sheared roots as a va-mycorrhizal inoculum and methods for enhancing plant growth

7/27/2019 Sheared Roots as a Va-mycorrhizal Inoculum and Methods for Enhancing Plant Growth

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US. Patent M a r . 1 7 , 1 9 9 2 5 , 0 9 6 , 4 8 1

F / G I /I 0 0 0

P R O P A G U h E I S P E Rg m o r 0 0 0 ) ' 0

' b 2 6 0 4 b 0 a a l o ' o o ?S I Z E m c n o u ( p m )H e . 24 0

30 _o_ I S I N F E S T E DC O L O N I Z A T I O N ( % ) -'-' O N D I S I N F E S T E D

l 0 -

o , , ,o 5 n o I 5 2 0P R O P A G U L E S / g M E D I AH635 0 q

4 0 /w

- y ' [ 4 8 8 2 + 0 . 8 2 6 3 9 X R " 2 ' 0 . 9 6 2m. . .

l 0 :0

C U D N I Z A T I O N ( % )

I I 0 K X )P R O P A G U L E S / g M E D I A


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5 , 0 9 6 , 4 8 11SHEARED ROOTS A S A VA-MYCORRHIZALINOCULUM AND METHODS FOR ENHANCING

PLANT GROWTHBACKGROUND OF THE INVENTION

1 . F i e l d o f t h e I n v e n t i o nTh e p r e s e n t i n v e n t i o n r e l a t e s t o a v e s i c u l a r - a r b u s c ul a r m y c o r r h i z a l f u n g i i n o c u l u m a n d m e t h o d s f o r t h ep r o d u c t i o n a n d t h e u t i l i z a t i o n t h e r e o f f o r p l a n t g r o w t he n h a n c e m e n t .2 . D i s c u s s i o n o f t h e P r i o r ArtVA v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r ) m y c o r r h i z a l f u n g i a r e b e ne ? c i a l f u n g i i n t h a t t h e y i n f e c t t h e f e e d i n g r o o t s o fp l a n t s a n d s t i m u l a t e u p t a k e o f p h o s p h o r u s f r o m t h e s o i l .Hyphae o f t h e f u n g u s grow o u t w a r d l y f r o m t h e r o o tw e l l b e y o n d t h e p h o s p h a t e d e p l e t i o n z o n e ( t h e z o n ef r o m w h i c h t h e a v a i l a b l e p h o s p h a t e h a s a l r e a d y b e e nc o n s u m e d b y t h e p l a n t ) . S e l e c t e d V A - m y c o r r h i z a lf u n g i h a v e b e e n shown t o e n h a n c e t h e growth o f num e r o u s p l a n t s o f e c o n o m i c i m p o r t a n c e [ J e f f r i e s , CRCC r i t i c a l R e v i e w s i n B i o t e c h n o l o g y , V o l . 5 , " U s e o f Myc o r r h i z a e i n A g r i c u l t u r e , " p a g e s 3 1 9 - 3 5 7 ( 1 9 8 7 ) ] , i nc l u d i n g v e g e t a b l e s [ H a a s e t a 1 , A g r o n . J . , V o l . 7 9 , V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r M y c o r r h i z a l F u n g u s I n f e s t a t i o na n d P h o s p h o r u s F e r t i g a t i o n t o Overcome P e p p e rS t u n t i n g A f t e r M e t h y l B r o m i d e F u m i g a t i o n , p a g e s9 0 5 - 9 1 0 ( 1 9 8 7 ) ; M o h a n d a s , P l a n t a n d S o i l , V o l . 9 8 ," F i e l d R e s p o n s e s t o Tomato ( L y c o p e r s i c o n e s c u l e n t u m )t o I n o c u l a t i o n With a V A - m y c o r r h i z a l Fun gus Glomusf a s c i c u l a t u m a n d A z o t o b a c t e r v i r e l a n a ' i i , p a g e s 2 9 5 - 2 9 7( 1 9 8 7 ) ; P l e n c h e t t e e t a l , P l a n t and S o i l , V o l . 7 0 ,Growth R e s p o n s e o f S e v e r a l P l a n t S p e c i e s t o Mycorr h i z a e i n a S o i l o f M o d e r a t e P h o s p h o r u s F e r t i l i t y I .M y c o r r h i z a l D e p e n d e n c y U n d e r F i e l d C o n d i t i o n s , p a g e s 1 9 7 - 2 0 9 ( 1 9 8 3 ) ] ; ? e l d c r o p s [ B a l t r u s c h a t , Z e i t sc h r i ? ? l r P ? a n z e n k r a n k he i t e n a n d P ? a n z e n s c h u t z , V o l .9 4 , " F i e l d I n o c u l a t i o n o f M a i z e w i t h V e s i c u l a r - a r b u s c ul a r M y c o r r h i z a l F u n g i b y U s i n g E x p a n d e d C l a y a sC a r r i e r M a t e r i a l f o r M y c o r r h i z a , " p a g e s 4 1 9 - 4 3 0( 1 9 8 7 ) ; H a l l , J . A g r . S c i . , V o l . 1 0 2 , F i e l d T r i a l s A s s e ss i n g t h e E f f e c t i n I n o c u l a t i n g A g r i c u l t u r a l S o i l s W i t hE n d o m y c o r r h i z a l F u n g i , p a g e s 7 2 5 - 7 3 1 ( 1 9 8 4 ) ; M ed i n a e t a l , B i o l F e r t . S o i l s , "Growth R e s p o n s e o f F i e l dg r o w n S i r a t r o ( M a c r o p t i l i u m a t r o p u r p u r e u m U r b . ) a n dAeschynomene a m e r i c a n a L . t o I n o c u l a t i o n With S el e c t e d V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r M y c o r r h i z a l F u n g i , V o l .9 , p a g e s 5 4 - 6 0 ( 1 9 9 0 ) ] a n d n a t i v e p l a n t s u s e d f o r r e v e g et a t i o n [ D e h g a n e t a 1 , B a r t o w , F l a . : F l o r i d a I n s t i t u t e o fP h o s p h a t e R e s e a r c h , " P r o p a g a t i o n a n d M y c o r r h i z a lI n o c u l a t i o n o f I n d i g e n o u s F l o r i d a P l a n t s f o r P h o s p h a t eM i n e R e v e g e t a t i o n , N o . 0 3 - 0 5 3 - 0 7 6 , 2 2 5 p a g e s ( 1 9 8 9 ) ;S y l v i a , J . C o a s t a l R e s , V o l . 5 , N u r s e r y I n o c u l a t i o n o fS e a O a t s w i t h V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r M y c o r r h i z a l F u n g ia n d O u t p l a n t i n g P e r f o r m a c e o f F l o r i d a B e a c h e s, p a g e s7 4 7 - 7 5 4 ( 1 9 8 9 ) ] . N o n e t h e l e s s , V A - m y c o r r h i z a l f u n g ia r e n o t u s e d w i d e l y i n c r o p p r o d u c t i o n , p a r t i a l l y b ecause inoculum s o u r c e s a r e l i m i t e d a n d a p p l i c a t i o nt e c h n o l o g i e s a r e n o t w e l l d e v e l o p e d .A a j o r l i m i t a t i o n t o t h e u t i l i z a t i o n o f VA-mycorrh i z a e i n c r o p p r o d u c t i o n i s t h e i n a b i l i t y t o p r o d u c es u f f i c i e n t amounts o f f u n g a l i n o c u l u m . Th e VAm y c o r r h i z a l f u n g i h a v e n o t b e e n grown s u c c e s s f u l l y i np u r e c u l t u r e a n d a r e c o n s i d e r e d o b l i g a t e s y m b i o n t s[ H e p p e r , VA M y c o r r h i z a , P o w e l l a n d B a g y a r a j , e d s .(CRC P r e s s , B o c a R a t o n , F l a . ( 1 9 8 4 ) ) ] . D ue t o t h i sl i m i t a t i o n , t h e s e f u n g i a r e u s u a l l y m a i n t a i n e d a n d i nc r e a s e d i n p o t c u l t u r e s [ F e r g u s o n e t a 1 , Methods a n d

2 _P r i n c i p l e s o f M y c o r r h i z a l R e s e a r c h , N . C . S c h e n c k ,e d . ( A m e r i c a n P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y , S t . P a u l ,M i n n . ( 1 9 8 2 ) ) 1 , s a n d [ ' I ' h o m p s o n , C a n . J . B o t , V o l . 6 4 ,p a g e s 2 2 8 2 - 2 2 9 4 ( 1 9 8 6 ) ] o r e x p a n d e d c l a y [ D e h n e e t a 1 ,5 Z e i t s c h n ? ? t r P ? a n z e n k r a n k h e i t e n a n d P ? a n z e n s c h u t z ,

1 5

20

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3 0

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6 0

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V o l . 9 3 , N o . 4 , p a g e s 4 1 5 - 4 2 4 ( 1 9 8 6 ) ] . P o t c u l t u r e s a r ec o m p r i s e d o f h o s t p l a n t s , m y c o r r h i z a l f u n g i a n d s o i lmicro?ora a n d m i c r o f a u n a , a n d a r e i n ? u e n c e d by t h ep h y s i c a l a n d c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e p o t t i n g medium[ S y 1 v i a , " A p p l i c a t i o n s o f M y c o r r h i z a l F u n g i l n C r o pP r o d u c t i o n , J . J . F e r g u s o n , e d . ( U n i v e r s i t y o f F l o r i d a ,G a i n e s v i l l e , F l a . ( l 9 8 4 ) ) ] . I t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t t h eq u a l i t y a n d q u a n t i t y o f p r o p a g u l e s p r o d u c e d f o r i n o c ulum by h i s method v a r i e s w i d e l y due t o t h e many i n t e ra c t i o n s among t h e s e v a r i a b l e s .

I n o c u l u m o f V A - m y c o r r h i z a l f u n g i ma y c o n s i s t o fs o i l ( c o n t a i n i n g c o l o n i z e d r o o t f r a g m e n t s , s p o r e s a n dh y p h a e ) , c o l o n i z e d r o o t s a l o n e o r s p o r e s a l o n e . Th e u s eo f s o i l and r o o t i n o c u l u m h a s l i m i t e d commercial v a l u eb e c a u s e t h e s e s y s t e m s c a n become e a s i l y c o n t a m i n a t e db y o t h e r V A - m y c o r r h i z a l f u n g i a n d p l a n t p a t h o g e n s[ S c h e n c k e t a 1 , P h y t o p a t h o l o g y , V o l . 7 2 , p a g e 9 5 0( 1 9 8 2 ) ] . S i n g l e - s p e c i e s c u l t u r e s o f V A - m y c o r r h i z a l 'f u n g i t h a t a r e r e l a t i v e l y f r e e o f o t h e r c o n t a m i n a t i n go r g a n i s m s a r e b e s t a c h i e v e d by t h e u s e o f s p o r e i n o c ul u m .

S e v e r a l a l t e r n a t i v e s t o t h e p o t - c u l t u r e system haveb e e n p r o p o s e d f o r i n o c u l u m p r o d u c t i o n . The VAm y c o r r h i z a e h a v e b e e n f o r m e d on r o o t - o r g a n c u l t u r e s[ M o s s e e t a l , P h y s i o l . P l a n t P a t h o l o g y , V o l . 5 , p a g e 2 1 5( 1 9 7 5 ) ; M i l l e r - W i d e m a n e t a l , C a n . J . M i c r o b i o L , V o l .3 0 , p a g e 6 4 2 ( 1 9 8 4 ) ] . H o w e v e r , c o l o n i z a t i o n a n d s p o r ul a t i o n a r e l i m i t e d i n t h e s e monoxenic s y s t e m s . Th e VAm y c o r r h i z a e h a v e a l s o b e e n e s t a b l i s h e d i n s o l u t i o n c u lt u r e [ H o w e l e r e t a l , N e w P h y t o L , V o l . 9 0 , p a g e 2 2 9( 1 9 8 2 ) ; Mosse e t a 1 , C a n . J . B o t . , V o l . 6 2 , p a g e 1 5 2 3( 1 9 8 4 ) ; Elmes e t a l , C a n . J . B o t . , V o l . 6 2 , p a g e 1 5 3 1( 1 9 8 4 ) ; C r u s h e t a l , N . Z . J . A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h , V o l .2 4 , p a g e 3 7 1 ( 1 9 8 1 ) ; U S . a t . N o . 4 , 2 9 4 , 0 3 7 ] . For examp l e , E l m e s a n d M o s s e r e p o r t e d a p p r o x i m a t e l y 50%c o l o n i z a t i o n of Zea mays r o o t s a f t e r n i n e w e e ks i n an u t r i e n t ?lm s y s t e m . Th e i n o c u l u m p r o d u c e d i n t h e i rn u t r i e n t s y s t e m , however, w as p r i m a r i l y c o l o n i z e d r o o tm a t e r i a l . I n g e n e r a l , s p o r u l a t i o n i n s o l u t i o n c u l t u r es y s t e m s h a s b e e n p o o r . T h i s i s due t o t h e f a c t t h a t VAm y c o r r h i z a a r e i n h i b i t e d by e x c e s s i v e m o i s t u r e a n dpoor a e r a t i o n i n t h e n a t u r a l e n v i r o n m e n t .Th e VA-mycorrh izae have a l s o b e e n grown i n a e r op o n i c c u l t u r e [ H u n g e t a l , A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o L ,V o l . 5 4 , P r o d u c t i o n o f V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r M y c o rr h i z a l F u n g u s I n o c u l u m i n A e r o p o n i c C u l t u r e , p a g e s3 5 3 - 3 5 7 ( 1 9 8 8 ) ] .

V a r i o u s s t r a t e g i e s h a v e b e e n p r o p o s e d t o a p p l y i n o ci u l u m o f V A - m y c o r r h i z a l f u n g i i n a g r i c u l t u r e [ J a r s t f e re t a l , S o i l M i c r o b i a l T e c h n o l o g i e s , B . M e t t i n g , e d . ( M a rc e l D e k k e r , I n c . ) , I n o c u l a t i o n T e c h n i q u e s a n d I n o c ul u m P r o d u c t i o n o f V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r M y c o r r h i z a lF u n g i ( i n p r e s s ) ] . I n o c u l a - c o n t a i n i n g s o i l i s c o n s i d e r e di m p r a c t i c a l d u e t o i t s b u l k a n d t h e r i s k o f c o n t a m i n a t i o n ;h o w e v e r , c h o p p e d r o o t s i n p e a t b l o c k s [ W a r n e r , US .P a t . N o . 4 , 5 5 1 , 1 6 5 , M y c o r r h i z a l S e e d P e l l e t s ( 1 9 8 5 ) ]a n d s p o r e s w i t h i n a p o r o u s m a t r i x [ B a l t r u s c h a t , s u p r a ]h a v e b e e n p r o p o s e d f o r f i e l d a p p l i c a t i o n . S i n c e t h e c o s to f i n o c u l u m p r o d u c t i o n i s h i g h , a n e e d e x i s t s f o r metho d s t o p r o c e s s i n o c u l a o f V A - m y c o r r h i z a l f u n g i f o re f f i c i e n t d i s t r i b u t i o n .


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5 , 0 9 6 , 4 8 13Colonized roots o f a Glomus p . c a n serve a s e f f e c t i v e

inoculum due t o t h e p r e s e n c e o f i n t r a r a d i c a l v e s i c l e s[ B i e r m a n n e t a l , N e w P h y l o L , V o l . 9 5 , U s e o f V e s i c ul a r - a r b u s c u l a r M y c o r r h i z a l R o o t s , I n t r a r a d i c a l V e s i c l e sa n d E x t ra r a d i c a l V e s i c l e s As I n o c u l u m , " p a g e s 9 7 - 1 0 6( 1 9 8 3 ) ] . H o w e v e r , f o r e f f i c i e n t h a n d l i n g i n o c u l u ms h o u l d b e p r o c e s s e d i n t o s m a l l a n d u n i f o r m p i e c e s . S u c hi n o c u l u m c a n t h e n b e p e l l e t i z e d [ C r u s h e t a 1 , End o m y c o r r l r i z a s , S a n d e r s a n d M o s s e , e d s . ( A c a d e m i cP r e s s , N . Y . ) , P r e l i m i n a r y R e s u l t s o n t h e P r o d u c t i o n o fV e s i c u l a r - a r b u s c u l a r M y c o r r h i z a l l n o c u l u m b y F r e e z eD r y i n g " ( 1 9 7 5 ) ] o r u s e d i n f l u i d - d r i l l s y s t e m s [ B r y a n ,A p p l i c a t i o n s o f y c o r r h i z a l F u n g i i n C r o p P r o d u c t i o n , J .F e r g u s o n , e d . ( U n i v e r s i t y o f F l o r i d a , G a i n e s v i l l e , F l a ) ," F l u i d D r i l l i n g o f V e g e t a b l e C r o p s : A T e c h n i q u eA d a p t a b l e f o r M y c o r r h i z a l F i e l d I n o c u l a t i o n , p a g e s4 6 - 4 7 ( 1 9 8 4 ) ] . R o o t s c o l o n i z e d by a Glomus s p . h a v eb e e n m a c e r a t e d [ B i e r m a n n e t a 1 , s u p r a ] a n d v a r i o u s l ym i l l e d [ W a r n e r , s u p r a ; J a c k s o n e t a l , S o i l S c i . Soc A m e r .P r o c , V o l . 3 6 , E f f e c t s o f V e s i c u l a r - a r b u s c u l a r Mycorr h i z a e on Growth a n d P h o s p h o r o u s C o n t e n t o f ThreeA g r o n o m i c C r o p s , p a g e s 6 4 - 6 7 ( 1 9 7 2 ) ] . H o w e v e r ,m i l l i n g w as f o u n d t o r e d u c e i n o c u l u m p o t e n t i a l . W a rn e r , s u p r a , r e p o r t e d n e a r l y a 5 0% d r o p i n p r o p a g u l e swhen i r - d r i e d peat in o c ulum w a s milled t o a s i z e o f 8 50pm.I t i s a n o b j e c t o f t h e p r e s en t i n v e n t i o n t o p r o v i d e an o v e l V A - m y c o r r h i z a l i n o c u l u m c o m p o s i t i o n w h i c h i sa d v a n t a g e o u s l y a p p l i e d i n a g r i c u l t u r a l m e t h o d s f o re n h a n c i n g p l a n t g r o w t h a n d w h i c h h a s a h i g h p r o p ag u l e d e n s i t y .

SUMMARY OF THE INVENTIONTh e f o r e g o i n g a n d o t h e r o b j e c t s a r e r e a l i z e d b y t h e

p r e s e n t i n v e n t i o n , o ne embodiment o f which s a v e s i c ul a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l i n o c u l u m c o m p o s i t i o n c o mp r i s i n g h o s t p l a n t r o o t s c o l o n i z e d by t l e a s t o n e s p e c i e so f v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g u s , t h e c o l on i z e d r o o t s h a v i n g a p a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o f from

1 0

20

25

3 0

3 5

a b o u t 3 3 pm o a b o u t 4 2 5 pm nd a p r o p a g u l e d e n s i t y o f 4 0f r o m a b o u t 1 0 , 0 0 0 up t o a b o u t 1 , 0 0 0 , 0 0 0 v e s i c u l a ra r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i p r o p a g u l e s p e r g r a m d r ymass o f h o s t p l a n t r o o t .A u r t h e r embodiment o f t h e i n v e n t i o n i s t h e abovei n o c u l u m c o m p o s i t i o n e n c a p s u l a t e d i n a b i o d e g r a d a b l em a t e r i a l s u i t a b l e a s a c a r r i e r i n a c o m p o s i t i o n a d a p t e df o r e n h a n c i n g p l a n t g r o w t h .An d d i t i o n a l embodiment o f t h e i n v e n t i o n r e l a t e s t o

a method o f p r o d u c i n g t h e a b o v e - d e s c r i b e d v e s i c u l a ra r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l i n o c u l u m c o m p o s i t i o n c o m p r i si n g p r o v i d i n g h o s t p l a n t r o o t s c o l o n i z e d by t l e a s t o n es p e c i e s o f v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g u s a n dr e d u c i n g t h e c o l o n i z e d r o o t s t o p a r t i c l e s h a v i n g a s i z e i nt h e r a n g e o f from a b o u t 3 3 pm o a b o u t 4 2 5 pm, t h ep a r t i c l e s h a v i n g a p r o p a g u l e d e n s i t y o f f r o m a b o u t1 0 , 0 0 0 up t o a b o u t 1 , 0 0 0 , 0 0 0 v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r myc o r r h i z a l f u n g i p r o p a g u l e s p e r gram o f h o s t p l a n t r o o t .

Yet a f u r t h e r embodiment o f t h e i n v e n t i o n c o m p r i s e sa m e t h o d o f e n h a n c i n g p l a n t g r o w t h c o m p r i s i n g e f f e c t

45

5 5

i n g t h e g r o w t h o f p l a n t s i n t h e p r e s e n c e o f a n amount o f 6 0t h e a b o v e - d e s c r i b e d i n o c u l u m c o m p o s i t i o n s s u f f i c i e n tt o s t i m u l a t e t h e u p t a k e b y t h e p l a n t s o f p h o s p h o r u sfrom t h e s o i l .BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

F I G . 1 i s a g r a p h i c a l d e p i c t i o n o f t h e f u n g u s p r o p ag u l e d e n s i t y a s a f u n c t i o n o f p a r t i c l e s i z e o f t h e i n o c ulum o f t h e i n v e n t i o n .

6 5

4FIGS. 2 a n d 3 a r e g r a p h i c a l d e p i c t i o n s o f c o l o n i z at i o n of t h e i n o c u l a of t h e i n v e n t i o n a s a f u n c t i o n o f t h ef u n g i p r o p a g u l e d e n s i t y .

DETAILED DESCRIPTIONOF THEINVENTION

Th e p r e s en t i n v e n t i o n i s p r e d i c a t e d on t h e d i s c o v e r yt h a t V A - m y c o r r h i z a l f u n g i c o l o n i z e d h o s t p l a n t r o o t sw h i c h a r e r edu ced i n s i z e i n such a m a nne r a s t o pr od u c e a p r o d u c t h a v i n g a p a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o ffrom a b o u t 3 3 pm o a b o u t 4 2 5 pm nd a b o u t 1 0 , 0 0 0 upt o a b o u t 1 , 0 0 0 , 0 0 0 V A - m y c o r r h i z a l f u n g i p r o p a g u l e sp e r gram d r y m a s s o f h o s t p l a n t r o o t c o m p r i s e a n e f f e ct i v e p l a n t g r o w t h e n h a n c i n g a g e n t w h i c h i s a d v a n t ag e o u s l y a n d e f f i c i e n t l y s t o r e d , t r a n s p o r t e d a n d a p p l i e di n a g r i c u l t u r a l m e t h o d s .I t h a s b e e n u n e x p e c t e d l y f o u n d t h a t s u b j e c t i n g c o l on i z e d r o o t s t o methods o f s i z e r e d u c t i o n which i n v o l v es u b j e c t i n g , e . g . , l i q u i d s u s p e n s i o n s o f t h e r o o t s t o a h i g hs h e a r s i z e r e d uc t i o n p r o c e s s i n l i q u i d , t h e s i z e o f t h ec o l o n i z e d r o o t s ma y be reduced t o between 3 3 pm nd4 2 5 u m w h i l e a c t u a l l y i n c r e a s i n g t h e f u n g i p r o p a g u l ed e n s i t y t h e r e o f . At p a r t i c l e s i z e s b e l o w a b o u t 3 3 pm,t h e f u n g i p r o p a g u l e d e n s i t y o f t h e r o o t s b e g i n s t o f a l l o f fd r a m a t i c a l l y , b u t i s s t i l l g r e a t e r t h a n t h a t o f u n p r o c e s s e dr o o t s . I t w i l l b e u n d e r s t o o d by t h o s e s k i l l e d i n t h e a r tt h a t a n y s i z e r e d uc t i o n p r o c e s s ma y b e employed whichr e s u l t s i n a " c u t t i n g o f t h e r o o t s r a t h e r t h a n a g r i n d i n go r c r u s h i n g o f t h e t i s s u e .I t w i l l b e r e c o g n i z e d by t h o s e s k i l l e d i n t h e a r t t h a ta n y h o s t l e g u m e , c e r e a l , g r a s s , v e g e t a b l e c r o p o r o t h e rh e r b a c e o u s o r w o o d y p l a n t r o o t c a n b e employed f o rc o l o n i z a t i o n o f t h e V A - m y c o r r h i z a l f u n g i . E x e m p l a r yo f s u c h p l a n t s a r e P h a s e o l u s v u l g a r i s , A l l i u m p o r r um ,Avena s a l i v a , Zea m a y s , L y c a p e r s i c o n e s c u l e n t u m a n dT r i t i c u m a e s t i v u m .Th e f u n g u s employed t o c o l o n i z e t h e r o o t s ma y b es e l e c t e d from a n y o f t h e g e n e r a o f V A - m y c o r r h i z a lf u n g i t h a t f o r m v e s i c l e s i n r o o t s , i n c l u d i n g G l o m u s ,A c a u l o s p o r a , E n t r o p h o s p o r a o r S c l e r o c y s t i s .A l t h o u g h a n y c o n v e n t i o n a l s y s t e m a n d method f o rc o l o n i z i n g t h e r o o t s ma y b e e m p l o y e d , i t i s p r e f e r r e d t oe m p l o y t h e a e r o p o n i c c u l t u r e s y s t e m d e s c r i b e d b yHung t a 1 ( 1 9 8 8 ) , s u p r a . T h i s i s b e c a u s e r o o t s gro w n na e r o p o n i c c u l t u r e s a r e f r e e o f d e b r i s t h a t would r e d u c et h e e f f i c i e n c y o f s h e a r i n g .

B r i e ? y , " a e r o p o n i c c u l t u r e i n c l u d e s a n y s y s t e m o rzone comprising a h i g h l y a e r o b i c m i s t o r vapors o f ana q u e o u s s o l u t i o n o f n u t r i e n t s c a p a b l e o f m a i n t a i n i n g t h egrowth o f t h e r o o t s y s t e m o f a p l a n t r o o t s y s t e m and aV A - m y c o r r h i z a l f u n g u s t h e r e o n . I t i s e s s e n t i a l t h a t t h em i s t o r v a p o r s b e h i g h l y a e r a t e d .Th e n u t r i e n t m i s t o r v a p o r s ma y be g e n e r a t e d a cc o r d i n g t o a n y c o n v e n t i o n a l method f o r g e n e r a t i n gm i s t s . Fo r e x a m p l e , a s y s t e m e m p l o y i n g a n a t o m i z e rs u c h a s t h a t d e s c r i b e d b y Went [ 7 7 1 a E x p e r i m e n t a l C o nt r o l o f l a n t G r o w t h , C h r o n i c a B o t a n i c a C o . , W a l t h a m ,M a s s , p a g e s 8 1 - 8 3 ( 1 9 5 7 ) ] ma y b e e m p l o y e d f o r o b t a i ni n g t h e a e r o p o n i c c u l t u r e . I n a d d i t i o n , t h e s y s t e m s d es c r i b e d b y Vyvyan t a l [ " A Method o f Growing T r e e swith T h e i r R o o t s i n a N u t r i e n t M i s t , A n n . R e p . E a s tM a l l i n g . R e s S r a . , p a g e s 9 5 - 9 8 ( 1 9 5 3 ) ] ; K l o t z [ P h y t o p at h o l o g y , V o l . 3 4 , p a g e s 5 0 7 - 5 0 8 ( 1 9 4 4 ) ] a n d C a r t e r [ P h yr o p a t h o l o g y , V o l . 3 2 , p a g e s 6 2 3 - 6 2 5 ( 1 9 4 2 ) ] ma y l s o b eemployed.Th e n u t r i e n t m i s t o r v a p o r s ma y a l s o b e g e n e r a t e d bye m p l o y i n g a m o d i ? e d v e r s i o n o f t h e s y s t e m d e s c r i b e d


5/8


6/8

5 , 0 9 6 , 4 8 17e x t r u d i n g t h e c a r r a g e e n a n s u s p e n s i o n t h r o u g h a 1 6gauge n e e d l e from a 3 0 ml s y r i n g e i n t o 0.3M K Cl a tr o o m t e m p e r a t u r e . P e l l e t s w er e s e p a r a t e d from t h e K C]by s i e v i n g o v e r a s u r f a c e d i s i n f e s t e d 4 2 5 um e t a l s i e v ean d w e r e t h e n b l o t t e d o n s t e r i l e paper t o w e l s . P e l l e t swere s t o r e d a t 4 ' C . i n p l a s t i c b a g s . A i o a s s a y f o r i n f e c ~t i v i t y was c o n d u c t e d i n t h e HID growth c h a m b e r .T h i r t y m i l l i l i t e r s o f M e t r o - M i x 200 w e r e p l a c e d i ne a c h P i n e c e l l . P e l l e t s ( 5 , 1 0 o r 1 5 ) w e r e p l a c e d o n t h egrowth medium a n d a n a d d i t i o n a l 2 0 ml o f growthm e d i u m w er e added t o ? ve r e p l i c a t e d p e r t r e a t m e n t .Five s u r f a c e - d i s i n f e s t e d s e e d s o f s e a o a t s w er e p l a c e d i ne a c h P i n e c e l l and c o v e r e d w i t h v e r m i c u l i t e . P l a n t swere w a t e r e d w i t h 0 . 2 5 s t r e n g t h H o a g l a n d s s o l u t i o n[ H o a g l a n d e t a 1 , C a l i f o r n i a A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t a lS t a t i o n C i r c u l a r N o . 3 4 7 ( U n i v e r s i t y o f C a l i f o r n i a ,B e r k e l e y , C a l i f ) , The W a t e r C u l t u r e Method F o rGrowing P l a n t s W i t h o u t S o i l , " p a g e s 1 - 3 2 ( 1 9 5 0 ) ] f o rt h e ? r s t f o u r weeks o f t h e a s s a y and d e i o n i z e d w a t e rd u r i n g t h e ? n a l t w o w e e k s . Th e a s s a y w as h a r v e s t e da f t e r s i x w e e k s o f g r o w t h i n t h e g r o w t h c h a m b e r a n dt h e MPN f p r o p a g u l e s p e r p e l l e t w as d e t e r m i n e d .

EXAMPLEE n c a p s u l a t i o n w as a l s o t e s t e d w i t h a second VA

m y c o r r h i z a l f u n g u s . S w e e t p o t a t o r o o t s c o l o n i z e d w i t hGlomus e l u n i c a t u m B e c k e r a n d Gerdemann ( i s o l a t eS 3 2 9 ) w e r e grown i n a e r o p o n i c c u l t u r e f o r e i g h t e e nw e e k s , c o l o n i z e d r o o t s w er e p r o c e s s e d f o r f o r t y s e conds and t h e f r a c t i o n between 6 3 and 90 um w a s c o ll e c t e d o n metal s i e v e s a nd w a s h ed w i t h w at e r o n t o aMetricel membrane. T h i s m a t e r i a l w a s t h e n s u sp e n d e d i n 2 . 5 % c a r r a g e e n a n . The c a r r a g e e n a n p e l l e t sw er e p r e p a r e d a s a b o v e , e x c e p t t h a t t h e s o l u t i o n w a sc o o l e d t o 3 4 ' C . i n a w a t e r b a t h . Th e i n f e c t i v i t y a s s a yw a s conducted i n P i n e c e l l s u s i n g Zea mays L . v a r . E a r l y S u n g l o w ( W . A t l e e B u r p e e C o . ) a s t h e h o s t a n dp a s t e u r i z e d A r r e d o n d o l o a m y s a n d ( l o a m y , s i l i c e o u s ,h y p e r t h e r m i c , G r o s s a r e n i c P a l e u d u l t ) a s t h e g r o w t hm e d i u m . S e v e n r e p l i c a t e s o f 0 , 1 , 5 , 1 0 o r 2 0 p e l l e t sw e r e p l a c e d o n 30 ml o f o i l a nd covered with an a d d it i o n a l 2 0 ml o f s o i l . Two e e d s were p l a c e d on t h e s o i ls u r f a c e and covered with v e r m i c u l i t e . Th e a s s a y w a sh a r v e s t e d a f t e r s i x w e e k s o f g r o w t h i n t h e HID g r o w t hchamber a n d t h e MPN o f p r o p a g u l e s p e r p e l l e t w asd e t e r m i n e d .

P r o c e s s e d r o o t s were e n c a p s u l a t e d s u c c e s s f u l l y i nc a r r a g e e n a n . For Glomus s p . ( S 3 2 8 ) , t h e d i s i n f e s t e di n o c u l u m c o n t a i n e d 1 . 2 p r o p a g u l e s p e r p e l l e t w h i l e t h en o n ~ d i s i n f e s t e d i n o c u l u m c o n t a i n e d 0 . 5 p r o p a g u l e s p e rp e l l e t . I n c r e a s i n g t h e d e n s i t y o f e n c a p s u l a t e d i n o c u l u mr e s u l t e d i n i m p r o v e d c o l o n i z a t i o n ( s e e F I G . 2 ) . F o r G .e r u n i c a t u m , t h e i n o c u l u m c o n t a i n e d 0 . 3 p r o p a g u l e s p e rp e l l e t a l t h o u g h e a c h h a d a n a v e r a g e o f 4.0:085 s p o r e sp e r p e l l e t .

EXAMPLESweet p o t a t o r o o t s c o l o n i z e d by Glomus p . ( $ 3 2 8 ) a s

i n Example 1 w er e h a r v e s t e d from a n 8 . 5 - w e e k - o l da e r o p o n i c c u l t u r e a n d p r o c e s s e d f o r t y s e c o n d s . Thef r a c t i o n between 90 and 4 2 5 pm a s u s e d t o ma ke d i l ut i o n s i n a 2.5% h y d r o x y e t h y l c e l l u l o s e c a r r i e r (N at r o s o l ) . Th e d i l u t i o n s r e s u l t e d i n c o n c e n t r a t i o n s o f ,0 . 1 , 0 . 5 , 1 , l 0 a n d 1 0 0 s p o r e s ml- . A o - g e l c o n t r o l w asa l s o e s t a b l i s h e d .A s i x - w e e k b i o a s s a y was c o n d u c t e d i n t h e growthc h a m b e r . T h i r t y m i l l i l i t e r s o f M e t r o - M i x 20 0 werep l a c e d i n a P i n e c e l l , 1 ml o f a n inoculum s u s p e n s i o n w as

1 0

1 5

2 0

2 5

3 5

40

4 5

5 0

5 5

6 0

6 5

8added and t h i s w a s covered with an a d d i t i o n a l 20 ml ofgrowth medium. There w e r e s e v e n r e p l i c a t e s p e r t r e a tment. Seeds of s e a o a t s w e r e placed o n t h e s u r f a c e oft h e medium and c o v e r e d w i t h v e r m i c u l i t e . P l a n t s werew a t e r e d w i t h 0 . 2 5 - s t r e n g t h H o a g l a n d s s o l u t i o n ( H o a gl a n d , s u p r a ) f o r . t h e ? r s t f o u r weeks o f t h e a s s a y a n dd e i o n i z e d w a t e r d u r i n g t h e ? n a l tw o w e e k s . Th e MPNo f p r o p a g u l e s i n t h e i n i t i a l i n o c u l u m w as d e t e r m i n e d .

N a t r o s o l e r v e d a s a n e f f e c t i v e c a r r i e r o f pr oc e s s e d i n o c u l u m . Th e i n o c u l u m c o n t a i n e d 0 . 5 p r o p ag u l e s m l - 1 a n d i n c r e a s i n g i n o c u l u m d e n s i t y r e s u l t e d i ni n c r e a s e d c o l o n i z a t i o n ( s e e F I G . 3 ) .We l a i m :1 . A e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l inoculum c o mp o s i t i o n p r o d u c e d b y r e d u c i n g h o s t p l a n t r o o t s c o l on i z e d by a t l e a s t o n e s p e c i e s o f v e s i c u l a r - a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a l f u n g u s , i n s i z e , b y a h i g h s h e a r s i z e r e d u ct i o n p r o c e s s i n a l i q u i d t o c o l o n i z e d r o o t s h a v i n g ap a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o f from a b o u t 3 3 pm o a b o u t4 2 5 um n d a p r o p a g u l e d e n s i t y o f up t o a b o u t 1 , 0 0 0 , 0 0 0v e s i c u l a r ' a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i p r o p a g u l e s p e rgram d r y m a s s o f h o s t p l a n t r o o t .2 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 1 , w h e r e i n s a i df u n g u s i s o f t h e g e n e r a G l o m u s , A c a u l o s p o r a , E n t r op h o s p o r a o r S c l e r o c y s t i s .3 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 2 , w h e r e i n s a i dfungus i s a Glomus p . .4 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 1 , w h e r e i n s a i dh o s t p l a n t i s a g r a s s , v e g e t a b l e c r o p o r o t h e r h e r b a c e o u sp l a n t , a legume o r a w o o d y p l a n t .5 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 1 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i ze i n t h e r a n g e o f froma b ou t 33 pm to a b ou t 6 0 pm.6 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 1 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i ze i n t h e r a n g e o f froma b ou t 60 pm o a b ou t 25 0 u m.7 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 1 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o f froma b o u t 6 0 pm o a b o u t 9 0 pm .8 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 1 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i z e o f a b o u t 6 3 pm .9 . A n i n o c u l u m c o m p o s i t i o n o f c l a i m 1 e n c a p s u l a t e di n a biodegradable m a t e r i a l s u i t a b l e a s a c a r r i e r i n ac o m p o s i t i o n a d a p t e d f o r e n h a n c i n g p l a n t g r o w t h .1 0 . A o m p o s i t i o n a c c o r d i n g t o c l a i m 9 , w h e r e i n s a i de n c a p s u l a n t m a t e r i a l i s c a r r a g e en a n , h y d r o x y e t h y l c e l l ul o s e , a n a l g i n a t e o r gu m a r a b i c .

1 1 . A method o f p r o d u c i n g a v e s i c u l a r - a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a l i n o c u l u m c o m p o s i t i o n c o m p r i s i n g p r o v i di n g h o s t p l a n t r o o t s c o l o n i z e d by t l e a s t o n e s p e c i e s o fv e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g u s a n d r e d u c i n gs a i d c o l o n i z e d r o o t s by a h i g h s h e a r s i z e r e d u c t i o n pr oc e s s i n a l i q u i d t o p a r t i c l e s h a v i n g a s i z e i n a r a n g e o ff r o m a b o u t 6 0 pm o a b o u t 4 2 5 pm, s a i d p a r t i c l e s h a vi n g a p r o p a g u l e d e n s i t y o f up t o a b o u t 1 , 0 0 0 , ( I ) 0 v e s i c ul a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g i p r o p a g u l e s p e r g r a md r y m a s s o f h o s t p l a n t r o o t .1 2 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 1 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a s i z e i n a range of f r om about 0 . 7 5cm o a b o u t 1 . 5 cm r i o r t o b e i n g reduced i n s i z e t o s a i dp a r t i c l e s .

1 3 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 1 , w h e r e i n s a i df u n g u s i s o f t h e g e n e r a G l o m u s , A c a u l o s p o r a , E n t r op h o s p o r a o r S c l e r o c y s t i s .1 4 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 3 , w h e r e i n s a i df u n g u s i s a Glomus s p .


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5 , 0 9 6 , 4 8 191 5 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 1 , w h e r e i n s a i d

h o s t p l a n t i s a g r a s s , v e g e t a b l e c r o p o r o t h e r h e r b a c e o u sp l a n t , a l e g u m e o r a w o o d y p l a n t .

1 6 . A e t h o d o f e n h a n c i n g p l a n t g r o w t h b y i n c r e a si n g v e s i c u l a r - a r b u s c u l a r m y c o r r h i z a l f u n g u s c o l o n i z at i o n o n p l a n t r o o t s c o m p r i s i n g e f f e c t i n g t h e g r o w t h o fp l a n t s i n t h e p r e s e n c e of an amount o f an inoculumc o m p o s i t i o n o f c l a i m 1 o r 2 s u f f i c i e n t t o s t i m u l a t e t h eu p t a k e b y s a i d p l a n t s o f a v a i l a b l e p h o s p h o r u s f r o m t h es o i l .

5

1 5

2 0

25

3 5

45

5 5

6 5

1 01 7 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 6 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o f froma b o u t 3 3 pm o a b o u t 425 pm .1 8 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 6 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o f froma b o u t 6 0 pm o a b o u t 9 0 um.1 9 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 6 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i z e i n t h e r a n g e o f froma b o u t 3 3 pm o a b o u t 6 0 pm .2 0 . A method a c c o r d i n g t o c l a i m 1 6 , w h e r e i n s a i dc o l o n i z e d r o o t s have a p a r t i c l e s i z e o f a b o u t 6 3 pm .

Q t t t


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UNITED STATES P ATE NT AND TRADEMARK OFFICECERTIFICATE OF CORRECTIONPATENT N 0 . : 5,096,431D ATED I M a r c h 1 7 , 1992INVENTUMS): D avid M . SYLVIA, ET AL

I t i s c e r t i ? e d t h a t e r r o r a p p e a r s i n t h e a b o v e - i d e n t i f i e d p a t e n t a n d t h a t s a i d L e t t e r s P a t e n t i s h e r e b yc o r r e c t e d a s shown b e l o w :On the title page, u n d e r the h e a d i n g "Other P u bli c a t i o ns" at line 1 :delete "Innoculation ' o f Citns" a n d substitute - Inoculation o fsubstitute - Inoculation of Citrus .

On the title Page, in c olumn 2 at line 6 : d el e t e "Innorulum" a n dsubstitute Inoculum .

S i g n e d and S e a l e d t h i sF i r s t D a y o f J u n e , 1993

MICHAEL . KIRKA r r e s t i n g 0 / 7 7 0 8 ) A c t i n g C o m m i s s i o n e r o f P a t e n ts a n d T r a d e m a r k s

sheared roots as a va-mycorrhizal inoculum and methods for enhancing plant growth

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