test%richies*%per%la%classiﬁcazione% ecotossicologica%old.iss.it/binary/ampp/cont/marchini.pdf ·...

Test%richies*%per%la%classificazione%ecotossicologica%

%

%Silvia%Marchini!–!Dip.%Ambiente%e%Prevenzione%Primaria,%%

Is*tuto%Superiore%di%Sanità%–%Roma%%%!La!classificazione!dei!rifiu0:!presentazione!dei!test!richies0!dalla!norma0va.%Is*tuto%Superiore%di%Sanità,%17%oEobre%2013.%%%%

%!%

Ecotossico: H14 !

rifiuto che presenta o può presentare rischi immediati o differiti per uno o più comparti ambientali !

Silvia!Marchini!-!La!classificazione!dei!rifiu0!

ADR%Classe%9:%Sostanze%ed%ar*coli%pericolosi%%diversi!

(Materie!e!ogge4!pericolosi!diversi)!

!

M6-M7!!Sostanze!(materie)!pericolose!per!l’ambiente!!(sostanze!inquinan<!per!l’ambiente!acqua<co!e!soluzioni!e!miscele!di!tali!sostanze!!

come!prepara<!e!rifiu<)!

!!

!M6!-!inquinante!per!l’ambiente!acqua<co!liquido!

!M7!-!inquinante!per!l’ambiente!acqua<co!solido!

!!

!

!

!

ADR:!“Accord!Dangereuses!Route”!(Accordo!europeo!rela<vo!ai!traspor<!internazionali!di!merci!pericolose!su!strada)!!

!


ADR!

  Tossicità!acuta!per!l'ambiente!acqua<co!

  Tossicità!cronica!per!l'ambiente!acqua<co!

  Bioaccumulo!potenziale!o!misurato!

  Degradazione!(bio<ca!e!abio<ca)!dei!compos<!organici!


Test%ecotossicologici%%Perchè?%!

•  Misurano!l’effeLva!tossicità!del!rifiuto!(persistenza!e!

accumulo)!

•  Evitano!falsi!posi<vi!(biodisponibilità)!

•  Tengono!conto!delle!complesse!interazioni!tra!i!componen<!

del!rifiuto!(materiale!eterogeneo)!

!

•  Superano!il!problema!delle!misure!anali<che!


Test%di%ecotossicità%

Quali%organismi?%!Decompositori!!(p.e.!!baPeri!)!!

!

!!!!!!!!ProduPori!!(alghe,!macrofite)!

.!

! !!!!!!!!Consumatori!primari!(erbivori)!!

!

! ! !!!!!!!!!!!Consumatori!secondari!(planc<vori)!

!Quali%test?%%Standardizza<,!sensibili,!faLbili,!rapidi,!effeL!rilevan<!ecologicamente.!

Quali%procedure?%%Test!limite!o!test!concentrazione/effePo,!modifiche!necessarie!per!saggiare!miscele!complesse/

difficili.!

!

!

!


Endpoint!!

%LC50%(Lethal%Concentra*on%50%)%%!Concentrazione!letale!per!il!50%!degli!individui!di!una!popolazione!(p.e.!96h!LC50)!!

EC50%(Effect%Concentra*on%50%)%!Concentrazione!che!causa!un!effePo!subletale!nel!!50%!degli!individui!(p.e.!48h!EC50)!!

NOEC%(%No%Observed%Effect%Concentra*on)%%Concentrazione!più!alta!alla!quale!non!si!sono!osserva<!effeL!sta<s<camente!diversi!da!quelli!del!!

controllo!(p.e.!28d!NOEC!crescita).!

!

ECx%%!!

Concentrazione!alla!quale!si!osserva!«x»!%!di!effePo!(p.e.!72h!ErC10)!

!

!

!


Curva%concentrazione%effeEo%%%

EC10 NOEC NOEC

Significato!sta<s<co!≠!significato!

biologico!


Tossicità%acuta%%

!!•  Pesci!-!test!di!tossicità!acuta!a!96h!(OCSE!203);!C1!!!LC50!!

•  Crostacei!-!Daphnia!sp,!test!acuto!di!immobilizzazione!!a!48h!(OCSE!202,!2004),!C2!!

EC50!

•  Alghe%e%cianobaEeri%di%acqua%dolce%-!!test!di!inibizione!della!crescita!!72h/96h!(OCSE!201,!2011),!C3!!!!EC50!(ECr50)!

oppure%

•  Piante%acqua*che%-!Lemna!sp.!-!test!di!inibizione!della!crescita!!(OCSE!221,!2006)!C20!!EC50]!

!!

Preferenza!a!test!condoL!in!BPL!e!secondo!linee!guida!OCSE!o%equivalen*.%%Anche!da<!su!altri!organismi,!se!ques<!rappresentano!specie!ed!endpoints!equivalen*%(Nota!1,!tab.!2.2.9.1.10.3.1).!

!


medium O2 saturazione

18-22°C pH 6-9

durezza 140-250 mg/L

16h 8h (24 h)

48!h!<!24h!

Misura: !!immobilizzazione!(anche!colore,!intrappolamento)!!!!

Endpoint:!!48h!EC50!

Conc. 1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5

soluzione test ≥ 10 mL

Replica!1!

Replica!2!

Replica!3!

Replica!4!

controllo

OCSE%202:%Daphnia%sp.,%test%acuto%di%immobilizzazione%%

Criteri!di!validità:!!≤!10%!immobili!(anche!sbiadi<!o!intrappola<)!nel!controllo!;!O2!disciolto!≥!3!mg/

L!

T variazioni ± 1°C pH variazioni < 1,5

durezza 140-250 mg CaCO3/L FaPore!≤!2.2!


OCSE%203:%Pesci,%test%di%tossicità%acuta%

Specie&raccomandate:& Lunghezza&totale&(cm)&

T°C& O2&

Brachidanio*rerio! 2,0!±1,0! 21!'!25! !!!!

≥!80%!

Pimephales*promelas! 2,0!±1,0! 21!'!25!Cyprinius*carpio! 3,0!±1,0! 20!'!24!Oryzias*latipes! 2,0!±1,0! 21!'!25!Poecilia*reticulata! 2,0!±1,0! 21!'!25!Lepomis*macrochirus! 2,0!±1,0! 21!'!25!Oncorynchus*mykiss! 5,0!±1,0! 13!'!17!

12-16h 12-8h

medium O2 ≥ 60% pH 6-8,5 durezza 10 – 250 mgCaCO3/L

96!h!

Criteri!di!validità:!mortalità!in!controllo!≤!10%,!condizioni!test!costan<,!O2!≥!60%!,!(controllo!anali0ca)!

Misura:!mortalità!! Endpoint:!96h!LC50!

Conc. 1 Conc. 2 Conc. 3 Conc. 4 Conc. 5

1,0 g pesci/litro ≥ 7 pesci/replica/concentrazione

Replica!1!

Replica!2!

Replica!3!

Replica!4!

controllo FaPore!≤!2.2!

T variazioni ± 2°C pH variazioni < 1,5


!REACH%(Considerando!47)!!

!

“[…]!è!necessario!sos0tuire,!ridurre!o!migliorare!le!sperimentazioni!su!animali!vertebra0.!L’aAuazione!del!presente!regolamento!dovrebbe!basarsi!sul!ricorso,!ogni!volta!che!sia!possibile,!a!metodi!di!prova!alterna0vi!a4!a!valutare!i!pericoli!che!le!sostanze!chimiche!comportano!per!la!salute!e!per!l’ambiente.!L’uso!degli!animali!dovrebbe!essere!evitato!ricorrendo!a!metodi!alterna0vi!valida0!dalla!Commissione!o!da!organismi!internazionali,!oppure!riconosciu0!dalla!Commissione!o!dall’Agenzia!come!idonei!a!soddisfare!le!prescrizioni!in!materia!di!informazione!ai!sensi!del!presente!regolamento.”!!!

!

!

!«Animale»!non!altrimen0!specificato:!qualsiasi!vertebrato!vivo!non!umano,!ivi!comprese!le!forme!larvali!autonome!capaci!o!non!di!riprodursi!a!esclusione!di!altre!forme!fetali!o!embrionali.!

%%%3%R%

%Dire[va%86609CE,%DL%116%27%gen%1992%%

(In!materia!di!protezione!degli!animali!u<lizza<!!ai!fini!sperimentali!o!ad!altri!fini!scien<fici)!


Test%alterna*vi%%

Test!in!vitro!!(estrapolazione!agli!effeL!in!vivo?)!

!

  ! Cellule!primarie!(epatoci<,!cellule!epiteliali,…)!

! !Riducono!l’uso!di!animali!vivi!

!

  ! Linee!cellulari!di!pesci!!

! !Eliminano!l’uso!di!animali!vivi.!(OK!per!effeL!acu<!ma!possono!mancare!!

! !di!tossicocine<che!realis<che.!In!corso!di!validazione)!

!

!

Test!con!embrione!di!pesce!!!in!sos<tuzione!test!acuto!

Silvia Marchini - ISS

Non solo sostituzione! Anche screening e comprensione meccanicistica

Test idonei ≠ test validati


OCSE%236:%Test%di%tossicità%acuta%con%embrione%di%pesce%(FET)%!

!!Organismo%test:!!!!!!!Uova!fecondate!di!Danio!rerio!(max!16!cell)!!Durata:! ! !fino!a!96!ore!!Numero%uova: !20/concentrazione!!(esposizione!individuale)!!Contenitori:! !Piastre!24!pozzeL!(2!ml!soluz)! !!!Alimentazione: !NO!!Temperatura: !26±!1!°C!!!!%pH:! ! !6.5-8.5!(variaz!entro!1.5!unità!durante!il!test)!!Fotoperiodo:! !12-16!ore!luce!!Misure: ! !coagulazione,!!

! !!! !mancata!formazione!somi<,!!! ! !!! !mancato!distacco!della!coda,!!! !!! !mancanza!di!baLto!cardiaco!! !!! !(schiusa!uova)!

!!!Endpoint:! ! !96h!LC50!(tranne!schiusa)!!


Procedura%%

Produzione%% Raccolta%% Pre_esposizione%% selezione% Distribuzione%nelle%piastre%!

Rifiu*:%VETRO!!!%

Condizioni!di!validità:!Fecondazione!delle!uova!raccolte!≥!70%!

T!=!26±!1!°C!

Mortalità!embrioni!nel!controllo!<!10%!a!96h!

Controllo!posi<vo:!mortalità!>!30%!a!96h!

Schiusa!nel!controllo!≥!80%!a!96h!

Ossigeno!disciolto!≥!80%!satur.!a!96h!(nella!max!concentrazione!e!

controllo)!

!!

!Vantaggi:!sistema!biologico!complesso,!!

! !stadi!di!vita!non!proteL!,! !!

! !piccoli!volumi!di!soluzione!

!

! !Limitazioni:!!ridoPa!biosponibilità!(barriera!corion),!

! ! !!!!!!capacità!metabolica!non!completa,! !!

! ! ! !(“range!finding”)!

! ! !!!!!!mantenimento!pesci!per!la!riproduzione!!,!!

! ! !!!!!!addestramento!operatore!!!


OCSE%201:%alghe,%test%di%inibizione%della%crescita%

Organismo%test:%%%%%%% %alghe!verdi:!Pseudokirchneriella!subcapitata,!Desmodesmus!subspicatus!!!Durata:! ! !72h!±!24!!!Procedura: ! !sta<ca!

!!Numero%organismi: !5!x!103!-!104!cellule/ml!(P.!subcapitata),!2.5!x!103!(D.!subspicatus)!in!crescita!esponenziale!!Contenitori:! ! !!volume!adeguato!per!scambio!gassoso,!agitazione!(scuo<mento)! !!!Temperatura: %21-24!±!2!°C!!Concentrazioni:% %5!(3!repliche,!per!controllo!preferibile!6!repliche)!%Fotoperiodo:% %illuminazione!con<nua,!4500-9000!lux !!%pH: % %±!1.5!unità !(<0.5!per!metalli!e!compos<!ionizzan<)!!Mezzo%di%coltura:% !sinte<co:!US!EPA!(pH!7.5!or!OECD*!!(pH!8.1)! %%!

Misure: ! !numero!di!cellule!(conta,!fluorescenza)!

! !(anormalità)!

! !!

Risposta:% % %riduzione!del!tasso!specifico!di!crescita!rispePo!al!controllo!(aumento!log!della!biomassa)!

% %(riduzione!dell’incremento!in!biomassa!:!resa)!

!!Endpoint:% ! !ErC50!(tossicità!acuta)!e!NOErC/ECx!(tossicità!cronica).!Ecx!(x=10-20%)!!*!Rapporto!molare!EDTA/Fe!!tale!da!prevenire!la!precipitazione!del!ferro!e!minimizzare!la!chelazione!dei!metalli!pesan<!


Derivazione%ErC50%%

Tasso!di!crescita!specifico!medio!(per!ogni!replica)!

!

Per!ogni!replica!si!calcola!la!%!di!inibizione!della!crescita!rispePo!

alla!media!del!controllo!

Sta<s<ca:!!EC:!regressione!lineare!(e.g!probit!,!modificata!per!da<!con<nui)!o!non!lineare!(che!ges<sce!meglio!le!

irregolarità!alle!%!di!effePo!basse)!

NOEC:!Anova!+!Dunnet!


OCSE%201:%alghe,%test%di%inibizione%della%crescita%%Criteri%di%validità%%

Aumento!della!concentrazione!cellulare!

nelle!colture!di!controllo!in!72!ore!

16!volte!

Coefficiente!!di!variazione!dei!tassi!di!

crescita!specifici!medi!nelle!repliche!del!

controllo!

<7%!

!

Coefficiente!!di!variazione!medio!dei!

tassi!di!crescita!calcola<!per!ogni!giorno!

nelle!repliche!del!controllo!

!

<!35%!

!!!!!

% Daily%specific%growth%rates%(d_1) Coefficient%of%varia*on%(%)

Average%specific%growth%

rate%(d_1)

Coefficient%of%varia*on%(%)

Replicate 0!-!1!d 1!-!2!d 2!-!3!d 3!-!4!d 0!-!4!d 1 1.61 1.82 1.38 1.01 23.8 1.46 1.4 2 1.39 2.03 1.29 1.09 27.9 1.45 3 1.86 1.58 1.25 1.00 26.5 1.42


Esempio.!Nel!controllo!le!repliche!dovrebbero!essere!6!!

FaEori%confonden*%

  Presenza!di!EDTA!!

!

  !S<molo!della!crescita!!a!basse!dosi!!ormesi!!

!aggiunta!di!faPori!nutri<vi!presen<!nell’estraPo!

  Soluzioni!colorate!!

Aggiustamen<!metodologici!(propos<!inizialmente):!!

!massima!irradiazione!prevista!dal!metodo,!!

!!ridurre!volume!delle!soluzioni!(5!-!25!ml),!!

!adeguata!agitazione!!

!

Test!alterna<vo!*:!

!!

!Lemna!test!(OCSE!221,!!eseguito!su!superficie!nera!non!riflePente).!!

!

!

*!EU!Manual!of!Decisions!dated!July!2006.!


Tossicità%a%lungo%termine%%

!•  Pesci!–!test!di!tossicità!sugli!stadi!di!vita!precoci,!30/60!gg,!(OCSE!210,!2013)!!!

•  Crostacei!-!Daphnia!magna,!test!di!riproduzione,!21!gg!(OCSE!211,!2012)!C.20!!!NOEC!(mortalità,!riproduzione)!!

•  Alghe%e%cianobaEeri%di%acqua%dolce!-!!test!di!inibizione!della!crescita!!72h/96h!(OCSE!201,2011)!C3!!!!!!!!!!!NOEC!/ECx!(tasso!di!crescita)!

!

……..anche!altri!test,!se!valida<!ed!accePa<!internazionalmente.!

Anche!da<!su!altri!organismi,!se!ques<!rappresentano!specie!ed!endpoints!equivalen*%(Nota!1,!tab.!2.2.9.1.10.3.1).!

!


OCSE%210:%pesci,%test%di%tossicità%sugli%stadi%di%vita%precoci%

!!

Organismo%test:%%%%%%% %Pimephales!promelas,!Oncorhynchus!mykiss,!Danio!rerio!,!Oryzias!la0pes/Cyprinodon!variegatus,!! ! !Menidia!sp.!(UOVA!prima!dello!stadio!di!gastrula)!

!

Durata:! ! !28-60!gg!dopo!la!schiusa!(30gg!per!D.!rerio)!!Procedura: ! !semista<ca/flusso!con<nuo!

!!Numero%organismi: !80!uova/concentrazione!(4!repliche)!!Contenitori:! ! !volume!adeguato!(7!l!!per!pesci!piccoli)!! !!!Temperatura: % %secondo!la!specie,!26±!1.5!°C!per!Danio!rerio!!!Fotoperiodo:! ! !secondo!la!specie,!12-16!ore!luce!per!Danio!rerio!!!Alimentazione:%% %secondo!la!specie!(2gg!dopo!la!schiusa!per!Danio!rerio)!%Misure: ! !mortalità,!!

! !schiusa,!!

! !anormalità,!!

! !comportamento,!

! !peso,!

! !lunghezza.!

!

!!Endpoint:% ! !30/60gg!NOEC/ECx!!


OECD%211:%Daphnia!magna,!test%di%riproduzione%

Organismo%test:%%%%%%%%piccoli!!<!24!ore!!Durata:! ! !21!gg!!Procedura: ! !semista<ca!

!!Numero%organismi: !20/concentrazione!(4!replica)!!Contenitori:! !adegua<!per!contenere!min!50!ml!di!soluzione!test !!!Temperatura: %20!±!2°C!!Fotoperiodo:! !16!ore!luce!%pH % %6-9!%Alimentazione:% %alghe!unicellulari!(0.1-0.2!mg!C/daphnia/g)!%Misure: ! !mortalità!delle!madri,!!

! !numero!di!piccoli!(inibizione!della!riproduzione)!

! !(lunghezza)!

!Endpoint:% !21!gg!ECx/NOEC!!

%

%!


Invertebra*%!(possibili!test!cronici!alterna<vi)!

•  Crostacei:!Ceriodaphnia!dubia!-!test!di!riproduzione!7!gg!(ISO!20665,!2008;!ARPAT/IRSA!CNR!(2003),!!US!EPA)!

!

!

(!Ro<feri:!Brachionus!calyciflorus!–!determinazione!della!tossicità!cronica!su!

Brachionus!calyciflorus!in!48!ore)!


Ceriodaphnia!dubia,!test%di%riproduzione%

%%Organismo%test:%%%%%%% %piccoli!!<!24!ore!(meglio!se!più!giovani)!

!

Durata:! ! !7!±!1!gg!!Procedura: ! !semista<ca!

!!Numero%organismi: !10/concentrazione!(1!daphnia/!replica)!!Contenitori:! !min!30ml!(min!15!ml!di!soluzione!test) !!!Temperatura: %25±!1!°C!%pH % %8%±!0.3%%Fotoperiodo:! !16!ore!luce!!Alimentazione:% %alghe!+!lievito!e/o!estraPo!di!mangime!pesci!%Misure: ! !mortalità!delle!madri,!!

! !numero!di!piccoli!(inibizione!della!riproduzione)!

! !(lunghezza)!

!

!!Endpoint:% ! !7gg!ECx/NOEC!!

%!

Criteri!di!validità:!Mortalità!femmine!<20%!

Almeno!15!piccoli/femmina!nel!controllo!

60%!madri!vive!hanno!prodoPo!3!schiuse!


Ceriodaphnia!dubia!vs!Daphnia!!magna%

•  Stessa%sensibilità%(o%maggiore)%

•  Ciclo%vitale%più%breve!%%%-!primi!piccoli!al!3°/4°!giorno!di!età!(versus!9°)!!!

!-!3!/!4!schiuse!in!7!gg!!(versus!21!gg)!

•  Dimensioni%inferiori%

Daphnia!magna!3.5-4.3!mm!

Ceriodaphnia!dubia!!0.95-1.4!mm!


Test%limite%(linee%guida%OCSE)%%

!

!

Test!acu<!!!

!Alghe/Piante!

!Daphnia!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!100mg/L!o!al!limite!di!solubilità!nel!mezzo!di!prova!

!Pesci!!!!

Test!cronici!!

!!

%Daphnia!

!Pesci! ! !10!mg/Lo!al!limite!di!solubilità!nel!mezzo!di!prova!

!

!

!

(Per!alcuni!test!si!richiede!un!numero!maggiore!di!repliche)!

!

!

  Per!i!rifiu<,!il!test!limite!potrebbe!essere!condoPo!alla!valore!limite!fissato!!la!classificazione.!

!!


Schema%di%classificazione%per%le%miscele%pericolose%per%l’ambiente%

Limi*%in%mg/L%


H14!!da*%di%ecotossicità%del%rifiuto%disponibili%

!

Categoria%pericolo%Acuto%!

Per!essere!classificato!come!ecotossico!è!sufficiente!che!un!!solo!dato!di!tossicità!acuta!(LC50/EC50)!sia!al!di!soPo!del!limite!(≤!1!mg/l).!

!

Non!ecotossico:!i!da<!di!tossicità!acuta!(LC50%/EC50)!per!tuL!i!livelli!trofici!devono!essere!>!1mg/l!o!>!solubilità!in!acqua.!

!

Categoria%pericolo%Cronico:%%Per!essere!classificato!come!ecotossico!è!sufficiente!che!un!dato!di!tossicità!cronica!(NOEC/ECx)!sia!al!di!soPo!del!limite!fissato!per!«cronico!2»!(≤!1!mg/l,!sostanze!non!rapidamente!degradabili).!

!

Non!ecotossico:!i!da<!di!tossicità!cronica!(NOEC!/ECx)!per!tuL!i!livelli!trofici!sono!al!di!sopra!>!1mg/l!o!>!solubilità!in!acqua.!

!

!

!

!

Per%classificare%H14:!è!sufficiente!che!venga!verificato!il!criterio!di!pericolo!acuto!(LC50/EC50!≤!1!mg/l)!

!

Per%concludere%«non%ecotossico»%o%confutare%%assegnazione%H14:!!è!necessario!il!criterio!«cronico!2»!sia!superato!!per!tuL!e!tre!i!livelli!trofici!(NOEC!/ECx>!1mg/l!!

!

!


Aspe[%cri*ci%

!

 CaraPeris<che!del!medium!(biodisponibilità)!

 Proprietà!delle!sostanze! Volume!di!estraPo!acquoso!necessario!!per!i!test!

 Durata!test!! FaPori!confonden<!(ossigeno!disciolto,!sali,!ammonio,!elemen<!

non!pericolosi….)!

 Soluzioni!torbide/colorate!! Presenza!di!organismi!nel!campione!


CaraEerizzazione%ecotossicologica%dei%rifiu*%Pun*%aper*%

•  Pesci?!!

!Test!alterna<vi!sui!pesci!?!Solo!“Replace”!!!!

!Test!con!altri!organismi!in!sos<tuzione?!

!

•  Eventuali!misure!di!tossicità!cronica!(test!a!breve!termine!,!ma!il!bioaccumulo?)!

•  Guida/armonizzazione!nelle!procedure!di!preparazione!del!campione!e!dell’estraPo!acquoso!da!soPoporre!ai!test!di!ecotossicità!

•  Esperienza!da!maturare!con!varie!<pologie!di!rifiuto!(67%!studi!su!classe!19-!materiale!da!rifiuto!e!traPamento!acqua,!8!classi!mai!testate)!


Grazie per l’attenzione!

Non sparate sul pianista…. Non è colpa mia!

test%richies*%per%la%classiﬁcazione% ecotossicologica%old.iss.it/binary/ampp/cont/marchini.pdf ·...

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