g i o n s o f p o l y ( C ) - c on t a i n i n g c a r d i o v i r u s e s w a s c r e a t e dt h r o u g h r e i t e r a t i v e u s e o f t h e f o l d i n g a l g o r i t h m o f Z u k e r a n dS t i e g l e r ( 4 2 ) , m o d i f i e d t o a c c e p t l a r g e ( e . g . , > 2 , 5 0 0 n u c l e o -t i d e s ) d a t a f i e l d s . T h e m i n i m u m - f r e e - e n e r g y s t r u c t u r e s f o rt h e 5 ' - m o s t 2 , 5 0 0 n u c l e o t i d e s f r o m EMCV-R, m e n g o v i r u s - M( 2 4 ) , EMCV-D, a n d EMCV-B ( 1 , 2 ) , w e r e c a l c u l a t e d s e p a -r a t e l y a n d t h e n c o m p a r e d . T h e f o l d i n g e n e r g i e s w e r e t h o s ed e f i n e d b y F r e i e r e t a l . ( 7 ) a n d a v e r a g e d t o a b o u t - 1 , 1 8 0k c a l / m o l ( c a . - 4 , 9 3 7 k J / m o l ) f o r e a c h s e q u e n c e . E l e m e n t scomm o n t o a l l d e t e r m i n a t i o n s w e r e r e t a i n e d , a n d i n t e r v e n i n gs e g m e n t s w e r e r e f o l d e d u n t i l a c o n s e n s u s s t r u c t u r e m a x i m i z -i n g t o t a l p a i r e d n u c l e o t i d e s i n a n a l o g o u s c o n f i g u r a t i o n s f o ra l l s t r a i n s w a s a c h i e v e d . T h e m o d e l w a s a d j u s t e d u n t i l t h ec a l c u l a t e d m i n i m u m f r e e e n e r g y d i d n o t d i f f e r b y m o r e t h a n5% f r o m a n y o f t h e o p t i m u m i n d i v i d u a l s e q u e n c e s o l u t i o n s .C o n s t r u c t i o n o f c D N A . S t a n d a r d DNA c l o n i n g r e a c t i o n s( 3 4 ) w e r e u s e d , a n d E s c h e r i c h i a c o l i J M 1 0 1 w a s t h e b a c t e r i a lh o s t f o r p r o p a g a t i o n o f r e c o m b i n a n t DNA. T h e t r a n s c r i p t i o nv e c t o r B l u e s c r i b e M13+ w a s p u r c h a s e d f r o m S t r a t a g e n e .P l a s m i d p E A 1 , a s u b c l o n e o f p E 1 3 ( 4 ) , c o n t a i n e d EMCVb a s e s 3 3 5 t o 4 2 2 9 i n s e r t e d b e t w e e n t h e E c o R I a n d BamHIs i t e s o f B l u e s c r i b e M13 + . T h i s c o n s t r u c t i o n i s v e r y s i m i l a rt o p l a s m i d p E S A 1 ( 2 8 ) , e x c e p t f o r t h e c h o i c e o f v e c t o rs e q u e n c e s . T h e p B a l A l p l a s m i d s ( n u m b e r e d 1 t o 1 4 ) w e r ed e r i v e d f r o m p E A l a n d c o n t a i n e d a n e s t e d s e r i e s o f s e q u e n -t i a l d e l e t i o n s ( f r o m p r o g r e s s i v e B a l 3 1 r e a c t i o n s ) w i t h i n t h e5 ' n o n c o d i n g s e g m e n t s o f t h e v i r a l cDNA. I n s e r t i o n m u t a -t i o n s c o n t a i n i n g E c o R I r e s t r i c t i o n s i t e s w e r e m a d e a t n a t u -r a l l y o c c u r r i n g M a e I I r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e v i r a l 5 ' n o n c o d -i n g r e g i o n o f p l a s m i d p E A L . T h e s e q u e n c e a t t h e i n s e r t i o n i sACGCGCGCGGAAT T CGT ( i n s e r t e d s e q u e n c e s a r e u n d e r -l i n e d ) . A d d i t i o n a l 4 - b a s e i n s e r t i o n s w e r e c r e a t e d b y f i l l i n g i nA v r I I a n d H i n d I I I r e s t r i c t i o n s i t e s w i t h i n t h e v i r a l 5 ' n o n -c o d i n g r e g i o n o f p E A l w i t h K l e n o w f r a g m e n t . An i n s e r t i o n -d e l e t i o n p l a s m i d w a s m a d e b y j o i n i n g ( w i t h E c o R I l i n k e r s )s e q u e n c e s c l e a v e d a t K p n I ( b a s e 7 0 1 ) a n d M a e I I ( b a s e 7 7 6 ) .T h e c o n s t r u c t i o n o f a l l p l a s m i d s w a s c on f i r m e d b y n u c l e o -t i d e s e q u e n c i n g .T r a n s c r i p t i o n o f p l a s m i d cDNA. P l a s m i d DNAs w e r e l i n -e a r i z e d b y d i g e s t i o n w i t h BamHI a n d u s e d a s t e m p l a t e s i n T 7p o l y m e r a s e r u n o f f t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s c o n t a i n i n g[ a - 3 2 P ] C T P ( 1 3 m C i / m m o l ) . R e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b ya d d i t i o n o f EDTA ( t o 1 0 m M ) , a n d t h e s a m p l e s w e r ee x t r a c t e d w i t h p h e n o l - c h l o r o f o r m , p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l ,a n d t h e n r e s u s p e n d e d i n w a t e r . R e a c t i o n e f f i c i e n c y wasm o n i t o r e d b y s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g a f t e r a b s o r p t i o n o f s a m -p l e s t o Whatman DE81 f i l t e r s . To d e t e r m i n e t h e t r a n s c r i p ts i z e a n d p u r i t y , s a m p l e a l i q u o t s w e r e d e n a t u r e d b y i n c u b a -t i o n a t 5 0 C f o r 1 h i n t h e p r e s e n c e o f 1 M d e i o n i z e d g l y o x a la n d 1 0 mM N a 2 H P O 4 ( p H 6 . 5 ) a n d t h e n l o a d e d o n t o 1%a g a r o s e g e l s . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s ( 1 V / c m f o r 1 1 h ) , d r i e dg e l s w e r e s c a n n e d f o r r a d i o a c t i v i t y w i t h a n A m b i s r a d i a t i o nd e t e c t o r . T h e r a d i o a c t i v i t y i n f u l l - l e n g t h t r a n s c r i p t b a n d sr e l a t i v e t o t h a t f r o m t h e t o t a l s a m p l e w as u s e d t o e s t i m a t et h e p e r c e n t a g e o f f u l l - l e n g t h RNA s y n t h e s i z e d i n t h e r e a c -t i o n .I n v i t r o p r o t e i n s y n t h e s i s . C e l l - f r e e t r a n s l a t i o n r e a c t i o n s i nr e t i c u l o c y t e e x t r a c t s w e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d p r e v i -o u s l y ( 2 9 ) . T y p i c a l l y , vRNA ( 1 t o 3 , u g ) o r t r a n s c r i p t RNA ( 1t o 3 , u g ) was u s e d t o d i r e c t p r o t e i n s y n t h e s i s i n r e a c t i o n s ( 1 5t o 3 0 , u l ) r a d i o l a b e l e d w i t h [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e ( 1 , u C i / u ) . A f t e r6 0 t o 9 0 m i n o f i n c u b a t i o n a t 3 0 C , r e a c t i o n s were s t o p p e d b yt h e a d d i t i o n o f c y c l o h e x i m i d e a n d p a n c r e a t i c RNase ( t o 0 . 3

6 112 118 124 13 0 13 6 142 14 8 154 16 0 166 172 17 8 18 4 19 0 1

UUGAAAGCCGGGGGUGGGAGAUCCGGAUUGCCAGUCUGCUCGAUAUCGCAGGCUGGGUCCGUGACUACCCACUCCCCCUWUCAACGUGAAGGCUACGAUAGUGCCAGGGCGGGUACUGCCG U A A G U G C C A C C C C A A A A U A A C A A C A G A C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C Cc C C C C C C C C c C C C C C C C c C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C c C c C C C C C C C C C CC C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C U C U C C C U C C C C C C C C C C U A A C G U U A C U G G C C G A A G C CG C U U G G A A UA A G G C C G G U G U G C G U U UG U C U A U A UG U U A U W W U C C A C C A U A U UG C C G U C U UUUGGCAAUGUGAGGGCCCGGAAACCUGGCCCUGUCUUCUUGACGAGCAUUCCUAGGGGUCU U U C C C C U C U C G C C A A A G G A A U G C A A G G U C U G U U G A A U G U C G U G A A G G A A G C A G U U C C U CU G G A A G C U U C U U G A A G A C A A A C A A C G U C U G U A G C G A C C C U W U G C A G G C A G C G G A A C C C C CC A C C U G G C G A C A G G U G C C U C U G C G G C C A A A A G C C A C G U G U A U A A G A U A C A C C U G C A A A G GC G G C A C A A C C C C A G U G C C A C G U U G U G A G U W G G A U A G U U G U G G A A A G A G U C A A A U G G C U C UCCUCAAGCGUAUUCAACAAGGGGCUGAAGGAUGCCCAGAAGGUACCCCAWUGUAUGGGAUC U G A U C U G G G G C C U C G G U G C A C A U G C U U U A C A U G U G U U U A G U C G A G G U U A A A A A A C G U C UA G G C C C C C C G A A C C A C G G G G A C G U G G U U U U C C U U U G A A A A A C A C G A U G A U A A U A U G C C AM A TC A A C C A U G G A AC A A G A G A C W U G C G C G C A C U C U C UC A C U U W U G A G G AA U G C C C A A A A UG C UT M E Q E T C A H S L T F E E C P K C SCUGCUCUACAAUACCGUAAUGGAUUUUACCUGCUAAAGUAUGAUGAAGAAUGGUACCCAGAL Q Y R N G F Y L L K Y D E E W Y P E96AGAUA.AUAGAGGA UUUUAC 1000

6 01 2 018 02 4 03 0 036 04 2 048 054 06 0 06 6 072 078 084 09 0 09 6 0

9 6 1 A G G A G U U A W ~ G A C U G A U G G ' A G A G G A U G A U G U C U U U G A U C C 10 0 0E L L T D G E D D V F DF I G . 1 . N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e 5 ' - m o s t 1 , 0 0 0 n u c l e o t i d e s o fEMCV-R. T h e p o l y p r o t e i n r e a d i n g f r a m e b e g i n s a t b a s e 8 3 4 , a n d t h ep o l y ( C ) t r a c t c o n t a i n s 1 3 2 p y r i m i d i n e s ( C 1 1 5 U C U C C C U C 1 0 ) .

m g / m l e a c h ) . S a m p l e s ( 3 R I ) were a n a l y z e d b y s o d i u md o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e ( M a i z e l ) g e l e l e c t r o p h o r e s i s( S D S - P A G E ) ( 2 6 ) , a n d l a b e l e d p r o t e i n s were v i s u a l i z e d b ya u t o r a d i o g r a p h y o f t h e d r i e d g e l . I n c o r p o r a t i o n o f [ 3 5 S ] m e -t h i o n i n e i n t o a c i d - i n s o l u b l e p r o d u c t s w a s p e r f o r m e d a s d e -s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 2 2 ) .N u c l e o t i d e s e q u e n c e a c c e s s i o n n u m b e r . T h e G e n B a n k /EMBL a c c e s s i o n n u m b e r f o r t h i s s e q u e n c e ( c o m p l e t eEMCV-R g e n o m e ) i s M 8 1 8 6 1 .

RESULTS

S e q u e n c e a n d s t r u c t u r e m o d e l f o r EMCV-R. T h e n u c l e o -t i d e s e q u e n c e o f t h e 5 ' - m o s t 1 , 0 0 0 n u c l e o t i d e s o f EMCV-R i sp r e s e n t e d i n F i g . 1 . T h e d a t a c o r r e c t m i n o r d i s c r e p a n c i e s i nt h e p r e v i o u s d e t e r m i n a t i o n ( 2 3 , 2 5 ) a n d c o m p l e t e t h e s e -q u e n c e f o r t h i s s t r a i n . When p o l y ( C ) l e n g t h d i f f e r e n c e s a r ed i s c o u n t e d , t h e 5 ' NT R o f EMCV-R s h a r e s 9 5 . 2 % n u c l e o t i d ei d e n t i t y w i t h t h o s e o f EMCV-B a n d EMCV-D ( 1 , 2 ) a n d9 2 . 7 % i d e n t i t y w i t h t h e same r e g i o n f r o m m e n g o v i r u s - M( 2 4 ) .A c o n s e n s u s RNA s e c o n d a r y s t r u c t u r e f o r t h e 5 ' e n d s o ff o u r c a r d i o v i r u s R N A s , h i g h l i g h t i n g s t r a i n d i f f e r e n c e s , i sp r e s e n t e d i n F i g . 2 . T h e m o d e l c o n t a i n s many e l e m e n t ss i m i l a r t o t h o s e s u g g e s t e d f r o m p a r t i a l s e q u e n c e a l i g n m e n t s( 1 3 , 3 1 ) , b u t i t a l s o d i f f e r s i n t h r e e r e g a r d s . F i r s t , t h e s ed o m i n a n t p a t t e r n s were d e r i v e d f r o m m i n i m u m - f r e e - e n e r g yc a l c u l a t i o n s w h i c h c o n s i d e r e d s i m u l t a n e o u s l y a l l p o s s i b l ep a i r i n g o p t i o n s f o r l a r g e s e g m e n t s o f t h e g e n o m e ( t h e 5 ' - m o s t2 , 5 0 0 n u c l e o t i d e s ) . S e c o n d , t h e p o l y ( C ) t r a c t s a n d t h e i rd i s c o n t i n u i t i e s were n o t e x c l u d e d f r o m c o n s i d e r a t i o n b y t h ea l g o r i t h m , b u t were a l l o w e d t o ( p o t e n t i a l l y ) p a r t i c i p a t e i nb a s e p a i r i n g , a s l o n g a s t h e s e i n t e r a c t i o n s c o u l d c o n t r i b u t e t ot h e l o w e s t - e n e r g y s o l u t i o n s . T h i r d , c a l c u l a t i o n s f r o m t h ef i n a l c o n s e n s u s m o d e l a l l o w e d a maximum d e v i a t i o n o f o n l y5% f r o m t h e o p t i m u m f o l d i n g s o l u t i o n f o r e a c h o f t h e f o u rp a r t i c i p a t i n g ( 2 , 5 0 0 - b a s e ) s e q u e n c e s . T h i s m o d e l i s c o n s i s -t e n t w i t h most a v a i l a b l e d a t a c o n c e r n i n g e n z y m e - s e n s i t i v es i t e s , e x p o s e d l o o p s , e t c . , f o r r e l a t e d i s o l a t e s o f EMCV ( 6 ,1 3 , 3 1 , 4 0 ) .T h e s t r u c t u r e s u g g e s t s a l i n e a r s e r i e s o f 5 ' n o n c o d i n g

VOL. 6 6 , 1 9 9 2


4/9

1 6 0 4 DUKE ET A L .

G A UAC U4 0 U C( a ) G - - C( C ) U - - A ( G )C - - GU - - GG - - C( 0 ) A - - U ( C )C - - GG C - - GU)U - - G

A - - UG - - CC - - G( U- GC - - GU - - AA)G2-CA - - U(AG - - CG - - CG - - CU - - AG - - CG - - UG - - CG - Cc G - - C ( u )C C ( a )G - - c p s e u d o - k n o tA - - UA - - UG - - CU - - A A G A( U - - AAA&

G - U U t U - A CA C- G C- G A AG - - C G - c U ( A ) AACAG ( G - - C U ) A0 (c )A

A C CC C( C ) U C Cp s e u d o - k n o t 1 4 0 ( - . ) ( A C C( - ) A C C( - ( C C C( C ) A C CA C CC C CA C CG ( U ) C 0 C( + A ) A C C

c C CC C CC CEMCV-R ( CM e n g o ( CEMCV-B ( CEMCV-D ( C

c ccccccccccccccccccc

r C

( ) A A AC AC-GG- C5 6 0 G-CAC 58 0 ( G ) A(a)GA9AGGUG-I; 9 U - r i i G 9 ; GLT~TAU

Mu) G6 ACGCG,AC,G, G - C AGC A C .C(U.:G A

U-A

-GCGG AC cC-GCACC GU & A C CA- UG- U62C - GG - - U GA G A P CG- 5 UU- GC- GU-AG- U( AC- GA- UA- UC- G

( G . g ) A - U G AS O A AGAC-GGA- UA G - - CA AG U - - A

U - GC-G

G - U( A c

c {)8 0 A - - UG U 8GG C 6 6 13 0 0-G A UUCC-G AG O G AU U G - U GG)( A U G

A - - A ( - 9 CGG- G- C G

Au~~~~~00 A4AAu 3 8 2 U - ~ A A G

- G - U A - U (GaA C , GAU

C CUC - - G ( G u c UUA) G A - Mc)aCAU C U - - CGCC U A C - G e u G - - AM-U--GCC C U U C - G ( A ) G - - CC-GuAUC-GCCa)G--C(u) C G--Cro) A'M'C(QU-- C--G U - - AC--GG M2~~~~~~~~~--GC-CCU0C G-CC C ( C . C ) U - G G - - C U- AC A C G U () 32 U- A cc AA ) u ( U C U - ( ) ( ) A . GCA 9 CC - - UC U AU(OAAGGC C - - C U - - A CA - - C 70- - C U A C-G G--CAQU--G(-( C (CU } (A)-Cu C U . - ( G e ) ( A ) GC-G G c).A(I C - - A - - U A AA - - UC-jC-Gg)C--GUAG-c c cc UU(CAA.CG-G--CAc ( c ) A UG-C AcCC . . - -G-CAAuC ) U U- ( U ) (A),CAUcc G - - ~ ~ ~ ~ ~ C - I U l G -'C C C-CUAC C C U - A C440GUGCCC c C UCU - GC C C C-GAGCC C cC2

G A-jUAC CCCA-CA - - U l AC C C C - -~~AU(C

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c ~ ~ ~ ~ G - GOCC-CCUG-C

C C C C G - U 7 2 0C,CC ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ A U - A _115UCUCCCUC 0 )50 UC10 )27),(C141)*130), (C 144) *

E)cCGC- G( C ) U - I ( C )U ( G )G

*i n d e p e n d e n t d e t e r m i n a t i o n s o f sequenceF I G . 2 . C o n s e n s u s s e c o n d a r y s t r uct ure f o r 5 ' NTRs o f f o u r r e l a t e d c a r d i o v i r u s e s . T h e sequence s h o w n i s f o r EMCV-R. Changes i nm e n g o v i r u s a n d o t h e r EMCV s t r a i n s (EMCV-B and EMCV-D) are g i v e n p a r e n t h e t i c a l l y as c a p i t a l and l o w e r c a s e l e t t e r s , r e s p e c t i v e l y .S t e m - l o o p f e a t u r e s a re l e t t e r e d c o n s e c u t i v e l y , an d AUG sequences (EMCV-R) are b o x e d .

J . V I R O L .

I n i t i a t i n g A U G ,b a s e 8 3 4

L U C A 8 4cA 8 2 c A- - ACU - - A (~CA U - - A ~ a PCAC Ai - - C G A ( C x ) G- C- G G - - C G C ( u )- G U - - A A- G G- C U, - G C - - G C O( U - - GAAu ) A G 0kAAA A . . ( 3 . )

( G . g )7 6 3 AU U ( C ) cA;AGCUG UG I GU AICU: : U(C )U C G G UGC A UZ 3 (G)

)~ ,


5/9

EMCV TRANSLATION 1 6 0 5T 7 RNA T r a n s c r i p t s .

E - A l p3alAl -14

4 t k -3 kb-

6kb

F I G . 3 . RNA t r a n s c r i p t i n t e g r i t y . T 7 t r a n s c r i p t s a m p l e s f r o mp B a l A l - 1 t o p B a l A l - 1 4 w e r e p r e p a r e d , d e na t ur e d, f r a c t i o n a t e d b ye l e c t r o p h o r e s i s , a n d d e t e c t e d as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h -o d s .

s t e m - l o o p m o t i f s ( F i g . 2 , l e t t e r s A t o N ) , w i t h i n w h i c h a tl e a s t 6 5% o f t h e n u c le o t id e s [ e x c l u s i v e o f t h e p o l y ( C ) t r a c t ]p a r t i c i p a t e i n b a s e p a i r i n g . S u r p r i s i n g l y , t h e p o l y ( C ) r e g i o nd i d n o t make a m a j o r c o n t r i b u t i o n t o t h e most f a v o r a b l ec o n f i g u r a t i o n o f a n y sequence ( 5 ' - m os t 2 , 5 0 0 b a s e s ) , evenwhen a l l o w e d t o p a i r w i t h d i s t a n t r e g i o n s . T h e p s e u d o k n o tm o t i f s i n B a n d C d i f f e r f r o m a p u b l i s h e d s t r u c t u r e o f t h i sr e g i o n ( 4 0 ) , b u t t h i s a r r a n g e m e n t i s e n e r g e t i c a l l y very f a v o r -a b l e a n d h a s b e e n i n d e p e n d e n t l y s u g g e s t e d b y a l g o r i t h m ss e n s i t i v e t o p s e u d o k n o t c o n f i g u r a t i o n s ( 3 1 a ) .Among t h e c o n s i d e r e d v i r a l s t r a i n s , t r a n s i t i o n s ( e . g . ,U-*C o r A - - G ) account f o r 6 0 % o f t h e sequence v a r i a t i o n .More t h a n t w o - t h i r d s o f t h e s e e x c h a n g e s o c c u r i n s t e m s a n dc a u s e l i t t l e ( i f a n y ) p e r t u r b a t i o n o f t h e common s t r u c t u r e .T h e m o d e l h a s 1 0 e x a m p l e s o f d o u b l e s u b s t i t u t i o n s w i t h i np a i r e d b a s e s , a l t h o u g h some o f t h e s e c o m p e n s a t i n g c h a n g e sare s e p a r a t e d b y more t h a n 4 0 t o 5 0 n u c l e o t i d e s w i t h i n t h esequence ( s e e s t e m s A , F , H , I , a n d K ) . T r a n s v e r s i o n s ( e . g . ,U-iA o r G - * C ) , i n s e r t i o n s , a n d d e l e t i o n s are more commont o t h e u n p a i r e d r e g i o n s ( 7 7 % ) a n d are t y p i c a l l y a t t h e t o p s o fs t e m s o r i n b u l g e - l o o p s b e t w e e n p a i r e d s t e m s .T r a n s l a t i o n o f RNAs c o n t a i n i n g 5 ' NT R m u t a t i o n s . T od e f i n e i m p o r t a n t t r a n s l a t i o n a l e l e m e n t s w i th i n t h e EMCV 5 'NTR, we c o n s t r u c t e d a s e r i e s o f cDNA p l a s m i d s c o n t a i n i n gp r o g r e s s i v e 5 ' - - 3 ' d e l e t i o n s . The c o n s t r u c t i o n s , d e s i g n a t e dp B a l A l - 1 t o p B a l A l - 1 4 , e a c h i n c l u d e d c o d i n g sequences f o rt h e a m i n o - t e r m i n a l h a l f o f t h e p o l y p r o t e i n open r e a d i n gf r a m e ( 1 , 1 3 1 c o d o n s ) . RNA t r a n s c r i p t s f r o m t h e s e cDNAswere p r e p a r e d i n p a r a l l e l a n d a s s a y e d b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s( F i g . 3 ) t o ensure minimum v a r i a t i o n i n t h e amount o ff u l l - l e n g t h m a t e r i a l ( c a . 7 0 % ) . T he t r a n s c r i p t s were u s e d t op r o g r a m r e t i c u l o c y t e l y s a t e r e a c t i o n s , t a k i n g care t h a t e a c hs a m p l e r e c e i v e d t h e same a m o u n t o f RNA ( 2 . 6 , u g ) , a t ac o n c e n t r a t i o n ( 8 6 , u g / m l ) p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d t o g i v eo p t i m a l , s a t u r a t i n g p r o t e i n s y n t h e s i s .The pEAl t r a n s c r i p t s w h i c h b e g a n a t v i r a l b a s e 3 3 5

A . 1 D I 2 A I 1 2 BL I | 1 A I | 1 B 1 CAl

virlon RNAp E A l

p B a l A l1 - 1 4

B .400

c 3 0 0 7xv-2

200-

2 1CI O

"6

- 3 6 33 8 74 0 64 1 64 4 34 5 44 6 64 8 55 0 55 1 35 4 6

6 2 07 7 6 -L 802-

CPM I n c o r p o r a t e dpe r u l o f l y s a t e

UG ( 8 3 4 ) ( x 1 0 3 )30 2 ( 1 00%)

1 2 53 ( 8 4 % )^ , 251 ( 8 3 % )* 2 54 ( 8 4 % h )

. 4 2 30 ( 7 6 % )"= 95 ( 3 1 % ). = 6 4 ( 2 1 % h ).= 82 (27%),= 16 9 ( 5 6 % ),= 7 6 ( 2 5 % ),~ 14 ( 5 % ),= 18 ( 6 % ).= 2 1 ( 7 % ),= 23 ( 8 % ).= 45 ( 1 5 % ).= 10 5 ( 3 5 % )

- \ & - _ 4 0 6l - _ 4 6 6

4 1 6 1485 - - - - 8 0 2AUG (b ase 8 3 4 )

20 0 46 0 60 0 80 0 10005 ' most v i r a l n u c l e o t i d e

F I G . 4 . 5 ' d e l e t i o n m u t at i o n s. ( A) EMCV v i r i o n RNA ( 1 , u g ) o rT 7 RNA t r a n s c r i p t s ( 2 . 6 , g ) as s h o w n i n F i g . 3 [ p E A 1 a n d p B a l A l - 1t o p B a l A l - 1 4 ] w e r e u s e d t o p r o g r a m t r a n s l a t i o n r e a c t i o n s ( 3 0 R I ) i nr a b b i t r e t i c u l o c y t e e x t r a c t s c o n t a i n i n g [ 3 5 S ] m e t h i o n i n e ( 1 , u C i / , u l ) .A f t e r 9 0 m i n a t 3 0 C , t r i p l i c a t e s a m p l e s w e r e r e m o v e d ( 2 , u l ) a n dq u a n t i t a t e d f o r t r i c h l o r o a c e t i c a c i d - i n s o l u b l e r a d i o a c t i v i t y . A v e r -a g e d r e s u l t s ( s t a n d a r d d e v i a t i o n ,


6/9

1 6 0 6 DUKE ET A L .J n - - r c : . e e e t - . . 'T ..

- - 2 I AP ' -

F I G . 5 . P r o t e i n p r o d u c e d i n c e l l e x t r a c t s i s v i r a l . S a m p l e s f r o mt h e t r a n s l a t i o n e x t r a c t s i n F i g . 4 w e r e p r o c e s s e d w i t h e x o g e n o u s 3 Cp r o t e a s e a n d a n a l y z e d b y SDS-PAGE a n d a u t o r a d i o g r a p h y .w i t h b a s e s 4 0 6 t o 4 5 0 ) may a s s u m e s t a b l e p a i r i n g c o n f i g u r a -t i o n s q u i t e d i s s i m i l a r t o t h e c o n s e n s u s s t r u c t u r e ( n o t s h o w n ) .T h e p r e d i c t e d a l t e r a t i o n s w o u l d d i s r u p t s t e m - l o o p I a s w e l la s r e m a i n i n g H f r a g m e n t , b u t i t i s a l s o a n t i c i p a t e d t h a ts l i g h t l y l a r g e r d e l e t i o n s ( i . e . , t o b a s e s 4 5 1 t o 5 0 0 ) m i g h tr e s t o r e m o s t o f t h e I c o n f i g u r a t i o n ( s e e a l s o r e f e r e n c e 6 ) .I n d e e d , c o m p l e t e r e m o v a l o f t h e H d o m a i n ( t o b a s e 4 6 6 )f r o m t h e p B a l A l - 7 t r a n s c r i p t p a r t i a l l y r e e s t a b l i s h e d t r a n s l a -t i o n i n a r e p r o d u c i b l e m a n n e r . T h i s l e v e l o f i n c o r p o r a t i o nw a s a l w a y s l o w e r ( e . g . , 5 6 v e r s u s 8 4 % ) t h a n t h a t a c h i e v e dw i t h p E A 1 , b u t c l e a r l y i n d i c a t e s t h a t i n t a c t H s e q u e n c e s a r en o t a n a b s o l u t e r e q u i r e m e n t f o r t r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y . T r a n -s c r i p t s b e g i n n i n g w it h b a s e 5 0 5 , 5 1 3 , 5 4 6 , o r 6 2 0 w e r e p o o r l yt r a n s l a t e d i n t h e r e a c t i o n s , a l t h o u g h v e r y s h o r t t r a n s c r i p t sw i t h o n l y 3 2 5 ' NT R b a s e s h a d s o m e w h a t b e t t e r a c t i v i t y .T h e s e h i g h l y a b b r e v i a t e d RNAs ( e . g . , b e g i n n i n g w i t h b a s e8 0 2 ) h a v e b e e n s u g g e s t e d t o i n i t i a t e s y n t h e s i s i n a 5 ' - e n d -d e p e n d e n t m a n n e r u n r e l a t e d t o i n t e r n a l r i b o s o m e e n t r y s i t ef u n c t i o n ( 1 5 ) .T h e t r a n s l a t i o n d a t a p r e s e n t e d i n F i g . 4 w e r e o b t a i n e dw i t h o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s o f a d d e d t e m p l a t e RNA. How-e v e r , t h e d i f f e r e n t i a l l e v e l s o f i n c o r p o r a t i o n w e r e c l e a r l yd e p e n d e n t o n t e m p l a t e s e q u e n c e , n o t c o n c e n t r a t i o n , b e -c a u s e s i m i l a r r e s u l t s w e r e a l s o o b t a i n e d u n d e r s u b s a t u r a t i n gRNA t r a n s c r i p t c o n d i t i o n s ( e . g . , 5 0 , u g / m l ) , a s l o n g a sc o m p a r e d s a m p l e s c o n t a i n e d s i m i l a r m o l a r e q u i v a l e n t s o ft e m p l a t e ( m u l t i p l e d e t e r m i n a t i o n s n o t s h o w n ) .T o c o n f i r m t h a t p r o t e i n s y n t h e s i s b y t h e t r a n s c r i p t s e r i e sw a s u n i f o r m l y i n i t i a t i n g a t t h e s a m e AUG ( b a s e 8 3 4 ) , wep r o c e s s e d s e l e c t e d p r o d u c t s a m p l e s w i t h e x o g e n o u s , u n l a -b e l e d 3 C p r o t e a s e a n d t h e n a n al y z e d t h e m b y SDS-PAGE( F i g . 5 ) . A l t h o u g h t h e p a t t e r n s v a r i e d i n i n t e n s i t y a c c o r d i n gt o i n c o r p o r a t i o n , a l l l a n e s s h o w e d b a n d s c h a r a c t e r i s t i c o fL - P 1 - 2 A B * s e q u e n c e s a n d t h e r e w a s n o c l e a r e v i d e n c e f o rs i g n i f i c a n t l e v e l s o f i n i t i a t i o n a t a l t e r n a t e AUGt r i p l e t s . E v e nt h e s h o r t e s t t r a n s c r i p t s , w h i c h a r e m i s s i n g m a j o r p o r t i o n s o ft h e i n t e r n a l r i b o s o m e e n t r y s i t e , s e e m e d t o d i r e c t m o s tr e s i d u a l s y n t h e s i s t o w a r d s t h e c o r r e c t , i n - f r a m e AUG a n dh e n c e r e i n f o r c e f i n d i n g s t h a t s e q u e n c e s a n d / o r s t r u c t u r e s i nt h e i m m e d i a t e v i c i n i t y o f t h i s c o d o n p r o b a b l y p l a y s t r o n gs e l e c t i v e r o l e s i n s y n t h e s i s i n i t i a t i o n ( 1 5 ) .

p E A I ( 1 1 3 1 c o d o n s )A 1 B I C I 1 D I 2 A 1 2 6 B |

R e l a t i 'i n c o( pn o m u t a t i o n U G 8 3 4 )

3 3 5 4 1 5H i n t i l l i n

3 3 5 488E c o R I l i n k e rl n " r f i t

3 3 5 5E c o R I l i n k e ri n s e r t i o n

3 3 5E c o R I l i n k e ri n s e r t i o n

3 3 5 77

i v e 3 5 - M e tw r p o r a t i o ne r c e n t )

1 0 08 89 08 51 5

87 7 7E c o R I l i n k e ri n s e r t i o n / d e l e t l o n

3 3 5 A47 01-77 6 2F I G . 6 . L o c a l i n s e r t i o n a n d d e l e t i o n m u t a t i o n s . M u t a t i o n s w e r ec r e a t e d i n p E A l t h r o u g h r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t ( A v r I I a t b a s e4 1 5 ; H i n d I l a t b a s e 4 8 8 ; M a e I I a t b a s e s 5 0 6 , 5 7 7 , a n d 7 7 7 ; o r K p n Ia t b a s e 7 0 1 ) f o l l o w e d b y E c o R I l i n k e r i n s e r t i o n , f i l l i n g i n w i t hK l e n o w p o l y m e r a s e , o r s e q u e n t i a l d i g e s t i o n ( w i t h K p n I a n d M a e I I )a n d E c o R I l i n k e r i n s e r t i o n . T 7 RNA t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d f r o mt h e s e cDNAs ( 1 . 6 t o 1 . 7 j i g ) w e r e t r a n s l a t e d i n r e t i c u l o c y t e l y s a t e s( 1 5 i u l ) a s i n F i g . 4 , a n d p r o t e i n s y n t h e s i s w a s q u a n t i t a t e d b yt r i c h l o r o a c e t i c a c i d - i n s o l u b l e r a d i o a c t i v i t y . P r e s e n t e d v a l u e s a r er e l a t i v e t o u n m u t a t e d p E A l t r a n s c r i p t i n c o r p o r a t i o n ( c a . 2 5 0 , 0 0 0c p m / , u l ) , w h i c h w a s s e t a t 1 0 0 o .T h e d e l e t i o n e x p e r i m e n t s p l a c e d t h e 5 ' b o u n d a r y f o rm i n i m u m t r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y w i t h i n t h e l o w e r r e g i o n s o fs t e m - l o o p I ( r o u g h l y b e t w e e n b a s e s 4 6 6 a n d 5 0 5 ) . L o c a lp e r t u r b a t i o n s a f f e c t i n g t h i s r e g i o n w e r e e x a m i n e d w i t h e n g i -n e e r e d l i n k e r i n s e r t i o n s o r i n t e r n a l d e l e t i o n s ( F i g . 6 ) . F o u r -b a s e i n s e r t i o n s a t p o s i t i o n 4 1 5 ( s t e m H ) o r 4 8 8 ( l o w e r s t e m o fI ) d e c r e a s e d t r a n s l a t i o n o f t h e d o w n s t r e a m c i s t r o n b y o n l y1 0 t o 1 2 % , c o n s i s t e n t w i t h t h e i d e a t h a t a n i n t a c t H e l e m e n ta n d t h e l o w e r p o r t i o n o f s t e m - l o o p I a r e n o t r e q u i r e d f o rt r a n s l a t i o n a l f u n c t i o n a l i t y . S i n c e d e l e t i o n s p a s t b a s e 4 8 5g a v e v i r t u a l l y i n a c t i v e t e m p l a t e s ( F i g . 4 ) , i t w a s s u r p r i s i n gt h a t i n s e r t i o n s c r e a t i n g a n e x t e n d e d b u l g e l o o p a t b a s e 5 0 6w e r e q u i t e e f f e c t i v e t e m p l a t e s ; t h i s s u g g e s t s t h a t s i z a b l ea l t e r a t i o n s i n t h e m i d d l e o f s t e m I may a l s o b e t o l e r a b l e , i f

s t e m i n t e g r i t y i s g e n e r a l l y m a i n t a i n e d . I n c o n t r a s t , i n s e r t i o na t p o s i t i o n 5 7 7 , w h i c h d i s r u p t s t h e t o p o f t h i s s t e m ( f r o mb a s e s 5 2 7 t o 5 9 1 ) , s t r o n g l y d e c r e a s e d t r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y .T h e J - K d o m a i n a l s o c o n t r i b u t e s t o e f f i c i e n t t r a n s l a t i o n a lf u n c t i o n . D e l e t i o n s w i t h i n t h i s r e g i o n ( e . g . , b a s e s 7 0 1 t o 7 7 6 )o r i n s e r t i o n a l a u g m e n t a t i o n n e a r t h e A - r i c h b u l g e l o o p a tb a s e 7 7 7 s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d p r o t e i n s y n t h e s i s ( F i g . 6 ) .T h e d e t r i m e n t a l e f f e c t s o c c u r r e d w i t h o u t a l t e r a t i o n o f ( p r e -d i c t e d ) b a s e p a i r s w i t h i n a d j a c e n t s t e m s ( H , I , L , M , e t c . )a n d a r e c o n s i s t e n t w i t h d a t a i m p l i c a t i n g t h i s r e g i o n a s ar e q u i r e d t r a n s l a t i o n a l e l e m e n t a n d p o s s i b l e p r o t e i n - b i n d i n gs i t e ( 3 5 ) .T r a n s l a t i o n c o m p e t i t i o n a s s a y s . C a r d i o v i r u s RNAs h a v e

J . V I R O L .

fj ,

e. -

2 . . .


7/9

EMCV TRANSLATION 1 6 0 7R e( pP rF h( a

C o m p e t i n g RNAF r a g m e n t

( n o n e )33 5 '848

e l a t i v e I n c o r p o r a t i o n l e s s p r o n o u n c e d w i t h t h e f r a g m e n t f r o m b a s e s 3 3 5 t o 7 7 5 o re r c e n t ) o f 3 5 S - M e t i n w h e n t h e c o m p e t i t o r i n c l u d e d a 1 3 - b as e i n s e r t i o n a t b a s e 7 7 7r e s e n c e o f C o m p e t i n g RNA ( w i t h i n J - K ) . T h e f r a g m e n t f r o m b a s e s 3 3 5 t o 6 1 9 h a d a l m o s tT e m p l a t e R N A n o i n h i b i t o r y e f f e c t , w h i c h m a k e s i t u n l i k e l y t h a t t h e o b -I V R N A B - g l o b i n p E A l s e r v e d r e s u l t s w e r e a n o n s p e c i f i c c o n s e q u e n c e o f a d d e da p p e d ) ( c a p p e d ) ( E M C V ) RNA. T h e r e l a t i v e i n h i b i t o r y a c t i v i t y o f t h e t e s t e d f r a g m e n t sw a s a l s o e v i d e n t a t h i g h e r a n d l o w e r m o l a r e x c e s s o f1 0 0 1 0 0 1 0 0 c o m p e t i t o r RNAs ( e . g . , m o l a r r a t i o s o f 1 , 2 . 5 , a n d 1 0 ) a n dc o n f i r m a d e p e n d e n c e o n s e q u e n c e , r a t h e r t h an c o n c e n t r a -3 6 1 2 4 2 t i o n ( a l l d a t a n o t s h o w n ) .

620-848620-7976 6 7 - 7 9 7

3 3 5 6193 3 5 7 7 5E c o R i h i k e rw h i e r o n3 3 5 % - 7 8 4 8E c o R t h i k e r3 3 5 7 7 1 . 4 8

F I G . 7 . T r a n s l a t i o n c o m p e t i t i o ns c r i p t s c o n t a i n i n g t h e i n d i c a t e d E la d d e d t o r e t i c u l o c y t e r e a c t i o n s ( 1 5e x c e s s ( o r a t w o - t o t h r e e f o l d m o l a ro v e r t h e t e m p l a t e RNA. T h e t e m p l a t( F H V ) RNA ( 1 . 2 , u g ) , c e l l u l a r 3 - g l oT 7 t r a n s c r i p t s ( 1 . 8 , u g ) . S y n t h e s i z tt r i c h l o r o a c e t i c a c i d - i n s o l u b l e r a d i o at i o n a t 3 0 C . T h e r e s u l t s ( a v e r a g e (i n c o r p o r a t i o n ( p e r c e n t ) r e l a t i v e t o st o r RNA ( t y p i c a l l y , f o r FHV 3 0 0 , 0 01 2 5 , 0 0 0 c p m / , u l = 1 0 0 % , a n d f o r pEAr e s u l t s a r e r e p r o d u c i b l e t o a s t a n dd o n e .

b e e n d e m o n s t r a t e d t o b e e f f i te u c a r y o t i c mRNAs i n c e l l - f r eR e g i o n s w i t h i n t h e EMCV 5 'p r o t e i n s w e r e i n v e s t i g a t e d i n t r aRNA t r a n s c r i p t s c o n t a i n i n g b a s et h e r e o f w e r e a d d e d t o r e t i c u l o c yl a t i o n - c o m p e t e n t mRNAs f r o m, B - g l o b i n , o r i n t a c t p E A l ( F i g . 7 )s e q u e n c e s w e r e o m i t t e d f r o m t hi n t e r f e r e n c e f r o m s y n t h e s i z e d va s s a y s o n i n i t i a l t r a n s l a t i o n e v cS i n c e t h e m o l a r r a t i o s o f t h ed e l i b e r a t e l y k e p t l o w ( m o l a r r a lp r o t e i n s y n t h e s i s t o 50% o f t h e l 1o f f r a g m e n t was i n d i c a t i v e o f s tT h e a s s a y s r e v e a l e d t h a t i n t a ca n d a l l s m a l l e r s e g m e n t s c o n t a ir e a s o n a b l y e f f e c t i v e c o m p e t i t ow i t h i n t h e s e f r a g m e n t s c e n t e r s cp r e d i c t i o n s s u g g e s t t h a t t h e s ei n h i b i t o r y RNAs a n d m a k e i t l i kt e r i n g o f r e q u i r e d t r a n s l a t i o n a l cb l e f o r t h i s e f f e c t . B o t h c a p p3 - g l o b i n ) a n d u n c a p p e d ( p E A 1 )c o m p e t i t i o n , a l t h o u g h 1 - g l o b i nt o r y t h a n p E A l a n d c o u l d t y p im o l a r r a t i o s o f f r a g m e n t . W i t h -

3 7 1 3 4 2cc 'OA AR

DISCUSSIONDo Am T r a n s l a t i o n i s i n i t i a t e d o n p i c o r n a v i r u s RNA b y c a p -n d 4 4 5 2 i n d e p e n d e n t , i n t e r n a l e n t r y o f r i b o s o m e s o n t o t h e 5 ' NTR.P r e v i o u s a n a l y s e s o f EMCV b a s e s i n v o l v e d i n e f f i c i e n t8 8 9 5 1 1 4 t r a n s l a t i o n w e r e c a r r i e d o u t p r e d o m i n a n t l y w i t h d i c i s t r o n i cmRNAs ( 1 4 ) . We h a v e f u r t h e r d e f i n e d t h e r e q u i r e d RNA7 1 7 2 1 2 5 s e q u e n c e s b y d e l e t i o n a n d i n s e r t i o n a n a l y s i s w i t h m o n o c i s -t r o n i c mRNAs. A l t h o u g h o u r r e s u l t s g e n e r a l l y a g r e e w i t h1 3 < 5 2 0 t h o s e o f J a n g a n d Wimmer ( 1 4 ) , t h e y d o c a l l i n t o q u e s t i o n t h er o l e o f s t e m - l o o p H . T h e s e a u t h o r s s u g g e s t e d t h a t i n t e g r i t y6 8 6 2 1 0 5 o f H c o r r e l a t e s w i t h t r a n s l a t i o n a l e f f i c i e n c y o f t h e d o w n -s t r e a m c i s t r o n i n d i c i s t r o n i c mRNAs a n d a l s o w i t h t h e a b i l i t yM CV 5 ' NT R s e q u e n c e s w e r e o f a 5 7 - k D a c e l l u l a r p r o t e i n t o b i n d t o t h i s s p e c i f i c s t r u c t u r e .R I ) i n a f o u r - t o s i x f o l d m o l a r H o w e v e r , t h e i r t e s te d d e l e ti o n s w i t h i n t h i s r e g i o n w e r e l e s se x c e s s w i t h P - g l o b i n r e a c t i o n s ) c o m p r e h e n s i v e t h a n o u r p E A l B a l s e r i e s , a n d w e h a v eL e RNAs w e r e : f l o c k h o u s e v i r u s c r e a t e d a t l e a s t one t r a n s c r i p t i n w h i c h t h i s e n t i r e d o m a i n i so b i n mRNA ( 0 . 8 R g ) , a n d p E A l c l e a n l y r e m o v e d ( d e l e t i o n t o b a s e 4 6 6 ) a n d y e t t h e RNA s t i l le d p r o t e i n w a s q u a n t i t a t e d b y t r a n s l a t e s w i t h r e a s o n a b l e e f f i c i e n c y ( 7 0 % o f t h a t o f p E A 1 ) .i c t i v i t y a f t e r 6 0 m i n o f i n c u b a - We c a n o n l y s p e c u l a t e a b o u t t h e r e a s o n s f o r t he s e e x p er -o f d u p l i c a t e s a m p l e s ) r e p r e s e n t i m e n t a l d i s c r e p a n c i e s . H o w e v e r , i t m i g h t b e c o n s i d e r e d t h a tc a m p l e s w i t h n o a d d e d c o m p e t i - m o n o c i s t r o n i c a n d d i c i s t r o n i c c o n t e x t s c o u l d p l a c e e n t i r e l y) 0 c p m 2 5 l = 1 0 % , f o r1 T - g l o b i n d i f f e r e n t c o n s t r a i n t s o n t h e a b i l i t y o f t h e 5 ' N T R t o i n i t i a t el a r d d e v i a t i o n o f 1 0 % . n d , n o t t r a n s l a t i o n . I n d e e d , J a n g e t a l . s h o w e d p r e v i o u s l y ( 1 2 ) t h a ts o m e EMCV d e l e t i o n m u t a n t s a r e m o r e e f f e c t i v e i n m o n o -c i s t r o n i c t h a n d i c i s t r o n i c c o n t e x t s . M o r e o v e r , i t i s p o s s i b l e

t h a t e n g i n e e r e d c o n s t r u c t i o n s w h i c h o n l y p a r t i a l l y r e m o v e al o c a l RNA m o t i f h a v e u n a n t i c i p a t e d c o n f i g u r a t i o n e f f e c t s o nc i e n t c o m p e t i t o r s o f o t h e r a d j a c e n t s t r u c t u r a l e l e m e n t s . T h u s , c e r t a i n t r a n s c r i p t s , e i -e s y n t h e s i s r e a c t i o n s ( 3 2 ) . t h e r m o n o c i s t r o n i c o r d i c i s t r o n i c , c o u l d p o t e n t i a l l y e x h i b i tNT R t h a t m i g h t s e q u e s t e r a l t e r e d a c t i v i t i e s i n d e p e n d e n t o f t h e d e l e t e d s e q u e n c e s ., n s l a t i o n c o m p e t i t i o n a s s a y s . C o m p u t e r - a i d e d RNA f o l d i n g s u p p o r t s t h i s i d e a a n d s u g -s 3 3 5 t o 8 4 8 o r s u b f r a g m e n t s g e s t s t h a t t h e d e l e t i o n s w i t h i n s t e m - l o o p H ( t o p o s i t i o n s 4 2 1( t e e x t r a c t s c o n t a i n i n g t r a n s - a n d 4 2 5 ) p e r f o r m e d b y J a n g a n d Wimmer ( 1 4 ) m i g h t h a v ei f l o c k h o u s e v i r u s , r a b b i t d i s t u r b e d t h e n a t u r a l f o l d i n g o f a d j a c e n t s t e m I , i n a m a n n e r. E x c e p t f o r 1 4 b a s e s , c o d i n g a n a l o g o u s t o o u r p E A l B a l c o n s t r u c t i o n s w h i c h b e g i n a t b a s ee t e s t e d f r a g m e n t s t o r e d u c e 4 0 6 , 4 1 6 , o r 4 4 3 . I n s e r t i o n s s p e c i f i c t o s t e m - l o o p H ( l i n k e ri r a l p r o t e i n a n d t o f o c u s t h e i n s e r t i o n a t b a s e 4 1 5 ) o r r e m o v a l o f H w i t h o u t d i s r u p t i o n o fe n t s r a t h e r t h a n e l o n g a t i o n . I ( d e l e t i o n o f b a s e 4 6 6 ) a l l o w e d u s t o i n d e p e n d e n t l y a s s e s sc o m p e t i n g s e g m e n t s w e r e t h e s e m o t i f s a n d t o map t h e 5 ' - m o s t r e q u i r e d t r a n s l a t i o n a lt i o o f 2 t o 6 ) , d e p r e s s i o n o f e l e m e n t t o t h e l o w e r r e g i o n s o f s t e m I r a t h e r t h a n s t e m - l o o pe v e l a c h i e v e d i n t h e a b s e n c e H .t r o n g c o m p e t i t i o n .S t 5 ' NTRs ( b a s e s 3 3 5 t o 8 4 8 )i n i n g b as e s 6 6 7 t o 7 9 7 w e r et r s . T h e comm o n s e q u e n c eD n t h e J - K r e g i o n . C o m p u t e rs t e m s a r e c o n s e r v e d i n a l l; e l y t h a t J - K - s p e c i f i c s e q u e s -c o m p o n e n t s ( 3 5 ) i s r e s p o n s i -t e d ( f l o c k h o u s e v i r u s a n dt e m p l a t e s w e r e s e n s i t i v e t oRNA was much l e s s r e f r a c -i c a l l y b e i n h i b i t e d b y l o w e ra l l t e m p l a t e s , i n h i b i t i o n was

O u r d a t a a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h o s e o f S h i h e t a l . ( 3 6 ) ,who f o u n d t h a t cDNA f r a g m e n t s h y b r i d i z i n g t o n u c l e o t i d e s4 2 0 t o 4 4 9 c a u s e d o n l y a s l i g h t t r a n s l a t i o n a l i n h i b i t i o n o fEMCV vRNA, w h e r e a s cDNAs h y b r i d i z i n g b e t w e e n n u c l e -o t i d e s 4 5 0 a n d 8 3 4 c a u s e d a h i g h d e g r e e o f i n h i b i t i o n .C o r r e l a t i v e r e s u l t s w e r e a l s o o b t a i n e d w i t h t h e r e l a t e df o o t - a n d - m o u t h d i s e a s e v i r u s , i n w h i c h t h e RNA r e g i o nc o n t r o l l i n g t r a n s l a t i o n a p p e a r s t o m a i n t a i n t h e same b a s i cs t r u c t u r a l p a t t e r n a s t h a t o f EMCV ( 3 1 ) . T h e f o o t - a n d - m o u t hd i s e a s e v i r u s a n a l o g o f EMCV s t e m H was m u t a t e d s u c h t h a tt h e 5 7 - k D a p r o t e i n b o u n d v e r y w e a k l y , y e t t r a n s l a t i o n w a sd e c r e a s e d o n l y 50% w h e n c o m p a r e d w i t h t h a t o f u n m u t a t e dt r a n s c r i p t RNA ( 1 6 , 1 8 a , 1 9 ) . T h i s l e n d s s u p p o r t t o o u r

VOL. 6 6 , 1 9 9 2


8/9

1 6 0 8 DUKE ET AL.c o n c l u s i o n t h a t t h e i n t e g r i t y o f s t e m H d o e s n o t seem c r u c i a lf o r p r o p e r t r a n s l a t i o n a l f u n c t i o n .We s u g g e s t i n s t e a d t ha t t he J - K e l e m e n t a n d t h e e v e r -p r e s e n t s t e m - l o o p I p l a y more c r i t i c a l r o l e s i n t r a n s l a t i o ni n i t i a t i o n . I n d e p e n d e n t o f o t h e r 5 ' NTR r e g i o n s , t h e J - Ks e q u e n c e s ( b a s e s 6 6 7 t o 7 9 7 ) were r e m a r k a b l y a c t i v e i nc o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n a s s a y s . I t i s n o t a b l e t h a t l i n k e r i n s e r -t i o n s i n s t e m s I a n d J - K ( a t b a s e s 5 7 7 a n d 7 7 7 , r e s p e c t i v e l y )b o t h d e s t r o y e d t r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y b u t s h o w e d q u i t e d i s -t i n c t e f f e c t s when u s e d a s i n h i b i t o r s i n t h e c o m p e t i t i o na s s a y s . T h e i n s e r t i o n a t b a s e 5 7 7 ( s t e m I ) was a n a c t i v ec o m p e t i t o r , w h e r e a s t h e i n s e r t i o n a t b a s e 7 7 7 ( s t e m J - K ) h a dl o s t i n h i b i t o r y a c t i v i t y . T h e t e r m i n a l l o o p o f s t e m K ( C U -UUA, b a s e s 7 4 6 t o 7 5 0 ) w as r e c e n t l y r e p o r t e d a s a n e f f i c i e n tb i n d i n g s i t e f o r e u c a r y o t i c i n i t i a t i o n f a c t o r e I F - 2 / 2 B ( 3 5 ) , ap r o t e i n c o m p l e x p r e s u m e d t o f u n c t i o n i n i n i t i a t o r AUGr e c o g n i t i o n ( 8 ) . C o n si s te n t w i t h o u r d a t a , a s t r o n g c o m p e t i -t i v e J - K s e q u e n c e - d e p e n d e n t s e q u e s t e r i n g o f t h e s e r e q u i r e dt r a n s l a t i o n a l e l e m e n t s may e x p l a i n t h e o v e r a l l e f f i c i e n c y o fEMCV f r a g m e n t s a t d i r e c t i n g p r o t e i n s y n t h e s i s . M o r e o v e r ,s u c h i n t e r a c t i o n s c o u l d p r o v i d e a p l a u s i b l e m e c h a n i s m b yw h i c h EMCV vRNA may o u t c o m p e t e h o s t mRNAs f o rr i b o s o m e s o r i n i t i a t i o n f a c t o r s ( e I F - 2 / 2 B ? ) a n d e f f e c t s h u t o f fo f c e l l u l a r p r o t e i n s y n t h e s i s d u r i n g i n f e c t i o n . We a r e c u r -r e n t l y e x a m i n i n g t h e r o l e o f p u r i f i e d e I F - 2 a n d e I F - 2 B o nt r a n s l a t i o n a l a c t i v i t y a n d s p e c i f i c a l l y o n J - K - d e p e n d e n t i n h i -b i t i o n o f e x o g e n o u s mRNA t r a n s l a t i o n .

ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k D i n g S h i h f o r c r i t i c a l r e a d i n g o f t h e m a n u s c r i p t a n dC o r n e l i s P l e i j f o r c o r r o b o r a t i v e d a t a c o n c e r n i n g p s e u d o k n o t s t r u c -t u r e s B a n d C .T h i s w o r k was s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e g r a n t A I - 1 7 3 3 1f r o m t h e N I H .

REFERENCES1 . B a e , Y . S . , H . M . E u n , a n d J . W. Y o o n . 1 9 8 9 . M o l e c u l a r

i d e n t i f i c a t i o n o f a d i a b e t o g e n i c v i r a l g e n e . D i a b e t e s 3 8 : 3 1 6 - 3 2 0 .2 . C o h e n , S . H . , R . K . N a v i a u x , K . M . V . B r i n k , a n d G . W. J o r d a n .1 9 8 8 . C o m p a r i s o n o f t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f d i a b e t o g e n i ca n d n o n d i a b e t o g e n i c e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s . V i r o l o g y 1 6 6 :6 0 3 - 6 0 7 .3 . D e v a n e y , M. A . , V . N . V a k h a r i a , R . E . L l o y d , E . E h r e n f e l d , a n dM. J . G r u b m a n . 1 9 8 8 . L e a d e r p r o t e i n o f f o o t - a n d - m o u t h d i s e a s ev i r u s i s r e q u i r e d f o r c l e a v a g e o f t h e p 2 2 0 c o m p o n e n t o f t h ec a p - b i n d i n g p r o t e i n c o m p l e x . J . V i r o l . 6 2 : 4 4 0 7 - 4 4 0 9 .4 . D u k e , G . M . , a n d A . C . P a l m e n b e r g . 1 9 8 9 . C l o n i n g a n d s y n t h e -s i s o f i n f e c t i o u s c a r d i o v i r u s RNAs c o n t a i n i n g s h o r t , d i s c r e t ep o l y ( C ) t r a c t s . J . V i r o l . 6 3 : 1 8 2 2 - 1 8 2 6 .5 . E l r o y - S t e i n , O . , T . R . F u e r s t , a n d B . M o s s . 1 9 8 9 . C a p - i n d e p e n -d e n t t r a n s l a t i o n o f mRNA c o n f e r r e d b y e n c e p h a l o m y o c a r d i t i sv i r u s 5 ' s e q u e n c e i m p r o v e s t h e p e r f o r m a n c e o f t h e v a c c i n i av i r u s / b a c t e r i o p h a g e T 7 h y b r i d e x p r e s s i o n s y s t e m . P r o c . N a t l .A c a d . S c i . USA 8 6 : 6 1 2 6 - 6 1 3 0 .6 . E v s t a f i e v a , A . G . , T . Y . U g a r o v a , B . K . C h e r n o v , a n d I . N .S h a t s k y . 1 9 9 1 . A c o m p l e x RNA s e q u e n c e d e t e r m i n e s t h e i n t e r -n a l i n i t i a t i o n o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s RNA t r a n s l a t i o n .N u c l e i c A c i d s R e s . 1 9 : 6 6 5 - 6 7 1 .7 . F r e i e r , S . M . , R . K i e r z e k , J . A . J a e g e r , N . S u g i m o t o , M. H .C a r u t h e r s , T . N e i l s o n , a n d D . H . T u r n e r . 1 9 8 6 . I m p r o v e df r e e - e n e r g y p a r a m e t e r s f o r p r e d i c t i o n s o f RNA d u p l e x s t a b i l i t y .P r o c . N a t l . A c a d . S c i . US A 8 3 : 9 3 7 3 - 9 3 7 7 .8 . H e r s h e y , J . W. B . , R . D u n c a n , a n d M . B . M a t h e w s . 1 9 8 6 .I n t r o d u c t i o n : m e c h a n i s m s o f t r a n s l a t i o n a l c o n t r o l , p . 1 - 1 8 . I nM . B . M a t h e w s ( e d . ) , T r a n s l a t i o n a l c o n t r o l : c u r r e n t c o m m u n i -c a t i o n s i n m o l e c u l a r b i o l o g y . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y .9 . J a c k s o n , R . J . 1 9 8 6 . A d e t a i l e d k i n e t i c a n a l y s i s o f t h e i n v i t r os y n t h e s i s a n d p r o c e s s i n g o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s p r o d -

u c t s . V i r o l o g y 1 4 9 : 1 1 4 - 1 2 7 .1 0 . J a c k s o n , R . J . , M. T . H o w e l l , a n d A . K a m i n s k i . 1 9 9 0 . T h e n o v e lm e c h a n i s m o f i n i t i a t i o n o f p i c o r n a v i r u s RNA t r a n s l a t i o n .T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 5 : 4 7 7 - 4 8 3 .1 1 . J a n g , S . K . , M. V . D a v i e s , R . J . K a u f m a n , a n d E . W i m m e r .1 9 8 9 . I n i t i a t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s b y t h e i n t e r n a l e n t r y o fr i b o s o m e s i n t o t h e 5 ' n o n t r a n s l a t e d r e g i o n o f e n c e p h a l o m y o -c a r d i t i s v i r u s RNA i n v i v o . J . V i r o l . 6 3 : 1 6 5 1 - 1 6 6 0 .1 2 . J a n g , S . K . , H . - G . K r a u s s l i c h , M. J . H . N i c k l i n , G . M. D u k e ,A . C . P a l m e n b e r g , a n d E . W i m m e r . 1 9 8 8 . A s e g m e n t o f t h e 5 'n o n t r a n s l a t e d r e g i o n o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s RNA d i -r e c t s i n t e r n a l e n t r y o f r i b o s o m e s d u r i n g i n v i t r o t r a n s l a t i o n . J .V i r o l . 6 2 : 2 6 3 6 - 2 6 4 3 .1 3 . J a n g , S . K . , T . P e s t o v a , C . U . T . H e l l e n , G . W. W i t h e r e l l , a n d E .W i m m e r . 1 9 9 0 . C a p - i n d e p e n d e n t t r a n s l a t i o n o f p i c o r n a v i r a lRNAs: s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e i n t e r n a l r i b o s o m a l e n t r ys i t e . E n z y m e 4 4 : 2 9 2 - 3 0 9 .1 4 . J a n g , S . K . , a n d E . W i m m e r . 1 9 9 0 . C a p - i n d e p e n d e n t t r a n s l a t i o no f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s RNA: s t r u c t u r a l e l e m e n t s o f t h ei n t e r n a l r i b o s o m a l e n t r y s i t e a n d i n v o l v e m e n t o f a c e l l u l a r 5 7 - k DR N A - b i n d i n g p r o t e i n . G e n e s D e v . 4 : 1 5 6 0 - 1 5 7 2 .1 5 . K a m i n s k i , A . , M. T . H o w e l l , a n d R . J . J a c k s o n . 1 9 9 0 . I n i t i a t i o no f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s RNA t r a n s l a t i o n : t h e a u t h e n t i ci n i t i a t i o n s i t e i s n o t s e l e c t e d b y a s c a n n i n g m e c h a n i s m . EMBOJ . 9 : 3 7 5 3 - 3 7 5 9 .1 6 . K u h n , R . , N . L u z , a n d E . B e c k . 1 9 9 0 . F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f t h ei n t e r n a l t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i t e o f f o o t - a n d - m o u t h d i s e a s ev i r u s . J . V i r o l . 6 4 : 4 6 2 5 - 4 6 3 1 .1 7 . L a w r e n c e , C . , a n d R . E . T h a c h . 1 9 7 4 . E n c e p h a l o m y o c a r d i t i sv i r u s i n f e c t i o n o f m o u s e p l a s m a c y t o m a c e l l s . I . I n h i b i t i o n o fc e l l u l a r p r o t e i n s y n t h e s i s . J . V i r o l . 1 4 : 5 9 8 - 6 1 0 .1 8 . L l o y d , R . E . , H . T o y o d a , D . E t c h i s o n , E . W i m m e r , a n d E .E h r e n f e l d . 1 9 8 6 . C l e a v a g e o f t h e c a p b i n d i n g p r o t e i n c o m p l e xp o l y p e p t i d e p 2 2 0 i s n o t e f f e c t e d b y t h e s e c o n d p o l i o v i r u sp r o t e a s e 2 A . V i r o l o g y 1 5 0 : 2 9 9 - 3 0 3 .1 8 a . L u z , N . P e rs o n a l c o m m u n i c a t i o n .1 9 . L u z , N . , a n d E . B e c k . 1 9 9 0 . A c e l l u l a r 5 7 k D a p r o t e i n b i n d s t ot w o r e g i o n s o f t h e i n t e r n a l t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i t e o f f o o t - a n d -m o u t h d i s e a s e v i r u s . FEBS L e t t . 2 6 9 : 3 1 1 - 3 1 4 .2 0 . M a x a m , A . M . , a n d W. G i l b e r t . 1 9 8 0 . S e q u e n c i n g e n d - l a b e l e dDNA w i t h b a s e - s p e c i f i c c h e m i c a l c l e a v a g e s . M e t h o d s E n z y m o l .6 5 : 4 9 9 - 5 6 0 .2 1 . M o s e n k i s , J . , S . D a n i e l s - M c Q u e e n , S . J a n o v e c , R . D u n c a n ,J . W. B . H e r s h e y , J . A . G r i f o , W. C . M e r r i c k , a n d R . E . T h a c h .1 9 8 5 . S h u t o f f o f h o s t t r a n s l a t i o n b y e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u si n f e c t i o n d o e s n o t i n v o l v e c l e a v a g e o f t h e e u c a r y o t i c i n i t i a t i o nf a c t o r 4 F p o l y p e p t i d e t h a t a c c o m p a n i e s p o l i o v i r u s i n f e c t i o n . J .V i r o l . 5 4 : 6 4 3 - 6 4 5 .2 2 . P a l m e n b e r g , A . C . 1 9 8 2 . I n v i t r o s y n t h e s i s a n d a s s e m b l y o fp i c o r n a v i r a l c a p s i d i n t e r m e d i a t e s t r u c t u r e s . J . V i r o l . 4 4 : 9 0 0 -9 0 6 .2 3 . P a l m e n b e r g , A . C . 1 9 8 7 . C o m p a r a t i v e o r g a n i z a t i o n a n d g e n o m es t r u c t u r e i n p i c o r n a v i r u s e s , p . 2 5 - 3 4 . I n M . A . B r i n t o n , a n dR . R . R u e c k e r t ( e d . ) , P o s i t i v e s t r a n d RNA v i r u s e s . A l a n R .L i s s , I n c . , New Y o r k .2 4 . P a l m e n b e r g , A . C . , a n d G . M . D u k e . U n p u b l i s h e d d a t a .2 5 . P a l m e n b e r g , A . C . , E . M . K i r b y , M. R . J a n d a , N . L . D r a k e ,G . M. D u k e , K . F . P o t r a t z , a n d M . S . C o l l e t t . 1 9 8 4 . T h en u c l e o t i d e a n d d e d u c e d s e q u e n c e s o f t h e e n c e p h a l o m y o c a r d i t i sv i r a l p o l y p r o t e i n c o d i n g r e g i o n . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 : 2 9 6 9 -2 9 8 5 .2 6 . P a l m e n b e r g , A . C . , M . A . P a l l a n s c h , a n d R . R . R u e c k e r t . 1 9 7 9 .P r o t e a s e r e q u i r e d f o r p r o c e s s i n g p i c o r n a v i r a l c o a t p r o t e i n r e -s i d e s i n t h e v i r a l r e p l i c a s e g e n e . J . V i r o l . 3 2 : 7 7 0 - 7 7 8 .2 7 . P a r k s , G . D . , G . M. D u k e , a n d A . C . P a l m e n b e r g . 1 9 8 6 .E n c e p h a l o m y o c a r d i t i s 3 C p r o t e a s e : e f f i c i e n t c e l l - f r e e e x p r e s -s i o n f r o m c l o n e s w h i c h l i n k v i r a l 5 ' n o n c o d i n g s e q u e n c e s t o t h eP 3 r e g i o n . J . V i r o l . 6 0 : 3 7 6 - 3 8 4 .2 8 . P a r k s , G . D . , a n d A . C . P a l m e n b e r g . 1 9 8 7 . S i t e - s p e c i f i c m u t a -t i o n s a t a p i c o r n a v i r u s V P 3 / V P 1 c l e a v a g e s i t e d i s r u p t i n v i t r op r o c e s s i n g a n d a s s e m b l y o f c a p s i d p r e c u r s o r s . J . V i r o l . 6 1 :3 6 8 0 - 3 6 8 7 .2 9 . P e l h a m , H . R . B . , a n d R . J . J a c k s o n . 1 9 7 6 . An e f f i c i e n t mRNA-

J . V I R O L .


9/9

EMCV TRANSLATION 1 6 0 9d e p e n d e n t t r a n s l a t i o n s y s t e m f r o m r e t i c u l o c y t e l y s a t e s . E u r . J .B i o c h e m . 6 7 : 2 4 7 - 2 5 6 .3 0 . P e l l e t i e r , J . , a n d N . S on e n b e r g . 1 9 8 8 . I n t e r n a l i n i t i a t i o n o ft r a n s l a t i o n o f e u k a r y o t i c mRNA b y a s e q u e n c e d e r i v e d f r o mp o l i o v i r u s RNA. N a t u r e ( L o n d o n ) 3 3 4 : 3 2 0 - 3 2 5 .3 1 . P i l i p e n k o , E . V . , V . M. B f i n o v , B . K . C h e r n ov , T . M. D m i t r i e v a ,a n d V . I . A g o l . 1 9 8 9 . C o n s e r v a t i o n o f t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r ee l e m e n t s o f t h e 5 ' - u n t r a n s l a t e d r e g i o n o f c a r d i o - a n d a p h t h o v i -r u s RNAs. N uc l e i c A c i ds R es . 1 7 : 57 0 1 - 57 1 1 .3 1 a . P l e i j , C . P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n .3 2 . R o s e n , H . , G . D i S e g n i , a n d R . K a e m p f e r . 1 9 8 2 . T r a n s l a t i o n a lc o n t r o l b y m e s s e n g e r RNA c o m p e t i t i o n f o r e u k a r y o t i c i n i t i a t i o nf a c t o r 2 . J . B i o l . C h e m . 2 5 7 : 9 4 6 - 9 5 2 .3 3 . R u e c k e r t , R . R . , a n d M . A . P a l l a n s c h . 1 9 8 1 . P r e p a r a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s . M e t h o d s E n -z y m o l . 7 8 : 3 1 5 - 3 2 5 .3 4 . S a m b r o o k , J . , E . F . F r i t s c h , a n d T . M a n i a t i s . 1 9 8 9 . M o l e c u l a rc l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l , 2 n d e d . C o l d S p r i n g H a r b o rL a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y .3 5 . S c h e p e r , G . C . , A . T h o m a s , a n d H . 0 . V o o r m a . 1 9 9 1 . T h e 5 'u n t r a n s l a t e d r e g i o n o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s c o n t a i n s as e q u e n c e f o r v e r y e f f i c i e n t b i n d i n g o f e u k a r y o t i c i n i t i a t i o n f a c t o re I F - 2 / 2 B . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 0 8 9 : 2 2 0 - 2 2 6 .3 6 . S h i h , D . S . , I . - W . P a r k , C . L . E v a n s , J . M . J a y n e s , a n d A . C .P a l m e n b e r g . 1 9 8 7 . E f f e c t s o f cDNA h y b r i d i z a t i o n o n t r a n s l a t i o n

o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s RNA. J . V i r o l . 6 1 : 2 0 3 3 - 2 0 3 7 .3 7 . S h i h , D . S . , C . T . S h i h , D . Z i m m e r n , R . R . R u e c k e r t , a n d P .K a e s b e r g . 1 9 7 9 . T r a n s l a t i o n o f e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u sRNA i n r e t i c u l o c y t e l y s a t e s : k i n e t i c a n a l y s i s o f t h e f o r m a t i o n o fv i r i o n p r o t e i n s a n d a p r o t e i n r e q u i r e d f o r p r o c e s s i n g . J . V i r o l .3 0 : 4 7 2 - 4 8 0 .3 8 . S m it h, A . J . H . 1 9 8 0 . DNA s e q u e n c e a n a l y s i s b y p r i m e ds y n t h e s i s . M e t h o d s E n z y m o l . 6 5 : 5 6 0 - 5 8 0 .3 9 . S v i t k i n , Y . V . , V . A . G i n e v s ka y a , T . Y . U g a r o v a , a n d V . I . A g o l .1 9 7 8 . A c e l l - f r e e m o d e l o f t h e e n c e p h a l o m y o c a r d i t i s v i r u s -i n d u c e d i n h i b i t i o n o f h o s t c e l l p r o t e i n s y n t h e s i s . V i r o l o g y 8 7 :1 9 9 - 2 3 3 .4 0 . V a r t a p e t i a n , A . B . , A . S . M a n k i n , E . V . S h r i p k i n , K . M.C h u m a k o v , V . D . S m i r n o v , a n d A . A . B o g d a n o v . 1 9 8 3 . T h ep r i m a r y a n d s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e 5 ' e n d r e g i o n o f e n c e p h -a l o m y o c a r d i t i s v i r u s RNA. A n o v e l a p p r o a c h t o s e q u e n c i n gl o n g RNA m o l e c u l e s . G e n e 2 6 : 1 8 9 - 1 9 5 .4 1 . Z h o u , Y . , T . J . G i o r d a n o , R . K . D u r b i n , a n d W. T . M c A l l i s t e r .1 9 9 0 . S y n th es i s o f f u n c t i o n a l mRNA i n m a m m a l i a n c e l l s b yb a c t e r i o p h a g e T 3 RNA p o ly m e r a s e . M o l. C e l l . B i o l . 1 0 : 4 5 2 9 -4 5 3 7 .4 2 . Z u k e r , M . , a n d P . S t i e g l e r . 1 9 8 1 . O p t i m a l c o m p u t e r f o l d i n g o fl a r g e RNA s e q u e n c e s u s i n g t h e r m o d y n a m i c s a n d a u x i l i a r yi n f o r m a t i o n . N u c l e i c A c i d s R es . 9 : 1 3 3 - 1 4 8 .

V O L . 6 6 , 1 9 9 2

sequence and structural elements emcv

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