tm 13 aplikasi manipulasi gen 2 (biologi molekuler 2014).pptx

TATAP MUKA 13

Genetic engineering in action(2)

Learning Outcome (LO)

LO 58: menjelaskan tanaman transgenikLO 59: menjelaskan hewan transgenik

studying gen

Gene structure

Gene expression

Aplication of Genetic engineering

Coding sequences

DNA binding proteins

Control sequences mRNA

transcript levels

Effects of deletion & mutation

protein production

Inserting coding sequence in the

correct reading frame

Fusion protein

Nativeprotein

May be cleaved by CnBr

•Bacteria•Yeasts•Insects•Mammalian cells

• Therapeutics• rBST• Enzymes

Medical and forensic

Diagnosis Gene therapy

Forensic analysis

Transgenic organisms (GMO)

Plants Animals

Alter the organism‘s genetic makeup

Genes from adifferent organism

Beneficialchanges

• Agricultural Biotechnology• Basic Research• Medical applications

involves investigation of

by studyingto produce

byaim is to

by incorporating

to effect

in hosts such as

useful for

which

by identifying

In vivo

Microbial or viral

DNA

of

by identifying In vitro

can be either

Infection DNA

profiling

using

Three main areas involved

Minisatellite DNA

to analyse

Microsatellite DNA

Single-locus probes

Multi-locus probes

STR amplification

byusing

can be can be

Produksi organisme transgenik melibatkan pengubahan genom sehingga terjadi perubahan permanen.

Ini berbeda dengan terapi gen sel somatik, di mana efek dari transgen dibatasi untuk individu yang diubah (diobati).

Pada kenyataannya, tujuan keseluruhan pembuatan organisme transgenik adalah mengubah germ line sehingga perubahan genetik diwariskan dalam pola yang stabil mengikuti reproduksi.

Pembuatan dan penggunaan organisme transgenik adalah salah satu bidang rekayasa genetik telah menimbulkan kekhawatiran publik yang besar.

Selain itu, masalah-masalah ilmiah dan teknis yang terkait dengan rekayasa genetik organisme tingkat tinggi seringkali sulit untuk diatasi.

Hal ini sebagian disebabkan oleh ukuran dan kompleksitas genom, dan sebagian disebabkan oleh kenyataan bahwa pengembangan tanaman dan hewan adalah proses yang sangat kompleks yang masih belum sepenuhnya dipahami pada tingkat molekuler.

Meskipun ada kesulitan-kesulitan ini, metode untuk membuat tanaman transgenik dan hewan sekarang mapan, dan teknologi ini telah memiliki dampak yang besar dalam berbagai disiplin ilmu.

Transgenic plants and animals

LO 58: menjelaskan tanaman transgenik


Selama ribuan tahun manusia telah memanipulasi karakteristik genetik tanaman dengan pemuliaan selektif.

Pendekatan ini telah sangat sukses dan akan terus memainkan peranan utama di bidang pertanian.

Namun, program pemuliaan tanaman klasik mengandalkan pada kemampuan untuk melakukan persilangan genetik antara individu tanaman.

Tanaman tersebut harus kompatibel secara seksual (yang biasanya berarti bahwa mereka harus erat terkait); dengan demikian, belum mungkin untuk menggabungkan sifat-sifat genetik dari spesies yang sangat berbeda.

Munculnya rekayasa genetika telah mengatasi kendala ini dan telah memberikan ilmuwan pertanian cara yang sangat ampuh untuk menggabungkan perubahan genetik tanaman.

Perubahan tersebut sering bertujuan untuk meningkatkan produktivitas dan 'efisiensi' tanaman, yang keduanya penting untuk membantu memberi makan dan pakaian populasi dunia yang terus meningkat.

Why transgenic plants?

Ada banyak bidang genetika tanaman, biokimia, fisiologi, dan patologi yang terlibat dalam manipulasi genetik tanaman.

Beberapa target utama untuk perbaikan tanaman tercantum pada Tabel 13.1.

Dalam banyak hal, keberhasilan telah dicapai sampai batas tertentu.

Namun, banyak orang khawatir tentang dampak ekologi yang mungkin timbul dari pelepasan organisme hasil rekayasa genetika (GMO) ke lingkungan.



Keberhasilan manipulasi genetik tanama tergantung pada dua persyaratan utama:1) metode untuk memasukkan gen yang dimanipulasi ke

tanaman target2) Pemahaman mendalam tentang genetika molekuler terhadap

sistem (tanaman) yang sedang dimanipulasi. Dalam banyak kasus, persyaratan ke-2 merupakan faktor

pembatas, terutama jika karakteristik yang diteliti melibatkan banyak gen (sifat poligenik).

Namun demikian, meskipun masih ada masalah, manipulasi genetik tanaman sudah memiliki dampak yang cukup besar pada pertanian.

Transgenic plants

Ti plasmids as vectors for plant cells Memasukkan (introduksi) DNA terklon ke dalam sel tanaman

sekarang merupakan praktek rutin di banyak laboratorium di seluruh dunia.

Metode introduksi meliputi: metode fisik: seperti injeksi atau penembakan menggunakan

DNA biolistic. metode biologis dapat digunakan di mana DNA kloning

dimasukkan ke dalam tanaman dengan vektor berua virus tanaman (calumoviruses atau geminivirus).

Saat ini vektor sel tanaman yang paling banyak digunakan didasarkan pada Ti plasmid Agrobacterium tumefaciens, yang merupakan bakteri tanah yang bertanggung jawab untuk penyakit tumor crown gall.


Agen yang bertanggung jawab untuk pembentukan tumor crown gall bukan bakteri sendiri, tetapi plasmid yang dikenal sebagai plasmid Ti (Ti singkatan dari tumor-inducing).

Ti plasmid besar dengan berbagai ukuran antara 140-235 kb. Plasmid Ti mengandung gen :

untuk pembentukan tumor, untuk fungsi virulensi untuk sintesis dan pemanfaatan turunan asam amino yang

tidak biasa dikenal sebagai opines. Dua jenis utama plasmid Ti yang ditemukan biasanya dapat

dicirikan atas dasar gen penyandi octopine dan nopaline. Sebuah peta dari Ti plasmid nopaline ditunjukkan pada Gambar.

13.1.



Fig. 13.1 Map of the nopaline plasmid pTiC58

Ti plasmids as vectors for plant cells

Regions indicated are the T-DNA (shaded), which is bordered by left and right repeat sequences (LB and RB), the genes for nopaline and agrocinopine catabolism, and the genes specifying virulence (vir). The CON region is responsible for conjugative transfer

Bagian plasmid Ti yang bertanggung jawab untuk pembentukan tumor dikenal sebagai T-DNA.

T-DNA (berukuran antara 15 - 30 kb) membawa gen untuk sintesis octopine atau nopaline.

Ketika infeksi, T-DNA menjadi terintegrasi ke dalam genom sel tanaman dan karena itu merupakan jalan yang mungkin untuk memasukkan DNA asing ke genom tanaman.

Integrasi dapat terjadi secara acak pada berbagai situs dalam genom tanaman Nopaline T-DNA merupakan segmen tunggal, sedangkan DNA octopine

merupakan dua daerah yang dikenal sebagai segmen kiri dan kanan. Segmen kiri adalah mirip dengan struktur nopaline T-DNA, dan tidak diperlukan

untuk pembentukan tumor. Struktur nopaline T-DNA ditunjukkan pada Gambar. 13.2. Gen untuk morfologi tumor ditujukan tms ('shooty' tumours), tmr

('rooty'tumours), dan tml (‘large'tumours). Gen nos pada nopaline T-DNA menyandi sintase nopaline Gen ocs pada octopine T-DNA menyandi sintase octopine. Gen nos dan ocs eukariotik dan promotornya telah digunakan secara luas dalam

pembuatan vektor yang mengekspresikan urutan basa (gen) sisipannya.



Fig. 13.2 Map of the nopaline T-DNA region

Ti plasmids as vectors for plant cells

Batas kiri dan kanan ditunjukkan dengan LB dan RB. Gen untuk sintase nopaline (nos) dan morfologi tumor (tms, tmr, dan tml) ditunjukkan. Transkrip peta ditunjukkan di bawah peta T-DNA. Transkrip 1 dan 2 (tms) yang terlibat dalam produksi auksin, transkrip 4 (tmr) dalam produksi sitokinin. Ini menentukan baik shooty atau rooty tumor. Transkrip 3 menyandi sintase nopaline, dan transkrip 5 dan 6 produk menyandi untuk menekan diferensiasi.

Ti plasmid terlalu besar untuk digunakan secara langsung sebagai vektor, sehingga vektor yang lebih kecil telah dibuat yang cocok untuk manipulasi in vitro.

Vektor ini tidak mengandung semua gen yang dibutuhkan untuk transfer gen yang dimediasi Ti, dengan demikian, harus digunakan bersama dengan plasmid lain untuk mengaktifkan DNA sisipan sehingga terintegrasi ke dalam genom sel tanaman.

Seringkali tripartit atau lintas triparental diperlukan, yang meliputi rekombinan yang ada dalam satu galur E. coli dan plasmid konjugasi dalam galur E. coli yang lain.

Plasmid Ti derivatif terdapat dalam A. tumefaciens. Ketika tiga galur dicampur, plasmid konjugasi berpindah ke galur

yang membawa plasmid rekombinan, yang kemudian dimobilisasi dan dipindahkan ke Agrobacterium.

Rekombinasi ini kemudian memungkinkan integrasi DNA terklon (sisipan) ke dalam plasmid Ti, yang dapat mentransfer DNA ini ke genom tanaman pada saat infeksi.


Dalam pengembangan metodologi tanaman transgenik, dua pendekatan berbasis plasmid Ti dirancang:

1) kointegrasi2) sistem vektor biner.

Dalam metode kointegrasi, plasmid berdasarkan pBR322 digunakan untuk mengkloning gen yang diinginkan (Gambar 13.3).

Plasmid ini kemudian diintegrasikan ke dalam vektor berbasis plasmid Ti seperti pGV3850. pGV3850 ini membawa daerah vir (yang menentukan virulensi) dan memiliki perbatasan

kiri (LB) dan kanan (RB) T-DNA, yang penting untuk integrasi daerah T-DNA. Namun, sebagian besar T-DNA telah digantikan oleh urutan pBR322, yang memungkinkan

penggabungan plasmid rekombinan melalui rekombinasi homolog. Penggabungan ini menghasilkan plasmid besar yang dapat memfasilitasi integrasi urutan

DNA kloning (sisipan). Penghapusan T-DNA memiliki konsekuensi lain yang penting, seperti sel yang terinfeksi

konstruksi tersebut tidak menghasilkan tumor dan kemudian lebih mudah untuk beregenerasi menjadi tanaman dengan teknik kultur jaringan.

Plasmid Ti yang tidak mempunyai fungsi tumourigenic dikenal sebagai “disarmed vectors”.

Making transgenic plants


Gambar. 13.3 Pembentukan Ti plasmid cointegrate. Plasmid pGV3850 membawa gen vir tetapi beberapa wilayah T-DNA diganti dengan urutan pBR322 (pBR). Batas kiri dan kanan T-DNA (daerah diisi). Insert (berbayang) yang diklon dalam plasmid berbasis pBR322 dapat dimasukkan ke pGV3850 melalui rekombinasi homolog antara daerah pBR, menghasilkan “disarmed cointegrate vector”.


Gambar. 13.4 sistem vektor biner berdasarkan Bin 19The Bin 19 plasmid membawa urutan gen untuk α-peptida β-galaktosidase (lacZ '), hilir dari polylinker (MCS) di mana DNA bisa disisipkan. The polylinker/lacZ '/wilayah neo diapit oleh urutan perbatasan T-DNA (daerah diisi). Selain itu, gen untuk phosphotransferase neomycin (neo) dan resistensi kanamisin (Kanr) dapat digunakan sebagai penanda seleksi. Plasmid yang digunakan dalam hubungannya dengan pAL4404, yang membawa gen vir tetapi tidak memiliki T-DNA. Kedua plasmid saling melengkapi secara trans untuk memungkinkan transfer DNA kloning ke dalam genom tanaman.


Sistem vektor biner menggunakan plasmid yang terpisah untuk memasok “disarmed T-DNA” (mini-Ti plasmids) (plasmid mini-Ti) dan fungsi virulensi.

Plasmid mini-Ti ditransfer ke strain A. tumefaciens (yang berisi plasmid kompatibel dengan gen vir) oleh silang triparental (triparental cross).

Gen yang disisipkan dalam plasmid mini-Ti dimasukkan ke dalam genom sel tanaman dengan komplementasi trans, di mana fungsi vir disediakan oleh plasmid kedua (Gambar 13.4).

Gambar. 13.5 Regenerasi tanaman transgenik dari cakram daun. (a) Gen target dikloning ke vektor berbasis plasmid Ti. Plasmid rekombinan digunakan untuk mengubah Agrobacterium tumefaciens. Bakteri ini kemudian digunakan untuk menginfeksi sel-sel tanaman yang telah tumbuh sebagai cawan eksplan dari jaringan daun, seperti yang ditunjukkan pada (b). Pabrik transgenik diregenerasi dari cawan daun melalui propagasi pada media kultur jaringan yang tepat.


Ketika strain A. tumefaciens telah dihasilkan, yang mengandung “disarmed Ti-plasmid” rekombinan, infeksi jaringan tanaman dapat dilakukan.

Hal ini sering dilakukan dengan menggunakan cakram daun, dari mana tanaman dapat diregenerasi dengan mudah, dan banyak gen telah ditransfer ke tanaman dengan metode ini.

Metode ini diringkas dalam Gambar. 13.5.

Kepercayaan masyarakat dan penerimaan tanaman transgenik telah menjadi daerah yang sulit di bidang bioteknologi, dengan banyak pandangan dan kepentingan yang berbeda.

Sebuah perdebatan yang rasional dan seimbang adalah penting jika teknologi ini akhirnya menjadi nilai yang meluas.

Putting the technology to work

Tanaman Bt, di mana racun bakteri digunakan untuk memberikan resistensi terhadap hama ulat, telah berhasil dikembangkan dan ditanam secara komersial di banyak negara.

Resistensi terhadap herbisida merupakan daerah yang telah dieksploitasi oleh ahli bioteknologi tanaman untuk merekayasa tanaman yang tahan terhadap herbisida yang pada umumnya digunakan untuk mengendalikan gulma.

Tanaman GM sekarang ditanam di 22 negara, dengan lebih dari 100 juta hektar yang ditanam pada tahun 2006.

Beras sangat penting sebagai makanan pokok merupakan target yang jelas untuk ahli teknologi GM.

Perkembangan 'Golden Rice' adalah contoh dari ilmu pengetahuan yang baik dan niat yang baik, meskipun seperti yang sering terjadi agenda politik mungkin memiliki peran dalam menentukan bagaimana keuntungan dibagi dan didistribusikan.

Pengembangan dan implementasi teknologi proteksi merupakan daerah yang sangat kontroversial dan emosional dalam manipulasi genetik tanaman, dengan pendapat yang kuat di kedua sisi argumen.

Penggunaan tanaman sebagai 'pabrik' untuk sintesis protein terapeutik merupakan daerah yang saat ini sedang dikembangkan untuk memungkinkan produksi farmasetikal tanaman (PMPs).

Hewan Transgenik Generasi hewan transgenik merupakan salah satu aspek rekayasa

genetika yang paling kompleks, baik dari segi teknis dan kesulitan dalam masalah etika yang muncul.

Banyak orang, yang menerima bahwa manipulasi genetik bakteri, jamur, dan spesies tumbuhan bermanfaat, namun menemukan kesulitan dalam memperluas penerimaan ini ketika hewan (terutama mamalia) yang direkayasa genetiknya.

Diskusi yang simpatik dan objektif tentang topik ini oleh komunitas ilmiah, media, dan masyarakat umum akan menjadi salah satu tantangan besar dalam etika ilmiah selama beberapa tahun ke depan.

LO 99: menjelaskan hewan transgenik

Why transgenic animals? Rekayasa genetika berdampak besar terhadap studi tentang struktur dan

ekspresi gen dalam sel hewan, dan ini adalah salah satu kajian yang akan terus berkembang.

Penelitian kanker adalah salah satu contoh nyata, dan penelitian genetika molekular penyakit saat ini mensyaratkan penggunaan teknologi manipulasi gen.

Dalam bidang produksi protein di bidang bioteknologi, sintesis beberapa protein rekombinan mamalia yang diturunkan sering terbaik ketika dilakukan menggunakan sel mamalia.

Aplikasi berbasis sel seperti yang diuraikan di atas merupakan bagian penting dari rekayasa genetika hewan.

Namun, istilah 'transgenik' biasanya diperuntukkan bagi organisme keseluruhan, dan generasi hewan transgenik jauh lebih kompleks daripada bekerja dengan sel kultur.

Banyak masalah telah diatasi dengan menggunakan berbagai hewan, dengan karya awal melibatkan amfibi, ikan, tikus, babi, dan domba.


Why transgenic animals? Transgenik dapat digunakan untuk berbagai tujuan, yang meliputi penelitian

dasar dan aplikasi bioteknologi. Studi tentang perkembangan embriologis telah dikembangkan oleh

kemampuan untuk memasukkan gen ke dalam telur atau embrio awal, dan ada ruang untuk manipulasi hewan ternak dengan penggabungan sifat yang diinginkan melalui transgenesis.

Penggunaan organisme keseluruhan untuk produksi protein rekombinan adalah kemungkinan lebih lanjut, dan ini telah dicapai dalam beberapa spesies.

Istilah pharm animal atau pharming (dari farmasi) kadang-kadang digunakan ketika berbicara tentang produksi protein terapeutik bernilai tinggi menggunakan teknologi hewan transgenik.


Producing transgenic animals Ada beberapa rute yang mungkin untuk introduksi gen ke embrio, masing-

masing dengan kelebihan dan kekurangannya sendiri. Beberapa metode tersebut yaitu

(1) transfeksi langsung atau infeksi retroviral sel induk (stem cell) embrionik diikuti dengan introduksi sel-sel ini menjadi embrio pada tahap perkembangan blastosis;

(2) infeksi retroviral embrio awal;(3) injeksi langsung DNA ke dalam oosit, zigot, atau sel-sel embrio awal;(4) Transfer dimediasi-sperma;(5) transfer ke ova unfertilised; dan(6) teknik fisik seperti biolistics atau Electrofusion.

Selain metode-metode di atas, teknik transfer inti (digunakan dalam kloning organisme, kadang-kadang dikaitkan dengan protokol transgenesis.


Keberhasilan awal dicapai dengan menyuntikkan DNA ke dalam salah satu dari pronukleus telur terbuahi, sesaat sebelum fusi pronukleus (yang menghasilkan zigot diploid).

Percobaan ini menghasilkan 'supermouse' pada awal tahun 1980, yang merupakan salah satu tonggak rekayasa genetika.

Percobaan 'supermouse' dilakukan dengan menempatkan salinan gen hormon pertumbuhan tikus (GH) di bawah kendali promotor gen metallothionine tikus (MMT).

Untuk membuat 'supermouse', sebuah fragmen linier dari plasmid rekombinan yang membawa urutan gen menyatu (MGH) disuntikkan ke dalam pronukleus jantan pada telur terbuahi (fragmen linier muncul untuk mengintegrasikan ke dalam genom lebih mudah daripada urutan sirukuler).

Telur terbuahi yang dihasilkan ditanam ke dalam uteri ibu asuh, dan beberapa tikus yang dihasilkan dari ini mengekspresikan gen GH.

Tikus tersebut tumbuh beberapa 2 - 3 kali lebih cepat daripada tikus kontrol.

Mikroinjeksi Pronuclear diringkas dalam Gambar. 13.8.


Gambar. 13,8 Produksi 'supermouse'. (a) Telur terbuahi diambil dari tikus betina dan (b) konstruk DNA yang membawa gen hormon pertumbuhan tikus/promotor metallothionein (MGH) disuntikkan ke dalam pronukleus pria. (c) Telur kemudian ditanamkan ke ibu angkat. (d) Beberapa tikus anakan mengekespresikan MGH (MGH +) dan lebih besar dari tikus yang normal.


a) Sel induk embrio (Embryonic stem cells/ES cells) dikeluarkan dari embrio awal dan dikultur. Transgen target dimasukkan ke dalam sel-sel ES, yang ditumbuhkan pada media selektif.

b) Sel-sel ES yang mengandung transgen yang disuntikkan ke dalam sel-sel ES dari embrio yang lain, di mana mereka dimasukkan ke dalam massa sel. Embrio ditanamkan ke betina hamil, dan tikus transgenik chimaeric (chimaera) diproduksi.

c) Dengan mengawinkan chimaera dengan tikus normal, beberapa transgenik heterozigot akan diproduksi.

d) Jika sesama chimaera dikawinkan, transgenik homozigot akan diproduksi sekitar 25% dari keturunannya

Gambar. 13,9 Produksi tikus transgenik menggunakan teknologi sel induk embrio.


Pada mamalia, tikus transgenik ini menjadi salah satu bukti sistem model yang paling berguna untuk mengetahui perkembangan embrio, dan ekspresi banyak transgen telah dipelajari dalam organisme ini.

Salah satu aplikasi tersebut ditunjukkan pada Gambar. 13.10, yang menunjukkan penggunaan gen lacZ sebagai sarana untuk mendeteksi ekspresi gen spesifik jaringan.

Dalam contoh ini gen lacZ ditempatkan di bawah kendali lemah promotor timidin kinase (TK) dari herpes simplex virus (HSV), menghasilkan HSV-TK - lacZ.

Hal ini digunakan untuk melacak domain kromosom aktif dalam perkembangan embrio.

Salah satu turunan transgenik mengekspresi transgen pada jaringan otak tertentu (Gambar. 13.10).


Gambar. 13.10 Ekspresi transgen dalam embrio tikus. Daerah penyandi (coding region) β-galaktosidase (lacZ) ditempatkan di bawah kendali promotor timidin kinase dari herpes simplex virus untuk menghasilkan konstruk gen HSV-TK-lacZ. Konstruk gen ini disuntikkan ke pronukleus jantan dan tikus transgenik yang diproduksi. Contoh ini menunjukkan janin 13 hari dari strain transgenik yang mengekspresikan transgen dalam jaringan otak selama kehamilan. Deteksinya adalah dengan melihat terbentuknya senyawa berwarna biru yang dihasilkan oleh aksi β-galaktosidase pada X-gal. Dengan demikian, daerah gelap di otak depan dan belakang menunjukkan daerah di mana gen lacZ telah diekspresikan.


Applications of transgenic animal technologyThere are over 5 000 entries in the Mouse Knockout and Mutation Database, which is a major resource for those interested in using the mouse as a model system for the study ofgene expression, development, and disease.

Many new variants of transgenic mice have been produced and have become an essential part of research into many aspects of human disease.

Increased knowledge of molecular genetics, and the continued development of the techniques of transgenic animal production, have enabled mice to be generated in which specific genes can be either activated or inactivated. Where a gene is inactivated or replaced with a mutated version, a knockout mouse is produced.

If an additional gene function is established, this is sometimes called a knockin mouse. The use of knockout mice in cystic fibrosis (CF) research is one example of the

technology being used in both basic research and in developing gene therapy procedures.

Mice have been engineered to express mutant CF alleles, including the prevalent F508 mutation that is responsible for most serious CF presentations.

Having a mouse model enables researchers to carry out experiments that would not be possible in humans, although (as with developmental studies) results may not be exactly the same as would be the case in a human subject.


Applications of transgenic animal technology

The use of transgenic animals as producers of high-value products is more fully developed than is the case for transgenic plants, although there are often scientific and commercial problems in making a success of the technology.

In 1991 PPL’s first transgenic sheep (called Tracy) was born.

Yields of human proteins of around 40 g L−1 were produced from milk, demonstrating the great potential for this technology.

PPL continues to develop a range of products, such as -1-antitrypsin (for treating CF), fibrinogen (for use in medical procedures), and human factor IX (for haemophilia B).

Using animals as bioreactors offers an alternative to the fermentation of bacteria or yeast that contain the target gene.

The technology is now becoming well established, with many biotechnology companies involved.

As we have already seen, this area is sometimes called pharming, with the transgenic animals referred to as pharm animals.


Applications of transgenic animal technologyThe use of transgenic technology to enable xenotransplantation is an area that could alleviate some of the problems of supply and demand that exist in the field of organ transplantation.

In January 2001 the birth of the first transgenic nonhuman primate, a rhesus monkey, was announced.

This was developed by scientists in Portland, Oregon. He was named ANDi, which stands for inserted DNA (written backwards!).


SELAMAT MENEMPUH

UAS

SEMOGA ANDA SUKSES

tm 13 aplikasi manipulasi gen 2 (biologi molekuler 2014).pptx

Documents