universidad central del ecuador facultad de ciencias … · 2018. 7. 30. · del dengue,...
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i
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS
CARRERA DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y AMBIENTALES
RESISTENCIA DE Aedes aegypti (DIPTERA, CULICIDAE) A MALATIÓN,
TEMEFOS Y DELTAMETRINA INSECTICIDAS UTILIZADOS EN SALUD
PÚBLICA PARA EL CONTROL VECTORIAL EN LAS PROVINCIAS DE
SANTO DOMINGO DE LOS TSÁCHILAS-LA CONCORDIA Y
ESMERALDAS-QUININDÉ
Informe Final de Investigación presentado como requisito para optar por el
Título de Licenciado en Ciencias Biológicas y Ambientales
Autor: PAUL ANDRES QUINATOA TUTILLO
Tutor: DRA. SILVIA JESSICA GUARDERAS MUÑOZ
Quito, julio 2018
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Paul Andrés Quinatoa Tutillo en calidad de autor y titular de los
derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación Resistencia de
Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) a malatión, temefos y deltametrina
insecticidas utilizados en salud pública para el control vectorial en las
provincias de Santo Domingo de los Tsáchilas-La Concordia y
Esmeraldas-Quinindé, modalidad Proyecto de Grado, de conformidad con
el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS
CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedemos a favor
de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuita, intransferible
y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente
académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la
obra, establecidos en la normativa citada. Así mismo, autorizo a la
Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y
publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior. El autor declara que la obra objeto de la presente
autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho
de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier
reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
Firma:
Paul Andrés Quinatoa Tutillo
C.C.: 172003892-4
Dirección electrónica: [email protected]
iii
APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR PARTE DEL
TUTOR
Yo, Jessica Guarderas Muñoz, en calidad de tutor del trabajo de titulación
Resistencia de Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) a malatión, temefos y
deltametrina insecticidas utilizados en salud pública para el control
vectorial en las provincias de Santo Domingo de los Tsáchilas-La
Concordia y Esmeraldas-Quinindé, elaborado por el estudiante Paul
Quinatoa, estudiante de la Carrera de Ciencias Biológicas y Ambientales,
Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Central del Ecuador,
considero que el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el
campo metodológico y en el campo epistemológico, para ser sometido a
la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que
lo APRUEBO, a fin de que el trabajo investigativo sea habilitado para
continuar con el proceso de titulación determinado por la Universidad
Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito a los 28 días del mes de mayo del año 2018
Firma
Silvia Jessica Guarderas Muñoz
DOCENTE TUTOR
C.C.: 171655424-9
iv
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Dra. María Mercedes Gavilánez, Dra. Ana Soto
Vivas y Msc. Stefan Bruck.
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título (o grado académico) de Licenciado en Ciencias
Biológicas y Ambientales presentado por el señor Paul Andres Quinatoa
Tutillo.
Con el título:
Resistencia de Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) a malatión, temefos y
deltametrina insecticidas utilizados en salud pública para el control
vectorial en las provincias de Santo Domingo de los Tsáchilas-La
Concordia y Esmeraldas-Quinindé.
Emite el siguiente veredicto: Aprobado
Fecha: 18 de julio de 2018 Para constancia de lo actuado firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Presidente Dra. María Mercedes Gavilánez
Vocal 1 Dra. Ana Soto Vivas
Vocal 2 Msc. Stefan Bruck
v
AGRADECIMIENTO
Agradezco a Dios, a mi familia por todo su apoyo brindado en el trascurso
de mi carrera, los cuales han sido un pilar fundamental de motivación para
llegar cumplir todos mis objetivos.
Gracias a las instituciones que apoyaron la elaboración de este proyecto
la Universidad Central del Ecuador, Instituto Nacional de Investigación en
Salud Pública INSPI, Centro Nacional de referencia en vectores CRNV,
especialmente al Ing. Pablo Espinosa y Mgs. Diego Morales, por su
paciencia y amabilidad para la realización de este trabajo, así mismo a los
docentes y tutores por la labor y el apoyo que brindaron en la formación
profesional como biólogo.
Mis agradecimientos al personal del insectario, laboratorio de biología
molecular y colección de referencia quienes trabajaron y fueron guían
para cumplir el propósito de este estudio.
Muchas gracias a Diana Ulcuango, Jonathan Mora, Santiago Quinatoa y
Mili, quienes de una u otra manera supieron brindar su apoyo emocional y
académico para culminar este trabajo.
vi
INDICE GENERAL
LISTA DE TABLAS ....................................................................................................... vii
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... viii
LISTA DE ANEXOS ....................................................................................................... ix
RESUMEN ....................................................................................................................... x
ABSTRAC ....................................................................................................................... xi
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
METODOLOGIA .............................................................................................................. 6
ÁREA DE ESTUDIO ................................................................................................... 6
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................................ 7
POBLACIÓN Y MUESTRA ........................................................................................ 7
MÉTODOS ................................................................................................................... 8
PLAN DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...................................................................... 13
RESULTADOS .............................................................................................................. 14
DISCUSIÓN ................................................................................................................... 22
CONCLUSIONES .......................................................................................................... 28
RECOMENDACIONES ................................................................................................ 29
LITERATURA CITADA ................................................................................................. 30
ANEXOS ......................................................................................................................... 41
vii
LISTA DE TABLAS
TABLA pág.
1. Puntos de muestreo localidades de estudio 7
2. Primers mutación Phe1534Cys 12
3. Primers mutación Val1016Ile 13
4. Análisis a deltametrina La Concordia 14
5. Análisis a deltametrina Quinindé 15
6. Análisis a malation La Concordia 15
7. Análisis a malation Quinindé 16
8. Análisis a temefos La Concordia 16
9. Análisis a temefos Quinindé 17
10 Factor de resistencia Quinindé y La Concordia 18
11. Frecuencias alélicas Quinindé y La Concordia 20
viii
LISTA DE FIGURAS
FIGURA pág.
1. Mutaciones del canal de voltaje de sodio 5
2. Ubicación geográfica de las localidades de La Concordia y Quininde 7
3. Curvas de amplificación mutaciones V1534C y V1016I 19
4. Frecuencia alélica F1534C localidades de La Concordia y Quininde 21 5. Frecuencia alélica V1016I localidades de La Concordia y Quininde 21
ix
LISTA DE ANEXOS
ANEXO pág.
1. Colecta y trasporte de muestras biológicas 40
2. Manejo de estadios inmaduros de Ae. aegypti 40
3. Preparación de alimentación sanguínea por
sistema de membrana 41
4. Alimentación de colonias por el sistema
Sistema Hemoteck 41
5. Instalación de ovitrampa 42
6. Almacenamiento de huevos de Ae. aegypti 42
7. Protocolo de resistencia en larvas OMS 46
8. Protocolo de resistencia en adultos CDC 50
9. Protocolo de extracción de DNA 60
x
TEMA: RESISTENCIA DE Aedes aegypti (DIPTERA, CULICIDAE) A
MALATIÓN, TEMEFOS Y DELTAMETRINA INSECTICIDAS
UTILIZADOS EN SALUD PÚBLICA PARA EL CONTROL VECTORIAL
EN LAS PROVINCIAS DE SANTO DOMINGO DE LOS TSÁCHILAS-LA
CONCORDIA Y ESMERALDAS-QUININDE
RESUMEN
El uso de insecticidas organofosforados y piretroides se han convertido en
la principal herramienta utilizada para el control vectorial. En la presente
investigación se determinó la resistencia a insecticidas en poblaciones de
Aedes.aegypti Linnaeus, 1762, (Díptera, Culicidae) en las localidades de
La Concordia y Quinindé. Se aplicó la metodología de la botella
impregnada propuesta por el Centro de Control y Prevención de
enfermedades, con los insecticidas malatión y deltametrina en mosquitos
adultos en los cuales se encontró riesgo de resistencia con 94% de
mortalidad y resistencia confirmada con un valor de 7,5% para el
insecticida deltametrina en cada población respectivamente; además con el
insecticida malatión se registró el riesgo de resistencia con una mortalidad
de 94% y 88,75%. Para la evaluación de resistencia en larvas con el
insecticida temefos se aplicó la metodología de la Organización Mundial de
la Salud en la que resulto la resistencia moderada (RR50 5,24 y 6,37) para
La Concordia y Quinindé. Además, se realizó la identificación de las
mutaciones F1534C con frecuencias alélicas (Cys 1534) de 0,45 y 0,56 en
cada localidad. En la identificación de la mutación V1016I se registró
únicamente el homocigoto (Ile/Ile). La presencia de estas mutaciones
estaría vinculada con la resistencia a piretroides, debido a la presión
ejercida por el insecticida y la resistencia cruzada con el DDT.
PALABRAS CLAVE: Piretroides, organofosforados, resistencia, Aedes
aegypti. Mutaciones, kdr
xi
RESISTANCE OF Aedes aegypti (DIPTERA, CULlCIDAE) TO
MALATIÓN, TEMEFOS AND DELTAMETRINA, INSECTICIDES USED
BY PUBLlC HEALTH AGENCIES TO CONTROL VECTORS IN
SANTO DOMINGO DE LOS TSÁCHILAS-LA CONCORDIA AND
ESMERALDAS-OUININDE PROVINCES
ABSTRAC
The use of organ phosphorus and pyrethroid insecticides has become the
main tool used for vector control. In the current investigation, the
resístance to tnsectícides by populations of Aedes aegypti Linnaeus,
1762, (Díptera, Culicidae) was found in La Concordia and Ouinindé. The
methodology of the impregnated bottle proposed by the Centro de Control
y Prevención de Enfermedades was used, containing malatión and
deltametrina for adult mosquitos, where a resistance risk was found, with
94% mortality and confirmed resistance, accounting for 7.5% for
deltametrina insecticide in each population, respectively. Regarding
malatión, a resistance risk was found with 94% and 88.75% mortality. To
assess resistance in larvae with temefos insecticide, the methodology
provided by the World Health organization was used, where a moderate
resistance was found (RR50 5.24 and 6.37) in La Concordia and
Ouinindé. Additionally mutations F1534C were identified with allelic
frequencies (Cys 1534) of 0.45 and 0.56 in each locality. In the
identification of mutation V10161 only homozygote (lIe/lle) was found. The
occurrence of such mutations would be related to the resistance to
pyrethroids, due to pressure exercised by insecticide and crossed
resistance of DDT.
KEYWORDS: Pyrethroid, organ phosphorus, resistance, Aedes aegypti
mutations, kdr
I CERTIFY that the above and foregoing is a true and correct translation of the
original document in Spanish
_________________ Name: Certified Traslator: ID:
1
INTRODUCCIÓN
Aedes aegypti (Linnaeus 1762) es catalogado como el principal vector del
virus del dengue y de otras enfermedades arbovirales como el zika,
chikungunya y fiebre amarilla (OMS, 2015). Según datos del Ministerio de
Salud Pública, se ha estimado que aproximadamente el 70% del territorio
nacional presenta las condiciones adecuadas para la distribución del
vector, con una mayor tendencia en la región litoral (PUCE, 2011; MSP,
2013). Esta distribución se debe a variables como las fluctuaciones
demográficas, cambios de temperatura y el aumento de precipitaciones
(López & Neira, 2016), convirtiéndose en factores de riesgo para el
desarrollo del vector lo que a su vez incrementa la carga de trasmisión de
la enfermedad y su persistencia continua, en países ecuatoriales (Colon et
al, 2013). En el año 2017 se han registrado un total de 9.389 casos de
dengue en las provincias de Manabí, Guayas, Santo Domingo de los
Tsáchilas, El Oro y Esmeraldas (MSP, 2017).
El dengue es una enfermedad infecciosa arboviral distribuida en regiones
tropicales y subtropicales, se trata de un virus de ARN pequeño
monocatenario perteneciente al género Flavivirus, familia Flaviviridae el
cual presenta cuatro distintos serotipos (DEN-1 a DEN -4), por lo que
destaca su extensa variabilidad genética (OPS, 2010). En Ecuador se han
registrado la presencia de los cuatro serotipos antigénicamente del virus
del dengue, registrando el primer brote epidémico de dengue clásico
(DEN1) en 1988 en la ciudad de Guayaquil.
A partir de entonces las diferentes zonas de la costa ecuatoriana, valles
subtropicales de la sierra y la amazonia han sido afectados por diferentes
brotes epidémicos (Terán et al, 2012; MSP, 2013).
Al no encontrarse disponible la aplicación de vacunas que protejan contra
el dengue, así como de un tratamiento específico y efectivo contra la
enfermedad, el control de vectores es la herramienta utilizada para
2
prevenir la transmisión viral (CENAPRECE, 2014). En el Ecuador se han
tomado como medida preventiva varias estrategias de control, realizando
la aplicación de insecticidas organofosforados de acción residual, el uso
de insecticidas piretroides en fumigaciones y la erradicación de criaderos
potenciales dentro de viviendas (MSP, 2015). Entre los años 1957 a 1999
se realizaba la aplicación del insecticida DDT (organoclorado dicloro
difenil tricloroetano) en fumigaciones intradomiciliarias con la finalidad de
fortalecer el control de la malaria y la erradicación del mosquito Ae.
aegypti (Echeverría, 2013), sin embargo, al ser un compuesto altamente
tóxico y perjudicial para la salud se prohibió su uso en fumigaciones
dentro del país (MSP, 2015). Actualmente se realiza la aplicación del
piretroide deltametrina en concentraciones de 2.5% y 5%, el cual es
empleado de forma intradomiciliar de manera rotatoria con el
organofosforado malation para controlar las poblaciones de Ae. aegypti
(MSP, 2015).
En el año de 1972, Ae aegypti había sido erradicado en 19 países
(Gubler, 1989), sin embargo, en el mismo año se registró la resistencia al
DDT y fue reconocido como un problema en las estrategias de control
vectorial (Brown & Pal, 1971). Según la Organización Mundial de la Salud
(OMS) define a la resistencia a insecticidas como la capacidad que tienen
los insectos para sobrevivir a la exposición de una dosis estándar de
insecticida, debido a la adaptación fisiológica o de comportamiento (OMS,
2018). Genéticamente la resistencia, se encuentra caracterizada por el
aumento en las frecuencias alélicas de una población, que surgen como
resultado directo de los efectos de presión del insecticida (Braga & Valle,
2007).
Los primeros indicios de resistencia en el Ecuador se registraron en la
localidad de Pascuales, provincia del Guayas en el cual se reportó la
resistencia a temefos en larvas de Ae. aegypti con un factor de resistencia
3
moderado (RR50 9,2), causado por el incremento de 0,6/1 en la actividad
enzimática de esterasas inespecíficas (Terán, 2012).
Existen dos mecanismos principales que contribuyen al desarrollo de la
resistencia: el mecanismo metabólico y la insensibilidad del punto de
acción. La resistencia metabólica se basa en la síntesis de enzimas
desintoxicantes y se encuentran involucrados tres principales grupos: las
enzimas monooxigenasas del citocromo P450, esterasas y glutatión S-
transferasas (Saingamsook et.al, 2017). La insensibilidad del punto de
acción consiste en un cambio pequeño del lugar donde se fija el
insecticida e impide su acción toxica, produciendo la reducción y el
impedimento de la función primaria y así producir un factor de resistencia
elevado (Bielza, 2005). Uno de los mecanismos de insensibilidad del
punto de acción es la resistencia knockdown (kdr), la cual es un
mecanismo que altera los sitios blancos de acción y produce la reducción
de sensibilidad de los insecticidas (Hemingway & Ranson, 2000).
La resistencia kdr se ha asociado con mutaciones no sinónimas en el
canal de sodio dependiente de voltaje (VGSC), y sucede cuando un
aminoácido resultante disminuye la unión del insecticida, sin causar una
pérdida de la función primaria del sitio blanco (Bobadilla, 2010). El canal
de sodio dependiente de voltaje es una proteína de transmembrana
presente en los axones neuronales y está compuesta por cuatro dominios
homólogos (I-IV), cada uno con seis segmentos hidrofóbicos (S1-S6)
(Figura 1), en insectos, solo se encuentra presente un gen de VGSC (Brito
et al. 2013). El gen del canal de sodio, llamado también gen Aa-para
efecto de parálisis en Ae. aegypti, consta de un ORF de 6441 pares de
bases al menos en la región transcrita más larga, la cual codifica 2.147
residuos de aminoácidos con un peso molecular estimado de 241 kD;
presenta alrededor de 33 exones abarcando 293 kb, cuyo transcrito esta
modulado por splicing alternativo (Chang et al., 2009; Murcia, 2015). Las
mutaciones que causan resistencia se encuentran comúnmente en la
región del dominio II (entre el enlazador IIS4-5 y IIS6) de la proteína
4
VGSC (Murcia, 2015). Las mutaciones kdr juegan un papel primordial en
fenotipos resistentes a piretroides y estas mutaciones son no sinónimas,
lo que significa la sustitución de uno de los aminoácidos por otro y
posteriormente las proteínas resultantes (Murcia, 2015). La alteración del
aminoácido se presentan en tres loci diferentes por una transición Iso1011
(I→M/V), Val1016 (V→G/I) en el dominio II y F1534 (F→C) en el dominio
III (Murcia, 2015). La combinación de estas mutaciones presentan un
efecto sinergista sobre la perdida de la susceptibilidad, afectando la
sensibilidad de los canales de sodio (SupYoon et al., 2008), lo que indica
que la interacción entre mutaciones tiene un papel importante para la
comprensión de resistencia a piretroides (Liu, 2015).
El uso prolongado de insecticidas piretroides en los programas de control
se ha considerado como la causa del incremento en los mecanismos de
resistencia y el aumento en las frecuencias alélicas kdr (Saingamsook
et.al, 2017). Varios países de Latinoamérica como Colombia, Brasil,
México y Bolivia (Li et al., 2015), han reportado mutaciones asociadas con
los genes de resistencia en las posiciones de Ae aegypti I1011M/V,
V1016G/I, F1534C (Saavedra et al., 2008).
5
Figura 1. Representación gráfica de la ubicación de las mutaciones
asociadas con resistencia a piretroides en los canales de sodio (VGSC).
Se enumeran los 4 dominios homólogos en números romanos (I-IV) y los
segmentos hidrofobicos se encuentran enumerados de 1 a 6 (S1-S6),
unidos por los p-loops linkers. Adaptado de Liu, 2015
Los ensayos biológicos se han diseñado como una herramienta de
vigilancia para detectar la presencia de resistencia a insecticidas en
poblaciones de vectores. La aplicación de esta metodología proporciona
una evidencia inicial de que un insecticida está perdiendo su efectividad
en una población, y debería ser considerada como una metodología de
monitoreo rutinaria, aun antes de que un insecticida sea escogido para el
control vectorial (Brogdon & Chan, 2010). El conocimiento del estado de
resistencia y sus mecanismos subyacentes son los primeros pasos para
realizar una evaluación de los insecticidas aplicados, en poblaciones de
mosquitos en campo (Brito et al, 2013). Por lo que es indispensable que
las decisiones sobre el uso de insecticidas sean apoyadas en información
técnica y científica (CENAPRECE, 2014).
A partir de los resultados de bioensayos se pueden desarrollar estrategias
operacionales de campo, estratificadas, participativas, complementarias,
rotatorias y sostenibles para incrementar la eficacia de las intervenciones
vectoriales y evitar una mayor propagación de la resistencia (MSAL, 2016;
MSP, 2015).
En el Ecuador debido al alto número de casos reportados por dengue así
como la falta de información sobre el estado de resistencia y/o
susceptibilidad de Ae. aegypti, se vuelve fundamental conocer las
condiciones que presentan las poblaciones de mosquitos a los
insecticidas aplicados (OMS, 2017), teniendo en cuenta que el
diagnóstico oportuno de la resistencia es recomendable antes de iniciar la
aplicación de insecticidas para el control vectorial. (Hemingway & Ranson,
2000). Los objetivos de este estudio fueron determinar la resistencia y/o
susceptibilidad de Ae. aegypti a los insecticidas temefos, malatión y
6
deltametrina en las localidades de La Concordia y Quinindé; además de la
identificación de la presencia de las mutaciones V1016I y F1534C en el
gen del canal de voltaje de sodio que confiere la resistencia a piretroides.
METODOLOGIA
ÁREA DE ESTUDIO
Para la presente investigación se estudiaron dos poblaciones de Ae.
aegypti, una de La Concordia provincia de Santo Domingo de los
Tsáchilas y otra de Quinindé provincia de Esmeraldas (ver Figura 2).
Figura 2. Ubicación geográfica de Santo Domingo de los Tsáchilas-La
Concordia y Esmeralda-Quinindé.
Se realizó la colecta de larvas de Ae aegypti en 10 sitios dentro de la zona
urbana para cada localidad, realizando visitas domiciliares y revisando
recipientes de uso doméstico (ver Tabla N 1)
7
Tabla N 1. Puntos geográficos de muestreo en las localidades de
Quinindé y la Concordia
Localidad Ubicación GPS (UTM)
Localidad Ubicación GPS (UTM)
Longitud Latitud Longitud Latitud
Quinindé -79,472,012 0.325362 La Concordia
-79,387,866 0.000215
Quinindé -79,465,665 0.329472 La Concordia
-79,388,773 0.012729
Quinindé -79,465,759 0.330740 La Concordia
-79,388,205 0.013262
Quinindé -79,472,894 0.321881 La Concordia
-79,387,746 0.014231
Quinindé -79,473,349 0.320940 La Concordia
-79,391,616 0.008984
Quinindé -79,474,362 0.321395 La Concordia
-79,386,905 0.014457
Quinindé 79,478,177 0.321861 La Concordia
-79,390,681 0.006303
Quinindé -79,477,734 0.321692 La Concordia
-79,391,704 0.007371
Quinindé -79,467,010 0.332833 La Concordia
-79,392,012 0.008037
Quinindé -79,466,381 0.333532 La Concordia
-79,392,504 0.007736
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
Con la finalidad de evaluar la resistencia a malation temefos y
deltametrina en poblaciones de Ae. aegypti se utilizó un bioensayo in vito,
POBLACIÓN Y MUESTRA.- La población del presente estudio estuvo
conformada por individuos Ae. aegypti localizados en Esmeraldas-
Quinindé y Santo Domingo de los Tsáchilas-La Concordia.
Se realizó el cálculo de individuos para la realización de cada bioensayo
como lo recomienda en el protocolo de la OMS y CDC, determinando un
total de 750 individuos (OMS, 2016; Brogdon & Chan, 2010). Se realizó la
exposición a insecticidas con 125 individuos para cada insecticida
(deltametrina y malation) y 500 individuos para la evaluación en temefos.
El análisis molecular se realizó con 30 individuos de la localidad de La
Concordia y 40 individuos para Quinindé, provenientes de la evaluación
del insecticida deltametrina
8
MÉTODOS
Mantenimiento de colonias
Las muestras fueron transferidas en envases plásticos para su transporte
al Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública “Dr. Leopoldo
Izquieta Pérez” (INSPI) (ver Anexo 1). El mantenimiento de inmaduros de
Ae. aegypti se realizó en el insectario del Centro de Referencia Nacional
de Vectores (CRNV) utilizando bandejas plásticas para cada localidad (ver
Anexo 2). Se realizó la separación de larvas con 500 individuos por
bandeja en agua reposada y se proporcionó una cantidad alimenticia
diaria de 0,4 mg de balanceado de conejo acompañado de una fuente
proteica de solución de hígado en polvo (DifcoTM). Cuando las larvas
pasaron a estadio de pupa, fueron trasferidas a vasos plásticos de 500 ml
hasta la obtención de los adultos, los cuales fueron identificados utilizando
la clave de Culicidologia medica (Forattini, 2002), previamente a la
formación de colonias de Ae. aegypti (generación F0).
Los mosquitos adultos se mantuvieron en jaulas de 30cm x 30 cm y
fueron alimentados con sangre de bobino mediante el sistema de
alimentación sanguínea por membrana Hemoteck (PS6 Power Unit) (ver
Anexo 3,4). La colonia se mantuvo con una solución azucarada al 10% la
cual era colocada diariamente y retirada 5 horas antes de la alimentación
sanguínea. Después de las 48 horas de alimentación se colocó dentro de
las jaulas contenedores de ovoposición (Pyrex 100 x 500 N° 3140)
cubiertos en el interior con papel filtro y cubierto con 50 ml de agua
reposada durante 48 horas (ver Anexo 5). Los huevos obtenidos fueron
etiquetados para cada localidad y secados en una incubadora a 28°C
para su posterior almacenamiento (ver Anexo 6). Cuando se obtuvo la
cantidad suficiente de huevos se procedió a realizar la eclosión
(generación F1) en agua reposada, colocando 1500 ml de agua a una
temperatura de 26°C ± 2.
Las condiciones del insectario se mantuvieron a una temperatura de
26±2°C, humedad relativa entre los 60±5% con un fotoperiodo de 12
horas.
9
Bioensayo con larvas de Ae aegypti
La evaluación de susceptibilidad y/o resistencia en larvas de Ae. aegypti
fue llevada a cabo con el Kit de evaluación en temefos diseñado por la
Organización mundial de la Salud OMS (OMS, 2016) (ver Anexo 7). Se
utilizaron cuatro concentraciones de 0.625 ppm, 0.125 ppm, 0.025 ppm y
0.005ppm, donde fueron expuestas 25 larvas de tercer estadio tardío de
la generación F1 realizando 4 repeticiones por cada dosis en cada
localidad.
Se emplearon 4 vasos de precipitación de 500 ml para cada
concentración en los cuales se colocó 1 ml de concentración de
insecticida diluido en una cantidad de 249 ml agua reposada, además se
realizó un grupo control se utilizando una solución de etanol. Las
muestras se mantuvieron cubiertas con una tela tipo tul a una temperatura
de 27±2°C en una cámara de cría, una vez completado el tiempo de
exposición de 24 horas se pudo analizar los resultados con el conteo del
número de larvas muertas y vivas
El resultados de los bioensayos en larvas fueron procesados mediante el
programa Probit-logaritmo de Raymond (Raymond, 1985).
Se obtuvo el valor del factor de resistencia (RR), a partir de la
concentración letal que causo el 50% de la mortalidad para cada
población (DL50). El valor se obtuvo al dividir la DL50 de la población de
estudio, sobre la DL50 de la cepa susceptible Rockefeller. El valor del
factor de resistencia, nos permitió caracterizar las poblaciones de acuerdo
al criterio propuesto por Hemingway & Ranson, 2005 como: alta
resistencia cuando el valor es superior a 10 (FR> 10), moderada
resistencia cuando el valor de FR cae entre 5 y 10; y, susceptibilidad
cuando el valor es menor a 5 (FR< 5).
10
Bioensayo con adultos de Ae aegypti
La susceptibilidad y/o resistencia de Ae. aegypti en adultos se determinó
mediante el método de la botella impregnada, metodología propuesta por
el Centro de Prevención y Control de Enfermedades (CDC) (Brogdon &
Chan, 2010) (ver Anexo 8). Fueron utilizados mosquitos hembras criados
en el insectario de 3-5 días de edad en cada una de las localidades, las
cuales fueron alimentadas con una solución azucarada al 10%. Se
emplearon botellas Wheaton de boca angosta de 250 ml de capacidad
con tapa rosca, con un total de 5 botellas para cada bioensayo (4
repeticiones y un grupo control), colocando en cada botella 1ml de la
dosis diagnostica de cada insecticida (Deltametrina 10,45ppm - Malation
55 ppm), correspondientemente para cada bioensayo. Según el protocolo
de la CDC la dosis diagnóstica de un insecticida es aquella que mata el
100 % de mosquitos susceptibles expuestos en un tiempo determinado,
en el caso de Ae aegypti el tiempo diagnóstico para ambos insecticidas es
de 30 min (Brogdon & Chan, 2010). Como solución de control se utilizó
una botella impregnada con 1 ml de etanol absoluto para la evaluación de
cada insecticida. Dentro de cada botella se utilizó una cantidad de 20 a 25
mosquitos y se registró la mortalidad de los individuos cada 15 minutos,
desde el tiempo 0, durante dos horas.
Las soluciones de dosis diagnostica (DD) de malation y deltametrina
fueron proporcionadas por el laboratorio de resistencia del Centro de
Referencia Nacional de Vectores del INSPI. Para el análisis de resultados
se utilizó como criterio de mortalidad a los mosquitos que presentaron
incapacidades motoras para volar o mantenerse en pie. Una vez
completado el tiempo de exposición, se realizó la selección de individuos
resistentes y susceptibles para ser transferidos a contenedores de
recuperación con torundas de sacarosa al 10%.
La resistencia y/o susceptibilidad al insecticida se evaluó en términos de
porcentaje de mortalidad observada en la aplicación de cada bioensayo,
siendo la unidad de análisis cada réplica realizada. Se asumieron los
11
parámetros de la CDC para el diagnóstico de susceptibilidad a los
insecticidas en artrópodos vectores: cuando la mortalidad fue superior al
98%, se diagnosticó susceptibilidad al insecticida, cuando la mortalidad
osciló entre 80% y 97%, se consideró como población en riesgo de
resistencia y cuando la mortalidad fue menor al 80% se consideró como
resistencia al insecticida (Brogdon & Chan, 2010).
Extracción de ADN de mosquitos y qPCR Sybr Green® para las
mutaciones del gen VGSC
Se utilizó el kit Qiagen Blood and Tissue para la extracción de ADN a
partir de un mosquito completo (DNeasy, 2006) (ver Anexo 9). Se realizó
el genotipado para las posiciones V1016I y F1534C del (VGSC) a partir de
ADN de 70 mosquitos individualmente; se procesaron 30 individuos para
la localidad de La Concordia y 40 individuos para la localidad de Quinindé.
Debido a la baja variabilidad en cuanto al porcentaje de mosquitos
resistentes entre cada localidad, se realizó un muestreo no probabilístico
por conveniencia, seleccionando una muestra de 30 individuos, para la
localidad de La Concordia. Adicionalmente para la localidad de Quinindé
se obtuvo una muestra de 40 individuos, considerando a 10 Individuos
como resistentes. La selección fue realizada con el fin de mantener un
análisis homogéneo entre localidades.
Se realizó la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real con
Sybr® Green (qPCR) para el exón 31 del gen, que codifica para el
segmento transmembrana 6 del dominio III en el sitio 1534 (Phe/Cys) del
(VGSC), utilizando el siguiente set de Primers (Harris, Rajatileka, y
Ranson, 2010) (ver Tabla N. 2)
12
Tabla N 2. Secuencia de cebadores correspondientes para la mutación
1534 (Phe / Cys)
Mutación Primers Dirección Secuencia
Phe 1534
Cys
AaEx31P Forward TCGCGGGAGGTAAGTTATTG
AaEx31Q Reverse GTTGATGTGCGATGGAAATG
AaEx31wt Forward CCTCTACTTTGTGTTCTTCATCATCTT
AaEx31mut Reverse GCGTGAAGAACGACCCGC
La amplificación se llevó acabo que con un volumen final de 25 (µL) que
contenían 12.5 (uL) Master Mix (FastStart Essential DNA Green Master®),
1 (µL) primer forward, 1 (µL) primer reverse, 5,5 (µL) H2O grado molecular
y 5 (µL) de solución DNA. Cada reacción fue realizada por separado bajo
las condiciones de amplificación descritas.
El perfil térmico consistió en una etapa inicial de desnaturalización a 94 °C
durante 540 segundos, seguida por 35 ciclos de alineamiento a 94° C
durante 30 seg, 60°C durante 40 seg y 72ºC durante 45 seg; a
continuación, un ciclo 1 de extensión por 72ºC durante 10 seg, 60°C
durante 1 min, 97ºC durante 1 seg. Finalmente 1 ciclo de enfriamiento
durante 30 segundos a 37°C.
La amplificación de la región del dominio II en el segmento VI para la
posición 1016 a partir de ADN genómico se realizó con la siguiente set de
primers (Linss et al., 2014) (ver Tabla N. 3)
13
Tabla N 3. Secuencia de cebadores correspondientes para la mutación
1016 (Val / Ile)
Mutación Primers Dirección Secuencia
Val 1016
Ile
1016Val Forward GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGGGCCACA
AATTGTTTCCCACCCGCACCGG
1016Ile Forward GCGGGCACAATTGTTTCCCACCCGCACTGA
1016 Ile
commom
Reverse GGATGAACCGAAATTGGACAAAAGC
Cada reacción tenía una concentración total de 25 (µL) que contenía Go
Taq Green (12,5 µL), Primer 1016 forward (1 µL), Primer 1016 reverse (1
µL), H2O (5,5 µL) y muestra DNA (5 µL).
El perfil térmico consistió en una etapa inicial de desnaturalización a 94 °C
durante 540 segundos, seguida por 30 ciclos de alineamiento a 94 °C,
54°C y 72°C durante 30´, 40´ y 45´ segundos correspondientemente; una
extensión a 72 °C durante 45 segundos y una etapa final de extensión a
72 °C durante 600 segundos.
En cada serie de PCR se incluyó un control negativo constituido por agua
estéril en lugar de ADN, con el fin de establecer la presencia de
contaminación. Los análisis de reacción de amplificación se realizaron en
un sistema de PCR en tiempo real (LightCycler® 96 Real-Time PCR
System).
PLAN DE ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Una vez recopilada la información se procedió a levantar una base de
datos para su análisis con el software STATGRAPHICS Centurion XVI (V:
16.1.03) y IBM® SPSS® (V: 24.0.0). Con la finalidad de determinar la
normalidad de los datos se aplicó la prueba de normalidad de Shapiro-
14
Wiilk. Para el análisis inferencial se usó la prueba de U de Mann Whitney
para diferenciar entre las frecuencias tipo salvaje y mutante de cada
población. La prueba de Hardy Weinberg fue aplicada para verificar si la
población se encuentra en equilibrio génico mediante el x2
RESULTADOS
Evaluación de la resistencia-susceptibilidad a deltametrina
La exposición del insecticida en la localidad de La Concordia en respuesta
al tiempo diagnóstico (30min) presento una mortalidad del 94%,
determinando la posibilidad resistencia al piretroide deltametrina (ver
Tabla N 4). Al finalizar el tiempo de exposición (60 min), la mortalidad fue
del 100%.
Tabla N 4. Análisis de evaluación de botella impregnada para el piretroide
deltametrina en la localidad de La Concordia-Santo Domingo de los
Tsáchilas.
La Concordia
Tiempo Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 4 % de
mortalidad Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos
0 min 0 25 0 25 0 25 0 25 0
15 min 3 22 1 24 3 22 1 24 8
30 min 24 1 24 1 22 3 24 1 94
45 min 24 1 24 1 25 0 24 1 97
60 min 25 0 25 0 25 0 25 0 100
En la localidad de Quinindé se registró una mortalidad de 7,5% en
respuesta al tiempo diagnóstico de 30 min, lo que indica que la población
analizada es resistente al piretroide deltametrina. Al finalizar el tiempo de
15
exposición del bioensayo la mortalidad de los individuos fue de 46,25%
(ver Tabla N 5).
Tabla N. 5. Análisis de evaluación de botella impregnada para el
piretroide deltametrina, localidad Quinindé-Esmeraldas
Quinindé
Tiempo Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 4 % de
mortalidad
Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos
0 min 0 20 0 20 0 20 0 20 0
15 min 0 20 0 20 0 20 0 20 0
30 min 2 18 1 19 1 19 2 18 7,5
45 min 2 18 4 16 4 16 5 15 18,75
60 min 9 11 10 10 9 11 9 11 46,25
Evaluación de la susceptibilidad a malation
Los resultados obtenidos a la exposición del organofosforado malation en
la localidad de La Concordia, fue del 94% en respuesta al tiempo
diagnostico (30 min), lo que indica la posibilidad de resistencia en la
población evaluada (ver Tabla N 6). Al finalizar la exposición del
insecticida la mortalidad fue del 100%
Tabla N 6. Análisis del factor de resistencia para malation la localidad de
la Concordia
La Concordia
Tiempo Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 4 % de
mortalidad Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos
0 min 2 23 0 25 0 25 0 25 2
15 min 5 20 3 22 2 23 1 24 11
30 min 24 1 23 2 23 2 24 1 94
45 min 25 0 25 0 25 0 25 0 100
60 min 25 0 25 0 25 0 25 0 100
16
El resultado de la exposición al organofosforado malation la localidad de
Quinindé demuestra una mortalidad del 88,75%, en respuesta al tiempo
diagnóstico (30 min), lo que indica que la población muestra posibilidad de
resistencia al insecticida aplicado (ver Tabla N. 7) Al finalizar el bioensayo
se registró un 100% de la mortalidad de los individuos.
Tabla N 7. Análisis de evaluación de botella impregnada para malation,
localidad Quinindé
Quinindé
Tiempo de
exposición
Replica 1 Replica 2 Replica 3 Replica 4 % de
mortalidad Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos Muertos Vivos
0 min 0 20 0 20 0 20 0 20 0
15 min 1 19 0 20 0 20 0 20 1,25
30 min 18 2 17 3 18 2 18 2 88,75
45 min 20 0 20 0 19 1 20 0 98,75
60 min 20 0 20 0 20 0 20 0 100
Evaluación de la susceptibilidad a temefos
El organofosforado temefos fue probado en poblaciones de Ae. aegypti en
la localidad de La Concordia, obteniendo como resultados del bioensayo
una mortalidad de 33.75%, en respuesta a la dosis diagnostica (0,025
ppm) (ver Tabla 8)
Tabla N 8. Análisis de evaluación de temefos para localidad de La
Concordia.
La Concordia
0,625 ppm 0,125 ppm 0,025 ppm 0,005 ppm
Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
Replica 1 20 0 18 2 6 14 0 20
Replica 2 20 0 20 0 7 13 0 20
Replica 3 20 0 19 1 6 14 0 20
17
Replica 4 20 0 19 1 8 12 0 20
Total 80 0 76 4 27 53 0 80
% de
mortalidad
100 95 33,75 0
La exposición del organofosforado temefos en la localidad de Quinindé,
muestra una mortalidad del 23,75% en respuesta a la dosis diagnóstica
(0,025 ppm), lo que indica que la población es resistente al insecticida
aplicado (ver Tabla N. 9).
Tabla N 9. Análisis de evaluación de temefos para localidad de Quinindé.
Quinindé
0,625 ppm 0,125 ppm 0,025 ppm 0,005 ppm
Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas Muertas Vivas
Replica 1 20 0 19 1 4 16 0 20
Replica 2 20 0 18 2 5 15 0 20
Replica 3 20 0 18 2 4 16 0 20
Replica 4 20 0 19 1 6 14 0 20
Total 80 0 74 6 19 61 0 80
% de
mortalidad
100 92,5 23,75 0
Los valores de pendiente fueron de (2,62±0.14) y (3,71±0.39) lo que
indican una respuesta heterogenia entre poblaciones. La exposición a
varias concentraciones para el insecticida temefos, permitió obtener la
dosis letal (DL50) y posteriormente su factor de resistencia (RR50), al ser
comparado con la DL50 de la cepa susceptible de referencia Rockefeller.
El valor obtenido para la DL50 en la localidad de la Concordia fue de
0,0555 ppm con un rango entre 0,0462-0,065, mientras que para la
localidad de Quinindé fue de 0,0675ppm con un rango de 0,058-0,077. El
factor de resistencia (RR) calculado fue de 5,24 y 6,37 (ver Tabla N. 10)
los cuales indican la presencia de resistencia moderada al insecticida.
18
Tabla N 10. Análisis del factor de resistencia en las localidades de la
Concordia-Santo Domingo de los Tsáchilas y Quinindé-Esmeraldas.
Factor de Resistencia (FR) DL50 La
Concordia
Factor de Resistencia (FR) DL50 Quinindé
DL50
Campo
DL50
Rockefeller
FR b+DE DL50
Campo
DL50
Rockefeller
FR b+D
E
Ppm 0,055 0,0106 5,24 2,62
+/-
0,14
ppm 0,067 0,0106 6,37 3,71
+/-
0,39
IC(+/-) 0,0462-
0,065
0,00829,0,0
131
IC(+/-) 0,058-
0,077
0,00829,0,0
131
Identificación de mutaciones F1534C Y V1016I del gen del canal de
sodio
Se pudo determinar los genotipos homocigotos y heterocigotos mediante
las curvas melting de disociación (Tm) para los loci 1535 y 1016. Se
consideró para el análisis una variación de 0,2 °C en cada una de las
curvas. Las curvas (Tm) en la posición 1534 fueron diferenciadas
mediante un pico sencillo de 82ºC correspondiente al homocigoto silvestre
(Phe) (ver Figura 3a), dos picos de 80ºC y 82ºC correspondiente al
heterocigoto (Phe/Cys) y un solo pico de 80ºC correspondiente al
homocigoto mutante (Cys) (ver Figura 3b). En el análisis de la posición
1016 solamente se encontró la amplificación del alelo mutante (Ile) con
temperaturas entre 76ºC correspondiente al homocigoto mutante (Ile).
19
a)
b)
c)
Fig 3. Curvas de amplificación para las SNPs en las posiciones F1534C y V1016G kdr del canal de voltaje de sodio en Ae. aegypti. Análisis de las curvas de amplificación en PCR en tiempo real que diferencia los alelos Phe/Cys de la posicion 1534 (a), Cys/Cys 1534 (b) y Ile/Ile de la posicion1016 (c). La Tm de los alelos se muestra en cada curva.
20
Frecuencia alélica
Se analizaron un total de 70 mosquitos, 30 individuos para la localidad de
La Concordia considerados todos como susceptibles y 40 individuos para
la localidad de Quinindé considerando 30 individuos susceptibles y 10
individuos resistentes, de los cuales se obtuvieron las frecuencias
genotípicas para cada localidad. La frecuencia alélica en la población de
Quinindé para el alelo mutante Cys 1535 fue de 0.56 y en la localidad de
La Concordia fue de 0.45 (ver Tabla N 11).
Tabla N 11. Identificación de la frecuencia alélica para las localidades de
Quinindé y La Concordia
Localidad N° de
individuos
1534 Frecuencia Cys 1534
1016 Frecuencia Ile1016
F/F F/C C/C V/V V/I I/I
La Concordia
30 8 17 5 0,45 0 0 30 1.0
Quinindé 40 3 29 8 0,56 0 0 40 1.0
La presencia de heterocigotos fue representativa para las dos localidades,
presentando frecuencias de 0.567 para La Concordia y 0.725 en
Quinindé. Los homocigotos mutantes se expresaron tanto en La
Concordia como en Quinindé en frecuencias de 0.166 y 0.20
respectivamente, además de homocigotos silvestres con porcentajes de
0.266 y 0.075 en las poblaciones de cada localidad (Fig. N 4).
Las localidades analizadas presentaron valores de normalidad <0,05, por
lo que al realizar el análisis diferencial entre las frecuencias alélicas entre
localidades no se encontró diferencias estadísticamente significativas en
la frecuencia silvestre F1534C (p=0,09) y en la frecuencia mutante
F1534C (p=0,147) entre las poblaciones analizadas.
21
Figura 4. Frecuencia genética de la mutación F1534C para las localidades
de La Concordia y Quininde.
En la posición V1016I se determinó la presencia de homocigotos
mutantes (Ile1016) en ambas localidades, sin la evidencia de homocigotos
silvestres Val/Val y heterocigotos Val/Ile (ver Figura 5)
V/V V/I I/I
0
5 0
1 0 0
1 5 0
M u ta c io n 1 0 1 6
G e n o tip o s
% d
e i
nd
ivid
uo
s
L a C o n c o rd ia
Q u in in d e
Figura 5. Frecuencia genética de la mutación V1016I para las localidades
de La Concordia y Quininde.
22
Se realizó el análisis de equilibrio de Hardy-Weinberg para cada una de
las localidades, utilizando el X2 para encontrar equilibrio génico en las
poblaciones con valores de significancia. La localidad de La Concordia no
se encontraba en equilibrio génico según la propuesta por Hardy-
Weinberg al no encontrar valores significativos (p=0,956). Además en la
población de Quinindé se determinó que la población se encontraba en
equilibrio (p=0.04). El cálculo de Hardy-Weinberg para la mutación V1016I
no pudo ser calculado debido a la dominancia del alelo mutante Ile1016.
DISCUSIÓN
En el análisis con el piretroide deltametrina, en la localidad de Quinindé
provincia de Esmeraldas, presentó resistencia al insecticida (7,5%
mortalidad), mientras que en la localidad de La Concordia provincia de
Santo Domingo de los Tsáchilas se determinó el riesgo de resistencia
(94% mortalidad). En los estudios realizados por Álvarez et al. (2006),
Santacoloma et al. (2010) y Conde et al. (2015) en los países de
Colombia, Perú y Venezuela respectivamente, han registrado la
resistencia a deltametrina similares al presente estudio, con porcentajes
de mortalidad entre 87%, 70% y 89%. La resistencia a los insecticidas
piretroides se ha dispersado ampliamente en poblaciones de Ae aegypti,
probablemente como resultado de la amplia dependencia del insecticida
en los programas de control vectorial durante varias décadas. La pérdida
de la susceptibilidad a deltametrina se encontraría relacionada por la
resistencia cruzada al DDT debido a que son compuestos químicos que
comparten un mismo sitio de acción (Brengues et al. 2003); además la
presión ejercida por el insecticida durante varias décadas en el pasado ha
contribuido al desarrollo de resistencia (Fonseca et al. 2009). Otros
mecanismos también se han vinculado a la resistencia a piretroides como
el incremento de actividades enzimáticas esterasas no específicas, el
citocromo P-450 monooxigenasa, glutatión S-transferasas (GST) y
oxidasas de función mixta (Rodriguez et al., 2014). El desarrollo de
23
mutaciones en el gen del canal de voltaje de sodio (S989P, I1011M/V,
V1016G/I, F1269C, F1534C) también estarían vinculados con la
resistencia a piretroides (Maestre et.al, 2010; Li et al., 2015).
En los últimos veinte años en países de Latinoamérica se ha venido
empleado insecticidas organofosforados para el control de poblaciones de
Ae. aegypti. El insecticida malation es utilizado ampliamente en el
Ecuador como adulticida en rociamientos intra y peridomiciliares; al igual
que el uso del temefos como insecticida de control larvario (Roldan et al.,
2013). En el análisis de susceptibilidad al insecticida malatión se encontró
porcentajes de mortalidad entre los 88% (n=100) en la localidad de
Quinindé y 94% (n=125) para localidad de La Concordia. Estos valores
sugieren la posibilidad de resistencia dentro de las localidades de estudio,
los cual debería ser corroborado, mediante la realización de un gradiente
dosificado del insecticida. En América Latina este organofosforado se
encuentra ampliamente utilizado en programas para el control vectorial y
se ha reportado la susceptibilidad en poblaciones de Colombia, Cuba,
Venezuela, Costa Rica y Jamaica (Cadavid et al., 2011; Coto et al., 2000).
En poblaciones de Venezuela a pesar del uso intensivo durante cuatro
décadas del insecticida malatión como adulticida, se registró la
susceptibilidad de Ae aegypti con dosis diagnostica (Fernández, 2013).
Según Rodríguez et al (2003), en poblaciones de Ae aegypti el desarrollo
de la resistencia al malation es un proceso evolutivo tardío en el cual
puede estar involucrado con varios factores como las condiciones
ambientales de fumigación, preparación del insecticida o la frecuencia de
aplicación del insecticida respecto a otros compuestos como los
piretroides. En pruebas realizadas en laboratorio la presión continua del
malation demostró que después de varias generaciones desarrolló
resistencia cruzada a la deltametrina (Rodríguez et al., 2003). En otras
especies de mosquitos vectores como Anopheles sp (Fernández et al.,
2007) y Culex sp (Bastidas et al., 2011) han registrado resistencia a un
amplio espectro de organofosforados. Esta resistencia se encontraría
vinculada por la presencia de mecanismos de resistencia diferentes a
24
otros organofosforados, por lo que las enzimas desintoxicadoras carboxil-
esterásas, actúan inhibiendo al insecticida antes de que llegue a su sitio
de acción (Fonseca, 2005).
El uso de dosis diagnostica es un criterio inicial para la determinación de
resistencia y son parámetros que se usan como referencia para ser
comparados con los resultados del ensayo biológico (Brogdon & Chan,
2010). El estudio realizado por Morales et al. (2016) hace énfasis en
realizar bioensayos con dosis diagnóstica y bioensayos con un gradiente
dosificado para la determinación del factor de resistencia, permitiendo una
percepción más clara de resistencia en las poblaciones.
En este estudio se encontró que las poblaciones nativas de Ae. aegypti en
las localidades de Quinindé y La Concordia presentaron resistencia
moderada a temefos con valores de RR50 5,24 y 6,37 respectivamente.
Esta resistencia es similar con la población analizada en la localidad de
Pascuales, provincia del Guayas, la cual presento un factor de resistencia
de 9,2 a la aplicación del temefos (Terán et al., 2012). A nivel regional en
las localidades de Sullana (RR50 6,84) y Tambo grande (RR50 5,60) en el
Perú determinaron igualmente valores de resistencia moderada a temefos
(Vargas et al., 2013), estos valores indican todavía la funcionalidad del
insecticida el cual debería ser monitoreado para su posterior aplicación
con otros insecticidas. La dependencia de este organofosforado durante
los últimos años en el Ecuador, al ser el único larvicida aplicado por el
Ministerio de Salud Pública, estaría provocando una presión selectiva
ocasionando la aparición de poblaciones resistentes como se reporta en
países como Cuba, Venezuela y Brasil los cuales presentan factores de
resistencia de 89,91, 11,1 y 15,5 respectivamente (Bisset et al, 2004;
Braga et al., 2004). La perdida de susceptibilidad al insecticida temefos
debería ser evaluada constantemente ya que la presión ejercida por este
insecticida podría generar resistencia expresada en insecticidas
organofosforados utilizados en el control del mosquito en etapa adulta
(Tikar et al., 2009 ).
25
El desarrollo de la resistencia a temefos también se encontraría vinculado
por las presiones de selección y mecanismos de resistencia como la
síntesis de la enzima carboxil-esterasas (Chen et al., 2005).
En América Latina las mutaciones en el canal de voltaje de sodio en
poblaciones de Ae aegypti, se han reportado con mayor frecuencia en los
últimos años. Países como Venezuela, Brasil, Colombia y México (Du, et
al., 2016) han registrado cambios puntuales en las posiciones de F1534C,
V1016I y I1011M en poblaciones de Ae aegypti, los cuales se encuentran
relacionados con la resistencia a piretroides. En nuestro estudio se
determinó la presencia de las mutaciones F1534C y V1016I en las
localidades de Quinindé y La Concordia. La presencia de estos genotipos
se debería a una presión continua en el uso del insecticida durante brotes
epidémicos de dengue, además por el uso del DDT en el pasado lo que
genero la formación de una resistencia cruzada aportando a la expansión
del genotipo kdr en varias especies. (Hemingway & Ranson 2000).
Estudios indican que la resistencia kdr disminuye de 10 a 20 veces la
sensibilidad al insecticida, en otras especies se ha reportado que el
fenotipo puede llegar hasta 100 veces más resistencia a los piretroides, el
cual tiene la presencia de tres mutaciones o más y es conocido como
Súper-kdr (Davies et al., 2007).
Investigaciones indican que la mutación F1534C se encuentra relacionada
directamente con la resistencia a piretroides tipo I (permetrina) que a los
piretroides tipo II (deltametrina) otorgando un mayor factor de resistencia
para este tipo de insecticida (Li et al., 2015). Sin embargo se ha reportado
que la ocurrencia de la mutación 1534 estaría relacionada conjuntamente
con la mutación 1016 formando un polimorfismo simultaneo que otorgaría
el aumento de resistencia a piretroides (Du et al., 2013). En este estudio
se registró la presencia de las dos mutaciones, con resultados similares
en poblaciones de Brasil los cuales confirmaron la presencia simultánea
de los dos polimorfismos (Linss et al., 2014)
26
El genotipo homocigoto mutante I/I1016 se encontró en una frecuencia del
100% en los individuos analizados para las localidades de Quinindé y La
Concordia, resultados similares se encontraron en poblaciones de
Venezuela y Brasil (Martins et al., 2009). Al parecer el desarrollo de esta
mutación se encuentra relacionado por la aplicación extensiva y frecuente
con insecticidas piretroides como respuesta a casos por dengue, además
de las condiciones biológicas de la especie al tener ciclos cortos de vida y
alta fecundidad (Siller, 2011); esto se demostró en estudios realizados en
laboratorio con poblaciones de Ae. aegypti, los cuales presentaron el alelo
kdr ile1016 después de cinco generaciones causado por la presión
ejercida por la deltametrina (Saavedra et al., 2012). En otro estudio se
encontró que las altas frecuencias tienen la tendencia rápida de fijación
dentro de las poblaciones, no obstante si la mutación alberga un ambiente
libre del insecticida se espera que cese la presión con los piretroides y
disminuya la frecuencia del alelo mutante (Brito et al., 2013).
Para el locus 1534, se observó una frecuencia alélica de 0,45 (n=30) para
La Concordia y 0,56 (n=40) en Quinindé para el alelo mutante C/C1534,
similares resultados se evidencio en localidades de Colombia donde fue
reportado homocigotos mutantes con mayor frecuencia en rangos desde
0,61 y 0,79 indicando que la mutación se encontraría relacionada con la
resistencia a piretroides en conjunto con mecanismos enzimáticos
(Murcia, 2015). En poblaciones de Venezuela se analizó la prevalencia de
los genes de resistencia 1534 en deltametrina durante quince
generaciones llegando a determinar una frecuencia alélica de 1.0, lo que
indicaría la selección más rápida del alelo para el piretroide (Álvarez et al.,
2015). En las dos localidades analizadas se encontró la alta frecuencia de
individuos heterocigotos, si la aplicación ejercida por el insecticida es
constante puede incrementar por mecanismos de evolución en el
aumento de la frecuencia de alelos kdr (Murcia, 2015).
En varios casos los fenotipos resistentes no se pueden explicarse
mediante las mutaciones kdr que representan la insensibilidad de los
sitios diana, estas variaciones también se encontrarían relacionadas con
27
capacidades metabólicas detoxificantes de los mosquitos (Hemingway et
al., 2004). Según Scott (2016) la alta frecuencia de kdr en algunos casos
no puede ser explicados por los niveles de resistencia, por lo que
parecería probable que el alelo puede tener un costo de fitness reducido
en relación con KDR respecto a la ausencia del uso de insecticidas.
La homogeneidad de las frecuencias alélicas F/F1534, C/C1534 y I/I1016
entre las localidades analizadas, se debería al modo de dispersión génico
a larga distancia realizado por las redes de comunicación vía terrestre
entre localidades (Goncalves et al., 2012).
Varias mutaciones en el gen del canal de sodio han sido asociadas con
los fenotipos resistentes a piretroides, Brooke, 2008 determino que la
resistencia podría ser multigenetica y que las mutaciones en el gen del
canal de sodio por sí sola no puede explicar completamente el fenotipo
resistente
Los resultados de la población de Quinindé mostraron un equilibrio de
Hardy-Weiberg para el alelo 1534, lo que sugiere la trasferencia continua
SNPs a través de las siguientes generaciones, al ya no ser dependiente la
exposición o no del insecticida estos genotipos se encontrarían
establecidos dentro de la población, un resultado diferente se observó en
la localidad de La Concordia el cual no se encontró en equilibrio de Hardy-
Weiberg. Según Collet et al., 2016 este resultado se debería a una posible
introducción de Ae. aegypti de otras localidades cercanas mediante el
flujo de trasporte terrestre. Además, el modo de aplicación de piretroides y
la presión ejercida por insecticidas de uso doméstico podría ser otro factor
de continuidad de este genotipo dentro de la población.
Los resultados de este estudio muestran la importancia y la necesidad de
realizar la vigilancia a los insecticidas utilizados para el control vectorial. El
conocimiento del cambio temporal en la susceptibilidad de los vectores y
el esclarecimiento de la distribución real de los polimorfismos pueden
ayudar en la gestión resistencia y la elaboración de estrategias para
28
garantizar la eficacia del programa de control. Por lo tanto, el monitoreo
de la presencia y la evolución de estos polimorfismos es indispensable
para el uso adecuado de piretroides y un control de vectores más
eficiente. Este estudio es una contribución para estudios futuros de
resistencia y/o susceptibilidad de Ae aegypti a los insecticidas aplicados
en el país.
CONCLUSIONES
1. Se determinó la presencia de resistencia a deltametrina y malation
con dosis diagnosticas en las poblaciones de La Concordia y
Quinindé debido a la continua exposición y presión generada por el
uso de los insecticidas, en el caso de deltametrina la resistencia
cruzada con el DDT durante varios años ha hecho que este
insecticida pierda su efectividad y desarrolle mecanismo de
resistencia.
2. Se estableció un factor de resistencia moderado en larvas a la
aplicación de temefos en las dos localidades analizadas, debido al
uso continuo del insecticida y al ser el único larvicida aplicado en
el control vectorial de Ae aegypti.
3. Se detectó la presencia de las mutaciones F1534C y V1016I que
confieren la resistencia a piretroides en el canal de voltaje de sodio,
con las frecuencias alélicas moderadas
29
RECOMENDACIONES
Analizar otros mecanismos de resistencia en insecticidas piretroides en
poblaciones de Ae aegypti
Identificar y monitorear las mutaciones que confieren resistencia a
piretroides para relacionar el estado génico de las poblaciones y su
relación con el fenotipo kdr
Realizar un seguimiento de las frecuencias alélicas en las mutaciones
F1534C y V1016I para verificar el aumento o disminución y su relación
con la aplicación del insecticida.
Realizar un gradiente dosificado para la confirmación de resistencia a
insecticidas, además de un monitoreo constante de los insecticidas
utilizados para el control vectorial.
30
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41
ANEXOS
Anexo 1. Recolección y trasporte de muestras biológicas
Anexo 2. Manejo de estadios inmaduros de Ae. aegypti por localidades
42
Anexo 3. Alimentación sanguínea por sistema de membrana
Anexo 4. Sistema hemoteck
43
Anexo 5. Colocación de ovitrampas en colonias
Anexo 6. Almacenamiento de huevos de Ae. aegypti
44
ANEXO 7 Protocolo de resistencia en
larvas OMS
45
46
47
48
ANEXO 8 Protocolo de resistencia en
adultos CDC
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
Anexo 9: Protocolo de
extracción de DNA
59
Protocolo de Extracción de DNA todo aedes
Qiagen Blood and Tissue Kit.
Cat: 69506
Andrea Zambrano & Andrés Recalde
Pasos previos
1. Si el kit de extracción es nuevo, añadir 130ml de etanol absoluto al buffer de lavado
(Wash Buffer 1 - AW1) y 160ml al buffer de lavado 2 (Wash Buffer 2 - AW2).
Extracción
1. Colocar 180μl del buffer ATL en un tubo tipo eppendorf de 1.5ml conjuntamente
con un mosquito entero a partir del cual se extraerá el ADN. Triturar el mosquito a
velocidad media con un homogenizador y macerador plástico.
2. Añadir 20μl de Proteinasa K y mezclar bien con ayuda del vórtex.
3. Incubar en baño maría a 56°C por 5 horas.
4. Adicionar 200μl del buffer AL, inmediatamente adicionar 200 μl de etanol absoluto.
Mezclar vigorosamente con ayuda de un vórtex.
5. Pasar el contenido del tubo a una columna (DNeasy Mini spin column) con el tubo
colector de 2ml (proveídos con el kit), y centrifugar por un minuto a 11000g.
6. Desechar el tubo, y colocar la columna en un nuevo tubo de 2ml. Adicionar 500μl del
buffer AW1 a la columna y centrifugar por un minuto a 8000g.
7. Desechar el contenido del tubo y colocar nuevamente la columna en el mismo.
Adicionar 500μl del buffer AW2 a la columna y centrifugar por seis minutos a
16000g.
8. Añadir nuevamente 500uL de AW2 a la columna y centrifugar por seis minutos a
16000g.
9. Descartar el líquido que se encuentra en el tubo colector, añadir 500uL de Etanol al
100% en cada columna.
10. Centrifugar por seis minutos a 16000g, abrir la tapa de la columna y dejarla así por
10 minutos a temperatura ambiente.
60
11. Desechar el tubo y colocar la columna en un nuevo tubo estéril tipo eppendorf de
1.5ml. Colocar 50μl del buffer de elución (Elution Buffer – AE) a la columna y dejar
incubar por dos minutos a temperatura ambiente.
12. Centrifugar la columna con el tubo por un minuto a 8000g.
13. Colocar 50μl del buffer de elución (Elution Buffer – AE) a la columna y dejar incubar
por dos minutos a temperatura ambiente.
14. Centrifugar la columna con el tubo por un minuto a 8000g.
15. Descartar la columna, y almacenar el tubo con ADN a -20°C.
Verificación de la extracción de ADN
1. Colocar 2μl de agua ultra pura en el medidor del NanoDrop para calibrar el aparato a
cero.
2. Colocar 2μl de ADN en el medidor del NanoDrop, medir la concentración y calidad
de ADN a las longitudes de onda 260 y 280nm.
Recomendaciones
En caso de tener termobloque usarlo en vez de baño maría
Se puede obtener mayor cantidad y calidad de DNA al someter a la muestra a
una incubación en termobloque por una noche.
En caso de tener más contaminación repetir los pasos 7 al 10 nuevamente.