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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“DETERMINACIÓN FENOTÍPICA DE CEPAS DE Escherichia coli
RESISTENTE A BETALACTÁMICOS, POR LA TÉCNICA DE DOBLE
DISCO, EN POLLOS FAENADOS EN SEIS CAMALES INDUSTRIALES
DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA”
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el
Grado o Título de Médico Veterinario y Zootecnista
Autor:
Diana Sofía de Janon González
Tutor:
Dr. Christian Vinicio Vinueza Burgos M.Sc.
Quito, Enero 2016
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DEDICATORIA
A mi familia, amigos y profesores
Por su apoyo incondicional
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AGRADECIMIENTOS
Primero quiero agradecer a Dios porque sin él no hubiera llegado hasta
este punto.
A mi amado Luis, a mi madre Susana, a mi padre Eugenio, a mis
hermanos Eugenio y Estefanía, a mi tía Loretta y mi primo Esteban por
estar siempre pendientes de mi.
A Valeria y Nataly porque con ellas el trabajo de campo fue mejor
organizado y más ameno.
Al doctor Christian Vinueza por la confianza y paciencia que depositó en
mi en todo el tiempo que llevé de tesista.
A las doctoras María Belén Cevallos y María Inés Vaquero y los doctores
Marco Cisneros y Carlos Gómez por sus amplios conocimientos de
bacteriología y avicultura que contribuyeron directamente con la
realización de esta investigación.
A las seis empresas faenadoras de pollo broiler, por su asistencia con las
muestras.
Al laboratorio de Bacteriología por prestar sus instalaciones para efectuar
el trabajo.
A la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad
Central del Ecuador por toda mi formación profesional y a mi Tribunal de
Grado conformado por los doctores Alex Andrade, César Guanoluisa,
Gustavo Salgado y la doctora María Revelo.
Mil gracias a todos.
Diana Sofía de Janon González
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ÍNDICE DE CONTENIDOS
Pág.
DEDICATORIA .......................................................................................... ii
AGRADECIMIENTOS .............................................................................. iii
RESUMEN ............................................................................................... xii
INTRODUCCIÓN ....................................................................................... 1
CAPÍTULO I............................................................................................... 3
EL PROBLEMA ..................................................................................... 3
Planteamiento del Problema ............................................................... 3
Justificación ........................................................................................ 4
Objetivos ............................................................................................. 5
CAPÍTULO II .............................................................................................. 6
MARCO TEÓRICO ................................................................................ 6
Antecedentes ...................................................................................... 6
Fundamentación Teórica .................................................................... 7
CAPÍTULO III ........................................................................................... 17
METODOLOGÍA .................................................................................. 17
Determinación de métodos a utilizar ................................................. 17
Descripción de la zona de estudio .................................................... 17
Población y Muestra ......................................................................... 18
Procedimiento de la Investigación .................................................... 19
Procesamiento y análisis de datos ................................................... 23
CAPÍTULO IV .......................................................................................... 24
RESULTADOS ..................................................................................... 24
DISCUSIÓN ......................................................................................... 27
CAPÍTULO V ........................................................................................... 30
CONCLUSIONES ................................................................................ 30
RECOMENDACIONES ........................................................................ 30
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 31
ANEXOS .................................................................................................. 40
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ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación taxonómica de E. coli .............................................. 7
Tabla 2. Clasificación de los patotipos de E. coli ....................................... 9
Tabla 3. Clasificación de betalactamasas según Ambler. ........................ 14
Tabla 4. Clasificación de los antibióticos betalactámicos. ........................ 16
Tabla 5. Códigos de las muestras según la empresa de la que provienen.
................................................................................................................. 19
Tabla 6. Resultados de aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos
del contenido cecal de pollos faenados en seis camales. ........................ 25
Tabla 7. Porcentaje de uso de antibióticos en las parvadas. ................... 26
ÍNDICE DE GRÁFICOS
Gráfico 1.- Ubicación de los camales industriales en la provincia de
Pichincha. ................................................................................................ 18
Gráfico 2.- Ubicación de discos de inhibición en el agar Mueller Hinton. . 21
Gráfico 3.- Cepas BLEE; sinergia entre halos de inhibición. .................... 22
Gráfico 4.- Cepas AmpC; Sinergia entre halos de inhibición. .................. 22
Gráfico 5.- Aislamiento positivo de E. coli resistente a betalactámicos. ... 24
Gráfico 6.- Prueba de TSI para confirmar la presencia de E. coli. ........... 24
Gráfico 7.- Fenotipos de cepas de E. coli. ............................................... 26
Gráfico 8.- Resultado de técnica de doble disco en las muestras positivas
a E. coli. ................................................................................................... 27
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
“DETERMINACIÓN FENOTÍPICA DE CEPAS DE Escherichia coli RESISTENTE A BETALACTÁMICOS, POR LA TÉCNICA DE DOBLE DISCO, EN POLLOS FAENADOS EN SEIS CAMALES INDUSTRIALES DE LA PROVINCIA DE PICHINCHA”
Autor: Diana Sofía de Janon González Tutor: Dr. Christian Vinueza M.Sc.
Fecha: Enero, 2016
RESUMEN
Escherichia coli (E. coli) es la causa más común de infecciones por gramnegativas. El desarrollo de resistencia en bacterias zoonóticas constituye un riesgo para la salud pública. Esta bacteria es productora de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y/o AmpC, enzimas que actúan anulando la acción de antibióticos betalactámicos. La resistencia a los antibióticos producida por dichas betalactamasas, es transferida a bacterias patógenas por medio de plásmidos de transferencia, provocando fracasos terapéuticos. El objetivo de este estudio fue determinar fenotipos BLEE y AmpC de E. coli proveniente de pollos broiler en la provincia de Pichincha. Se realizó aislamiento de E. coli BLEE/AmpC de 187 muestras del contenido cecal de aves faenadas, en agar TBX, encontrando el 94,7% (177/187) de muestras positivas. Posteriormente se aplicó la técnica de Doble Disco y se comprobó la presencia de cepas BLEE (78%) y AmpC (22%). Los antibióticos más utilizados en las parvadas cuyas muestras resultaron positivas a la presencia de E. coli fueron fluoroquinolonas (61%), macrólidos y fenicoles (17%). El uso de betalactámicos representó el 6%. Los presentes resultados evidencian la amplia difusión de bacterias resistentes a antibióticos betalactámicos en aves destinadas al consumo humano.
Descriptores: Escherichia coli, betalactamasa de espectro extendido, BLEE, AmpC, pollos, doble disco, camales
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“PHONOTYPICAL DETERMINATION OF Escherichia coli STRAINS RESISTANT TO BETALACTAMIC, BY USING THE DOUBLE DISC TECHNIQUE, IN BROILERS SLAUGHTERED IN SIX INDUSTRIAL SLAUGHTERING HOUSES OF PICHINCHA PROVINCE”
Author: Diana Sofía de Janon González Tutor: Dr. Christian Vinueza M.Sc.
Fecha: January, 2016 ABSTRACT
Escherichia coli (E. coli) are the most common cause of gram-negative infections. Development of resistance in zoonotic bacteria is a risk for public health. Such a bacterium generates extended spectrum betalactamases (ESBL) and/or AmpC, enzymes working annulling the action of betalactamic antibiotic. Antibiotic-resistance generated by such betalactamases is transferred to pathogen bacteria through transference plasmids, causing therapeutic failures. The purpose of the current study was determining ESBL and AmpC phenotypes for E. coli from broiler chicken in Pichincha province. E. coli ESBL/AmpC were isolated from 187 samples of fecal content of slaughtered birds, in TBX agar, with 94.7% (177/187) of positive samples. Afterwards the Double Disc technique was applied and the existence of ESBL strains (78%) and AmpC (22%) were verified. Most used antibiotic in samples were positive for E. coli with flour-quinolones (61%), macrolides and phenicols (17%). The use of betalactamic accounted for 6%. The current results showed the wide spread of bacteria resistant to betalactamic antibiotic in birds for human consumption.
Descriptors: Escherichia coli, extended-spectrum betalactamase, ESBL, AmpC, chicken, double-disc, slaughtering houses
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INTRODUCCIÓN
Durante el último siglo, el uso inadecuado de antibióticos tanto en seres
humanos como en animales, ha promovido el desarrollo de bacterias
resistentes a los mismos, lo cual representa un grave problema en la
salud pública (World Health Organization [WHO], 2014; World
Organization for Animal Health [OIE], 2013).
Una de las bacterias que más trascendencia tiene en la adquisición de
resistencia es Escherichia coli (Abreu et al., 2013; Mody & O’Reilly, 2004).
Se ha demostrado la transmisión de genes de resistencia de este
microorganismos a los seres humanos por manipulación y consumo de
carne de pollo, que ha sido contaminada con contenido fecal durante el
faenamiento (de Been et al., 2014; Miranda et al., 2008; Smet et al.,
2011).
E. coli es un habitante normal de la flora intestinal de humanos y
animales, la mayoría de sus cepas son inocuas (Mody & O’Reilly, 2004;
Wang, Tseng, Wu, Sheu & Wu, 2009). Las cepas patógenas de E. coli
causan infecciones intestinales y extraintestinales en el ser humano,
provocadas por contaminación alimentaria (Food and Agriculture
Organization of the United Nations [FAO], 2008; Hammerum & Heuer,
2009; Puerta-García & Mateos-Rodríguez, 2010).
Los antibióticos betalactámicos son una opción en el tratamiento de
infecciones causadas por E. coli, pero por acción de las betalactamasas
que ésta produce, se inactivan (Escalante-Montoya & Sime-Díaz, 2013).
La tasa de enterobacterias resistentes a betalactámicos en Latinoamérica
es más alta que en otras regiones del mundo (García-Apac, 2012).
Este estudio forma parte del proyecto denominado “Estudio de
Prevalencia y Resistencia a los Antimicrobianos de Campylobacter spp.,
E. coli BLEE y Salmonella spp. en muestras gastrointestinales de pollos
faenados en camales industriales de la Provincia de Pichincha - Ecuador”,
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y tiene como finalidad la recopilación de datos epidemiológicos sobre el
pollo broiler y sus derivados.
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CAPÍTULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del Problema
El uso poco apropiado de los antibióticos como: la aplicación de dosis
bajas, intervalos muy largos entre dosis, el uso de medicamentos de baja
calidad, caducados y la utilización innecesaria por diagnósticos erróneos,
promueven el desarrollo de bacterias resistentes a los mismos (Aguirre-
Íñiguez, 2012).
Cada vez que se utiliza un antibiótico, las bacterias más sensibles mueren
debido a la presión selectiva que éste ejerce sobre ellas pero los
gérmenes más resistentes pueden sobrevivir, crecer, reproducirse y
transferir la resistencia a su progenie (García-Vásquez et al., 2011).
La resistencia bacteriana se vuelve un tema de mayor importancia si se
trata de especies bacterianas patógenas y responsables de
enfermedades infecciosas (Reich, Atanassova & Gunter, 2013;
Sussmann, Mattos, Restrepo, 2002).
Los animales de granja pueden ser reservorio de bacterias resistentes
cuya propagación a la población humana, se facilita a través de la cadena
alimenticia (Hammerum & Heuer, 2009).
Una inadecuada manipulación de los operarios en granjas y centros de
faenamiento, transporte, acopio y expendio, son factores de riesgo para la
contaminación por bacterias resistentes a los antibióticos (FAO, 2008;
OIE, 2013).
La resistencia a los antibióticos representa un peligro significativo en el
tratamiento de infecciones comunes. Según la FAO, OMS y OIE en el año
2007, las bacterias relacionadas con la resistencia a quinolonas,
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macrólidos y cefalosporinas de tercera y cuarta generación son los
géneros E. coli, Salmonella spp. y Campylobacter spp.
Justificación
La resistencia de las bacterias a los antibióticos constituye un problema
en Salud Pública por su impacto en morbilidad y mortalidad en animales y
humanos (Abreu et al., 2013; Baene, 2015).
Estudios realizados en Estados Unidos y la Unión Europea revelaron que
las bacterias resistentes, provenientes de animales domésticos, podían
causar infecciones a los seres humanos por su alta capacidad de
diseminación (Gervás, 2000).
E. coli productor de enzimas betalactamasas ha sido aislado de muestras
fecales de animales sanos, en particular de aquellos destinados al
consumo humano como el pollo de engorde y sus derivados (Abreu et al.,
2013; Dierikx, van der Goot, Smith, Kant & Mevius, 2013a; Silva et al.,
2012).
Cuando las aves de corral están sometidas a un sistema de cría intensiva,
se promueve la transmisión de bacterias entre individuos, así como, el
intercambio de genes de resistencia entre bacterias (Leverstein-van Hall
et al., 2011; Torres & Zarazaga, 2007).
El intercambio genético se produce por mutación de genes y propagación
de plásmidos, transposones o integrones entre microorganismos de una
misma o distinta especie, dando como resultado cepas con capacidad de
resistir a la gran mayoría de antibióticos betalactámicos y a múltiples
agentes antimicrobianos de otras familias (Paterson & Bonomo, 2005). Es
así como, cepas de E. coli transfieren sus genes a las bacterias de la
microflora intestinal a través de un plásmido de transferencia (Abreu et al.,
2014).
La estrategia desarrollada por enterobacterias para luchar contra la acción
de antibióticos betalactámicos es la producción de enzimas
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betalactamasas (Castellas, 2012). Infecciones causadas por bacterias
productoras de betalactamasas dificultan el tratamiento y reducen las
opciones terapéuticas (Silva et al., 2012).
La frecuente resistencia a betalactámicos ha sido demostrada en
hospitales de Ecuador (Ortega-Paredes, 2014). En la ciudad de Quito, un
estudio de caracterización molecular reportó 22,4% de resistencia a
betalactámicos en E. coli uropatogénica (Chiluisa-Guacho, Vásquez,
Zahner, Silva-Pereira & Dutra-Asensi, 2014).
La importancia de esta indagación radica en la poca cantidad de
investigaciones fenotípicas de genes de resistencia en cepas de E. coli
provenientes de pollos broiler, tomando en cuenta que para 2013, el
consumo per cápita de carne de pollo en Ecuador fue de 32
kilogramos/habitante/año, con una mayor producción concentrada en la
región sierra (63%) (Corporación Nacional de Avicultores del Ecuador
[CONAVE], 2015; Instituto Nacional de Estadísticas y Censos [INEC],
2013).
Objetivos
a. General
Determinar fenotípicamente cepas de E. coli BLEE y AmpC por la técnica
de Doble Disco en pollos faenados en seis camales industriales de la
provincia de Pichincha.
b. Específicos
1. Diagnosticar E. coli resistente a betalactámicos del tracto
gastrointestinal de pollos faenados en seis camales industriales de
la provincia de Pichincha mediante métodos microbiológicos.
2. Identificar fenotípicamente cepas de E. coli BLEE y AmpC por la
técnica de Doble Disco.
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CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
Antecedentes
En España se aisló E. coli de 57 muestras del contenido fecal de aves de
corral, de ellas 23 mostraron dos o más genes de virulencia con serotipos
clásicos de E. coli patógena extraintestinal típicos de humanos (Cortés et
al., 2010).
En Dinamarca, un estudio de 98 muestras de carne de pollo de venta al
por menor, evidenció que el 94% de ellas contenían cepas de E. coli
productoras de BLEE, de los cuales el 39% pertenecían a genotipos
presentes en 516 muestras clínicas humanas recogidas en hospitales de
la zona (Leverstein-van Hal et al., 2011).
En el año 2012, en España, se analizaron 90 muestras rectales de pollos
sanos de engorde provenientes de granjas avícolas de Tenerife, en el
86% de las muestras se aisló E. coli productor de BLEE (Abreu et al.,
2013).
En el año 2013, en Holanda se realizó un estudio con 41 hisopados
cloacales de pollos de engorde de 26 granjas y 18 muestras fecales de
criadores de pollo. Se encontró E. coli con genes BLEE y AmpC en un
80% para las aves y 33,3% para los criadores (Dierick et al., 2013b).
En Ecuador, en 2014, se aisló E. coli de ciegos de pollos faenados
procedentes de diferentes camales industriales de la provincia de
Pichincha. De las 145 muestras, 126 fueron positivas a E. coli
representando el 86,9% (Vásconez-Paucar, 2014).
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En 1959 la Organización Mundial de la Salud (OMS) definió (Arce-Gil,
Llontop-Nuñez, Flores-Clavo & Fernandez-Valverde, 2013) como
zoonosis a las enfermedades e infecciones que se transmiten de un modo
natural de los animales al hombre y viceversa (Aguledo-Suárez, 2012). En
el 2009, Ewers et al., concluyeron que ciertas cepas E. coli provenientes
del intestino de aves de corral clínicamente sanas, originaban la zoonosis
alimentaria más frecuente en el ser humano, cuya importancia se debía a
la gravedad de los cuadros clínicos y al número de afectados.
Por lo expuesto anteriormente se puede apreciar que E. coli puede
representar un riesgo zoonótico sobre todo en aves de corral y que la
transmisión de genes de resistencia de las aves a los seres humanos
podría ser a través de la cadena alimenticia.
Fundamentación Teórica
Escherichia coli
E. coli fue aislada por primera vez en 1885 por el pediatra alemán
Theodor Escherich del contenido fecal de infantes (Shulman, Friedmann &
Sims, 2007).
Taxonomía
La familia Enterobacteriacea tiene géneros y especies relevantes tanto en
la colectividad como en el ámbito hospitalario, pues causan una amplia
variedad de infecciones que afectan a huéspedes sanos y enfermos,
siendo E. coli uno de los patógenos más destacables (García-Vásquez et
al., 2011). A continuación, su clasificación taxonómica (Tabla 1).
Tabla 1. Clasificación taxonómica de E. coli
Reino Bacteria
Dominio Bacteria
Phylum Proteobacteria
Clase Gammaproteobacteria
Orden Enterobacteriales
Familia Enterobacteriaceae
Género Escherichia
Especie coli
Fuente: Winn et al., (2006)
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Características
E. coli es un bacilo gramnegativo, anaerobio facultativo, móvil, que no
forma esporas, su tamaño varía entre 0,5 y 3,4 microgramos (µg), y
puede desarrollarse hasta en 45 grados centígrados (°C) con una
temperatura óptima de 37°C (Forbes, Sahm & Weissfeld, 2007; Winn et
al., 2006).
Esta bacteria crece en medios comunes por ser un microorganismo con
pocas exigencias nutritivas como agar nutritivo y caldo triptosa (BD
Biosciences, 2008; Dominguez-Carmona & Dominguez-De la Calle, 2003;
Winn et al., 2006). Se diferencia de otros miembros de su familia por la
capacidad de fermentar lactosa y glucosa produciendo gas (Murray,
Rosenthal & Pfaller, 2009; Winn et al., 2006).
E. coli comensal es el principal anaerobio facultativo de la microbiota del
intestino de humanos, mamíferos y aves, se encuentra en calidad de
saprobio sin causar enfermedad, dado que desde su nacimiento, el
individuo se coloniza con una o dos cepas que residen en la luz del colon
de manera permanente, estableciendo una relación simbiótica durante
toda la vida (Winfield & Groisman, 2003).
Este microorganismo participa en la metabolización de productos
alimentarios, proporciona factores esenciales para el crecimiento, protege
frente a las infecciones provocadas por gérmenes de alta virulencia y
estimula la respuesta inmunitaria (Murray et al., 2009). Muy raramente, y
solo en casos de inmunodepresión, se puede volver un patógeno
oportunista, sin desarrollar sintomatología en el hospedador (Reich et al.,
2013). Sin embargo, existen cepas que al producir factores de virulencia
específicos, se convierten en cepas patógenas o patotipos (Quinn et al.
2011).
E. coli patógena se divide en dos categorías: patógenos entéricos y
patógenos extraintestinales (Castellas, 2012). El mecanismo de
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patogenicidad y el cuadro clínico han permitido clasificar en siete
patotipos a estas cepas de E. coli, cuyo detalle se presenta en la tabla 2.
Tabla 2. Clasificación de los patotipos de E. coli
Patotipo Mecanismo de
patogenicidad
Cuadro clínico
ECET
E. coli
enterotoxigénica
Enterotoxina que estimula la
secreción masiva de líquido
por las células mucosas.
Diarrea acuosa, grave
deshidratación, fiebre,
escalofríos y vómitos.
ECEA
E. coli
enteroagregativa
Con capacidad de adherirse
al intestino.
Diarrea persistente y
emergente.
ECEI
E. coli
enteroinvasiva
Plásmido que permite a las
bacterias invadir la mucosa
del intestino grueso
inflamándola.
Diarrea acuosa y
sanguinolenta, calambres
abdominales.
ECEH
E. coli
enterohemorrágica
Toxinas de tipo Shiga o
verotoxinas que bloquean la
síntesis de proteínas
induciendo la muerte de la
célula huésped.
Diarrea, colitis hemorrágica,
síndrome inflamatorio
intestinal, síndrome
hemolítico urémico y muerte.
ECEP
E. coli
enteropatogénica
Microcolonias que producen
la pérdida de
microvellosidades.
Diarrea acuosa, fiebre y
vómitos.
ExPEC
E. coli patogénica
extraintestinal
Comensales oportunistas que
causan infecciones
extraintestinales en individuos
predispuestos.
Infecciones del tracto
urinario, bronconeumonía
sepsis, meningitis neonatal,
colibacilosis aviar.
Fuente: Bélanger et al.,(2011); Domínguez-Carmona & Domínguez-De la Calle, (2003) Modificado por: La Autora
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Morfología
El citoplasma aloja al genoma formado por un cromosoma circular que
se halla disperso, también puede hospedar a múltiples plásmidos (Winn et
al. 2006).
La pared está representada por dos revestimientos fosfolipídicos; interno
y externo, que encierran un espacio periplásmico el cual contiene un muro
de peptidoglucano o mureína; envoltura formada por N-acetilglucosamina
y N-acetilmurámico (Quinn et al. 2011).
El peptidoglucano es responsable de la estabilidad osmótica del
microorganismo y protege a la bacteria de la lísis osmótica y el daño
mecánico, pero se modifica constantemente en tanto la bacteria se
alargue y se divida (Quinn et al. 2011).
El revestimiento interno o citoplasmático, consiste en una doble capa
fosfolipídica impermeable a moléculas polares que regula el paso de
nutrientes, metabolitos y macromoléculas (Puerta-García & Mateos-
Rodríguez, 2010).
El espacio periplásmico es un entorno acuoso que aloja a una elevada
concentración de enzimas degradativas como la fosfatasa alcalina,
proteasas, betalactamasas, nucleosidasas y aminoglucósido fosforilasas
(Winn, et al., 2006). En la actualidad están descritas alrededor de 200
betalactamasas (Arce-Gil et al., 2013).
El revestimiento externo está constituido por fosfolípidos localizados en la
hoja interna, y en la hoja externa lipoproteínas fijadas al peptidoglucano,
porinas que regulan el paso de moléculas hidrofílicas y facilitan el paso de
diversas sustancias, y lipopolisacáridos termoestables (LPS) (Puerta-
García & Mateos-Rodríguez, 2010; Murray et al., 2009).
Los LPS son componentes esenciales de todas las gramnegativas. Están
conformados por 3 dominios: el lípido A o endotoxina, el núcleo o core y el
antígeno O (Quinn et al. 2011).
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El lípido A; más interno, sirve para anclar toda la estructura de la
membrana externa, es la parte biológicamente activa de la molécula que
el huésped reconoce (Murray et al., 2009; Quinn et al. 2011).
El antígeno O; más externo, formado por cadenas de monosacáridos que
se repiten hasta 40 veces, es el causante de la respuesta inmunológica,
por lo cual representa la base para la clasificación de los serogrupos,
encontrándose más de 170 en E. coli (Puerta-García & Mateos-
Rodríguez, 2010).
Los apéndices de superficie provienen de una estructura basal localizada
en la membrana interna y comprenden tres clases: las fimbrias, cuya
función es la adhesión a las células del huésped, los flagelos, formados
de proteínas con carácter antigénico (antígeno flagelar H), ayudan a las
bacterias en la locomoción, y los pili sexuales, que actúan en el
intercambio genético y son codificados por plásmidos conjugativos (Quinn
et al., 2011).
Reservorios
En humanos, el principal reservorio de E. coli resistente a betalactámicos
es el tracto digestivo (García-Vásquez et al., 2011).
Los animales pueden ser reservorio de cepas comensales de E. coli, que
llevan potencialmente factores de virulencia implicados en el desarrollo de
patologías humanas (Bélanger et al., 2011; Reich et al., 2013). Este es el
caso de la cepa E. coli patogénica extraintestinal (ExPEC) causante de
colibacilosis aviar e infecciones extraintestinales en pollos y patos (Mellata
et al., 2003).
Cortés et al. (2010) han detectado E. coli en el tracto digestivo de cerdos,
perros, gatos, caballos, ganado bovino y aves de corral.
Transmisión
La transmisión de humano a humano se produce a través de los
alimentos; en los procesos de manipulación y preparación de la carne, la
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cual, se contamina durante el sacrificio, a partir del contenido fecal del
propio animal. (de Been et al., 2014; Miranda et al., 2008; Reich et al.,
2013).
E. coli se encuentran en el agua y suelo; su presencia en alimentos es un
indicador de contaminación fecal que al ser expulsado por las heces,
actúan como mediador epidemiológico de salubridad e higiene
poblacional (Zhao et al,. 2012). El nivel de contaminación es directamente
proporcional con el nivel de infección intestinal, excreción fecal e higiene
(Mellata et al., 2003).
Se ha sugerido también que E. coli aislado de la carne de pollo es el
agente causal más prevalente en infecciones urinarias, al comparar las
cepas aisladas de carcasas con las de urocultivos en seres humanos
(García-Apac, 2012; Vincent et al., 2010).
La importancia de esta bacteria como agente zoonótico, es la presencia
de cepas resistentes a los antibióticos betalactámicos en animales
destinados para consumo, considerándolos una posible fuente de E. coli
multirresistente, detectada cada vez más en alimentos de origen animal;
hecho que ha ganado importancia desde el año 2002 en todo el mundo
(Junying et al., 2012).
Mecanismos de resistencia
Resistencia es la capacidad natural o adquirida de las bacterias para
evitar la acción bactericida o bacteriostática de un agente antibacteriano.
(Aguirre-Íñiguez, 2012). Resistencia natural es un proceso de presión
selectiva que ejerce un antibiótico sobre las bacterias favoreciendo la
supervivencia de las más fuertes (Arce-Gil et al., 2013; García-Vásquez et
al., 2011). La resistencia adquirida se produce por cambios puntuales en
el ADN como la mutación, o por la adquisición del mismo mediante
plásmidos, transposones e integrones transferidos entre bacterias de una
misma o diferente especie (Aguirre-Íñiguez, 2012; Brunton, Lazo &
Parker, 2007).
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La transferencia horizontal parece tener un papel importante en la
diseminación y permanencia de resistencia a antibacterianos, entre
microorganismos que comparten características genéticas como el
tamaño del genoma más que por su proximidad filogenética (Frost,
Leplae, Summers & Toussaint, 2005; Jain, Rivera, Moore & Lake, 2003).
El principal mecanismo de propagación de resistencia de bacteria a
bacteria es la conjugación en donde la célula donante transfiere a través
del pili sexual material genético a la célula receptora (Quinn et al. 2011).
La resistencia a antibióticos betalactámicos puede ocurrir por disminución
de la permeabilidad, alteración de las proteínas fijadoras de penicilina
(PBP), eflujo e inactivación enzimática por betalactamasas (Castellas,
2012). Este último es el principal mecanismo de resistencia de
gramnegativos (García-Vásquez et al., 2011). Los mecanismos de
resistencia se detallan a continuación:
1. La disminución en la permeabilidad de la membrana externa
excluye la entrada de moléculas no hidrófilas y de tamaño
molecular superior a 600D, como los betalactámicos que son
demasiado voluminosos para atravesar los canales protéicos o
porinas. Es posible que mutaciones cromosómicas, produzcan
porinas alteradas, en cuyo caso el betalactámico no podrá
atravesar la membrana externa (Castellas, 2012).
2. Las PBP (transpeptidasas, carboxipeptidasas y endopeptidasas)
son enzimas encargadas del ensamble de la matriz rígida que
forma la pared celular bacteriana; el peptidoglucano. Al alterar su
estructura, impiden al antibiótico unirse a ellas e inhibir su acción
(Winn et al., 2011).
3. El mecanismo de eflujo consiste en bombas de expulsión de
desechos, incluidos antibacterianos. Estas bombas están
encadenadas desde la membrana plasmática al espacio
periplásmico y de allí a la membrana externa (Cavalieri, 2005).
-
14
4. Las betalactamasas son enzimas que hidrolizan el enlace amida
del anillo penicilánico o cefalosporínico para inactivar al antibiótico
betalactámico antes de que éste alcance sus PBPs (Aguirre-
Íñiguez, 2012). En las bacterias gramnegativas las betalactamasas
permanecen dentro de la célula e inactivan los betalactámicos en el
espacio periplásmico (Cavalieri, 2005).
Ambler clasificó las betalactamasas basándose en la estructura molecular
(Frère, Galleni, Bush & Didenberg, 2005), como lo muestra la tabla 3.
Tabla 3. Clasificación de betalactamasas según Ambler.
Clasificación Enzimas Espectro de resistencia
Clase A
Betalactamasas de
espectro extendido
Penicilinas
Cefalosporinas
Monobactam
Carbapenemasas
Penicilinas
Cefalosporinas
Monobactam
Carbapenemicos
Clase B Metalo
betalactamasas
Penicilinas
Cefalosporinas
Monobactam
Clase C AmpC
betalactamasas
Penicilinas
Cefalosporinas
Monobactam
Inhibidores de betalactamasas
Clase D OXA
betalactamasas
Penicilina
Inhibidores de betalactamasas
combinados con carbapenemicos
Fuente: Frère et al. (2005); van der Bij & Pitout (2012) Modificado por: La Autora
-
15
Las BLEE son enzimas que tienen mayor actividad sobre cefalosporinas
de tercera y cuarta generación como ceftazidima, cefotaxima y cefepime.
El ácido clavulámico inhibe a estas enzimas. (Abreu et al., 2013; Arce-Gil
et al., 2013; Lezameta, Gonzáles-Escalante & Tamaris, 2010). La
resistencia aparente a cefoxitina tiene poca duración por la selección
rápida de mutantes deficientes en porinas (Castellas, 2012). Los
principales genes que codifican BLEE son TEM, SHV, CTX-M y OXA.
(Reich et al., 2013).
Las AmpC tienen mayor afinidad sobre cefalosporinas de primera,
segunda generación como cefoxitina, en menor medida tercera o cuarta
generación como cefotaxima o cefepima y no son inhibidas por el ácido
clavulámico pero si de manera específica por el ácido borónico
(Britanialab, 2011; Castellas, 2012). Estas enzimas están codificadas en
el cromosoma de bacterias gramnegativas como Actinobacter spp.,
Morganella spp., Providencia spp. y Citrobacter freundii resistentes a
antibióticos de espectro extendido (Treviño et al., 2009). Los principales
genes que codifican AmpC son CMY y DHA (Alonso, 2014).
Mecanismos de transmisión de resistencia
Los genes que codifican betalactamasas pueden ubicarse en el
cromosoma bacteriano, en plásmidos, en elementos móviles de
transposición o de integración de ADN (Cavalieri, 2005).
Los plásmidos son el vehículo de difusión de una gran variedad de genes
de resistencia (Alonso, 2014). Estas estructuras están formadas por
fragmentos de ADN extracromosómicos de replicación autónoma. A pesar
de no constituir un factor de patogenicidad, son la principal forma de
propagación horizontal de genes de resistencia a los antibióticos (Arce-Gil
et al., 2013; van der Bij & Pitout, 2012).
Los transposones son segmentos de ADN que se movilizan de manera
autosuficiente de una zona a otra de un genoma y los integrones
-
16
estructuras genéticas que capturan genes en forma de casette que se
encuentran en el citoplasma bacteriano (Di Conza & Gutkind, 2010).
Antibióticos Betalactámicos
Los betalactámicos son antibióticos de acción bactericida lenta que
actúan en fase de división celular. Su similitud estructural con el extremo
D-alanina-D-alanina que enlaza las cadenas de N-acetilmurámico y N-
acetilglucosamina les permite actuar como sustrato competitivo de las
PBPs impidiendo la síntesis de la pared (García-Vásquez et al., 2011).
Finalmente activan una autolisina bacteriana endógena que destruye el
peptidoglucano (Marín & Guidiol, 2003). La clasificación de estos
antibacterianos se detalla en la tabla 4.
Tabla 4. Clasificación de los antibióticos betalactámicos.
Clase Grupo Betalactámico
Penicilinas
Penicilinas Naturales Penicilina G (Bencilpenicilina), Penicilina
V
Aminopenicilinas Ampicilina, Amoxicilina
Ureidopenicilinas Azlocilina, Mezlocilina, Piperacilina
Carboxipenicilinas Ticarcilina, Carbenicilina
Penicilinas resistentes
a penicilinasas
Meticilina, Nafcilina, Isoxazolpenicilinas
(Cloxacilina, Oxacilina, Dicloxacilina)
Cefalosporinas
Cefalosporinas 1G Cefazolina, Cefalotina, Cefradina,
Cefalexina, Cefadroxilo
Cefalosporinas 2G Cefamandol, Cefuroxima, Cefaclor
Cefalosporinas 3G
Cefixima, Cefpodoxima, Ceftibuten,
Cefdinir, Cefotaxima, Ceftizoxima,
Ceftazidima, Cefoperazona
Cefalosporinas 4G Cefepime, Cefpirome
Cefamicinas Cefalosporinas 2G Cefoxitina
Monobactámicos Aztreonam
Carbapenémicos Imipenem, Meropenem, Doripenem
Inhibidores de las
betalactamasas
Ácido Clavulámico Amoxicilina- Ácido Clavulámico
Sulbactam Ampicilina-Sulbactam
Tazobactam Piperacilina-Tazobactam
Fuente: Sumano-López & Ocampo-Camberros (2006) Modificado por: La Autora
-
CAPÍTULO III
METODOLOGÍA
Determinación de métodos a utilizar
Tipo de investigación
La investigación fue de tipo cualitativo, no experimental, observacional.
Diseño de la Investigación
Se utilizó un diseño transversal porque no se manipularon
deliberadamente las variables y descriptivo porque se recolectaron datos
de las variables en un punto único y definido en el tiempo.
Descripción de la zona de estudio
En el laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia la Universidad Central de Ecuador, ubicado en la calle
Jerónimo Leytón y Gatto Sobral; dentro de la Ciudadela Universitaria, se
llevó a cabo el procesamiento de las muestras y el análisis de los
resultados obtenidos.
El muestreo se realizó en camales industriales ubicados en las parroquias
de Pintag, Puembo, Carcelén, San Antonio y Tababela; del cantón Quito y
la parroquia de Ascázubi del cantón Cayambe situados en la provincia de
Pichincha (Gráfico 1).
-
18
Tomado de: Wikimedia Commons Modificado por: La Autora
Población y Muestra
La población estuvo conformada por todas las aves faenadas de una
parvada (granja), en seis camales industriales pertenecientes a seis
empresas de la provincia de Pichincha que colaboraron en el estudio,
proporcionando una muestra por cada granja faenada durante cada ciclo
productivo, en un período de seis meses.
Se denominó a las muestras con un código alfanumérico (Tabla 5).
Gráfico 1.- Ubicación de los camales industriales en la provincia de Pichincha.
-
19
Tabla 5. Códigos de las muestras según la empresa de la que provienen.
Código de la Empresa Ubicación de la Planta Faenadora
1 CT Pintag
2CT San Antonio de Pichincha
3CT Carcelén
4CT Ascázubi
5CT Puembo
6CT Tababela
Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora
Se aplicó un muestreo no probabilístico, consecutivo y aleatorio de
parvadas de aves faenadas. La muestra estuvo conformada por un pool
de 25 gramos de contenido cecal. Posteriormente se procesaron las
muestras siguiendo la norma International Organization for Standarization
6579 (ISO, 2002) para detección de Salmonella spp. móvil en fecas.
Procedimiento de la Investigación
Técnicas e instrumentos de recolección de muestras
La toma de muestras se llevó a cabo en el área de evisceración de los
camales, colectando manualmente un ciego por pollo faenado. Los 25
ciegos fueron almacenados en una funda estéril previamente identificada.
Estas muestras se enviaron al laboratorio para el análisis bacteriológico.
Técnicas e instrumentos de recolección de información
La información de cada muestra fue levantada mediante el uso de una
encuesta (Anexo A); se indagó datos referentes a la granja (nombre,
ubicación, edad de faenamiento de las aves) y terapéutica utilizada
durante la crianza del lote.
-
20
Técnicas de laboratorio
El laboratorio contó con la infraestructura adecuada para un nivel de
bioseguridad II, como lo recomienda la norma ISO 6579 (2002), ciertos
procedimientos se efectuaron en una cabina o cámara para evitar la
contaminación cruzada entre muestras y al operador. Se procuró seguir
las recomendaciones de bioseguridad para aislamiento de bacterias
riesgo tipo II proporcionadas por la OMS (2005), con respecto al uso de
mandil, guantes y mascarilla. El esquema de trabajo se detalla en el
Anexo B.
a. Procesamiento de la muestra
Se colocaron los ciegos en un vaso de precipitación con alcohol al 70
porciento (%) por cinco minutos. Pasado ese tiempo, se los extendió en
una superficie plana y estéril con el objeto de retirar el exceso de alcohol.
Se seccionó su parte distal para extraer un gramo del contenido, el cual
se colocó en una funda estéril y se homogenizó haciendo pequeñas
presiones para formar un pool.
b. Aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos
Se tomó una asada del pool de heces y se realizó una siembra directa en
agar TBX más Cefotaxima (TBX+C) a razón de 1miligramo por litro (mg/L)
(Anexo C). Se incubó a 37°C por 24 horas.
Interpretación de resultados: Los criterios de positividad se tradujeron
en base a la presencia de colonias azul verdosas, de diferentes tamaños,
lisas, regulares y de consistencia cremosa; o negatividad en presencia de
colonias blancas, mucosas y sin brillo, además, con la prueba de TSI
(Anexo D) se confirmó los resultados de dos colonias de cada cepa.
c. Técnica de Doble Disco
Se realizó una suspensión de bacterias colocando cuatro a cinco colonias
azul verdosas idénticas obtenidas de un cultivo puro, en 10 mililitros (ml)
de suero fisiológico estéril, a una concentración de 0,5 Mac Farland
-
21
(Anexo E). Posteriormente se sembró homogéneamente esta suspensión
en cajas Petri con agar Mueller Hinton (Anexo F). Se dispuso sobre el
agar, discos de inhibición con: cefotaxima (CTX), cefotaxima más ácido
clavulámico (CTX+C), ceftacidima (CAZ), ceftacidima más ácido
clavulámico (CAZ+C), cefepime (FEP), cefepime más ácido clavulámico
(FEP+C), cefoxitina (CFO) y ácido borónico (BORON); de acuerdo al
gráfico 2. Se incubó a 37°C por 24 horas.
Gráfico 2.- Ubicación de discos de inhibición en el agar Mueller Hinton.
Tomado de: Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2009
La estandarización de la técnica se efectuó utilizando las cepas de
Klebsiella pneumonie American Type Culture Collection (ATCC) 700603
como control positivo y de E. coli ATCC 25922 como control negativo.
Interpretación de resultados:
Cepas BLEE: Se observó en los halos de inhibición, una diferencia mayor
a 5 mm entre CTX y CTX+C, CAZ y CAZ+C y/o FEP y FEP+C; cualquiera
de las tres formas o las tres, siendo siempre mayor la medida de los halos
pertenecientes a los antibióticos combinados con el ácido clavulámico,
-
22
además de la sinergia que habrá entre los halos de CTX y CTX+C, CAZ y
CAZ+C y/o FEP y FEP+C (Gráfico 3).
Gráfico 3.- Cepas BLEE; sinergia entre halos de inhibición.
Tomado de: Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2009
Cepas AmpC: Se observó en los halos de inhibición, una diferencia menor
a 5 mm entre CTX y CTX+C, CAZ y CAZ+C y FEP y FEP+C; siempre las
tres formas juntas, además de la sinergia entre los halos de BORON y
CTX y/o CAZ (Gráfico 4).
Gráfico 4.- Cepas AmpC; Sinergia entre halos de inhibición.
Tomado de: Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), 2009
-
23
d. Crioconservación de cepas de E. coli resistente a
betalactámicos
Partiendo de un cultivo puro se sembró dos colonias azul verdosas de
cada cepa en dos tubos Eppendorf con 300 microlitros (µl) de caldo
triptosa (TSB) (Anexo G), se incubó a 37°C por 24 horas, se agregó 600
µl de glicerol estéril, se homogenizó y se guardó a -80°C.
Procesamiento y análisis de datos
La información de cada muestra, los procedimientos diarios y los
resultados se registró en un cuaderno de laboratorio y en una base de
datos creada en Microsoft Excel®, también se realizó un informe de los
resultados (Anexo H).
Para obtener el porcentaje del total de aislamientos positivos de E. coli
resistente a betalactámicos, el uso de antibióticos en las parvadas y la
cantidad de cepas BLEE y AmpC, se empleó una fórmula mencionada por
Esper & Machado en 2008, la cual se indica a continuación:
p =
Donde:
Xi = Número de casos positivos
P = Proporción
M = Número total de muestra
-
CAPÍTULO IV
RESULTADOS
Aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos
Se aisló E. coli resistente a betalactámicos, en agar TBX (Tryptone Bile X-
Glucuronide Medium) suplementado con Cefotaxima y se confirmó con la
prueba de TSI como lo detallan los gráficos 5 y 6.
Gráfico 5.- Aislamiento positivo de E. coli resistente a betalactámicos.
Fuente: La Autora
Gráfico 6.- Prueba de TSI para confirmar la presencia de E. coli.
a: Reacción negativa a presencia de E. coli. b: Reacción positiva a presencia de E. coli. La fermentación de los azúcares glucosa, lactosa y sacarosa acidifica el medio, esto es detectado por el indicador rojo fenol, que lo teñirá de color amarillo. Fuente: La Autora
a) b)
-
25
En base a esto, durante los seis meses de muestreo se alcanzaron 177
muestras positivas a E. coli resistente a betalactámicos de un total de
187; equivalente al 94,7%. El número de muestras obtenidas por empresa
fue desigual debido al tamaño y características de cada empresa, esta
situación se detalla en la tabla 6.
Tabla 6. Resultados de aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos del contenido cecal de pollos faenados en seis camales.
PLANTAS DE
FAENAMIENTO
RESULTADOS
Número de
muestras
obtenidas
Número de
muestras
positivas
Porcentaje de
muestras
positivas
1 CT 97 88 90,7
2CT 40 40 100,0
3CT 17 16 94,1
4CT 12 12 100,0
5CT 15 15 100,0
6CT 6 6 100,0
Total de muestras 187 177
Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora
Uso de antibióticos en las parvadas muestreadas
Las encuestas permitieron obtener información heterogénea del uso de
antibióticos en granja, ya que en cada empresa se utiliza diferente tipo de
antibióticos, a diferentes dosis y en diferentes edades. En la tabla 7 se
especifica el porcentaje de uso de antibióticos en las parvadas.
-
26
Tabla 7. Porcentaje de uso de antibióticos en las parvadas.
Antibióticos %
Fluoroquinolonas 61
Macrólidos 17
Fenicoles 17
Fosfonatos 16
Tetraciclinas 14
Pleuromutilinas 8
Aminoglucósidos 7
Betalactámicos 6
Sulfas 4
Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora
Determinación fenotípica de E. coli resistente a betalactámicos por la
técnica de Doble Disco
Mediante la Técnica de Doble Disco se pudo observar el fenotipo
característico de cepas BLEE y AmpC (Gráfico 7).
Gráfico 7.- Fenotipos de cepas de E. coli.
a: Cepa BLEE. b: Cepa AmpC Fuente: La Autora
a) b)
-
27
Al realizarse la técnica de doble disco en dos colonias de cada una de las
177 muestras positivas, se reveló que el 70,1% (124 muestras) comparten
el mismo fenotipo BLEE, el 14,7% (26 muestras) comparten el mismo
fenotipo AmpC y el 15,3% (27 muestras) tuvieron fenotipos BLEE y AmpC
como lo demuestra el gráfico 8.
Gráfico 8.- Resultado de técnica de doble disco en las muestras positivas a E. coli.
Fuente: Investigación directa Elaboración: La Autora
DISCUSIÓN
El cultivo directo en agar TBX+C, ha demostrado ser un método eficaz
para el aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos. Así, en un
estudio para detección de E. coli en contenido cecal de broilers, el
aislamiento por cultivo directo en TBX+C proporcionó entre 5,5 y 5,8
unidades formadores de colonias por gramo (UFC/g Log10), indicando que
este método es apropiado para monitorear E. coli resistente a
betalactámicos (Pérez-Celorio, 2015). Adicionalmente, un estudio
-
28
comparativo donde se evaluaron varios medios de cultivo en muestras de
alimentos a base de carne de pollo, determinó que el agar TBX es uno de
los mejores medios para la detección de E. coli, con especificidad de
100% y sensibilidad 89,5% (Abdul-Rahman, Abdullah-Sani & Abdul-Aziz,
2012; Sanchis-Solera, 2009).
El aislamiento de E. coli resistente a betalactámicos en contenido cecal de
pollos destinados a consumo humano, reveló que el 94,7% (número de
muestras [n] = 187) de las muestras de este estudio, fueron positivas.
Investigaciones realizadas en Ecuador reportaron una prevalencia de
86,9% (n = 145) y 100% (n = 10) utilizando el mismo protocolo con el que
se realizó esta investigación (Pérez-Celorio, 2015; Vásconez-Paucar,
2014).
Los resultados concuerdan con indagaciones realizadas en México, en
donde se encontró una prevalencia de 71,4% (n = 20) de muestras
aisladas de carcazas de pollo (Sanchez, Castañeda & Cortés, 2014).
Mientras que en España, se determinó una prevalencia media de E. coli
resistente a betalactámicos de 86,6% (n = 261) en muestras rectales de
pollos de engorde (Abreu et al. 2013). Otro ensayo realizado en
Dinamarca identificó una prevalencia de 98% (n = 94) en carne de pollo
(Leverstein-van Hal et al., 2011). En Holanda se obtuvo una prevalencia
de 80% (n = 41) en hisopados cloacales de aves de engorde (Dierick et
al., 2013b). Estos datos corroboran la alta prevalencia de E. coli resistente
a betalactámicos a nivel mundial.
El uso extensivo de antibióticos en los sistemas de crianza de pollos
broiler, se ve reflejado por las cifras recopiladas en un estudio realizado
con E. coli en pacientes holandeses, en donde se indica que la resistencia
a las cefalosporinas ha aumentado de un 0,1% en 2000 hasta el 4,3% en
2009 (Pelayo, 2012).
Se ha demostrado que las tasas más altas de producción de E. coli y
Klebsiella pneumoniae resistentes a betalactámicos, provienen de
América Latina (34,6%), comparado con Europa (19,7%) y Norte América
(10%) (García-Apac, 2012).
-
29
Adicionalmente, una investigación realizada en Estados Unidos identificó
que la carne de pollo presenta un mayor porcentaje de bacterias
resistentes (83,5%) a varios antibióticos en comparación a otras fuentes
cárnicas (Zhao et al., 2012). Estos datos pueden ser atribuíbles al uso
inadecuado de antibióticos tanto en producción pecuaria como en
medicina humana.
Las proporciones de E. coli BLEE (77,7%) y AmpC (22,3%) obtenidas en
este estudio coinciden con datos alcanzados en diferentes países. Así, un
estudio realizado en Alemania, reportó que el 72,5% de aislados de 51
muestras de ciego de pollo presentaron genes BLEE y 56,9% genes
AmpC. En el mismo estudio se encontró cepas BLEE en 88,6% y AmpC
en 52,9%, aislados de 70 carcasas (Reich et al,. 2013). Más, una
investigación en Japón demostró que el 66% de cepas de E. coli aisladas
de 41 muestras rectales de pollo de engorde fueron AmpC y el 43%
fueron BLEE (Kameyama et al., 2013), lo que se puede adjudicar a la
contaminación cruzada de cepas clonales y propagación de las mismas
entre granjas, asegura la fuente.
Los resultados fenotípicos de E. coli BLEE y AmpC expuestos en este
estudio son los primeros informes en Ecuador a nivel de producción
avícola; sin embargo, estudios más detallados de estas cepas
demostrarán la epidemiología de los genes de resistencia a antibióticos
betalactámicos en la cadena alimenticia.
-
CAPÍTULO V
CONCLUSIONES
Las granjas industriales de crianza de pollos broiler examinadas en este
estudio presentan una alta prevalencia de E. coli BLEE/AmpC.
Las cepas BLEE fueron 3,6 más prevalentes, en relación a la cantidad de
cepas AmpC identificadas por la Técnica de Doble Disco.
El uso extensivo de antibióticos en la crianza de pollos broiler, podrían
desencadenar una exclusión competitiva a favor de bacterias resistentes
a los mismos.
RECOMENDACIONES
Realizar estudios genéticos para identificar los genes más prevalentes en
las muestras analizadas.
Investigar la presencia de bacterias resistentes a betalactámicos, en
niveles posteriores al procesamiento de pollo broiler en los camales.
Proponer un programa de monitoreo de bacterias resistentes a
betalactámicos en aves destinadas para consumo humano.
-
31
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40
Universidad Central
del Ecuador
ANEXOS
Anexo A
Encuesta para la identificación de las muestras.
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
Identificación de muestras
ID:……………………………………………
Fecha :
Lote:
Edad:
Nombre de la granja:
Ubicación de la granja:
Número de galpones en la granja:
Antibióticos usados al nacimiento en incubadora (dosis):
Antibióticos usados en la recepción (dosis y número de días):
Promotores de crecimiento usados en el alimento (dosis):
Antibióticos usados en tratamientos 1 recepción (dosis y número de días):
Antibióticos usados en tratamientos 2 recepción (dosis y número de días):
Antibióticos usados en tratamientos 3 recepción (dosis y número de días):
Enfermedades asociadas a bacterias
Observaciones:
Tomado de: Investigación directa
-
41
Anexo B
Esquema de Aislamiento de Escherichia coli resistente a
betalactámicos y Método de Doble Disco
Tomado de: Investigación directa. Elaboración: La Autora
Recolectar 25 ciegos de pollos y llevarlos en un cooler con hielo al laboratorio
Incubar por 24h a 37°C
Colocarlos en alcohol por 5 minutos
Secar los ciegos sobre una superficie estéril y cortarlos sobre la ampolla cecal
Pesar 25g de heces, tomando 1g por cada ciego. Homogenizar
Tomar una asada de la muestra y sembrar en agar TBX+C
Observar colonias azules
Sembrar 2 colonias en agar TSI Incubar por 24h a 37°C
Positiva: A/A+G Negativa
Autoclavar
Tomar 2 asadas desde TSI y
colocarlas en un tubo eppendorf
con 300 ul de caldo triptosa
Tomar una asada de la muestra y sembrar en
agar TBX+C
Incubar por 24h a 37°C Incubar por 24h a 37°C
Adicionar 600ul de glicerol,
homogenizar y guardar la cepa
en el ultracongelador (-
80°C)
Tomar de 4 a 5 colonias y diluirlas en 10 ml de suero fisiológico estéril
asada de la muestra y sembrar en agar TBX+C
Con un hisopo embebido en la dilución realizar 5 estriaciones en el agar Mueller Hinton Colocar
sobre el agar los 8 discos de antibióticos
Incubar por 24h a 37°C
Observar la sinergia entre los halos de inhibición de cada antibiótico y, según eso, designar el tipo de gen que tiene la cepa
Medir el diámetro de los halos de inhibición de cada antibiótico
Autoclavar
-
42
Anexo C
Descripción de Tryptone Bile X-Glucuronide Medium® (TBX Agar)
Escherichia coli, es la única bacteria coliforme que posee la enzima
glucoronidasa la cual rompe el complejo cromogénico-glucorónido
presente en el agar TBX, liberando al cromóforo que tiñe de una
coloración azul verdosa a las células, al acumularse dentro de ellas. Las
sales biliares impiden el crecimiento de las bacterias gram positivas, la
cefotaxima permite el crecimiento de bacterias resistentes a
betalactámicos y la triptosa proporciona los nutrientes esenciales para el
crecimiento de los organismos.
Fórmula en g/L de agua destilada
Triptona 20,000
Sales Biliares 1,500
Agar 0,075
X-b-D-glucorónido 15,000
Fuente: Scharlau (2013)
Preparación
Disolver 33,6 gramos de polvo en 1 litro de agua destilada. Esperar 5
minutos y mezclar hasta obtener una suspensión homogénea. Calentar
lentamente agitando con frecuencia, y llevar a ebullición hasta disolver
completamente. Esterilizar en el autoclave a 121ºC durante 15 minutos,
pH final 7,5 ± 0,2. Colocar 1 miligramo de Cefotaxime sodium salt® por 1
litro de agar TBX, cuando la temperatura del medio sea de
aproximadamente 50ºC y se vaya a disponerlo en las cajas Petri.
Conservar el recipiente cuidadosamente cerrado en un lugar fresco y
seco, al abrigo de la luz intensa.
-
43
Anexo D
Descripción de Triple Sugar Iron Agar® (TSI Agar)
Empleado para la diferenciación de enterobacterias. El extracto de carne
y la pluripeptona aportan con nutrientes. El cloruro sódico mantiene el
equilibrio osmótico del medio. La lactosa, sacarosa (10 partes; 1.0%
respectivamente) y glucosa (1 parte; 0.1%) son hidratos de carbono cuya
fermentación realizada por Escherichia coli se lleva a cabo en condiciones
aeróbicas (pico de flauta) y anaerobias (capa inferior) cambiando el pH
del medio, lo que es detectado por el indicador rojo fenol, que modificará
visiblemente a color amarillo por debajo de un pH de 6,8 (Winn et al.,
2013). La presencia de burbujas de aire, rupturas o grietas en el fondo del
agar, presión de gas en los tubos cerrados o el empuje de la totalidad de
la inclinación hacia la abertura del tubo indican la producción de hidróxido
de carbono (CO2) o hidrógeno (H2) a partir de la fermentación de la
glucosa (Forbes et al., 2007). El tiosulfato sódico es la fuente de átomos
de azufre, para que se reduzca a sulfuro de hidrógeno (SH2) se necesita
un medioambiente ácido (Winn et al., 2013), éste a su vez se combina
con las sales de hierro (sulfato ferroso y citrato de amonio férrico, que
constituyen el indicador) para formar sulfuro ferroso (FeS); un precipitado
negro insoluble. El agar produce la solidificación del medio.
Fórmula en g/L de agua destilada
Extracto de carne 10,000
Pluripeptona 10,000
Cloruro de sodio 5,000
Lactosa 10,000
Sacarosa 10,000
Glucosa 1,000
Sulfato ferroso y citrato de amonio férrico 0,200
Tiosulfato de sodio 0,200
Rojo de fenol 0,025
Agar 13,000
Fuente: BD Biosciences (2003)
-
44
Anexo E
Descripción de Escala de Mc Farland
El ácido sulfúrico se une al cloruro de bario con el propósito de generar
precipitación para formar una solución de turbidez reproducible. El
cloruro de bario produce la formación de un precipitado de sulfato de
bario suspendido.
Fórmula aproximada por 100 ml de agua destilada
Ácido sulfúrico 0,18M 99,5 ml
Cloruro de bario 0,048 M 0,5 ml
Fuente: BD Biosciences (2005)
Preparación
Se debe añadir ácido sulfúrico a una solución acuosa de cloruro de bario.
-
45
Anexo F
Descripción de Mueller - Hinton® (Agar MH)
Medio de cultivo que se utiliza de forma rutinaria para la realización de
antibiogramas en medio sólido pues presenta una buena reproducibilidad
en las pruebas de sensibilidad, su contenido de inhibidores de
sulfonamidas trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayoría de los
patógenos microbianos crece satisfactoriamente.
Fórmula en g/L de agua destilada
Infusión de carne 300,000
Peptona ácida de caseína 17,500
Almidón 1,500
Agar 15,000
Fuente: Britanialab (2010)
Preparación
Disolver 36 gramos de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar hasta
obtener una suspensión homogénea. Calentar lentamente agitando con
frecuencia, y llevar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar
en el autoclave a 121ºC durante 15 minutos. pH final 7,3 ± 0,1. Repartir en
cajas petri.
-
46
Anexo G
Descripción de Trypton Soya Broth® (Caldo TSB)
Medio líquido nutritivo que favorece el crecimiento de una amplia variedad
de microorganismos, en especial las bacterias aerobias facultativas y
aerobias comunes no exigentes en exceso.
Fórmula en g/L de agua destilada
Digerido pancreático de caseína 17,000
Digerido péptico de harina de soja 3,000
Glucosa (dextrosa) 2,500
Cloruro sódico 5,000
Fosfato dipotásico de hidrógeno 2,500
Fuente: BD Biosciences (2008)
Preparación
Disolver 30 gramos de polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar hasta
obtener una suspensión homogénea. Calentar lentamente agitando con
frecuencia, y llevar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar
en el autoclave a 121ºC durante 15 minutos. pH final 7,3 ± 0,2. Repartir en
tubos.
-
47
Anexo H
Informe de resultados de Doble Disco en cepas de Escherichia coli
resistentes a betalactámicos
Fecha:
Muestras:
Responsable:
Colonia
a
Diámetro
(mm) Efecto
Colonia
b
Diámetro
(mm) Efecto
BOR
BOR
CFO