8/3/2019 Über Benzimidazolderivate mit starker analgetischer Wirkung [Benzimidazole derivatives with strong analgesic effec…

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[tb. X. It}b7] Kurzc Mitteihmgen Brief Reports 40 1

Verbindung R1 R~ R a R 4 Summon formel Smp'~No, ~'C

12

3d

56789

10l /121314

-C~H~

-C 2H~

-CH~-C2H~-C~H~

C~H~CH~C2H~

-C2H~-C2H8-C~H 8

-C2H 8-C2H s-C2Hs

- H- H

- H-CONH 2HHHH

--H

- H- I t

HH

- H

- II4' CI

4' C14' CIH

- H-4' CI-4"-C1-4'-CI-3'-OCH~-Y ,4 ' (OCHa) 2

4' CH~-4'-OCH8-4'-OC2H ~

-H- H

- H-5-NO 2-5-NO 2

6-NO,-5-NO 2

.-5 ..NO26 -NO 2

-5-NO 2-5-N()~

-5-NO 2-5-NO 2.....5-NO 2

C2oH.oBN2 • H('ICeoH24N2Cl

CtsH20NaClC~1 Hz4 NsO3C 1

C2oH24N402C2oH24N402CtsHlt~N4()2CI • HCIC2oH2aN402CI

(;30 H2s-N4()2(~I

( ; 2 tH 2 ~ N 4 O s " H C I

C 2 2 H 2 s N 4 0 4 " H C I

C 2 1 H . 6 N 4 0 2 " H C 1

C 2 1 H 2 6 N 4 0 a ' H C I

C 2 2 H 2 8 N a O a • H C 1

184-18677-78

103 104161-16387 8996 98

230 23275-7696 98

186-189193 194216 218197 199162-164

5 Schmelzpunkte der freien Basen oder der Hydrochloride, wie au~ der Summenformel hervorgeht.

benzimidazol ( 5 ) syn the t i s i e r t werden . Diese Verb i ndung

erweis t s ich als ident isch mitde r Base B aus der Alky-

lierung yo n II I (R a = H, R, = 516]-NO2). Da mi t is[

I ii r die Base A die Formel des 6-Nit ro-De r ivat es ( 6 ) und fiir

Base B diej enige der 5 -Ni tro -Ve rbi ndu ng (5) sicher gestell t .

In der Tabel le [s t e ine kleine Auswahl der herges tel l -

ten Ver bin dun gen aufgef i ihr t . Fii r die Synthe se yon

Der iva ten ohne Subs t i t uen te n im Phenylen te i l des

Benzimidazo lkernes (1 , 2 , 3) eignet sieh der Weg a), ff ir

5-Nit ro-Ve rbind unge n der \ ,Veg b). Fi i r 6-Nit ro-D er iv ate

muss via a) ver f ahren und aus dem erha l t en en I somere n-

gemiseh das 6 -Ni t ro -be nz imidaz o l -Der iva t mi t gee igne-

ten Methoden daraus isol ier t werden. {~ber Struktur undEinhe i t l i ehke i t des i so l ie r t en I someren g ib t das Verh /i l t -

his der Ext inkt ionen der UV.-Maxima be[ 240 m/ , und

be[ 310 mt , , Auskunf t . Fi i r 6-Nit ro-Der ivate [s t das Ver-

h/ t l tnis von etwa 1,47, f t i r 5-Nit ro-Verbindungen dage-

gen der viel h6here "Wert von etwa 2,80 typiseh. Das

Amid d wird auf dem \Veg b) dur ch Reak t ion von IV

(R 1 = C2tts, R I -- NO2) m it de m aus p- Chl or -ph en yl -

cy an ac eta mi d zug~tnglichen Imino~ither V (R~ = CON H 2,

R 3 -- C1) e rh al te n.

Die Mehrzah l der b i s heu te bekannten s t a rk wi rk-

samen Ana tge t ika bes i t zen noch typ i sehe S t ruk ture le -

mente des Morphinmolek i i l s . Ih re pharmakolog i sche

Wirksamkei t i s [ dami t in Zusammenhang gebrach t wor -den 8. Sogar beim s t rukt urel l berei ts we i ter en tfe rnt en

Methadon d i sku t i e ren e in ige Autoren noch e ine gewis se

s te reochern is che Verwan dt scha fU. Im Gegensa tz dazu

lassen s ich yon der n eug efun den en Ser ie der 1- ( f l-Dialkyl-

amino- / i thy l ) -2 -benzy l -5-n i t ro -benz imidazo le aum mehr

Paral l e len zum Morphin kons t ru ie ren .

A. HUNGER, J , KEBRLE, A. RossL

u n d K. H O F F M A N N

F o r s c h u n g s l a b o r a t o r ie n de r C [ B A A k t i e n g e se l l sc h a / t ,

P h a r m a z e u t i s c h e A b l e [ l u n g , B a s e l , 2 6, A u g u s t 1 9 5 7.

S u m m a r y

The syn theses o f l - ( f l -d ia lky lamino-e thy l ) -2 -benzy l -

5-ni t ro-benzimidaz oles , a new ser ies of powerful anal-

gesics, are described.

6 0 . SCHAUMANN, Arch. exp. Path. Pharmak. 196, 109 (1940).7 Vgl. zum Be[spiel die zusammenfassende l) arsteihmg yon

J. LEE in C. M. SUTER, 3fedicinal Chemistry (John \Viley & Son~,Inc., New York 1951), Vol. I, p. 438.

t ~ b e r B e n z i m t d a z o l d e r i v a t e

m i t s t a r k e r a n a l g e t i s c h e r W i r k u n g

Benzimidazo l und ver sch iedene se iner Der iva te be-

s i t zen spez i fi s che Wirkung en auf das Ze n t r a lnerve n-

sys t em und f i ihren zu einer BeeintrAcht igung der int ra-

spinalen Erregungs i iber t ragung, ats deren Folge LS.h-

mungen der Ske le t tmuskula tu r auf t r e t en (GooDMAN

el al . 1 , BERGER ~, DOMINO e t a l . a ) . A n d e r s s u b s t i t u i e r t e

V e r b i n d u n g e n h a b e n k o n v ul s i v e E i g e n s c h a f t e n g e z ei g t

(DOMINO et al .3) . Dagegen s ind b i sher ke ine Benzimid-

azole mi t ausgesproch ener ana lge t i s cher Wirkung be-schr ieben worden . Be[ der pharmakolog i schen Unter -

suchung bas i s ch subs t i tu ie r t e r Benzimidazo le f anden

w i r neuerd ings Verb indungen , d ie n ieh t nur qua l i t a t iv

dem Morphin und ~ ihnl ich wi rkenden sy n the t i s che n Sub-

s tanzen nahes tehen , sondern von denen e inze lne d i e

w i r k s a m s t e n b i s h e r b e k a n n t e n A n a l g e t i k a i n q u a n t i t a -

f iver Hi ns ic ht i iber t re f fen. I ) ie Chemie dieser yon HOFF-

MANN und Mi ta rbe i t e rn syn the t i s i e r t en Ve rb indunge n

[ st in der voran s tehe nden Mi t r e[ lung beschr ieben 4.

Die analget ische \Virkung auf W~irmereiz wurde mit

der yon uns angege benen Methode an der Maus un te r -

sucht (GRoss~) . Weiterhin wurde an der Rat te die Reak-

t ion auf Druckschmerz quan t i t a t iv bes t immt (GREENund YOUNG n) und am Kan inc hen die Au fhe bun g der

durch Knei f en am Ohr hervorgerufene n Abwehr reak t ion .

Als Verg leic hssub s tanz diente Morphin. Aus den in Ta-

be ll e I zusammenge s te l l t en Wer te n geh t hervor , das s

Subs t i tu t ion mi t e iner Ni t rogruppe in S te l lung 5 zu

e iner e rheb l i chen S te ige rung der ana lge t i s ehen %qrkung

f i ihr t , w/ ihrend dies be[ Subs t i tut ion in 6-Stel tung nicht

der Fal l [ s t (Ver bind ung Nr . 6 und 9). I )e r ivate mit der

D i a e t h y t a m i n o g r u p p e a n d e r b a s i sc h e n S e i t e n k e t t e w i r-

ken im a l lgemeinen s t / i rker a l s d ie en t s prec hend en Di-

m e t h y l a m i n o v e r b i n d u n g e n ) . E i ne w ei t er e V e r s t ~ r k u n g

der Analgesie is [ auch durch E inf i ih rung e iner Met hoxy-

oder 3 , thoxygrupp e in para-S te l lung des Benzyl r es tes zu

1 L. GOODNAN,A. GILMAN und N. HART,Fed. Proc. 2, 80 (1943).2 F. M. BERGER,Pharmacol. Rcv. l, 23.1 (19-1~).a E. F. I)OMINo, K. R. UNNA rod J. I':ERWIN, J. Pharmacol. exp.

Ther. lO5,486 (195'2).4 A. HUNGER, J. KEIIRLE, A. ROSS[ ilild K, HOFFMANN, Exper. 1:1,

40O (1957).5 F, GRoss, Helv. physioL Acta 5, C "1l (1917).B A.F . GREEn mMP. A. YmIN% Brit. J. Pharmacol. 6, 572 (1~51).

Exper. 26

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402 Br ~v e s c o mm u n ic a t io n s - B r e v i c o mu n ic a z io n i [ExI'ERIENTIA VOL. XlII /10]

Tabelle IRe la t iv e a n a lg e t is c h e W ir k u n g s in te n s i tS t v e r s c h ie d e n e r Be n z imid a z -o ld e r iv a te b e z o g e n a u f Mo r p h in . D ie Z a h le n in K la ln me r n g e b e n diea b s o lu te n M o r p h in d o s e n f it mg /k g a n . D ie Z a h le n 1-14 b e t r e f f e n d iei n d e r T a b e l l e d e r v o r a n s t e h e n d e n M i t t e il u n g4 a n g e f f ih r t e n Ve r b in -

d u n g e n .

V e r b i n d u n g N r .

M o r p h i nt

3

4

fi

7

8

9

10

11

12

13

14

. m

M a u st s u b k u t a n

1 ( 5 )

1 / 1 011100321 /31 /33

1 / i 02I 01 01 0 01 0 0 0

Analges ie

Ma u s ] Ra t t e Ka n in e h e n

q

p e r o s I s u b k u ta n in t r a v e n S s

i ( 2 5 )

1/2

5

1 /25

I3I 015t 2 5 0

I ( 2 )

1 / 1 0

1

1 0

3 o1 0 0 0

1 ( 5 )

1 /51 /2

1 05

1/2

10

1 01 05 02 0 0i 0 0 0

Tabelle IIMit t l e r e L e ta ld o s e n b e i in t r a v e n S s e r u n d p e r o r a le r Ga b e a n d e rMa u s, in t r a v e n 6 s e L e ta ld o si s a m n ie h tv o r b e h a n d e l t e n u n d n ar ko ti -s i e r t e n K a n in e h e n s owie a t e mh e mm e n d e Do s is in Ur e th a n n a r k os e

(1 ,4 g /kg subkutan) . Alle Dosen in mg/kg .

V e r b i n d u n g L D s 0M a u sNr . in t r a - p e r o s

V0I]O3

M o r p h i n 2 0 0 : 1 0 0 0i 50 -z 5 0 5 0 0

5 0 -

4 50 !500

5 0 2 0 0a 50 I -7 5 0 5 0 08 50 i 100

1 0 0 -x o 2 5 2 0 011 2 5 i 4 0 01 2 t 0 2 5 013 5 0 1 0 014 1 25

K a n i n c h e n

mi t t l e r e L e ta ld o s i s Ve r min d . d eri u ich t vor - nark ot i - Atemfrequenz

beh and e l t s ie r t u rnS0% (nark .)

2 5 05 05 0

5 02 5

5 02 5

2 5> 5 0

2 55 0

0 ,5

1 , 0 0 , 52 5 , 0 1 0 , 02 5 , 0 1 0 , 02 5 , 0 k e i n e H e m -

m u n g0 , 5 0 , 2 51 , 0 0 , 2 5

5 0 , 0 0 , 5 01 0 , 0 2 ,5

O,25 0,17

1 0 , 0 5 , 00 , 5 0 , 2 50 , 2 0 , 1 00 , 1 0 , 0 2 50 , 0 2 5 0 , 0 1 00 , 0 0 2 5 0 , 0 0 0 5

e r r e i ch e n , w o b e i s i c h d i e w i r k s a m s t e n d e r b i s h e r d a r g e -

s t e l l t e n P r i t p a r a t e e r g a b e n .

V e r l a u f u n d D a u e r d e r W i r k u n g s i nd b e i d e n B e n z i m i d -

a z o l d e r i v a t e n i m a l l g e m e i n e n k f i r z e r a l s b e i M o r p h i n .

B e i t ~ ig l ic h er s u b k u t a n e r I n j e k t i o n a n d e r R a t t e n a h m

d i e a n a l g e t i s c h e W i r k u n g n a c h 8 - 1 0 T a g e n a b , s o d a s s e se r f o r d e r l i e h w a r , d i e D o s i s z u s t e i g e r n , u m e i n e n g l e i c h e n

E f f e k t z u e r r e i ch e n . D i es e G e w 6 h n u n g e n t s p r i c h t d e m

b e i A n w e n d u n g a n d e r e r A n a l g e t i k a a n d e r R a t t e u n d d e r

M a u s b e o b a c h t e t e n V e r h a l t e n .

D a s V e r g i f t u n g s b i ld d e r a n a l g e t i s c h s t a r k w i r k s a m e n

V e r b i n d u n g e n i s t a n d e r M a u s d u r c h V e r m i n d e r u n g d e r

A t e m f r e q u e n z , E r r e g u n g s s y m p t o m e , S c h w a n z p h / i n o -

m e n u n d i n S u b l e t a l d o s e n d u r c h K r a m p f e r s c h e i n u n g e n

c h a r a k t e r i s i e r t . D i e m i t t l e r e n L e t a l d o s e n l i eg e n fi ir d i e

m e i s t e n D e r i v a t e b e i i n t r a v e n 6 s e r G a b e z w i s c h e n 2 5 u n d

5 0 m g / k g , l e d i g l i c h b e i d e n V e r b i n d u n g e n N r . 1 2 u n d 74/

g e h t m i t d e r Z u n a h m e d e r W i r k u n g s i n t e n s i t i i t a u c h e in e

S t e i g e r u n g d e r T o x i z i t A t e i n h e r , w o b e i j e d o c h b e i V e r -

b i n d u n g N r . 1 3 u n d 1 4 d i e t h e r a p e u t i s c h e B r e i t e g r 6 ss e r

i s t a l s b e i d e n w e n i g e r w i r k s a m e n V e r b i n d u n g e n ( T a -

b e ll e I I ). A m K a n i n c h e n u n d a n d e r I R a t te i s t d a s W i r -

k u n g s b i l d n e b e n d e r A n M g e s ie d u r c h e i n e z u n e h m e n d e

S e d a t i o n b i s z u N a r k o s e s t a d i u m I / I I u n d M io s e c h a r a k t e -

r i s ie r t . D e r H u n d z e i g t ~ i h n li c h e S y m p t o m e w i e d a s K a -

n i n e h e n , w A h r e n d b e i d e r K a t z e E r r e g u n g s e r s c h e i n u n -

g e n u n d e b e n s o w i e u n t e r M o r p h i n e i n e M y d r i a s e a u f -

t r e te n . M i t d e r w i r k s a m s t e n V e r b i n d u n g N r . 7 4 w a r a m

H u n d m i t D o s e n y o n 0 ,0 01 m g / k g i n t r a v e n 6 s e i n e d e u t -

l i ch e V e r m i n d e r u n g u n d m i t 0 , 0 0 25 m g / k g e i n e v o i l e

A u f h e b u n g d e r S c h m e r z r e a k t i o n a u f K n e i f e n a m O h r z u

e r r e i c h e n ; g t e i c h z e i ti g t r a t S p e i c h e l f l u s s u n d b e i d e r

h 6 h e r e n D o s i s D u r c h f a l l a u f .A m n a r k o t i s i e r t e n T i e r i s t d i e T o x i z i t / i t e r h e b t i c h g e-

s t e i g e rt , d e r T o d e r f o l g t a n A t e m l i h m u n g ( T a b e t le I I ) .

B e i k i i n s t t i c h e r B e a t m u n g s i n d d a g e g e n d ie L e t a l d o s e n

u n g e f i h r g t e ic h w i e b e i m n i c h t n a r k o t i s i e r t e n T i e r . D i e

A t e m d e p r e s s i o n l ~i ss t s i ch d u r c h A n a l e p t i k a w i e C o r a m i n

o d e r ]3 e m e g r i d a u f h e b e n . D e r B l u t d r u c k d e s n a r k o t i -

s i e r t e n K a n i n c h e n s u n d d e r K a t z e w i rd d u r c h D o s e n ,

d ie z u e i n e r m i n d e s t e n s 5 0 p r o z e n t i g e n A b n a h m e d e r

A t e m f r e q u e n z f i i h r e n , n i c h t s i c h e r b e e i n f l u s s t , w ~ ih re nd

d ie H e r z f r e q u e n z u m e t w a 1 0 - 2 0 % a b n i m m t .

X h n l i c h w i e b e i M o r p h i n w a r e i n a n t i p y r e t i s c h e r Ef -

f e k t d e r s t a r k a n a l g e t i s c h w i r k e n d e n S u b s t a n z e n a m K a-

n i n c h e n g e g e n i i b e r d e r d u r c h B a k t e r i e n t o x i n e a us ge l6 s-

t e n T e m p e r a t u r s t e i g e r u n g n a e h w e i s b a r , j e d o c h e r st inD o s e n , d i e e i n M e h r f a c h e s d e r a n a l g e t i s c h e n S c hw e ll en -

d o s is b e t r a g e n u n d b e r e i t s d ie A t e m f r e q u e n z v e rm i n -

d e r n . D a s g l e ic h e g i lt f i ir d ie e n t z i i n d u n g s h e m m e n d e

W i r k u n g , d i e s i ch in e in e r g e r i n g e r e n 0 d e m b i l d u n g b ei

d e r S e n f 6 1 ch e m o s i s a m K a n i n c h e n a u g e o d e r n a e h I n-

j e k t i o n y o n D e x t r a n i n d i e R a t t e n p f o t e A u s se r t .

I m G e g e n s a t z z u M o r p h i n r u f e n d i e a n a l g e t i s c h w ir k-

s a m e n D e r i v a t e a m i s o l i e r t e n K a n i n c h e n d a r m k ei ne

T o n i s i e r u n g h e r v o r , s o n d e r n b e d i n g e n in K o n z e n t ra -

t i o n e n y o n 1 0 - 4 ( g / m l) e i n e A b n a h m e d e r P e n d e lb e w e -

g u n g e n . A m i s o l i e r t e n K a n i n c h e n u t e r u s f t i h re n d a ge g en

d i e m e i s t e n V e r b i n d u n g e n z u e i n e r a l le r d i n g s sc hw i ic he -

r e n T o n i s i e r u n g a ls M o r p h i n . S p e z i fi s c he s p a s m o l y t is c h e

E i g e n s c h a f t e n l i es s e n s i eh n i c h t n a c h w e i s e n .

D i e A u f f i n d u n g d i e se r n e u e n G r u p p e h o c h w i r k s a m e r

A n a l g e t i k a z e i g t, d a s s s y n t h e t i s c h e V e r b i n d u n g e n , f f ir

d i e s i c h a u f G r u n d d e r S t r u k t u r f o r m e l k e i n e V e r w a n d t -

s c h a f t z u m M o r p h i n m o l e k t i l m e h r e r k e n n e n l i i ss t, e in

q u a l i t a t i v s e h r A h n l i c h es G e s a m t w i r k u n g s b i l d w i e M o r-

p h i n h e r v o r r u f e n k 6 n n e n . D i e f i i r d i e S c h m e r z e m p f i n -

d u n g v e r a n t w o r t l i c h e n S u b s t r a t e d e s Z e n t r a l n e rv e n -

s y s t e m s l a s s e n s i ch s o m i t o f f e n b a r i n v e r h~ l t n i s m ii s si g

u n s p e z i f i s c h e r W e i s e a u s s e h a l t e n , u n d g l e i c h z e i t ig v er -

i t n d e r n d i e i n d i es e r H i n s i c h t w i r k s a m e n S u b s t an z e n

a u c h a n d e r e S u b s t r a t e ( A t e m z e n t r u m , v a g a l e Su b s tr a te )

i n i h r e r A k t i v i t ~ t . D i e T a t s a c h e , d a s s b i s h e r k e i n e s ta rk

w i r k e n d e n A n a l g e t i k a b e k a n n t g e w o r d e n s i n d , d e n e n zu -s A t z li c h e W i r k u n g e n a u f A t m u n g u n d b e s t i m m t e ze n-

t r a l e p a r a s y m p a t h i s e h e F u n k t i o n e n f e h l e n , s p r i c h t f i i r

e i n e A h n l i c h e O r g a n i s a t i o n d e r g l e i e h z e i t i g b e e in f l us s t en

Z e l l k o m p l e x e .

F . G R o s s u n d H . T UR RIA N

F o r s c h u n g s l a b o r a t o r i e n d e r C I B A A h t i en g e s el l sc h a f l,

P h a r m a z e u t i s c h e A b t e i l u n g , B a s e l , 2 6. A u g u s t 1 9 57 .

8/3/2019 Über Benzimidazolderivate mit starker analgetischer Wirkung [Benzimidazole derivatives with strong analgesic effec…

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[ 1 5. X . 1 9 5 7 ] K u r z e M i t t e i l u n g c n - B r i e f R e p o r t s 4 0 3

S u m m a r y

A n u m b e r o f b a s i c a l l y s u b s t i t u t e d b e n z i m i d a z o l e s

s h o w a s t r o n g a n a l g e s i c a c t i v i t y i n m i c e , r a t s , r a b b i t s ,

a n d do g s . Q u a l i t a t i v e l y t h e y a c t v e r y s i m i l a r l y t o

m o r p h i n e a n d c o r r e s p o n d i n g s y n t h e t i c a n a l g e t i c s a n d

t h e m o s t a c t i v e o f t h e s e c o m p o u n d s a r e q u a n t i t a t i v e l y

s u p e r i o r t o a l l a n a l g e t i c s h i t h e r t o d e s c r i b ed .

K i n e t i c s o f P e n i c i l l i n a s e A c t i v i t y

P e n i c i l l i n a s e , n e x t t o c a t a la s e , h a s o n e o f t h e h i g h e s t

t u r n o v e r n u m b e r s k n o w n ( 1. 48 × 1 0 ~ M o f s u b s t r a t e

h y d r o l y s e d p e r r a in a t 3 0 0 ) 1 . I t i s o f i n t e r e s t t h e n t o

d e t e r m i n e w h e t h e r M I C H A EL Is -M E N T E N k i n e t i c s a p p l i e s

i n t h i s i n s t a n c e .

R a t e o f h y d r o l y s i s o f b e n z y l p e n i c i l l i n b y p e n i c i l l i n a s e

f r o m B . s u b t i l i s ( c o m m e r c i a l p r e p a r a t i o n ; C o m m o n -

w e a l t h S e r u m L a b o r a t o r i e s , A u s t r a l i a ) h a s b e e n i n -

v e s t i g a t e d b y a s l i g h t m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f

W I SE a n d T W IG G 2. P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s h a v i n g

s h o w n t h a t t h e e f f e c t o f p o t a s s i u m c h l o r i d e in t h e r a n g e

o f c o n c e n t r a t i o n 0 . 0 0 2 - 0 . 0 8 M o n t h e r a t e w a s n e g l i g ib l e ,

a c o n s t a n t i o n i c s t r e n g t h o f 0 .0 2 m a i n t a i n e d b y p o t a s s i u m

c h l o ri d e w a s u s e d i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n .

R e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e r e a c t i o n f o l l o w s 1V [IC HA EL IS-

M E NT EN k i n e t i c s 3, a t l e a s t b e t w e e n c o n c e n t r a t i o n s o f

s u b s t r a t e 2 0 a n d 0 -2 t i m e s t h e a p p a r e n t M I CH A E LI S

c o n s t a n t K " . T h i s is e v i d e n t f r o m a p l o t ofm

( t + IS ] ) a g a i n s t l o g I S? .V"

( F i g . 1 ; w h e r e t i s t h e t i m e i n m i n u t e s , I S? i s t h e c o n -

c e n t r a t i o n o f p e n i c i l l i n r e m a i n i n g , a n d V ' i s t h e a p p a r e n t

m a x i m u m [ ze ro o rd e r ] v e l o c i t y e x p r e s s e d a s m o l e p e r

r a i n • 1 05 , a t 2 5 ° C , p H 6 - 58 a n d i o n i c s t r e n g t h 0 . 0 2 .)

T-..._

8 '0

5 ' 0

4 . 0

3. 0

& O

7 . o

0"57 Z

3 4 5 70 20 30405 0[S ] ( lo f t s c a l e ) --Fig, 1.

T ime d i f fe r e n ce p lo t ( se e t e x t f o r e x p la n a t io n ) .

1 M. R . POLLOCk, A. M . TORRIANI, n d E . J . TRIDGELL,B i o c h e m .J. ~2, 387 (1956).

2 ~V. S. WISE and G. H. TWIGG, Analyst 7a, 106 (1950).

3 L. MICHAELIS and M. L. MENaI~N, Biochem. Z. 49, 333 (1913).

L i n e a r i t y o f t h e t i m e d i f f e r e n c e

( t + [ S ] + V ' + c o n s t a n t ;

i .e . a c t u a l t i m e , l e s s t i m e c a l c u l a t e d f o r ze r o o r d e r k i n e -

t i c s) w i t h l o g E S] i s i n a c c o r d w i t h t h e r e l a t i o n s h i p

- - V ' " t = I S ? + K m" I n I S? + c o n s t a n to b t a i n e d o n i n t e g r a t i o n o f t h e M I C H A EL lS -M E N T E N r a t e

e q u a t i o n s

V a r i a t i o n w i t h p H o f t h e p a r a m e t e r s V " a n d K i n ', e s t i -

m a t e d b y L IN E W E A V E R -B U R K p l o t s 4 a n d c o r r e c t e d f o r

t h e s e c o n d d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f pe n i c il l o ic a c i d

p K A , , 5 "3 5 G, i s s u m m a r i s e d i n F i g u r e 2 . T h e s e r e s u l t s a r e

?5

2

7

# ×I

I

I xl

/

o ° o o ° o i t

~,~

- - - ~ - - - , 2 - ~ ' ~ ~

p l l - , ' -

Fig . ~ .

V a r i a t i o n o f t h e p a r a m e t e r s V a n d K i n ' w i t h p H .

10

l5

c o n s i s t e n t w i t h c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n o f t h e e n z y m e b y

h y d r o x y l i o n s i n v o l v i n g f u n c t i o n a l g r o u p s o f p K A " ~ 7 " 9 ,

a n d w i t h a n t i - c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n S i n v o l v i n g f u n c t i o n -

a l g r o u p s o f p K A ~ 8 "8 . C u r v e s s h o w n i n t h e F i g u r e r e -

p r e s e n t t h e e x p e c t e d v a r i a t i o n o f t h e p a r a m e t e r s

c a l c u l a t e d 7 o n t h i s b a s i s .

A t p H 7 .1 4 a n d i n t h e t e m p e r a t u r e r a n g e 2 2 ° t o 4 3 ° C ,

t h e p a r a m e t e r s V ' a n d K r a ' s h o w a v a r i a t i o n w i t h

t e m p e r a t u r e i n a c c o r d w i t h t h e A R RH E NIU S e q u a t i o n S :

- 5 7 0 0

V " = A e R T

a n d- - 700

K i n " = 1 " 4 6 × 1 0 - 4 e R T M

w h e r e R = 1 . 9 9 c a I p e r d e g r e e , a n d A "is a c o n s t a n t . A

s l i g h t d e v i a t i o n o b s e r v e d a t 4 7 ° m a y b e d u e t o p a r t i a l

i n a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e u n d e r t h e se c o n d i t io n s .

V a r i a t i o n o f t h e p a r a m e t e r s K r a ' a n d V ' w e r e l e ss t h a n

t h e e x p e r i m e n t a l e r r o r e i t h e r fo r a t h r e e f o l d d i l u t i o n o f

t h e e n z y m e o r f o r c h a n g e i n c o n c e n t r a t i o n o f t h e r e a c -

t i o n p r o d u c t s i n t h e r a n g e 3 × 1 0 - 4 - - 3 × 10 - 8 M .

4 H . L I N EW E A V E R a n d D . B U R Kp J , A m e r , c h e m . S o e . 5 6 , 6 5 8

( 1 9 3 4 ) .

5 R . M O Z IN G O a n d K . F O L K E R S , T h e C h e m i s t r y o / P e n i c i l l i n

(edito rs H. T. CLARKE, J . R. JOHNSOn, and R . ROBt~SON, Prin cet on,Univers i ty Press , 1949) , p . 573 .

6 W . A. RAWLINSON,Rev. pu re appl . C hem. 6 , 110 (1956).7 W . A. RAWLINSON,Rev. pure appL Chem. 6 , 118 (1956) .8 S . ARRHENIUS,Z. physical. Chem. 4, 226 (1889).

E x p e r . 2 6