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RETOS DEL LABORATORIO EN EL DIAGNÓSTICO DE LAS HEMOGLOBINOPATÍAS

SIMPOSIO 6

Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

SIMPOSIO 6 Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

APROXIMACIÓN INICIAL EN EL ESTUDIO DE HEMOGLOBINOPATÍAS.

¿DE QUÉ TÉCNICAS DISPONEMOS EN EL LABORATORIO?

Cristian Morales-Indiano

Laboratorio-Core. Sección Hematología. Laboratori Clínic Metropolitana Nord (LCMN).


HEMOGLOBINOPATÍAS

• Alteraciones monogénicas más frecuente en el mundo • Herencia autosómica recesiva

• Afectan a la estructura de la hemoglobina

4x Grupos Hemo 4x Cadenas globina


http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hemoglobin_t-r_state_ani.gif

• > 250 millones de personas (4.5% de la

población mundial).

• > 300000 recién nacidos afectos/ año.

Harteveld Cl, Higgs DR. Orphanet Journal of Rare Diseases 2010, 5:13

Angastiniotis M, et al. Bull World Health Organ.1995;73:375-86.

Weatherall D. Blood. 2010; 15: 4331-4336. Angastiniotis M., et al. ScientificWorldJournal. 2013;2013:727905.

HEMOGLOBINOPATÍAS


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23576907

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23576907

Hemoglobina A:

Hemoglobina F:

Hemoglobina A2: VN: 2.5-3.5%

VN: <1%

VN: 85-98%

TIPOS DE HEMOGLOBINAS

Bain B. Hemoglobinopathy diagnosis, 2006.


//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/8/87/Postnatal_genetics_en.svg

β δ ζ

Gen β globina. Cromosoma 11p15.5

βHS 5 4 3 2 1 ϒ ϒ

β-LCR

Bain B. Hemoglobinopathy Diagnosis 2006.

CADENAS DE GLOBINA Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Alteración cualitativa en la cadena de globina

Alteración cuantitativa de la cadena de globina TALASEMIA

HEMOGLOBINOPATÍA ESTRUCTURAL

TIPOS DE HEMOGLOBINOPATÍAS

No síntesis de cadena

Síntesis disminuida de cadena


http://globin.cse.psu.edu/hbvar/menu.html

HEMOGLOBINOPATÍAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

¿CÓMO ABORDAMOS EL ESTUDIO DE HEMOGLOBINOPATÍAS

https://www.marketingdirecto.com/digital-general/social-media-marketing/sombra-duda-se-

cierne-sobre-facebook-son-sus-datos-internos-realmente-fiables


GUÍAS INTERNACIONALES Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Estudio Inicial de Hemoglobinopatías

• HEMATIMETRIA

• MORFOLOGÍA ERITROCITARIA

• HbA1c

• PATRÓN DE HEMOGLOBINAS

• HPLC

• ELECTROFORESIS

• ISOELECTROENFOQUE

• ELECTROFORESIS CAPILAR

• OTRAS

https://www.google.es/search?biw=1366&bih=637&tbm=isch&sa=1&ei=C98MWsrCOsj_aLiWm5AK&q=pantera+rosa+lupa&oq=pantera+rosa+lupa&gs_l=psy-

ab.3..0.5879.6527.0.6657.4.4.0.0.0.0.89.291.4.4.0....0...1.1.64.psy-ab..0.4.290...0i30k1j0i8i30k1.0.NAIPA5RyWjg#imgrc=fxonyxKD0SWadM:

HbSC

HbSS HbAE

HbCC

http://www.capitalhumano.com.co/Gesti%C3%B3n%20del%20talento/claves-para-identificar-el-talento-interno-y-potenciarlo-5596

HbX


Hematimetría

Hb normal o ↓

Eritrocitos >5,5-6x109/L.

VCM < 79 fL.

HCM < 26 pg.

RDW N o ↑

Descartar ferropenia

• Ferritina

• IST

• ZPP

• sRTF

SOSPECHA TALASEMIA


RETICULOCITOS Y PARAMETROS DERIVADOS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

RBC: 5.20x109/L

Hb: 9.7 g/dL

VCM: 61.5 fL

HCM: 21.2 pg

MCHr: 21.9 pg

%MIC: 46.3 %

%HPO: 5.85 %

β-talasemia

RBC: 5.20x109/L

Hb: 8.2 g/dL

VCM: 66.7 fL

HCM: 18.7 pg

MCHr: 25.2 pg

%MIC: 40.3 %

%HPO: 53.4 %

Anemia Ferropénica


Clin Chem Lab Med 2015; 53(12): 1883–1894

Talasemia vs Ferropenia Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Hemoglobinas variantes

Heterozigoto

Homozigoto

• ↑ Reticulocitosis

• ↑ LDH

• ↑ Bilirubina

• ↓ Haptoglobina

• Coomb Directo -

Sin alteaciones

± Anemia hemolítica


What is missed in an automated cell count?

Hemoglobina E homozigota + déficit vitamina B12

:



• HEMATIMETRIA


• HbA1c


• ELECTROFORESIS



• HPLC

• OTRAS


MORFOLOGÍA ERITROCITARIA

Microcitosis

Hipocromia

Anisoctosis

Dianocitos

Punteado Basófilo

Eliptocitos

Fragmentocitos

Dacriocitos

TALASEMIA


Hb H (ß4)


Dianocitos

Punteado Basófilo

Eliptocitos

Fragmentocitos

Dacriocitos

Policromasia

Eritroblastos • Azul de metileno

• Azul brillante de cresilo

Hb H


HbSS


Drepanocitos

Policromasia

Dianocitos

HbSC

Cristales HbC

HbCC

ESTRUCTURAL



Hb Inestable (Köln)

Cuerpos de Heinz


“Screenning” mediante determinación de HbA1c

• HPLC

• EC

Journal of Diabetes Science and Technology 2015, Vol. 9(3) 713


“Screenning” mediante HbA1c. HPLC

HbS Normal HbC HbA2’


HbC/O Hb Hope Hb Hope/S

“Screenning” mediante HbA1c. HPLC Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

Interferencias HbA1c por presencia de Hb variantes

Tipo Hb RBC (vida media,

días)

HbA 120

HbS 97

HbC 87

HbD 115

… …

http://www.ngsp.org/interf.asp



• HEMATIMETRIA


• HbA1c


• ELECTROFORESIS



• HPLC

• OTRAS


SON NECESARIOS COMO MÍNIMO 2 MÉTODOS

PARA LA IDENTIFICACIÓN DE UNA HB ESTRUCTURAL

NÍNGUN MÉTODO POR SI SOLO ES CAPAZ DE IDENTIFICAR

TODAS LAS HEMOGLOBINAS VARIANTES

EQAs (External Quality Assessment)


- HPLC de intercambio catiónico - tubos EDTA. - Conservación a 4ºC (hasta 3 semanas). - Resultados se expresan en %. - Alta resolución.

- - - - - -

+

- - - - - -

+ +

+

+ + +

+

+

+

+ +

+

+

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)

- Determinar de manera precisa la concentración de HbA2 y HbF.

- Detectar variantes de hemoglobina


HPLC. DETECCIÓN DE TALASEMIAS

Hb A:

Hb F:

HbA2:

2α

2α

2α

2β

2γ

2δ VN: 2.5-3.5%

VN: <1%

VN: 85-98%

β-Talasemia

β δ ζ

Gen β globina. Cromosoma 11p15.5

βHS 5 4 3 2 1 ϒ ϒ

β-LCR

Cuantificación de HbA2 y HbF!!!

δβ-Talasemia α-Talasemia

↑HbA2 N o ↑ HbF

N o ↓ HbA2 ↑ HbF

DM


Val His Pro Glu Glu Treo Leu . . . H2N C-O-H

O

=

HbA 1 2 3 4 5 6 7

DETECCIÓN DE Hb VARIANTES

2α 2β

Val His Pro Val Glu Treo Leu . . . H2N C-O-H

O

=

HbS 1 2 3 4 5 6 7

2α 2βS

Val His Pro Lys Glu Treo Leu . . . H2N C-O-H

O

=

HbC 1 2 3 4 5 6 7

2α 2βc


CROMATOGRAMA DE HEMOGLOBINAS Congreso Nacional del Laboratorio Clínico 2017

HPLC HEMOGLOBINAS VARIANTES

Hb C

Hb E Hb Lepore

Hb SC


ELECTROFORESIS


Sencilla

Coste-efectiva

Identificación de la mayoría de Hbs

Laboriosa (manual)

Interferencias (paraproteínas)

No cuantifica HbA2 y HbF

No detecta Variantes de bajo %.

Alcalina

Ácida

Cortesía Dr. D. Beneitez.


ISOELECTROENFOQUE (IEF)

Hemoglobinopathies: Current Practices for Screening, Confirmation and Follow-up. 2015


Buena resolución

Identifica la mayoría de variantes

Semiautomatizado

Relativamente bajo coste

No cuantifica HbA2 y HbF

No detecta algunas variantes.


ELECTROFORESIS CAPILAR (EC)

Principio de la EC



g

h

HbA

HbA 2

Buena resolución

Reproducible y automatizada

Cuantitativa

Identifica la mayoría de variantes

No detecta algunas variantes.



HbA

HbS

Control

HbA

HbF HbS

HbA2

HbC

HbAS HbA

HbC HbAC HbA

HbD

HbAD HbA

HbE HbAE HbLepore HbSC


Espectometria de Masas (EM)

m/z


Tests funcionales

Test de falciformación

Test Funcionales Curva de disociación de oxígeno (p50)

Tinción vital con azul brillante de cresilo

Test de fragilidad osmótica

Tes de DCIP (2.6 dichlorophenolindophenol)

http://atlas.gechem.org/index.php?option=com_k2&view=item&id=237:falciformacion


Am J Clin Pathol 2017;00:1-10


CONCLUSIONES

HEMATIMETRÍA (Índices eritrocitarios) + MORFOLOGÍA SP Y HbA1C SON

TÉCNICAS ÚTILES EN EL DESPISTAJE DE HEMOGLOBINOPATÍAS.

LA PRESENCIA DE UNA HEMOGLOBINA VARIANTE SIEMPRE SE DEBE

CONFIRMAR COMO MÍNIMO POR DOS MÉTODOS (HPLC, EF, IEF O EC).

EL HPLC Y LA EC SON TÉCNICAS ADECUADAS PARA LA CUANTIFICACIÓN

DE HbA2 Y HbF.


… Dra. Adoración Blanco

MÉTODOS MOLECULARES

ARMS

GAP-PCR

MPLA

MULTIPLEX GAP-PCR

PCR-DIGITAL

SECUENCIACIÓN

NGS

https://www.google.es/search?biw=1366&bih=637&tbm=isch&sa=1&ei=GUb6WY7kOJHHsAeU5LKoBQ&q=DIBUJOS+LAB+DNA&oq=DIBUJOS+LAB+DNA&gs_l=psy-

ab.3...2949.3059.0.3162.0.0.0.0.0.0.0.0..0.0....0...1.1.64.psy-ab..0.0.0....0.VH_gbbgCOfg#imgrc=5MF4LwnZJIywuM:


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simposio 6 retos del laboratorio en el … · • ferritina • ist • zpp • srtf sospecha...

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