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AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS COMO Acetobacter aceti Y Saccharomyces cerevisiae.

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF MICROORGANISMS OF INTEREST AS Acetobacter aceti AND Saccharomyces cerevisiae.

Leidy Yulieth Castellanos Madero1

María Alejandra Jiménez Orjuela2

Luz Jakelyne Martínez Díaz3

Dayerly Ximena Silvera Bejarano4

RESUMEN

Las levaduras y bacterias juegan un papel importante en la elaboración de productos alimenticios entre ellos la producción de vinagre. En este artículo se describe procedimientos, para levaduras Saccharomyces cerevisiae y bacterias acéticas del género Acetobacter aceti para la obtención de vinagre. Para el aislamiento de dichos microorganismos se realizó lavado y esterilizado de todo el material que se

usó para la preparación de los medios de cultivo y que entro en contacto con las muestras.

Tanto para levaduras y bacterias acéticas se identificó el tipo de colonia de acuerdo con su color, tamaño y apariencia teniendo en cuenta su morfología como; color, bordes, tamaño, textura y forma, posteriormente de su prueba macroscópica, se realizó un frotis y tinción de Gram, para su identificación microscópica. para el aislamiento de las bacterias se tomó una muestra de

1 Leidy Yulieth Castellanos Madero, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Química Aplicada a la industria, Bogotá, Colombia. lycastellanos896@misena.edu.co Ficha 809153 – Grupo 52TGQID . 2 María Alejandra Jiménez Orjuela, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Química Aplicada a la industria, Bogotá, Colombia. majimenez572@misena.edu.co Ficha 809153 – Grupo 52TGQID3 Luz Jakelyne Martínez Díaz, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Química Aplicada a la industria, Bogotá, Colombia. ljmartinez94@misena.edu.co Ficha 809153 – Grupo 52TGQID4 Dayerly Ximena Silvera Bejarano, Servicio Nacional de Aprendizaje- SENA, Química Aplicada a la industria, Bogotá, Colombia. dxsilvera@misena.edu.co Ficha 809153 – Grupo 52TGQID

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vinagre de piña, que se había mezclado 10g de la muestra, en 90 mL de caldo de enriquecimiento durante siete días, se realizó el aislamiento y siembra por medio de la técnica de estría o técnica de siembra por agotamiento, que consiste en trazos de estrías sobre una placa de agar permitiendo el posterior crecimiento de colonias totalmente aisladas, en medio de cultivo GYC (glucosa, extracto de levadura y Carbonato de calcio) y medio Carr, que se encuentra compuesto por extracto de levadura, verde bromocresol, etanol y agar-agar.

Para confirmación de “Acetobacter aceti” se realizaron pruebas bioquímicas como superoxidación de etanol dando positivo, pruebas de movilidad, prueba de oxidasa y catalasa dando como resultado negativos para confirmación de Acetobacter aceti y obteniendo otro tipo de microorganismo.

Para el aislamiento de levadura se sustrajo la muestra a partir de chicha comercial, realizándose en diluciones, empezando con 10-1 hasta 10-4 y posteriormente su siembra en medio YGC (Extracto de levadura, glucosa y clorofenicol) teniendo en cuenta la temperatura y tiempo de incubación, posteriormente se realizó su aislamiento en recuento en placas, para identificar sus características morfológicas.

Se realizaron pruebas bioquímicas para la confirmación de “Saccharomyces cerevisiae” como fermentación de azucares y tolerancia al etanol comprendidas entre el 2%,4%,6% y 8%, en donde se puedo observar a

través de los resultados que su capacidad de supervivencia y reproducción es alta, éste tipo de microorganismo tolera concentraciones de etanol elevadas.

Para la fermentación de azúcares, no se obtuvieron resultados satisfactorios para confirmación de la levadura, indicándonos que el microorganismo que obtuvimos no era Saccharomyces cerevisiae.

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ABSTRACTThe yeasts and bacteria play an important paper in the production of food products between them the production of vinegar. In this article procedures are described, for yeasts Saccharomyces cerevisiae and acetic bacteria of the kind Acetobacter aceti for the obtaining vinegar. For the isolation of the above-mentioned microorganisms, wash was realized and sterilized of the whole material that was used for the preparation of the means of.Both yeast and acetic bacteria colony type according to their color, size and appearance was identified considering their morphology as; color, borders, size, texture and shape, then your gross test, a smear and Gram stain for microscopic identification was made. for isolation of bacteria a sample of vinegar pineapple, which was mixed 10g of the sample in 90 mL of enrichment broth for seven days was taken, the isolation was performed and sowing by means of the technique of spline or technical seed depletion, consisting of lines of grooves on an agar plate allowing further growth of isolated colonies fully in GYC medium (glucose, yeast extract and calcium carbonate) and Carr

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medium, which is composed of yeast extract, bromocresol green, ethanol and agar.For confirmation "Acetobacter Aceti" biochemical tests-oxidation of ethanol giving positive evidence of mobility, oxidase and catalase giving negative result for confirmation of Acetobacter aceti and obtaining other microorganism were performed.For the isolation of yeast sample was subtracted from commercial chicha, performing at dilutions, starting at 10-1 to 10-4 and then planting in YGC medium (yeast extract, glucose and clorofenicol) taking into account the temperature and incubation time later isolation in plate count was performed to identify morphological characteristics.Biochemical tests for the confirmation of "Saccharomyces cerevisiae" as fermentation of sugars and ethanol tolerance between 2%, 4%, 6% and 8% were conducted, where I observed through the results your survivability and reproduction is high, this type of microorganism tolerates high concentrations of ethanol. for fermentation of sugars, no satissfactorios results were obtained for confirmation of yeast, indicating that we obtained the microorganism was not Saccharomyces cerevisiae.

Palabras Clave

Fermentación acética, fermentación alcohólica, oxidasa, catalasa, vinagre.

INTRODUCCIÓNEl vinagre es el producto que se obtiene luego de dos etapas de fermentación, la primera etapa consiste en una etapa de fermentación alcohólica en donde el azúcar es transformado en alcohol en ausencia de oxígeno, en la segunda etapa ocurre

una fermentación acética en la que el alcohol es oxidado y transformado en ácido acético en presencia de oxígeno. En las siguientes páginas vamos a centrarnos en las levaduras y bacterias acéticas como responsables de las etapas de fermentación necesarias para la producción de vinagre ( Colquichagua , 1998 )

De igual manera, se describirán los medios de cultivo usados, su preparación y alistamiento de material, se darán a conocer los cálculos realizados para cada medio, los montajes de técnica para aislamiento de Saccharomyces cerevisiae y Acetobacter aceti, el montaje para caracterización macroscópica, microscópica e identificación bioquímica. Así mismo, la lectura e interpretación de los resultados obtenidos

OBJETIVOS

Objetivo General:

Aislar y caracterizar microorganismos de interés como Acetobacter aceti Y Saccharomyces cerevisiae.

Objetivos específicos:

Realizar pruebas bioquímicas para identificar si las características coinciden con las colonias presuntivas de Acetobacter aceti y Saccharomyces cerevisiae

Aislar a partir del vinagre casero de piña bacterias acéticas y a partir de la chicha comercial levaduras.

MATERIALES Y MÉTODOS

Operaciones previas.

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Para el aislamiento de bacterias acéticas Acetobacter aceti y levaduras Saccharomyces cerevisiae se prepararon medios de cultivo con medio Carr, medio GYC, medio YGC, Caldo de enriquecimiento y agua peptonada; Tal como se observa en la tabla 1.

Cálculos.

MEDIO CARR: Se prepararon 300mL del medio, así: Se tomaron 294mL de agua destilada, luego se agregaron 9g de levadura, 3x10-3mL de verde de bromocresol y de Agar-Agar 4.5g. Posteriormente se calentó en plancha de calentamiento, después de auto clavar se agregaron ,6mL de etanol al medio y finalmente se adicionaron 20mL a cada caja de Petri.

MEDIO GYC: Para éste medio se prepararon 300mL, así: Se midieron 294mL de agua, luego se pesaron 1.5g de CaCO3; 3g de levadura; 6g de Agar- Agar y 15g de glucosa y se disolvieron en el agua, se puso la solución en plancha de calentamiento, después de auto clavar se agregaron 6mL de etanol y finalmente se sirvieron los medios de cultivo en las cajas de Petri.

AGUA PEPTONADA: Se tomaron 100mL de agua destilada, luego se pesaron 0.85g de NaCl y 0.1g de peptona y se agregaron al agua destilada y finalmente se disolvió la solución.

CALDO DE ENRIQUECIMIENTO: Para su preparación se utilizó extracto de levadura 20g/L; etanol 20mL y ácido acético 10mL

Tabla 1. Cálculos realizados para preparación de todos los medios de cultivo.

MEDIO COMPONENTE CANTIDAD RESULTADO CÁLCULOS

MEDIO CARR

Extracto de levadura

30 g/L 9g

Verde de bromocresol

0,001 g/L 3x10-3 mL

Etanol 2% v/v 4,5gAgar- Agar 15 g/L 6Ml

MEDIO GYC

Carbonato de calcio

5g/L 1.5g

Extracto de levadura

10g/L 3g

Agar- Agar 20g/L 6gEtanol 2%v/v 15g

Glucosa 50g/L. 6mL

AGUA NaCl 0.85 %p/v 0.85gpeptona 0.1% p/v 0.1g

agua destilada 100mL 100mL

CALDO DE

ENRRIQUECIMIENT

O

Extracto de levadura

20g/L 2g

etanol 20mL 20mL ácido acético 10mL. 10 mL

YGC

Extracto de levadura

0.2g 0.2g

Glucosa 0.8 g 0.8 gAgar-Agar 0.6g 0.6 g

cloranfenicol 0.004g 0.004g

Montaje de la técnica para el aislamiento de Saccharomyces cerevisiae.

Para el aislamiento de Saccharomyces cerevisiae se realizó un proceso de dilución seriada (ver imagen 1) en agua peptonada a partir de chicha, se hizo la siembra de 0.1 ml de las diluciones seleccionadas (10-3 y 10-4) sobre la superficie de agar YGC, posteriormente se llevó a incubadora por 8 días.

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Imagen1. Montaje de Saccharomyces cerevisiae.

Montaje de la técnica para el aislamiento de Acetobacter aceti.

Para el aislamiento de las bacterias se tomó una muestra de vinagre de piña, donde se mezclaron 10g de la muestra, en 90 mL de caldo de enriquecimiento y se llevó a agitación a 120 rpm durante siete días, se realizó el aislamiento y siembra por medio de la técnica de estría o técnica de siembra por agotamiento, en medio de cultivo GYC y medio Carr.

Montaje de la caracterización macroscópica y microscópica.

Para la identificación macroscópica se utilizó un marcador, realizándose un círculo rodeando la colonia y al lado se marcó con una letra, como (A, B y C)

Se describió morfológicamente cada una de las colonias identificadas, teniendo en cuenta: Color, bordes, tamaño, textura, y forma.

Y para la identificación microscópica se realizó el frotis y posteriormente tinción de Gram.

Tinción de Gram: Se adiciono una gota de cristal violeta sobre el frotis por 1 minuto, se lavó y adiciono una gota de Lugol durante 1 minuto, se lavó y se adiciono alcohol acetona durante 30 segundos, se lavó y se adiciono fuscina de Gram durante 1 minuto, se lavó y dejo secar.

Para la observación en el microscopio se tuvo en cuenta el objetivo de 100X,

se añadió una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y se procedió a enfocar.

Montaje de las pruebas bioquímicas.

Para la tolerancia al etanol se elaboraron 4 tubos con caldo OGY cada uno a una concentración diferente de etanol (2%, 4%, 6% y 8%), se sembró el microorganismo a evaluar en cada concentración y se llevó a incubadora por 5 días.

En la fermentación de azúcares se elaboraron 6 tubos cada uno con un azúcar (glucosa, sacarosa, xilosa, maltosa, ribosa, lactosa), se agregó una campana de Durham para observar la producción de gases, se procedió a sembrar con el microorganismo seleccionado, se llevó a incubar por 3 días.

Para la prueba de movilidad se elaboró un tubo con 5mL de medio SIM, se sembró el microorganismo selección seleccionado y se llevó a incubadora por 3 días.

La superoxidación del etanol se realizó con un tubo de medio Carr, se sembró el microorganismo seleccionado con el tubo inclinado y se llevó a incubadora por 15 días.

Para la prueba de catalasa en una lámina se colocó una gota de peróxido, con ayuda de un palillo se tocó la colonia y se hizo una emulsión sobre el peróxido y para la prueba de oxidasa en un papel filtro se colocó 1% de oxalato de dimetil-p-fenilendiamina y con ayuda de un palillo se tocó la colonia y se adiciono al papel filtro impregnado.

Lectura de pruebas bioquímicas

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Para identificar a Saccharomyces cerevisiae se realizaron dos pruebas bioquímicas, la tolerancia al etanol, la cual se lee positiva cuando se observa crecimiento del microorganismo en el medio sembrado ,y la prueba bioquímica para la fermentación de azúcares debe arrojar de manera positiva para glucosa, galactosa, sacarosa, maltosa, trehalosa, rafinosa y ramnosa.

De igual manera para identificar Acetobacter Aceti se realizó prueba de oxidasa, la cual se reporta como

positiva cuando se observa un cambio a color morado al agregar el reactivo de oxalato de dimetil p-fenilendiamina. También se realizó la prueba de catalasa para identificar la enzima, observándose un burbujeo al ser positiva

Se realizó prueba de movilidad, en la que se debe presentar turbidez en la punción realizada sobre el medio. Igualmente se debe observar la superoxidación del etanol positiva cuando el medio vira a amarillo y posteriormente vuelve a color verde.

RESULTADOS

En la tabla 3 se muestra la identificación macroscópica y microscópica realizada para las colonias que coinciden con las características del microorganismo de interés.

Macroscopía y microscopía.

Tabla 3. Reporte de resultados de identificación macroscópica y microscópica.

Muestra ColoniaIdentificación Macroscópica Identificación Microscópica

Color Bordes Tamaño Textura Forma Forma GramTipo de

microorganismo

YGC 1 Blanco Entero Pequeño Cremosa Circular ovaladas + levaduras

GYC 2 Amarillo Circular Pequeño Cremosa Circular ovaladas + Cocobacilos

CARR 3 Beige ondulado grande Áspera Irregular Circulares + cocos

Pruebas bioquímicas.

A continuación se presentan los resultados de las pruebas bioquímicas con el fin de identificar si el microorganismo coincide con el de interés, Saccharomyces Cerevisiae (ver tabla4) y Acetobacter (ver tabla 5).

Tabla 4. Resultados tolerancia de etanol y fermentación de carbohidratos.

Colonia

Tolerancia al etanol Fermentación de carbohidratos

2% 4% 6% 8% Glucosa

Sacarosa

Xilosa Ribosa Lactosa Maltosa

1 positivo positivo positivo positivo positivo positivo Negativo Negativo

Negativo

Positivo

Tabla 5. Resultados prueba de movilidad y Superoxidación del etanol.

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Colonia Movilidad Superoxidación del etanol

Catalasa Oxidasa

1 Negativo Positivo Negativo Negativo

Macroscopía y microscopia de Saccharomyces cerevisiae

Imagen 2. Macroscopía Crecimiento de colonia 1 en Agar YGC.

Tabla 2. Identificación Macroscópica Saccharomyces cerevisiae.

Identificación MacroscópicaColor Blanco

Bordes EnteroTamaño 2mmTextura CremosaForma Circular

Imagen 3. Morfología microscópica Saccharomyces cerevisiae

Lectura de las pruebas bioquímicas.

Imagen 4. Resultados de fermentación de carbohidratos.

Imagen 5. Prueba de movilidad y Superoxidación del etanol.

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ANÁLISIS DE RESULTADOS

Para el aislamiento que se pretendía lograr de Saccharomyces Cerevisiae y Acetobacter aceti se utilizaron muestras de chicha y vinagre casero respectivamente, de las cuales los resultados obtenidos para caracterización microscópica y macroscópica no fueron satisfactorios ya que no coinciden con el de interés.

En los resultados obtenidos para bacterias acéticas, se obtuvo resultados como prueba negativa para la presencia de la enzima catalasa, presente en la mayoría de las bacterias aerobias. Se esperaba que el resultado fuera positivo, debido a que en el proyecto de formación se necesita trabajar con el microorganismo Acetobacter. También se realizó la prueba de oxidasa, la cual dio negativa para la presencia de citrocromo C oxidasa, en este caso es lo ideal según Hernández y Barbero, 2008, quienes indican además que la prueba para catalasa debe ser positiva para bacterias acéticas.

También se obtuvo prueba negativa para la movilidad, es decir que el

microorganismo obtenido no presenta movilidad alguna.

Los resultados no son satisfactorios debido a que según Hernández y Barbero, 2008 se indica que las bacterias acéticas son encontradas fácilmente en las uvas, en lugar de donde se realizó el aislamiento.

Para las levaduras se realizó una prueba al microorganismo de tolerancias al etanol comprendidas entre el 2%,4%,6% y 8%, en donde se puede observar a través de los resultados que su capacidad de supervivencia y reproducción es alta, éste es un buen resultado debido a que según Garzón y Hernández ,2009 éste tipo de microorganismos tolera concentraciones de etanol elevadas.

Posteriormente, para la prueba bioquímica de fermentación de carbohidratos se puede observas que no se obtuvo resultados satisfactorio para Saccharomyces Cerevisiae, ya que los resultados obtenido (ver tabla 4) no cumplen con los resultados encontrados según Buitrago, 2015.

Se esperaba lograr aislar el microorganismo Saccharomyces cerevisiae en la chicha, ya que de acuerdo López, Ramírez y Mambuscay,

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es una especie de levadura que se puede encontrar en este tipo de mostos.

Los resultados no son satisfactorios porque lo que se obtuvo del aislamiento según las pruebas mencionadas anteriormente no es una levadura, por lo que es necesario trabajar con una cepa control para poder inocular los mostos, ya que es el microorganismo que se esperar obtener para poder iniciar con la fermentación.

CONCLUSIONES

Se aislaron bacterias a partir de vinagre de piña casero y levaduras a partir de chicha comercial para realizar los procesos de fermentación alcohólica y acética

Se observó que en las diferentes concentraciones de etanol el microorganismo presenta crecimiento, es decir, que tolera el medio al que ha sido expuesto y por lo cual tiene la capacidad de reproducirse, pero esto no nos garantiza que sea Saccharomyces cerevisae, ya que en la prueba bioquímica de fermentación de azúcares arrojo negativo en la confirmación de dicho microorganismo.

Se evidencio a través de las pruebas bioquímicas como superoxidación de etanol, que dio positivo para el microorganismo de interés, pero en la prueba de movilidad, prueba de oxidasa y catalasa arrojando como resultado negativo para confirmación de Acetobacter aceti y obteniendo otro tipo de microorganismo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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2) Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos

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7) Colquichagua Diana. Vinagre de frutas. Procesamiento de alimentos 2. Peru .1998 .pag 10.