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Tema 3: Genómica

Griffiths AJ et al., (2000)Klug WS y Cummings MR (1999)

Links to Animal Genomic Research web siteLinks to Animal Genomic Research web site and Database Resources

http://www.genome.iastate.edu/resources/other.html

Objetivos:

• Identificar la utilidad del análisis de los• Identificar la utilidad del análisis de los marcadores de DNA para la construcción de mapas, la identificación individual y el aislamiento de genes de interés

• Conocer las metodologías que se han utilizado para la construcción de mapasutilizado para la construcción de mapas

• Establecer la relación entre genómica y la nueva producción y sanidad animal

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¿Qué es un polimorfismo?

¿cuáles conoces?¿cuáles conoces?

¿para qué puede servir el análisis de estos polimorfismos?

¿cómo se han construido¿cómo se han construido los mapas del genoma?

¿para qué nos sirven?

Contenidos• Introducción

P li fi d l DNA ti t d l í• Polimorfismos del DNA: tipos, metodología de estudio y aplicaciones

• Cartografía de los genomas, nuevas herramientas

• Identificación de un gen• Estrategias para el conocimiento del genoma:

j l d l hejemplo del genoma humano• Mapas genómicos de especies domésticas• Genómica funcional

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Genómica

• ESTRUCTURAL: • FUNCIONAL:

Caracterización molecular de genomas completos

– Caracterización de la naturaleza física de genomas completos

– Caracterización del proteoma y de los patrones globales de expresión génica

Genómica estructuralCaracterización de la naturaleza física de genomas:

- Polimorfismos del DNA- Cartografía

DNA eucariótico

Genes funcionales de copia única

DNA de secuencia repetida DNA separador

Secuencias funcionales Secuencias sin funciónconocida

S i f i l R ti i h t ti

Clasificación del DNA eucariota

Secuencias funcionalesNo codificantes

Familias de genes codificantes(y pseudogenes asociados)

Familias de genes dispersos

Familias de genes en tándem

Repeticiones heterocromatinaDel centrómero

VNTR

Secuencias derivadasDe transposiciones

Transposones

Retrotransposones

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Polimorfismo genético

• Existencia de distintos alelos:Existencia de distintos alelos:– Polimorfismo bioquímico:

• Detección de variación al nivel del producto del gen: proteínas, enzimas

– Polimorfismos del DNA:• Variaciones presentes en la secuencia de

bases– Polimorfismos producidos por mutaciones puntuales– Polimorfismos del número de repeticiones en

tándem

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• Variación de un nucleótido en una posición determinada.• Frecuencia:1/1000pb• También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms)

Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales

1. Cambios de bases:a. Transiciones:

i. Purina Purina:ii. Pirimidina Pirimidina:

Alelo 1Alelo 2

TACGAGCTATACGGGCTA

A G Purinasb. Transversiones

i. Purina Pirimidina: ii. Pirimidina Purina

T C Pirimidinas

• SNP: Single Nucleotide Polymorphisms:– Polimorfismo muy frecuente (1/300 pb)– 10 a 30 millones de SNP en el genoma

humano– Dos posibles alternativas en cada individuo– Herencia es muy estable (baja tasa de

mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites)Fácil estandarización– Fácil estandarización

– Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética

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RFLPs-SNP• Origen: mutaciones puntuales• Variabilidad: 2 alelos• Localización: exones, intrones, regiones reguladoras, DNA espaciador

• Detección de los SNP:– RFLP:

• Southern Blot• PCR + RFLP

– Secuenciación– Minisecuenciación

• RFLPs– Detección mediante

enzimas de restricción:

• Southern Blot

DNA espaciador

– Sondas específicas– SSCPs– PCR en tiempo real…

Southern Blot• PCR+RFLP

– Normalmente determinados en exones

Detección de mutaciones puntuales

RFLP:Alelo 1Alelo 2

TGGACGTCTTGGATGTCT

Aat II

MCL1

Alelo 1 Alelo 2Sonda

MCL1

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Detección de mutaciones puntuales

Minisequencingq g

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VNTR Tamaño Unidad ti ió

Método detección

Polimorfismos debidos a variaciones en el número de repeticiones de DNA en tándem

(Kb) repetición

Satélites 100-500 20 kb Centrifugación ClCsElec. campos pulsados

Minisatélites 0,1-20 20-40 pb Elec. Agarosa Southern

Microsatélites pb 1-4pb Elec. AcrilamidaSecuenciación

• DNA satélite: – repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y


algunas Mb)• DNA no transcrito• Regiones de heterocromatina, principalmente en

centrómeros (DNA alfoide)

• DNA minisatélite– Repeticiones de tamaño moderado (60pb)– Distribuidas por todo el genoma, principalmente en

telómerostelómeros– Normalmente no se transcriben– Tipos:

• DNA minisatélite hipervariable• DNA telomérico

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• DNA minisatélite hipervariable– Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb

de longitud, de repeticiones en tándem cortas– Secuencia repetida común (core):

GGGCAGGAXG– Son muy polimórficas– Se encuentran en intrones– Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares”

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4

5

7

9 10

11

8

6

INDIVIDUO 2

1

4

1

32

3 3’

32

1

32

4

1

32

4

3’3

2

4

1

3

1 1’

1

32

1

1

32

4

1

1

32

4

1

32

2

4

1

3

2’2

1

3

1

32

2 2’

2

10 11

INDIVIDUO 1

10

4

6

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INDIVIDUO 2

11

7

455

9

44

INDIVIDUO 1

4

6

8

5

7

9

3

5

7

4

6

5

7

4

6

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5

7

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6

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54

6

4

65

7

5

7

9

54

10

4

6

8

Fingerprints

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• DNA microsatélite (STR): Short Tandem Repeat


– Short Tandem Repeat– Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de

repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos)

– Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10))

– Herencia mendeliana codominante

CA CA CA CA CA CA

CA CA CA CA CA CA CA CA CA CA

Alelo 1

Alelo 2

• Visualización de los microsatélites

S i ióGenotipado:

ACGT

Secuenciación:Genotipado:

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• Implicaciones de las secuencias microsatélites en patologías:– Expansión de microsatélites de trinucleótidos:

• Síndrome de X frágil (FMR 1) (CCG)n• Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n• Distrofia miotónica (DM) (CTG)n• Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n• Ataxia de Friedreich (FA)• Nueve formas de ataxia espinocerebelar

(SCA)E ió d l ó id DM2–Expansión de tetranucleótidos: DM2

–Expansión de pentanucleótidos: SCA10

Enfermedades humanas se han creado animales modelo

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Secuencias de DNA dispersas

¿DNA basura?- ¿Regulación de la expresión?- ¿Mecanismo de reparación?- ¿Puntos de recombinación?

• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA:del DNA:–Diagnóstico genético– Ligamiento con fenotipos– Identificación individual –Construcción de los mapas génicos

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Técnicas básicas:Extracción del DNA genómicoExtracción del DNA genómicoElectroforesis Hibridación (Southern, Northern) Restriction Fragment Lenght PolymorphismReacción en Cadena de la PolimerasaSecuenciación (método de Sanger)Clonación

Diagnóstico genético directo:

• Mutaciones puntuales RFLPs Secuenciación chipsMutaciones puntuales

• Inserciones, deleciones

• Repeticiones en tándem

• Transcripción diferencial

• Procesamiento alternativo del RNA

• Metilación

RFLPs, Secuenciación, chips

PCR, Southern

PCR, secuenciación

RT-PCR, Northern, chips

RT-PCR, North.

MPCR• Metilación MPCR

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Diagnóstico genético indirecto:Análisis de marcadores genéticos

XGen alterado

Marcador polimórfico

Mutación puntualMicrosatéliteRFLPDeleciónInserción

Genotipo del marcador Genotipo del gen dañado

Identificación individual:

•Marcadores fenotípicos (HLA, Gr. Sanguíneos)

•Análisis de marcadores microsatélites

•PCR, secuenciación

• Fingerprinting (minisat.)

Detección mediante RFLP + Southern

Microsatélites Minisatélites

Control de filiaciónControl de libros genalógicos

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• Mapas del genoma:–Mapa genéticop g

• Posiciones relativas de los genes entre si, sin anclaje físico

• Distancia entre marcadores determinada por la frecuencia de recombinación en la meiosis

–Mapa físico• Posición exacta de un gen• Distancia entre marcadores determinada por

nº de pb

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Mapas genéticos

RequerimientosExistencia de polimorfismo en los genes a mapearAnálisis de familias “informativas” (AaBb x AABB)Análisis de familias informativas (AaBb x AABB)

Estudios de ligamiento :

-Herencia ligada al cromosoma X

-Marcadores polimóficos asignados a paneles de familias

- Alozimas

- Polimorfismos del ADN (microsatélites, RFLPs)( , )

- Caza de genes relacionados con enfermedades o caracteres productivos:

- Fibrosis Quística (9 años) humano

Mapas físicos

ResoluciónCromosoma (paneles de células híbridas somáticas)Banda cromosómica (FISH)Resolución Banda cromosómica (FISH)Células híbridas irradiadasSecuencia nucleotídica

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Estrategias para la identificación de un gen

Clonado posicional Clonado funcional Gen candidato

Identificación del fenotipo

Clonado posicional Clonado funcional Gen candidato

Mapa

Gen

Mutaciones

Función

Gen

Mutaciones

Gen

Mutaciones

Mapa

Función MapaFunción

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Identificación de un gen

Identificación clásica

Estudios en familias

Genómica

Estudios de expresiónEstudios en familias(modo de herencia)

Análisis de ligamiento o mapa físico(identificación de la región cromosómica)

Acotar la zona cromosómica(clonaje en YAC)

Estudios de expresión

gen

mutaciones

Análisis de los clones (contigs, búsqueda de marcadores, ORF, mutaciones)

gen Estudios de expresión

Gen de doble musculatura• Crecimiento anormal

del tejido muscular debido a una hipertrofia ( hi l i )(=hiperplasia)

• 20% más de rendimiento de carne

• Aumento de cortes con gran valor económico

• Carne magra• Muy buena conversión

Azul BelgaPiamontesa y

alimentaria• Dificultades en el parto

PiamontesaLimusinaCharolésAsturiana de los Valles

1995: Carácter controlado por un gen mayor mh

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Gen de doble musculatura¿mh?

Identidad? Localización cromosómica

Azul Belga x Frisona MYOS-/-

MYOS 2q11

Rastreo del genoma con microsatélites

Región BTA2 próxima centrómero

MiostatinaGen candidato

Mutaciones con efecto fenotipo: Doble musculatura

Descripción Tipo de mutación Raza

inserción/deleción en la posición 418

Corrimiento en el marco de lectura

Belgian blue, Asturianas, Rubia Gallega, Aubrac

transición C → T en la posición 610

Sin sentido -terminación

prematura de la Charoláis

Tipificación de animales:

Diagnóstico indirecto:

Herencia autosómica recesiva

proteína

transversión G → T en la posición 676

Sin sentido -terminación

prematura de la proteína

Maine-Anjou, Parthenais

Deleción de 11 pb desde la posición 821 hasta la 831

Corrimiento en el marco de lectura -

terminación prematura de la

proteína

Belgian blue, Limousine, South Devon, Asturiana

de los Valles

transición G → A en la posición 938

Transversión consentido. Cys → Piemontese,

Gascon

- microsatélitesDiagnóstico directo:

- mutaciones MYOS

posición 938 Tyr en la proteina Gascon

Mutaciones sin efecto fenotipo: Normales

transversión C → A en la posición 282

Mutación consentido. Phe →Leu en la proteina

Limousine, Aubrac, Devon,

Pirenaica

transición C → T en la posición 414

Transición silente –sin cambio en la

proteína

Ampliamente distribuida

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Ligamiento vs asociación

• Ligamiento:– Identificación de

• Asociación:– Análisis de individuos

regiones del genoma con un nº de alelos compartidos en individuos afectados > al esperado (en familias)

– Análisis de 500 pols– Regiones candidatas y

afectados no emparentados e identificación de alelos compartidos

– Facilidad para la obtención de muestras

– Necesidad de analizar Regiones candidatas y acotamiento de la región

– Alelos raros de alto riesgo

Necesidad de analizar miles de marcadores

– Alelos de acción modesta en enfermedades comunes






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Mapa genómico:

Representación lineal de los sitios genómicos importantes (genes y marcadores)

1990: Proyecto Genoma Humano (National Institute of Health and the Department of Energy, USA)

1. Construcción del mapa físico y genético2. Determinar la secuencia de 3000 millones de

caracteres del DNA humano con un 99 9% de fiabilidad

Mapear y secuenciar el genoma humano

caracteres del DNA humano con un 99.9% de fiabilidad3. Determinar y localizar las variaciones del DNA entre

individuos (polimorfismos)4. Localizar todos los genes humanos5. Establecer las funciones de estos genes y otras partes

del genoma

• Mapear y secuenciar los genomas de animales modelo:– E. coli (4,6 millones pb)– S. cerevisiae (12 millones pb)– C. elegans (97 millones pb)– D. melanogaster (165 millones pb)g ( p )– M. musculus (3000 millones)– Otros

• Recolectar y distribuir datos:– Publicar en 24 h toda secuencia >2000pb

• Crear bases de datos• Desarrollar programas de análisis de DNA• Desarrollar herramientas para comparar e interpretar la información

genómica– Compartir la información públicamente

• Estudiar los aspectos éticos, legales y sociales de la Estudiar los aspectos éticos, legales y sociales de la investigación en genética

• Entrenamiento de investigadores• Desarrollo de tecnologías

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- Desarrollar el catálogo definitivo de genes codificantes de proteínas

-Utilizar la genómica comparativa para alinear el genoma humano con el de otras especies para la

2003: Genoma completado

con el de otras especies para la identificación de genes

-Encontrar los elementos funcionales que controlan el tiempo y nivel de expresión de genes y micro-RNAs

-Secuenciar el restante 20% de heterocromatina (problemas de (prepeticiones)

“The end of the begining”

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Mapas genómicos en especies domésticas

1 Mapas de ligamiento ricos en marcadores1. Mapas de ligamiento, ricos en marcadores de DNA

2. Mapas físicos, ricos en genes conservados (permiten el mapeo comparativo)

3. Unión de ambos mapas4. Mapas de EST (Expressed Sequence Tag)p ( p q g)5. Mapas de alta resolución en cromosomas

específicos6. Identificación de genes candidatos y

regiones con QTLs

Mapas genómicos en especies domésticas

• Australian Sheep Gene mapping Web site• Australian Sheep Gene mapping Web site– http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm

• BovMap database– http://locus.jouy.inra.fr/cgi-bin/bovmap/intro2.pl

• Pig basehttp://www thearkdb org/browser?species pig– http://www.thearkdb.org/browser?species=pig

• Dogmap– http://www.dogmap.ch/

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Genómica funcional

• Los datos de la secuenciación a gran escala son el punto de partida de la genómica funcional

• Búsqueda de ORF en secuencias de DNA desconocidas

• Identificación de su funciónIdentificación de su función• Empleo de chips (microarrays) de

DNA para estudio de regulación génica

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Chips de DNA

• Muestras de DNA ordenadas, unidas a un chip de cristal del tamaño de un un chip de cristal del tamaño de un cubreobjetos

• En un chip puede haber miles de muestras (cDNA de genes conocidos)

• Los chips se exponen a muestras de mRNA marcados procedentes de distintos tejidos (distinta fase de desarrollo, tumoral vs normal, etc.)

• Se miden variaciones en la expresión de los tejidos

Aplicaciones de la Genómica

• Conocimiento y comprensión de procesospatológicosp g

• Precisión de diagnóstico:– Clasificación más fina (cáncer de colon, piel)– “Farmacogenómica” respuesta individual a

tratamientos, elección de quimioterapia• Evaluación correcta del riesgo genético:

P di ió d l i id d t l– Predicción de la agresividad tumoral• Prevención conocido el riesgo genético

– Comenzar planes de vigilancia en riesgo de cáncer, hipercolesterolemia, hemocromatosis,..

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• Análisis de recién nacidos• Detección de portadores

Implicaciones del conocimiento del genoma

• Detección de portadores• Desarrollo de terapias:

– Terapia génica: reemplazar un gen alterado por el gen funcional

– Terapia basada en la genética: • Diseño de nuevas drogas• Tratamientos basados en las bases moleculares

El ió d l i• Elección del tratamiento

• Identificación de genes con interés en producción.

Videos de genómica

Microarray:

http://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhMhttp://www.youtube.com/watch?v=ePFE7yg7LvM&feature=relatedhttp://www.youtube.com/watch?v=AhnTT6-Jgcg&feature=related

Microarray:

http://www.youtube.com/watch?v=6iFDphWXjw4&feature=related

¿Qué falta aquí?

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