Universidad de Colima

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AGROPECUARIAS

DIVERSIDAD GENÉTICA DE Mycosphaerella fijiensis Morelet EN PLÁTANO ENANO GIGANTE (Musa acuminata AAA) CULTIVADO

CON DIFERENTE MANEJO

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS: ÁREA BIOTECNOLOGÍA

PRESENTA

GILBERTO MANZO SÁNCHEZ

Tecomán, Colima, México Junio de 2001

INDICE

Página

INDICE DE CUADROS Y FIGURAS v RESUMEN vii I INTRODUCCIÓN 1 II REVISIÓN DE LITERATURA 5 2.1 Interacción planta-patógeno 5

2.2 Genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos 6

2.3 Estructura genética de poblaciones 7 2.4 Factores que influyen en la estructura genética 8

de poblaciones 8 2.4.1 Mutación 8 2.4.2 Recombinación 9 2.4.3 Flujo de genes 10 2.4.4 Selección 11

2.5 Uso de los marcadores de DNA en hongos fitopatógenos 12 2.5.1 Polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) 13 2.5.2 DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPD) 14 2.5.3 Polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP) 15 2.5.4 Microsatélites o secuencias repetidas simples (SSR) 17

2.6 El cultivo del plátano (Musa spp.) 19 2.7 Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) 20

2.7.1 Identificación y clasificación de M. fijiensis 21 2.6.2 Desarrollo de los síntomas de la enfermedad de

la sigatoka negra 26

2.6.3 Interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis 27 2.6.4 Fitoalexinas de M. fijiensis 28 2.6.5 Variabilidad patógena 29 2.6.7 Marcadores de DNA 30 III MATERIALES Y MÉTODOS 33 3.1 Lugar de realización 33 3.2 Muestreo 35 3.3 Aislamiento de M. fijiensis 35 3.4 Cultivo de M. fijiensis en medio líquido 35 3.5 Extracción del DNA genómico de M. fijiensis 36

3.6 Marcadores RAPDs en M. fijiensis 37 3.7 Microsatélites en M. fijiensis 38 3.8 Visualización de los productos 39 3.9 Análisis de los datos 39

IV RESULTADOS 41 4.1 Caracterización morfológica de M. fijiensis 41 4.2 Análisis de los marcadores RAPDs 41 4.4 Análisis de los microsatélites 48 V DISCUSIÓN 54 5.1 Caracterización morfológica de M. fijiensis 54 5.3 Análisis de los marcadores de RAPD en M. fijiensis 54 5.4 Análisis de los marcadores de SSR en M. fijiensis 56

VI CONCLUSIÓN 58 VII BIBLIOGRAFÍA CITADA 59

INDICE DE CUADROS

Cuadro Descripción

Página

INDICE DE FIGURAS

Figura Descripción Pagina

1 Características y propiedades de distintas técnicas de marcadores de DNA. 17 2 Principales plagas y enfermedades que afectan al cultivo de plátano (Musa spp.) a nivel mundial

20 3 Fungicidas usados en las plantaciones de plátano en América Latina. 21 4 Características de los huertos de plátano cultivar enano gigante que fueron muestreados para el

aislamiento de Mycosphaerella fijiensis. 34

5 Lista de los iniciadores utilizados en la determinación de los RAPD de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

38

6 Lista de los iniciadores utilizados en la determinación de los SSR de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

39

7 Apariencia en medio PDA de la morfología de 3 aislados de Mycosphaerella fijiensis. INIFAP-Tecomán (INI-2), poblados de Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).

41

8 Aislamientos monospóricos obtenidos de Mycosphaerella fijiensis de la región productora del estado de Colima.

42

9 Iniciadores al azar, secuencia, número total de bandas amplificadas y polimórficas en los aislados de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos.

44

10 Secuencias de los iniciadores de microsatélites, tipo de repetición y número de alelos en los aislados de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

51

1 Distribución de Mycosphaerella fijiensis en el mundo. 21 2 Conidios de Mycosphaerella fijiensis. 25 3 Ciclo de vida del hongo Mycosphaerella fijiensis causante de la sigatoka negra 27 4 Mapa de las localidades muestreadas para el aislamiento de Mycosphaerella fijiensis.

33 5 Características morfológicas de los aislados de Mycosphaerella fijiensis de tres predios de manejo

diferente de la región del Estado de Colima. INIFAP-Tecomán (INI-2); Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).

43

6 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador A-01 (5 CAGGCCCTTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

44

7 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador H-12 (5´ ACGCGCATGT 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

45

8 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-07. (5 CCGTGACTCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

46

9 Marcadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador P-13 (5´ GGAGTGCCTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb, carril 1: INI-3, carril 2 : INI-6, carril 3 : GLE-4, carril 4: PC-2, carril 5 : ORT-3 y carril 6 : GLE-4.

47

10 Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-O4 (5´ GGCGGTTGTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

48

11 Marcadores RAPD de aislados de Mycosphaerella fijiensis generado por el iniciador H-06 (5´ ACGCATCGCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

49

12 Dendrograma derivado de UPGMA de los análisis de seis iniciadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis de 6 campos con diferente manejo técnico (CA-2 e IN-3: Rústicos; IB-4 y CO-1: Intensivo; ORT-4 y FIE-3 : Semintensivo). Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 replicas.

50

13 Análisis de microsatélites para el locus MfSSR175 de 17 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos.

51

14 Análisis de microsatélites para el locus MfSSR005 de 17 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos.

52

15 Dendrograma derivado de UPGMA de los análisis de SSR de 16 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de huertos de plátano con tres manejos distintos. Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 replicas.

53

DIVERSIDAD GENÉTICA DE Mycosphaerella fijiensis Morelet EN PLÁTANO ENANO GIGANTE (Musa acuminata AAA) CULTIVADO

CON DIFERENTE MANEJO

GILBERTO MANZO SÁNCHEZ

Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias

DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPD) y secuencias simples repetidas (SSR) fueron usadas

para determinar la diversidad genética del hongo Mycosphaerella fijiensis Morelet, causante de la sigatoka negra

del plátano, presente en la región productora del cultivar enano gigante del Estado de Colima. 20 aislamientos

monospóricos de M. fijiensis, fueron obtenidos de parcelas con diferente grado de manejo. Los iniciadores RAPD

obtuvieron 51 bandas polimórficas de un total de 58 bandas, el índice de similaridad entre los aislados fueron

analizados y el rango fue de 0.00-0.40. El método promedio aritmético de grupos de pares no ponderados

(UPGMA) reveló dos grupos, uno a los aislamientos procedentes de parcelas con manejo rústico (R) y el otro

grupo a los de manejo semintensivo (SI) e intensivo (IN). Sin embargo, con los SSR, todos los aislados

presentaron un solo haplotipo para el locus MfSSR175 y con el locus MfSSR005 se obtuvieron de uno a tres

alelos, demostrando con esto un elevado nivel de flujo de genes entre las localidades analizadas. Los resultados

muestran que el nivel de tecnificación influye en la diversidad genética del hongo M. fijiensis.

Palabras claves : sigatoka negra, marcadores de DNA, RAPD, SSR, diversidad genética, control químico.

GENETIC DIVERSITY OF Mycosphaerella fijiensis Morelet IN BANANA

GIGANT NAINE (Musa acuminata AAA) WITH DIFFERENT

MANAGEMENT

GILBERTO MANZO SÁNCHEZ

Universidad de Colima, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias

Ramdomly amplified polymorphic DNA (RAPD) and simple sequence repeat (SSR) markers were used

to evaluated genetic diversity of fungi Mycosphaerella fijiensis Morelet, causal agent of black sigatoka of banana,

present in the growth region of cultivar gigant naine of Colima State. 20 single spore isolates of M. fijiensis, were

obtenied of farms with several level of management. The primers RAPD yielded 51 polymorphic bands of a total

of 58 bands, the similarities index between the isolates was analyzed and the range was from 0.00-0.40.

Unweighted pair-group method with arithmetic average (UPGMA) cluster analysis revelated two group, one

formed by isolates obtenied from fields with rustic handling (R) and the other group obtenied of semintensive

handling (SI) and intensive (IN). However, with the SSR, all the isolates presented a single haplotype for the

locus MfSSR175 and with the locus MfSSR005 was obtained of one to three alelos, demonstrating a high level of

gene flow between analyzed locations. The results showed that the level of tecnification influences in the genetic

diversity of fungus M. fijiensis.

Key words : black sigatoka, DNA markers, RAPD, SSR, genetic diversity, chemical control.

I INTRODUCCIÓN

Las plantaciones agrícolas ocupan entre 100 y 130 millones de hectáreas (ha) a escala mundial (Swayer,

1993). Un gran porcentaje de la producción de estas plantaciones se ven afectadas por organismos fitopatógenos

y fitoparasitos, entre los que se encuentran los micoplasmas, bacterias, hongos, nematodos, protozoarios, virus y

plantas parásitas (Staskawicz et al., 1995).

Los daños causados por los organismos fitopatógenos, ascienden a billones de dólares por efecto en la

reducción de casi un 20% de la producción en los principales cultivos (Oerke et al., 1994; Baker et al., 1997). Las

pérdidas podrían ser más severas sí variedades altamente susceptibles son cultivadas extensivamente (Schwinn,

1992).

Lo anterior, explica por que el objetivo de varias investigaciones está enfocado hacia la protección de los

cultivos contra las enfermedades que son causadas por patógenos y así poder satisfacer y mantener la demanda de

los alimentos en el mundo (Herrera-Estrella y Simpson, 1995; Baker et al., 1997).

El control de las enfermedades se ha basado principalmente en la aplicación de agroquímicos, prácticas

culturales y uso de variedades resistentes (Herrera-Estrella y Simpson, 1995). Sin embargo, estas estrategias de

control en casos muy raros han mantenido su efectividad por un periodo largo (Johnson, 1984). Además, la

aplicación indiscriminada de agroquímicos ha generado efectos nocivos en el medio ambiente y en la salud

humana (James et al., 1993; De Waard et al., 1993; Garry, et al., 1989).

Lo anterior es una respuesta a que las poblaciones de patógenos deben de adaptarse a cambios en su medio ambiente para sobrevivir; sin embargo, en los ecosistemas agrícolas, los cambios ambientales según McDonald, (1997) pueden incluir el uso de variedades resistentes, aplicaciones de fungicidas químicos, fertilizantes, irrigación y rotación de cultivos. Es claro que las características de los sistemas agrícolas intensivos, basados en gran parte sobre la

uniformidad de cultivos imponen una fuerte selección direccional sobre las poblaciones de los patógenos, a través

de su habilidad para desarrollarse y adaptarse rápidamente a medidas de control genético o químico (Milgroom y

Fry, 1997; McDonald, 1997). Por lo tanto, el interés de las estrategias de control deberá ser una población en

lugar de un individuo, de tal modo que en los estudios patológicos de plantas, deberá enfocarse un mayor

esfuerzo sobre el entendimiento de la genética de poblaciones para entender como las poblaciones se

desarrollarán en respuesta a diferentes estrategias de control (McDonald, 1997).

La estructura genética de poblaciones, según McDonald y McDermott, (1993), es la cantidad y

distribución de la variación genética que existe dentro y entre poblaciones de los patógenos. Su conocimiento es

fundamental para saber con que rapidez se puede desarrollar y adaptar un patógeno y eventualmente esta

información puede ser usada para predecir en que periodo de tiempo un método de control puede ser más

efectivo, ya que las poblaciones con un alto nivel de variabilidad genética pueden adaptarse más rápidamente a

hospederos resistentes y/o fungicidas. Los factores que influyen en los cambios de la estructura genética de las

población según McDonald et al., (1989) son: mutación, recombinación, flujo de genes y selección.

El uso de pesticidas para el control de plagas agrícolas es una práctica común, las aplicaciones continuas

de estos provocan el desarrollo de la resistencia en las poblaciones de hongos fitopatógenos (Georgopoulos,

1987), siendo uno de los problemas mas serios en la agricultura a nivel mundial (Staub, 1991). Sin embargo, la

evolución de la resistencia involucra cambios en las frecuencias de genes que controlan la resistencia, un

entendimiento de los cambios genéticos a nivel de población es importante para desarrollar métodos adecuados y

eficientes en el manejo de enfermedades (Adachi et al., 1996)

La resistencia a fungicidas es una de las preguntas más importantes en el estudios de la genética de

poblaciones de hongos fitopatógenos enfocados sobre como las poblaciones de los patógenos reflejan en

particular este proceso de selección (McDonald, 1997), pero, en la actualidad existen pocos estudios sobre la

genética de la resistencia a fungicidas en hongos fitopatógenos (Adachi et al., 1996; Yourman et al., 2000). Este

tipo de estudios podrían demostrar los procesos que ocurren durante una evolución hacia la resistencia de

funguicidas (Adachi et al., 1996).

Una de las herramientas para poder determinar estos factores, son los marcadores de DNA como son los

polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs) (Botstein et al., 1980), DNAs polimórficos

amplificados al azar (RAPD) (Williams et al., 1990; Welsh y McClelland, 1990), los microsatélites o secuencia

repetidas simples (SSR) (Jeffryes et al., 1985; Tautz y Renz, 1984), y los polimorfismos de la longitud de

fragmentos amplificados (AFLPs) (Vos et al., 1995), estos se han utilizado ampliamente en el estudio de la

genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos (Michelmore y Hulbert, 1987; Weising et al., 1995;

McDonald, 1997).

La enfermedad de gran importancia mundial que afecta al cultivo del plátano (Musa spp.) es la sigatoka

negra, causada por el hongo ascomiceto Mycosphaerella fijiensis Morelet (Mourichon y Stover, 1998), el cual

provoca actualmente los mayores daños económicos, causa necrosis, reduce el área foliar de la planta y por lo

tanto disminuye el rendimiento de fruta (Stover, 1980), tiene los dos tipos de reproducción y es heterotálico

(Mourichon y Zapater, 1990), dando como consecuencia una mayor recombinación genética de este hongo. Esta

enfermedad es controlada principalmente con la aplicación de fungicidas (Stover y Simmonds, 1987), lo que

implica hasta el 40% del costo total de la producción y un aumento en el grado de contaminación ambiental y

daños en la salud humana (Stover, 1980; Henriques et al., 1997).

La utilización de las técnicas moleculares en el estudio del genoma de Mycosphaerella spp., se convirtió

en el objetivo de varios proyectos de investigación. La PCR fue usada para amplificar el espacio 1 interno

trascrito (ITS) de la región del DNA ribosomal para distinguir a M. fijiensis y M. musicola (Johanson y Jeger,

1993) y recientemente a M. eumusae (Carlier et al., 2000), para determinar la variabilidad genética de aislados

procedentes de América, África, Asia y Oceanía por medio de marcadores RFLP (Carlier et al., 1994), RAPD

(Johanson et al., 1994), huellas genéticas de DNA en aislados de diferente hospedero, localidad, dentro del

mismo hospedero y así como también de la misma lesión (Müller et al., 1997) y microsatélites en dos

poblaciones, una de México y la otra de Nigeria (Neu et al., 1999), los cuales han demostrado ser eficientes para

determinar el nivel de diversidad genética de este patógeno.

En M. fijiensis se ha detectado resistencia cruzada hacia algunos grupos químicos de fungicidas, como a

benomyl (Fullerton y Tracey, 1984; Romero y Sutton, 1997), carbendazim (Fullerton y Tracey, 1984),

propiconazol (Romero y Sutton, 1998) y azoxistrobin (Sierotzki et al., 2000). La resistencia que ha presentado M.

fijiensis hacia algunos fungicidas y el indiscriminado uso de estos para su control son elementos suficientes para

suponer que la diversidad genética del hongo esta fuertemente influida por manejo del cultivo. Para dar respuesta

a esta hipótesis, se plantearon los siguientes objetivos:

1. Aislar y caracterizar morfológicamente el hongo M. fijiensis en plantas de plátano enano gigante (Musa

acuminata AAA), cultivadas con manejo intensivo, semintensivo y rústico.

2. Determinar la diversidad genética de aislados de M. fijiensis, obtenidos de plantas de plátano cultivadas bajo

manejo intensivo, semintensivo y rústico.

II REVISIÓN DE LITERATURA

2.1 Interacción planta-patógeno

Una gran diversidad de organismos atacan a las plantas de interés agrícola, entre ellos se encuentran:

virus, micoplasmas, bacterias, hongos, nematodos, protozoarios y plantas parásitas (Baker et al., 1997). Los

daños causados por los organismos fitopatógenos, ascienden a billones de dólares por efecto en la reducción de la

producción en casi 20% en los principales cultivos según Oerke et al., (1994); Baker et al., (1997). Schwinn,

(1992) mencionan que las pérdidas podrían ser más severas sí variedades altamente susceptibles son cultivadas

extensivamente.

Las bases genéticas de la resistencia localizada están descritas por la hipótesis de Flor (1971), la cual

describe que en las interacciones gene-por-gene entre las plantas y sus patógenos, la incompatibilidad (no

enfermedad) requiere genes de resistencia (R) dominantes y semidominantes de la planta y un gene

correspondiente de avirulencia (avr) del patógeno y mientras que en la compatibilidad sucede cuando las plantas

no tienen genes R y el patógeno presenta genes de virulencia. Esta hipótesis según Keen, (1990); Crute y Pink,

(1996); Scofield et al., (1996); Bonas y Van de Ackerveken, (1999) la han reportado en algunas interacciones de

hongos, virus, bacterias y nematodos con sus respectivos hospederos.

Principalmente se han identificado los genes R contra bacterias, hongos y virus, aislado y algunos

clonados en plantas tal y como lo reportan Martin et al., (1993); Joosten et al., (1994); Jones et al., (1994);

Mindrino et al., (1994); Bent et al., (1994); Whitham et al., (1994); Grant et al., (1995); Dixon et al., (1996) y

Parniske et al., (1997), tales genes pueden ser usados para el control de enfermedades por los fitomejoradores en

un futuro muy cercano (Lamb, 1994; Staskawicz et al., 1995; Hammond-Kosack y Jones, 1996; Jones, 1997;

Innes, 1998).

2.2 Genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos

La genética y biología de poblaciones de los hongos patógenos de las plantas han generado un gran

interés desde los años 80, un gran número de recientes revisiones de conceptos y métodos apropiados sobre los

estudios de genética y biología de poblaciones de hongos fitopatógenos han sido publicados (Burdon, 1993;

Leung et al., 1993; McDermott y McDonald, 1993, McDonald y McDermott, 1993; Anderson y Kohn, 1995;

Milgroom, 1995; 1996; Milgroom y Fry, 1997).

Los hongos muestran una de las formaciones más diversas de vida, que hacen de estos un modelo para el

estudio de muchos procesos básicos en la biología poblacional. Los hongos podrían tener exclusivamente

reproducción sexual, asexual o una combinación de estas dos. Las esporas de los hongos podrían ser

especializadas por cualquier tipo de dispersión ya sea local o de larga distancia provocadas por el viento, insectos

vectores o semillas (McDonald y McDermott, 1993).

Los principales objetivos de los fitopatólogos según Johnson, (1984), han sido elaborar estrategias de

control de las enfermedades causadas por los hongos. Estos métodos se han basado principalmente sobre la

resistencia genética de las plantas hospederas o la resistencia hacia fungicidas. En raros casos, genes individuales

de resistencia o ha fungicidas han mantenido sus efectos por varias décadas.

Sin embargo, McDonald y McDermott, (1993), mencionan que en la década reciente en el incremento de

la agricultura intensiva, basada en gran parte de cultivos uniformes o clones, es una habilidad de las poblaciones

de patógenos para desarrollarse y adaptarse a medidas genéticas o de control químico, provocando esto una

rápida adaptación del patógeno.

Para poder asegurar un largo periodo de suministro de productos alimenticios, nuevas estrategias podrían

ser desarrolladas, basadas sobre el entendimiento de la genética y biología poblacional de las interacciones

planta-patógeno, que podrían aplicarse como herramienta de control para las enfermedades (Allard, 1990; Wolfe,

1985).

Según McDonald (1997), existen tres preguntas que podrían ser consideradas por los fitopatólogos para

realizar experimentos en poblaciones genéticas con un nuevo patógeno. La primera es sobre la estructura genética

de las poblaciones de los patógenos: i) que tanta diversidad genética existe en una población?, ii) como está

distribuida la diversidad genética dentro de las poblaciones (y sobre que escala espacial)? y iii) como está

distribuida la diversidad genética entre las poblaciones (y sobre que escala espacial)?

Las siguientes tres preguntas se relacionan con la especificidad de los procesos evolutivos: i) como

afecta la reproducción sexual y asexual a la estructura poblacional del patógeno?, ii) como su migración y su

movimiento genético afecta la estructura poblacional? y iii) como afecta la selección la estructura poblacional?

(McDonald, 1997).

La tercera pregunta se relaciona específicamente a la patología sobre la planta: i) cual es la mejor

definición de una "población" para el patógeno en estudio (cuales son los límites geográficos y de especies que

pueden ser definidos por el flujo de genes), ii como afectan las diferentes estrategias de control la estructura

genética de las poblaciones del patógeno? y iii) cual es el potencial evolutivo de este patógeno? (¿Este

probablemente evolucione rápidamente o muy poco en un medio ambiente cambiante?) (McDonald, 1997).

2.3 Estructura genética de poblaciones de hongos fitopatógenos

La estructura genética de poblaciones, se refiere a la cantidad y distribución de la variación genética

dentro y entre poblaciones (McDonald et al., 1989b; McDonald y McDermott, 1993). El conocimiento de la

estructura genética de poblaciones de los hongos fitopatógenos como una aplicación directa, es saber la cantidad

de la variación genética que se mantiene dentro de una población, indicando que tan rápidamente un patógeno

puede evolucionar y esta información podría ser usada para predecir que tan efectivo que pueda ser un método de

control. Por ejemplo, las poblaciones con un alto nivel de variabilidad genética pueden adaptarse más

rápidamente a hospederos resistentes y/o fungicidas (MacDonald y McDermott, 1993). Los estudios de mayor

información han usado esquemas de muestreo jerárquico para fraccionar la diversidad genética dentro de varios

niveles, correspondientes a diferentes escalas geográficas, cuya escala de muestreo podría ser tan pequeña, como

diferentes aislamientos hechos de una sola lesión, en una hoja y tan grande como colecciones hechas de

diferentes regiones sobre el mismo continente o sobre diferentes continentes (McDonald et al., 1995; McDonald

et al., 1999b).

En varios casos, los marcadores de DNA han demostrado que las poblaciones de los hongos

fitopatógenos podrían contener un alto grado de diversidad genética que esta frecuentemente distribuida sobre

una escala espacial muy pequeña, como lo fue demostrado en los hongos Mycosphaerella graminicola

(McDonald y Martinez, 1990b), Sclerotinia sclerotum (Kohli et al., 1992), Stagonospora nodorum (McDonald et

al., 1994); Magnaporthe grisea (Xia et al., 1993); Ascochyta rabie (Morjane et al., 1994); Mycosphaerella

fijiensis (Müller et al., 1997) y Eutypa lata (Péros et al., 1997).

2.4 Factores que influyen en la estructura genética de poblaciones

2.4.1 Mutación

La mutación es un factor importante como fuente de variación genética en las poblaciones de hongos

fitopatógenos (McDonald et al., 1989b), cuya causa se atribuye principalmente a la fase sexual (Wolfe y

McDermott, 1994), debido a que grandes cantidades de DNA repetitivo provocan la alteración de la meiosis y

recombinación dentro de diferente aislados (Rasmussen et al., 1993). Aunque el rango de las mutaciones es

generalmente bajo por locus, la mutación es persistente y sobre un tiempo genera mucha variabilidad que es

preservada sobre todos los loci. Las mutaciones espontáneas de avirulencia hacia virulencia es bien reconocida

como un medio importante por el cual las poblaciones naturales de un amplio rango de hongos responden a

cambios en las resistencias de las poblaciones de su hospedero (Burdon, 1993).

2.4.2 Recombinación

La recombinación o el tipo de reproducción tanto sexual, asexual o una combinación de ambas,

incrementa la diversidad genética en las poblaciones permitiendo la formación de nuevas combinaciones

genéticas (McDonald et al., 1989; Burdon, 1993b; Wolfe y McDermott, 1994; Leslie, 1995; McDonald et al.,

1995). Los hongos fitopatógenos que se reproducen de forma sexual tienden a ser más diversos genéticamente

que las poblaciones asexuales de la misma especie (Milgroom, 1996).

En muchos casos, la reproducción asexual es baja, pero ocurre mas frecuente que la sexual, por esta

razón un número limitado de clones o líneas clonales son diseminados a través de un rango geográfico mundial

(Goodwin et al., 1997), mientras que las poblaciones que se reproducen sexualmente pueden tener un potencial

más evolutivo de largo plazo (Zhan et al., 1998). Por esta razón las recombinaciones permiten mucho mas

combinaciones de alelos, mientras que las poblaciones asexuales son limitadas por la mutación que ocurre dentro

de líneas clonales (McDonald et al., 1999b).

Los apareamientos que ocurren durante un ciclo de la enfermedad causada por M. graminicola , registró

más capacidad de reproducción asexual que sexual, por lo tanto las poblaciones mantienen una estructura

genética más consistente con apareamientos al azar durante todo el ciclo de la enfermedad (Chen y McDonald,

1996), como también en un periodo de 3 años donde se mantiene una estabilidad genética (Chen et al., 1999),

similarmente ocurre en Colletotrichum graminicola (Rosewich et al., 1998). De esta manera la mayor variación

genética se distribuye a una escala pequeña, entre diferentes localidades dentro de un mismo campo, indicando

que la mayor variación genética puede ser concentrada en áreas tan pequeñas como a pocos metros cuadrados

(McDonald y Martinez, 1990b). Algo similar ocurre en M. fijiensis, donde se determinó una alta diversidad

genética en una amplia escala geográfica, entre diferentes hospederos (cultivares), dentro de la misma planta y de

la misma lesión (Müller et al., 1997). Los genotipos existentes de M. graminicola en el curso de una epidemia

estuvieron en equilibrio gamético, demostrando apareamientos al azar, por lo que se concluye que la infección es

causada por ascósporas (sexuales) (Zhan et al., 1998).

La ausencia de recombinación sexual en muchas poblaciones podrían consistir de líneas propagadas

clonalmente (Koenig et al., 1997); sin embargo, en poblaciones donde la recombinación ocurre a través de

procesos parasexuales se pueden forman rápidamente nuevas combinaciones de alelos virulentos (Zeigler et al.,

1997).

2.4.3 Flujo de genes

El flujo de genes se refiere a los mecanismos resultantes en el movimiento de genes de

una población a otra, dando como resultado cambios debidos al movimiento de gametos y de

individuos o grupos de individuos de un lugar a otro, seguido por la recolonización, o el

movimiento de segmentos extranucleares de DNA tales como mitocondria, plásmidos, entre

otros (Slatkin, 1987). Por lo tanto, cuando ocurre un alto flujo de genes, facilita la similitud

genética entre poblaciones, actualmente los marcadores de DNA se han utilizado para

determinar el flujo de genes entre poblaciones de algunos hongos fitopatógenos (McDermott y

McDonald, 1993).

En aislados de M. graminicola obtenidos de localidades separadas aproximadamente a 750 km se

encontraron alelos comunes, asumiendo que este movimiento a gran distancia es por medio de ascósporas y que

una población genética puede ser representativa a este nivel geográfico (Boeger et al., 1993), mientras que Keller

et al., (1997) en Phaeosphaeria nodorum determinaron un flujo de genes entre poblaciones de Texas, Oregon y

Suiza; la poca evidencia para la subdivisión de la población sugiere que el flujo de genes no fue restringido entre

las poblaciones, ya que mu chos haplotipos de multilocus se encontraron en cada población y los pares de alelos

fueron en equilibrio gamético, por lo que los datos fueron consistentes con los sistemas de apareamientos al azar

dentro de cada población del hongo (Keller et al., 1997b).

También en Rhyncosphorium secalis (McDonald et al., 1989a), ya que aislamientos de dicho hongo

procedente de tres continentes tuvieron un flujo de genes considerable, aunque con cierta recombinación en

algunas poblaciones (Salamati et al., 2000), sin embargo el flujo de genes en Rhyzoctonia solani AG-1 IA de seis

campos de arroz separados a 280 km de distancia, indicó una alta diversidad genética, demostrando un flujo de

genes y heterotálismo (Rosewich et al., 1999).

Sin embargo, Goodwin et al., (1994), demostraron que las poblaciones de Phytophthora infestans de

México, fueron el inóculo principal para que se diseminara a Estados Unidos y Canadá por medio de material

infectado. Mientras que en Mycosphaerella fijiensis, Carlier et al., (1996) y Neu et al., (1999), demuestran que

las esporas (ascosporas) de este hongo no pueden desplazarse por el viento entre continentes (América-África),

ya que ambas poblaciones no tuvieron una similitud genética. En una colección de aislados de M. graminicola y

P. nodorum de diferentes países se encontró un alto nivel de flujo de genes entre esas poblaciones, así como

también dentro de poblaciones separadas por cientos de kilómetros, ya que se encontraron alelos comunes de loci,

concluyendo que ambos patógenos tiene una gran capacidad para el flujo de genes (McDonald et al., 1999).

2.4.4 Selección

La selección también llamada coevolución se ha definido como "cambios genéticos recíprocos que

ocurren en dos o más especies que interactúan ecológicamente" (Futuyma y Slatkin, 1983). Sin embargo, esta

definición es muy simple y se enfoca simplemente en términos de la coevolución, debido a que los

fitomejoradores en sus experimentos controlan la mitad de la interacción coevolutiva en patosistemas agrícolas

(McDonald et al., 1996). Si la selección natural o coevolución, está presente en poblaciones de hongos

fitopatógenos, es posible mantener altos niveles de flujo de genes.

La diferenciación poblacional, definida en términos de diferencias en la frecuencia de alelos dentro de

subpoblaciones, puede ser causada por una selección y movimientos genéticos (Slatkin, 1987), que pueden

ocurrir en un gran número de propágulos de patógenos dispersados dentro de campos con diferentes cultivares.

Esto genera que los patotipos incompatibles no podrían sobrevivir en poblaciones de hospederos resistentes y por

lo tanto el flujo de genes podría ser mínimo (Milgroom y Lipari, 1995), ya que la población de un hongo

fitopatógeno es forzada a responder a cualquiera de los cambios hechos en las poblaciones de su hospedero de tal

manera que la evolución de las poblaciones del patógeno refleja igualmente la evolución directa hecha por el

hombre en el hospedero (McDonald et al., 1996).

La introducción de genotipos de hospederos conteniendo un gene mayor de resistencia fue una estrategia común

(Vanderplank, 1963) para mostrar que las poblaciones del patógeno experimentan un rápido incremento en la

frecuencia de un gene de virulencia, causando que los genes de resistencia de las plantas pierdan su eficiencia

(Flor, 1971; Staskawicz et al., 1995).

En poblaciones de R. secalis, de diferentes genotipos de cebada tuvieron una diferencia significativa en

la estructura genética, sugiriendo que estas tuvieron historias evolutivas independientes y esas diferencias

probablemente son un resultado de la coevolución conducida por diferencias en la composición genética de los

hospederos (McDonald et al., 1989a), similarmente González et al., (1998), agruparon aislados de Colletotrichum

lindemuthianum de diferentes estados de México dependiendo de su origen y su hospedero. De manera similar, el

análisis de diferentes aislados de M. graminicola de un campo de cuatro diferentes genotipos de hospederos de

diferente grado de resistencia, sugirió que el sistema de apareamiento podría tener un gran impacto dentro de la

selección natural sobre la estructura genética de poblaciones del hongo, pero no se pudo demostrar con el uso de

RFLP (McDonald et al., 1996). La selección parece operar en los DNAmt y nuclear de M. graminicola, por lo

que podría incrementar la frecuencia de genotipos en el curso de una estación (McDonald et al., 1999b).

2.5 Uso de marcadores de DNA en hongos fitopatógenos

Los estudios sobre la biología y genética en los hongos fitopatógenos se han basado en el análisis de sus

características morfológicas, bioquímicas y aloenzimas. Sin embargo, estos métodos han demostrado ser

insuficientes (Weising et al., 1995), en años recientes, la introducción de las técnicas de hibridación de DNA y

las que se basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se han usado para tener un diagnostico muy

preciso de las enfermedades causadas por hongos (Erlich et al., 1991; Henson y French, 1993), para la

identificación y taxonomía (Cunfer y Ueng, 1999), la determinación de los modos reproductivos de hongos

asexuales (Taylor et al., 1999), su sistemática (Samuels y Seller, 1995; Bruns et al., 1995). Sin embargo, una de

las herramientas disponibles para hacer estudios sobre la genética de las poblaciones de los patógenos son los

marcadores de DNA (Rosewich y McDonald, 1994; McDonald, 1997), estos son las características de uno o más

loci del genoma en estudio, cuya variación es detectable por métodos analíticos (Winter y Kahl, 1995; Staub et

al., 1996; Jones et al., 1997).

2.5.1 Polimorfismos de la longitud de fragmentos de restricción (RFLPs)

El mapeo genético fue revolucionado por la realización de los RFLPs entre individuos, que podría ser

detectada en huellas usando sondas de DNA marcadas radioactivamente que híbridizan para una sola secuencia

blanco en el genoma (Botstein et al., 1980). El mapeo de los RFLP involucra los siguientes pasos generales: i)

Generación de las sondas, ii) Generación de una población segregante, iii) Identificación de polimorfismos entre

los padres mapeados o individuos de interés, iv) Determinación del genotipo de los individuos en la población

segregante, usando sondas que detectan polimorfismos y v) El análisis de los datos de segregación para producir

un mapa genético. Algunos de los pasos (ii, iv, v) podrían ser eliminados si el objetivo no es mapear, sino

determinar la diversidad genética en una población (Botstein et al., 1980; Staub et al., 1996; Rafalski et al.,

1996).

La técnica de RFLP, se ha utilizado para el estudio de las relaciones entre la patogenecidad y filogenía

de Leptosphaeria maculans (Koch et al., 1991), diversidad genética a nivel de un sólo campo de M. graminicola

(McDonald y Martinez, 1990b), en Bremia lactucae (Hulbert y Michelmore, 1988), P. infestans (Goodwin et al.,

1992), Mycosphaerella fijiensis (Carlier et al., 1994; Carlier et al., 1996), Rhyncosporium secalis (McDonald et

al., 1999a), Ustilago maydis (Valverde et al., 2000), para determinar la diversidad genotípica en M. graminicola

(Chen et al., 1994), para evaluar la similitud genética dentro de individuos (McDonald y Martinez, 1991), para

determinar la contribución de la reproducción sexual y asexual (McDonald et al., 1994).

En la determinación del flujo de genes en M. graminicola (Boeger et al., 1993), Phaeosphaeria nodorum

(Keller et al., 1997a), Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici (Rosewich et al., 1999b), Rhyzoctonia solani

(Rosewich et al., 1999a), para correlacionar el origen entre los hospederos, grupo de compatibilidad vegetativa

(VCG) y diferentes razas de Colletotrichum orbiculare (Correl et al., 1993) y así como también para hacer mapas

de ligamiento en Erysiphe graminis (Christiansen y Giese, 1990), en M. grisea (Dioh et al., 2000).

Las desventajas de los marcadores RFLPs es la gran cantidad de DNA genómico de alta calidad

requerida (1-10 mg), generación de sondas, clonación, etc., pero este método es conveniente por un gran número

de razones, ya que son codominantes, permitiendo la detección y caracterización de alelos múltiples en un locus

dentro de individuos de una población (Rafalski et al., 1996; Staub et al., 1996).

2.5.2 DNAs polimórficos amplificados al azar (RAPDs)

El uso de iniciadores de oligonucleótidos de secuencia arbitraria para la amplificación de segmentos de

DNA distribuidos al azar usando la PCR (Saiki et al., 1985) fue descrito por Williams et al., (1990) y Welsh y

McClelland (1990). Los productos son visualizados en geles de agarosa. Los avances han resultado como una

tecnología que puede ser rápidamente empleada por su simplicidad y por su amplia habilidad, ellos se

manifiestan en la presencia o ausencia de un producto (s) amplificado(s) (Williams et al., 1993). La facilidad de

su uso, bajos costos, de fácil acceso y su potencial de automatización son características atractivas (Rafalski et

al., 1996).

La utilización de RAPD en hongos fitopatógenos ha sido eficaz para la identificación de L. maculans

(Goodwin y Annis, 1991), M. fijiensis (Johanson et al., 1994), F. oxysporum f. sp. dianthi (Manulis et al., 1994),

linajes de F. oxysporum f. sp. canariensis (Plyler et al., 1999), determinar grupos virulentos de Puccinia triticina

(Kolmer y Liu, 2000), para determinar la diversidad genética de Erysiphe graminis (McDermott et al., 1992;

McDermott et al., 1994; Caffier et al., 1999), Pyrenosphora teres (Peever y Milgroom, 1994), F. oxysporum f.

sp. cubense (Koenig et al., 1997), Venturia inaequalis (Tenzer y Gessler, 1997), Setosphaeria turcica (Borchardt

et al., 1998), Eutypa lata (Péros et al., 1997; 1999), así como dentro de progenies de E. lata (Péros y Berger,

1999), para determinar grupos virulentos de F. oxysporum (Mes et al., 1999), para demostrar heterotalismo en M.

graminicola (Kema et al., 1996).

En la determinación de la estructura genética de Alternaria spp. (Peever et al., 1999), así como también

en su diferenciación genética (Peever et al., 2000), para determinar la variabilidad genética entre especies del

género Tilletia (Shi et al., 1996; Pimentel et al., 2000), la creación de mapas genéticos moleculares en

Pyrenophora teres f. sp. teres (Weiland et al., 1999), Pyricularia graminis (Zambino et al., 2000) y en

Magnaporthe grisea (Dioh et al., 2000).

Los RAPDs son marcadores dominantes, estos tienen algunas desventajas en comparación a los RFLP,

tales como la inhabilidad para la identificación de heterocigotos en poblaciones F2, poco reproducibles. Sin

embargo, proporcionan una tecnología innovadora para el mapeo de DNA y huellas genéticas por medio del uso

de la PCR. Las ventajas es que requieren cantidades extremadamente pequeñas de DNA las cuales pueden ser de

baja calidad, sino que también elimina la necesidad de huellas de DNA y el uso de radioactividad (Rafalski et al.,

1991; Waugh y Powell, 1992; Hadrys et al., 1992; Tingey y Tufo, 1993; Williams et al., 1993; Winter y Kahl,

1995; Rafalski et al., 1996).

2.5.3 Polimorfismos de la longitud de fragmentos amplificados (AFLPs)

La técnica de AFLP, consta de tres pasos principales: i) el DNA genómico es cortado con endonucleasas

de restricción (Eco RI y Mse I) y ligado a adaptadores específicos (Eco RI y Mse I), ii) amplificación por PCR de

los fragmentos cortados y iii) el análisis de los fragmentos amplificados en geles de poliacrilamida por medio de

radioisótopos (Vos et al., 1995) o tinción con plata (Zhong y Steffenson, 2000) y en geles de agarosa (Mueller et

al. 1996; Vandermark et al., 2000).

Los AFLP se han aplicado para determinar la diversidad genética en hongos micorrízicos (Rosendhal y

Taylor, 1997), en hongos que son cultivados por las hormigas Cryphomyrmex minutus (Müller et al., 1996),

entomopatógenos Nomuraea rileyi (Boucias et al., 2000ab). Sin embargo, recientemente se ha aplicados para

estudios en hongos fitopatógenos, como por ejemplo, para la detección de la diversidad genética de

Cladosporium fulvum y Pyrenopeziza (Majer et al., 1996), Colletotrichum lindemutianum (González et al.,

1998), Cercospora zea-maydis (Wang et al., 1998; Dunkle y Levy 2000), Septoria tritici (Schnieder et al., 1998),

Ophiosphaerella spp. (Wetzel et al., 1999), L. maculans (Pongam et al., 1999; Purwantara et al., 2000),

Macrophomina phaseolina (Vandermark et al., 2000), Cephalosporium maydis (Zeller et al., 2000) y Claviceps

africana (Tooley et al., 2000).

Para la identificación de aislados del género Colletotrichum (O´Nelli et al., 1997), del género Eutypa

(DeScenzo et al., 1999), para diferenciar los hongos Plespora papaveracea y Dendryphion penicillatum (Farr et

al., 2000), para identificar formas especiales de F. oxysporum (Baayen et al., 2000), para la caracterización de

híbridos naturales de P. infestans (Bonants et al., 2000), como marcadores filogenéticos en hongos del género

Ustilaginomycetos (Bakkeren et al., 2000), así como también, para la construcción de mapas de ligamiento de P.

infestans (Van der Lee et al., 1997), M. graminicola (Kema et al., 1999) y L. maculans (Pongam et al., 1998).

Una de las desventajas de los RAPD y AFLP es que son marcadores no específicos, por lo que puede

suceder algunos errores en la interpretación de los análisis por contaminación de DNA de bacterias (Dyer y

Leonard, 2000). Los AFLP generan cientos de marcas de DNA replicables, en un tiempo corto, los costos de su

eficiencia y resolución son más superiores que otros tipos de marcadores como los RFLP y RAPD, su facilidad

de automatización (Vos et al., 1995; Breyne et al., 1997; Simpson, 1997; Mueller y Wolfenbarger, 1999), dando

como resultado una técnica muy poderosa para estudios en hongos fitopatógenos.

Cuadro 1. Características y propiedades de distintas técnicas de marcadores de DNA. RFLP RAPD AFLP SSR

Principio Restricción por endonucleasas

Transferencia Souther Hibridación

Amplificación por PCR de

DNA con iniciadores al azar

Amplificación por PCR entre secuencias

simples repetidas espaciadas

Amplificación por PCR de repeticiones de secuencia simple

Tipo de polimorfismo

Cambios de una sola base

Inserciones Supresiones

Cambios de una sola base

Inserciones Supresiones

Cambios en una sola base

Inserción Deleción

Cambios de una sola base y de longitud de

las repeticiones Inserciones Supresiones

Abundancia genómica

Alta Alta Alta Alta

Nivel de polimorfismo

Medio

Medio

Alto

Alto

Herencia Codominante Dominante Dominante/Codominante Codominante

Número de loci

detectados

1-5

1-10

30-100

1 o más

Infor mación de secuencia

No No No Si

Dificultad técnica

Media Baja Media/Alta Baja

Uso de radioisótopos

Si/No

No

Si/No

Si/No

Costos de iniciación

Regulares

Bajos

Altos

Regular

Fuente (Rafalski et al., 1996; Staub et al., 1996; Winter y Kahl, 1995; Weising et al., 1998).

RFLP: polimorfismo de fragmento de restricción; RAPD: DNA polimórfico amplificado al azar; AFLP: polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados; SSR: secuencias repetidas simples.

2.5.4 Microsatélites o secuencias repetidas simples (SSRs)

El DNA repetitivo está clasificado dentro de tres principales clases según Tautz y Renz, (1984): i) DNA

satélite el cual consta de más de 300 pares de bases (pb), ii) minisatélites, el cual consta de monómero que

comprenden de 9-100 pb y iii) microsatélites o secuencias repetidas simples que son unidades repetidas de 1-6 pb

en longitud, los microsatélites están dispersados en los genomas.

Los métodos más comunes para la identificación de SSRs incluyen los siguientes pasos i) construcción

de bibliotecas genómicas, ii) prueba de la biblioteca por hibridación, iii) determinación de la secuencias de DNA

de los clones positivos, iv) diseño de iniciadores de locus específicos, v) análisis por PCR y la identificación de

los polimorfismos y vi) mapeo de los marcadores polimórficos (Weising et al., 1998).

En 1993, los oligonucleótidos complementarios de microsatélites fueron introducidos como iniciadores

en la PCR “iniciador de microsatélite-PCR” (MP-PCR), (Meyer et al., 1993), una técnica similar “Inter-SSR-

PCR”, usa microsatélites anclados a 5´ o 3´ de los nucleótidos repetidos (GG[CA]7), los cuales son visualizados

en geles de acrilamida (Zietkiewicz et al., 1994), otras de las variantes fue la combinación de iniciadores de

microsatélite 5´ con un iniciador arbitrario (decámero) “microsatélites polimórficos amplificados al azar”

(RAMPs) (Wu et al., 1994), otra de las técnicas es el uso DNA mancha e hibridación de productos de RAPDs

con sondas de microsatélites complementarios, “oligonucleótidos polimórficos de microsatélites amplificados al

azar” (RAMPO) (Richardson et al., 1995) o “secuencias de microsatélites amplificados al azar” (RAMS) (Ender

et al., 1996).

El uso de los microsatélites como marcadores de DNA se implementaron en hongos del género

Trichoderma (Meyer et al., 1992a), en hongos cultivados por las hormigas (Villesen et al., 1999), en hongos

fitopatógenos, los han usado para determinar la diversidad genética de C. gloesporoides (Braithwaite y Manners

1989), identificación de cepas y especies de Aspergillus, Penicillium y Trichoderma (Meyer et al., 1991), grupos

agresivos de L. maculans (Meyer et al., 1992b), Ascochyta rabie (Weising et al., 1991) y Podospora anserina

(Osiewacz et al., 1997).

Para determinar la variabilidad genética de patotipos de Sclerospora graminicola (Sastry et al., 1995),

para determinar la diversidad genética en A. rabie a nivel de un solo campo (Morjane et al., 1994), como también

de una región (Udupa et al., 1998), en la determinación de la herencia Mendeliana entre aislados virulentos y no

virulentos de A. rabie (Gestlinger et al., 1997a), determinar la variación alélica del locus ArMS1 (Gestlinger et

al., 1997b). En poblaciones asexuales de Stagonospora spp. y Septoria para determinar que es una fuente de

variabilidad genética (Czembor y Arseniuk, 1999) y en progenies sexuales del hongo P. nodorum (Czembor y

Arseniuk, 2000).

El uso de microsatélites específicos se iniciaron en el género Epichloe, en estudios de su diversidad

genética (Groppe et al., 1995), en M. fijiensis (Neu et al., 1999) y V. inaequalis (Tenzer et al., 1999). Los

microsatélites tiene las ventajas de ser: específicos, codominantes de un solo locus, de fácil manejo, altamente

reproducibles, alta calidad de información alélica, uso de la PCR y requerimiento de pequeña cantidad de muestra

(Weising et al., 1998; Rosewich y McDonald, 1994).

2.6 El cultivo de plátano (Musa spp.)

La planta de plátano es una herbácea triploide perenne de las regiones tropicales y subtropicales

(Gowen, 1995). Dos especies diploides Musa acuminata Colla (A) y M. balbisiana Colla (B) son los ancestros

comunes de todos los cultivares triploides conocidos (Simmonds y Shepherd, 1955).

El plátano (Musa spp.) es la segunda fruta tropical más importante por su consumo a nivel mundial

después de los cítricos (Hallam, 1995), así como por su contenido de fuentes de carbono, almidón, vitaminas y

minerales que son consumidos como fruta fresca (Robinson, 1996), la producción anual en el mundo asciende a

los 80 millones de toneladas al año, de la cual solamente el 15% se exporta y el resto es para el consumo local

(FAO, 1998). Sin embargo, la producción de este vital fruto es afectado por plagas y enfermedades (Cuadro 2),

las cuales pueden causar severos daños en las plantaciones (Robinson, 1996).

Cuadro 2. Principales plagas y enfermedades que afectan al cultivo de plátano (Musa spp.) a nivel mundial.

2.7 Sigatoka negra Mycosphaerella fijiensis Morelet

La enfermedad que actualmente provoca más daños a nivel mundial en plantaciones de plátano es la sigatoka negra, esta se encuentra en todas las regiones productoras (Fig. 1). Es causada por el hongo ascomiceto M. fijiensis, provoca necrosis y reducción del área foliar, dando como resultado un abatimiento del rendimiento entre 33 y 50% (Stover, 1983; Mobambo et al., 1993).

Uno de los métodos de control de la enfermedad es por medio de la obtención de plantas híbridas (Rowe

y Rosales, 1996 y Vuylsteke et al., 1997) y transgénicas resistentes (Mason et al., 1995; Sagí et al., 1995; Pérez

et al., 1999 y Becker et al., 2000), ha sido uno de los objetivo prioritario durante varios años. Esta enfermedad es

controlada principalmente con la aplicación de fungicidas (Stover, 1990), de diferente grupo químico (Cuadro 3).

Esto ha originado que además del incremento en los costos de producción del cultivo, se estén presentando

problemas de contaminación ambiental, de salud humana y de resistencia a fungicidas, debido a la gran cantidad

de productos químicos y de citrolina que se depositan en los huertos de plátano (Henriques et al., 1997).

Cuadro 3. Fungicidas usados en las plantaciones de plátano en América Latina.

Bitertanol Chlorothanolonilo

Tridemorph Benomyl

Organismo Distribución Referencia

Bacterias Pseudomonas solanacearum

Asia, América

Buddenhagen y Kelman 1964.

Insectos Cosmopolites sordidus

Asia, África, América

Frogatt, 1925.

Hongos Mycosphaerella musicola M. fijiensis M. eumusae Fusarium oxysporum f sp. cubense Colletotrichum musae

Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia y África Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía

Stover, 1962a. Mourichon y Fullerton, 1990. Carlier et al., 2000 Stover, 1962b Meredith, 1960

Nematodos Pratylencus spp. Helicotylencus multicinctus Meloidogyne spp. Radopholus similis

Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia, África, América y Oceanía

Gowen, 1994 McSorley, 1994 De Waele y Davide, 1998. Gowen, 1994

Virus Virus del Bunchy Top (BBTV) Virus del mosaico del plátano (BMV) Virus del mosaico de la bráctea (BBrMV)

Virus del estriado del plátano (BSV)

Asia, África y Oceanía Asia, África, América y Oceanía Asia, África Asia, África, América y Oceanía

Dale, 1987 Niblett et al., 1994. Mangaye y Espino, 1990. Lockhart, 1986.

Propiconazol Thiobendazol

Mancozeb Metil tiofeno

Henriques et al., 1997. Enviromental Toxicology and Chemistry.

Figura 1. Distribución de Mycosphaerella fijiensis en el mundo (Stover, 1980; Mourichon y Fullerton, 1990).

Existen evidencias de ciertos plaguicidas que pueden causar toxicidad aguda y actuar como inductores

moleculares de la actividad celular responsable de las funciones neuroendocrinas que regulan el control hormonal

de la reproducción, diferenciación del sexo, proliferación de células y competencia del sistema inmune

(Chambers y Yarbrough, 1982). La forma en que los humanos y la fauna son expuestos a los plaguicidas es por

medio de las aplicaciones aéreas, productos alimenticios y agua potable contaminada. En plantaciones de plátano,

la aspersión aérea es una técnica rápida para aplicar plaguicidas en áreas grandes; sin embargo, el escurrimiento

de los sitios de almacenamiento y pistas de aterrizaje, así como la deriva de agroquímicos de los sitios tratados

pueden contaminar los sistemas acuáticos y terrestres cercanos (Henriques et al., 1997).

El propiconazol se ha usado por casi dos décadas para el control de sigatoka negra en México. Este fungicida puede encontrarse en concentraciones altas en agua de drenes adyacentes a las plantaciones de plátano, tal y como ha sido demostrado en áreas bananeras de Costa Rica, en donde se han detectado concentraciones hasta de 24.2 µg/l de agua (Mortensen et al., 1998). Por otra parte, a partir de 1995 el mancozeb ha sido un fungicida clave en los programas de control a base de protectantes en México.

En Costa Rica, después de una aplicación se han registrado residuos de mancozeb de

0.77 a 2.38 µg/cm² en canales (Mortensen et al., 1998). Los fungicidas son aplicados uniformemente en las plantaciones plataneras y tienen un contacto directo con muchos organismos terrestres y acuáticos. El clorotalonil es conocido a ser tóxico a invertebrados

acuáticos y peces, mientras que el mancozeb posee propiedades carcinógenas y el benomyl es teratogénico (Lacher et al., 1997).

Por otra parte, el uso intensivo de algunos fungicidas de acción sistémica ha provocado problemas de

resistencia en el hongo M. fijiensis, causante de la sigatoka negra (Fullerton y Tracey, 1984; Romero y Sutton,

1998). Esto se atribuye a que ciertas clases de fungicidas sistémicos (benzimidazoles y triazoles), poseen una

actividad elevada en dosis bajas y actúan en un solo sitio del patógeno. Los problemas de resistencia han tenido

como consecuencia que el combate de sigatoka negra se vuelva más complejo y costoso, debido a la pérdida de

sensibilidad de los fungicidas y por lo tanto se requiere un mayor número de aplicaciones y más recientemente a

los triazoles (Romero y Sutton, 1998).

La evaluación de nuevas moléculas de fungicidas con acción diferente a las actuales y

sin o poco efectos nocivos al medio ambiente y salud humana es prioritario para la búsqueda

de nuevas alternativas de manejo de sigatoka negra. Dentro de este grupo de fungicidas se

encuentra el azoxistrobin que es seguro desde el punto de vista ambiental.

En la actualidad, el número de fungicidas sistémicos utilizados para el control de sigatoka negra es

reducido, por lo que es de suma importancia un manejo racional de los mismos para darles una vida mayor útil,

manteniéndose de esta manera una eficacia apropiada contra el hongo (Stover, 1990).

2.7.1 Identificación y clasificación de Mycosphaerella fijiensis

El ciclo de vida de M. fijiensis esta caracterizado por dos estados: el estado perfecto e imperfecto

(Alexoupoulos y Mims, 1979). Ambos estados son importantes en la infección a su hospedero.

Estado perfecto

Clase: Ascomycetae

Subclase: Eu-ascomycetae

Orden: Pseudospaeriles

Familia: Mycosphaerellaceae

Este estado esta caracterizado por la formación de peritecios, espermagonios y ascosporas. El peritecio y

espermagonio se encuentran en proporciones variables durante los estados 2 y 3 (ver capitulo 2.4.2 Ciclo de la

enfermedad de la sigatoka negra). Los espermagonios son más abundantes en la superficie adaxial de la hoja,

ellos frecuentemente se desarrollan en la cámara subestomal del estoma, los espermagonios maduros contienen

espermatia hialina (Meredith y Lawrence, 1969).

Las diferencias en el estado sexual es muy pequeña, de tal manera que las ascosporas entre M. fijiensis y

M. musicola son indistinguibles, las cuales son liberadas de los pseudotecios. El tamaño de las ascosporas de M.

fijiensis tienen un rango de 10.8 a 15.5 x 2.6 a 4.8 µm con un promedio de 13.1 x 3.8 µm, mientras que el tamaño

de las de M. musicola es de 14.0 a 17.6 x 3.1 a 4.5 µm con un promedio de 15.5 x 3.3 µm, éstas son usualmente

hiliadas y con un septo, con una pequeña constricción en el septo (Mülder y Stover, 1976).

La morfología del estado asexual de M. fijiensis (conocido como Paracercospora fijiensis Morelet). Los

conidios son hialinos, obclavados a cilíndricos, rectos o ligeramente curvos, 6 a 9 septos, delgados en el ápice y

más anchos en la base con una cicatriz en el hilum basal del conidio (punto de unión entre el conidio y el

conidióforo), miden de 30 a 132 µm de longitud y 2.5 a 5 µm en la parte más ancha son de forma recta o

ligeramente curveados con 6 a 9 septos (Fig. 2). En cambio los conidios de M. musicola son normalmente rectos

con máximo de 6 septos y carecen de cicatriz en la base del conidio. Los conidióforos pueden emerger

directamente por el estoma de manera individual o en grupos, o bien pueden formar fascículos sobre un estroma

erumpente de color oscuro (Mülder y Stover, 1976).

Estado imperfecto:

Estado imperfecto: Deuteromycetae (Hongo imperfecto)

Clase: Hyphomycetae

Orden: Hyphomycetales

Familia: Dematiaceae

Genero: Cercospora

Los pseudotecios son las estructuras femeninas y aparecen en los estados 4 y 5 que produce M. musicola,

mientras que en M. fijiensis aparecen en los estados 5 y 6, los cuales son anfígenos, globosos con un ostiolo

esférico papilado, de paredes pardo oscuras y células poligonales, tienen un diámetro de 42 a 81 µ y una media de

57 µ (Mülder y Stover, 1976).

Los espermagonios constituyen la parte masculina, éstos producen los espermacios que actúan como

gametos masculinos y su función es la de fertilizar a los pseudotecios. Una vez realizada la fertilización, se

desarrollan en su interior las ascas que contienen a las ascosporas en un número de ocho (Stover, 1980).

Figura 2. Conidios de Mycosphaerella fijiensis (Meredith y Lawrence, 1969).

Las hojas densamente infectadas, liberan ascosporas durante un período de dos a cuatro semanas más

que cuando se cortan (saneamiento) y se colocan en el suelo (Stover, 1980). Estas, son las principales fuentes de

inóculo de la enfermedad (Stover, 1980), las cuales son diseminadas por el viento y depositadas en las hojas más

jóvenes, principalmente en la hoja “cigarro” y en las cuatro hojas más jóvenes (Mülder y Holliday, 1974; Mülder

y Stover, 1976).

Recientemente, Carlier et al., (2000), descubrieron una nueva enfermedad similar a la sigatoka negra,

esta es causada por el hongo Mycosphaerella eumusae, los conidios son fusiformes, hialinos, tienen tres a cinco

septos y con una medida de entre 21.2 y 41.6 µm de longitud. Este estado fue identificado como Septoria, el

peritecio tiene un diámetro de 42 a 51 µm, este fue amfigeno, de forma irregular y globosa, con un ostiolo corto,

las ascósporas fueron de 12.0 a 16.5 x 3.0 a 4.5 µm, este hongo fue identificado en el Sureste de la India, Sry

Lanka, Tailandia, Malasia, Vietnam, Mauritus y Nigeria. Por último es necesario realizar investigaciones sobre

todos los aspectos de la biología de este hongo, incluyendo estudios de las interacciones hospedero-patógeno y

análisis de la estructura de poblaciones.

2.7.2 Desarrollo de los síntomas de la enfermedad de la sigatoka negra

Después de la germinación de las ascósporas y la penetración de la hifa por los estomas de las hojas de

las plantas, seis estados de los síntomas de la enfermedad se han reconocido (tres de raya, una de transición y dos

de mancha) (Meredith y Lawrence, 1969; Fouré, 1982):

Estado 1. Aparecen pequeñas puntuaciones de color amarillo pálido de 0.25 mm de diámetro que son visibles por

el envés de la hoja.

Estado 2 . Los puntos se alargan como rayas de 1 mm de ancho por 2 mm de largo, generalmente de color castaño

y son visibles por el haz.

Estado 3. Las rayas se alargan hasta alcanzar 20-25 mm de longitud y 2 mm de ancho; toman una coloración

marrón oscuro y son visibles sobre el envés como rayas amarillas.

Estado 4. Sobre el envés, las rayas se ensanchan, se tornan de un color marrón oscuro y son rodeados por una

zona amarilla pálida. Puede considerarse el primer estado de mancha.

Estado 5. Los centros de color negro de las manchas empiezan a colapsarse mientras rodean el tejido como un

halo amarillo.

Estado 6. Los centros de las manchas secas se ponen de color gris claro y son rodeados por un anillo negro bien

definido, el cual también es rodeado por un halo amarillo.

Figura 3. Ciclo de vida del hongo Mycosphaerella fijiensis causante de la sigatoka negra (González, 1975).

2.7.3 Interacción Musa-Mycosphaerella fijiensis

La resistencia a M. fijiensis es genéticamente controlada, los análisis genéticos del efecto del patógeno se

ha llevado en progenies diploides y tetraploides de cruzas obtenidas de triploides x diploides (Vuylsteke et al.,

1993). La resistencia a sigatoka negra es principalmente el resultado de la interacción de alelos recesivos en un

locus mayor (bs1) y de dos genes menores independientes con efecto aditivo (bsri) (Ortiz y Vuylsteke, 1994).

Se han reportado tres distintos niveles de respuesta del hospedero a M. fijiensis y se han definido según

Ortiz y Vuylsteke, (1994): como susceptible, poco susceptible y parcialmente resistente. Estas respuestas

diferentes son el resultado de la segregación de tres loci independientes. Los diploides con dos alelos favorables

en estado homocigoto (bs1/bs1) podrían tener una resistencia parcialmente o una menos susceptible. Un modelo

similar explica la resistencia parcial exhibida por los tetraploides a causa de la dosificación del efecto de las

cuatro copias del alelo de la resistencia bs1 (Ortiz y Vuylsteke, 1994).

La acción del locus de la resistencia bs1 en híbridos diploides y tetraploides de plátano, fue demostrado

que su efecto comb inado de ploidía y resistencia a M. fijiensis fue parcialmente responsable para la característica

cuantitativa de variación en el rendimiento. Como un resultado del gene de la interacción en el locus bs1 de

resistencia, los fenotipos de la resistencia parcialmente y menos susceptibles demostraron un alto rendimiento

(Craenen y Ortiz, 1996). La (s) acción (es) en el locus bs1 podría proveer una resistencia durable a M. fijiensis por

un retardo en el desarrollo de la enfermedad sobre la planta hospedera (Craenen y Ortiz, 1997). Ortiz y Vuylsteke

(1994) consideran como un tipo de resistencia vertical el contenido de polifenoles presentes en las hojas, la cual

desaparece cuando un patotipo virulento afecta al hospedero.

2.7.4 Fitotóxinas de M. fijiensis

El primer reporte de la actividad fototóxica de extractos crudos de M. fijiensis fue realizado por Molina y

Krausz (1989), quienes probaron diferentes extractos del hongo sobre hojas de 7 diferentes cultivares (enano

gigante, plátano cuerno, 3A-105-7, Sabá, 3A -106-6, SH 3437 y IV-9), encontraron que el cultivar enano gigante

presentó la mayor sensibilidad a dichos extractos, tal y como se observa en campo, posteriormente Stierle et al.,

(1991), encontraron que el más abundante y fitotóxico de los componentes aislados del extracto del hongo M.

fijiensis fue 2,4,8-trihidroxitetralon, el cual indujo las lesiones necróticas a 5 µg/5 ml en menos de 12 h sobre

cultivares sensibles. Otro de los compuestos encontrados fue la juglona en una cantidad menor, algunas de la

fitotóxinas aisladas son melaninas, las cuales hacen de este hongo como único dentro de los patógenos que la

producen.

Recientemente Hoss et al., (2000), usaron distintos cultivares de Musa: dominico Hartón, Cachaco,

Yangambi km 5, investigaron las interacciones de los metabolitos secundarios (flaviolona, 2-hidroxijuglona,

juglona y 2,4,8-trihidroxitetralona) del patógeno, detectando que en el cultivar Yangambi km 5 se activa una

acumulación de fenilalanina amonialiasa (PAL) y una acumulación subsecuente de substancias que bloquean el

crecimiento del hongo. Estos resultados podrían ser usados para la inducción de mecanismos de defensa

correlacionados con reacciones hipersensitivas después del ataque del patógeno.

El uso de las fitotóxinas de M. fijiensis para la selección de cultivares de plátano resistentes a sigatoka

negra es muy importante, dentro de los ensayos para determinar la resistencia de los cultivares a nivel de

invernadero, reduciendo costos y manejo de cultivares introducidos en nuevas áreas de producción (Harelimana

et al., 1997), así como también la aplicación de secciones de micro cortes de plátano por medio de cultivo de

tejidos para la regeneración de plantas resistentes a sigatoka negra (Okole y Schulz, 1996).

2.7.5 Variabilidad patógena de M. fijiensis

La variabilidad patógena de M. fijiensis fue demostrada por Fullerton y Olsen (1995), quienes utilizaron

sesenta y seis aislados obtenidos de diferentes hospederos de Musa procedentes de diferentes países y localidades

productoras. Este estudio demostró que algunas cepas que son virulentas sobre un hospedero no lo fueron sobre

otro. Algunos hospederos fueron susceptibles prácticamente a todos las cepas, mientras otros como T8 y Calcutta,

fueron resistentes a algunos aislados pero susceptibles a otros. Las cepas de Papua, Nueva Guinea y de las Islas

del Pacífico mostraron un amplio rango de diversidad patogénica sobre los cultivares comúnmente usados como

fuente de resistencia de programas de mejoramiento como Calcutta, Paka y Pisang Lilin.

Otro de los estudios sobre la variabilidad patógena lo realizaron Romero y Sutton (1997), quienes

evaluaron la reacción de dos híbridos (FHIA 1 y FHIA 2) con resistencia y dos cultivares altamente susceptibles

(enano gigante y falso cuerno) a M. fijiensis, determinaron su reacción con diferentes aislados del hongo y a tres

temperaturas (22, 26 y 30°C), pudieron concluir que los híbridos mostraron resistencia a todos los aislados y en

las tres temperaturas, mientras que los susceptibles fueron afectados por todos los aislados y en las tres

temperaturas, provocando mayor daño a 26°C, tal y como se ha reportado como la temperatura para el desarrollo

óptimo de la enfermedad en genotipos susceptibles de Musa (Stover, 1983; Jacome y Schuh, 1992).

2.7.6 Marcadores de DNA en Mycosphaerella spp.

La utilización de las técnicas moleculares en el estudio del genoma de Mycosphaerella spp., se convirtió

en el objetivo de varios proyectos de investigación. La PCR fue usada para amplificar el espacio 1 interno

trascrito (ITS) de la región del DNA ribosomal para distinguir a M. fijiensis y M. musicola (Johanson y Jeger,

1993), utilizando los iniciadores MF137: 5´ GGCGCCCCCGGAGGCCGTCTA 3´ para detectar a M. fijiensis y

el iniciador MM137: 5´ GGCGCCCCCGGAGGTCTCCTT 3´ para M. musicola, detectaron a ambos patógenos

estando presentes en las hojas de plátano y a algunos otros microorganismos como M. musae, M. minima,

Aspergillus niger, Botryodiploida theobromae, F. moniliforme y C. gloesporoides. Por lo que se concluye como

una técnica muy sensible y confiable para la detección de estos dos patógenos que afectan a los cultivos de

plátano.

La identificación de la variabilidad genética se ha demostrado por varias técnicas como RFLPs. Carlier

et al., (1994), quienes identificaron una importante variabilidad genética entre las poblaciones de M. fijiensis, M.

fijiensis var. difformis y M. musicola de diferentes regiones geográficas (Sudeste Asiático, incluyendo Filipinas y

Papua Nueva Guinea, Islas del Pacífico, África y América Latina). Los niveles más altos de diversidad genética o

alélica se hallaron en las dos poblaciones del sudeste asiático. Estos resultados concuerdan con la hipótesis según

la cual M. fijiensis sería originaria del Sudeste Asiático (Stover, 1978; Mourichon y Fullerton, 1990). Otros de los

resultados sobresalientes fueron que los sinónimos de M. fijiensis y M. fijiensis var. difformis no reflejaron una

variación genética, por lo que se descarta que M. fijiensis var. difformis , sea una variedad, como antes ya lo

habían identificado (Mulder y Stover, 1976; Pons, 1987).

La utilización de RAPDs (Johanson et al., 1994), demostraron la diferencias de los DNAs genómicos de

M. fijiensis, M. musicola y otras especies de Mycosphaerella presentes en las hojas de las Musaceas como M.

musae y M. minima , dando como resultado distintas bandas alélicas, usando el iniciador RC07

(TGCGACAATC), el cual amplificó fragmentos de 1250 pb de todos los aislados de M. fijiensis obtenidos de 11

regiones distintas. Estos fragmentos no se presentaron en las otras especies de Mycosphaerella, sirviendo esta

técnica para realizar diagnósticos precisos de este hongo, semejante a la reportada por Johanson y Jeger, (1993),

quienes usaron la PCR.

El estudio realizado por Müller et al., (1997), quienes utilizaron huellas genéticas de DNA con

oligonucleotidos sintéticos repetitivos simples tales como (CA)8 o (CAA)5, obteniendo una diversidad genética

entre escalas macro y microgeográficas, así como también entre una lesión, entre lesiones de una planta, entre

plantas, diferentes cultivares y en distintas localidades geográficas, lo que demuestra que el estado sexual del

hongo representa una fuente importante para la variación genética, ya que es un hongo heterotálico (Mourichon y

Zapater, 1990).

Los estudios realizados por Neu et al., (1999), ellos obtuvieron once iniciadores de microsatélites,

usándolos en dos poblaciones de M. fijiensis (Nigeria y México). El rango del número de alelos fue de 2 a 7 por

locus. La diversidad alelica dentro de cada región fue comparativamente baja. Todos los loci fueron polimórficos

entre las dos poblaciones y solamente un alelo en un locus fue común entre los aislamientos en ambas regiones.

Todos los aislamientos tuvieron diferentes haplotipos de multilocus. De acuerdo con la propagación sexual del

patógeno, se concluye que los polimórfismos entre los aislamientos de Nigeria y México tienen diferentes

haplotipos y que la migración entre continente es rara ya que la reproducción sexual en este hongo es

predominante, quienes concuerdan también con los resultados obtenidos por Carlier et al., (1996) por medio de

marcadores RFLP.

Recientemente Carlier et al., (2000), descubrieron un nuevo hongo en el sureste y suroeste de Asia y

África (India, Sry Lanka, Tailandia, Malasia, Vietnam, Mauricios y Nigeria), que causa daños muy similares a M.

fijiensis. Ellos lo nombraron Mycosphaerella eumusae, se estudiaron a nivel del ITS diferentes hongos presentes

en las hojas de plátano (M. fijiensis, M. musicola, M. musae y Phaeoseptoria musae), los análisis filogenéticos

confirmaron que M. eumusae está más cercano a M. fijiensis, por lo que señalan como una enfermedad

potencialmente importante.

La poca información existente sobre la influencia del manejo del cultivo y su repercusión en la

diversidad genética de M. fijiensis abre la posibilidad de realizar estudios para poder dar respuesta a este tema de

investigación, partiendo de otros modelos ya existentes como es el caso de P. infestans (Fry et al., 1992;

Goodwin, 1997), Alternaria alternata (Adachi et al., 1996) y B. cinerea (Yourman et al., 2000), dan la

posibilidad de poder estudiar este tópico en el hongo causante de la sigatoka negra del plátano, ya que McDonald,

(1997), en su revisión indica que los hongos fitopatógenos presentan una fuerte selección dependiendo del

manejo del cultivo, principalmente la aplicación de fungicidas.

III MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Lugar de realización

El trabajo experimental se realizó en el Laboratorio de Biología Molecular y Cultivo de Tejidos

Vegetales de la Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Colima ubicado en

Tecomán, Colima a 18° 54’ L.N. y a los 103°52’ L.W. y 33 msnm (SPP-INEGI, 1995).

3.2 Muestreo

Muestras de hojas infectadas por el hongo M. fijiensis en los estados 5 y 6 de desarrollo de acuerdo a la

escala de Fouré (1982) fueron colectadas de plantas con manejo con el tipo de muestreo de cinco de oros, con tres

tipos de manejo: rústico (R), semintensivo (SI) e intensivo (IN) (Cuadro 4), de diferentes lugares de la zona

platanera de la región del pacífico-centro (Fig. 4). Estas fueron colocadas en bolsa de papel para su transporte al

laboratorio.

Figura 4. Mapa de las localidades muestreadas para el aislamiento de Mycosphaerella fijiensis.

Cuadro 4. Características de los huertos de plátano cultivar enano gigante que fueron muestreados para el aislamiento de Mycosphaerella fijiensis.

Tipo de manejo Lugar

Intensivo (IN) Riego presurizado subfoliar.

Deshoje cada 2 semanas.

Deshije cada 2 semanas.

35 aplicaciones de químicos para el control de la sigatoka negra.

3 aplicaciones de herbicidas al año.

Una fertilización cada 2 meses.

Colomos, Colima

Cerro de Ortega, Colima

Semintensivo (SI)

Riego rodado cada 21 días.

Deshoje cada mes.

Deshije cada 4 meses.

15 aplicaciones de químicos para el control de la sigatoka negra. Control de

malezas manual y una aplicación de herbicida.

Dos aplicaciones de fertilizantes al año.

Armería, Colima

Coahuayana, Michoacán

Caleras, Colima

Rústico (R)

Riego rodado cada 21 días.

Deshoje cada 2 meses.

Deshije cada 4 meses.

No hay control químico de la sigatoka negra.

Control de malezas manual.

Dos aplicaciones de fertilizantes al año.

INIFAP-Tecomán

Puerta de Caleras, Colima

Asmoles, Colima

3.3 Aislamiento de M. fijiensis

Las muestras de hojas obtenidas de campo fueron cortadas en trozos de 15x15 cm, luego se enjuagaron

con agua corriente y colocadas individualmente dentro de bolsas de plástico junto con una toalla de papel

húmeda. Estas fueron incubadas durante 48 horas en cámara de crecimiento (Revco) a temperatura de 26 ± 1°C

con 12 horas luz, para uniformizar la maduración de los peritecios y su posterior descarga de ascosporas.

La descarga de ascosporas se realizó mediante el método propuesto por Stover (1976). De cada muestra

de hoja incubada, se cortaron 4 trozos circulares de aproximadamente 1.0 cm de diámetro y se engraparon en

papel filtro Wathman No. 2 de 9 cm de diámetro. Luego, bajo condiciones asépticas en cámara de flujo laminar,

las muestras de tejido con el papel saturado en humedad fueron colocadas en las tapas de cajas de petri y sobre

ellas las bases de éstas, conteniendo 15 g/l de agar-agar esterilizado. De esta manera, la parte superior de las hojas

quedó frente al medio de cultivo, permaneciendo así durante 24 horas a 26 ± 1°C en cámara de crecimiento y con

un fotoperiodo de 16 horas luz (Revco). Después, con ayuda del microscopio estereoscópico, se localizaron en el

agar las ascosporas descargadas por el estallido de los peritecios, causado por la presión de turgencia inducida por

la saturación de humedad.

Las ascosporas fueron capturadas con aguja de disección estéril y colocadas en cajas petri conteniendo el

medio nutritivo de papa dextrosa agar (PDA) a 30 g/l, esterilizado a calor húmedo (121°C, 1.2 kg cm-2) por 15

min. Luego, las cajas fueron incubadas en cámara de crecimiento (Revco) a 27 ± 1°C en oscuridad, hasta la

aparición de las colonias del hongo (Stover, 1976) y posteriormente fueron almacenadas en glicerol al 15% a

21°C (Carlier et al., 2000).

3.4 Cultivo de M. fijiensis en medio líquido

Para la producción de micelio, se utilizó medio líquido caldo V8 (300 ml de jugo V8 (Herdez), 3 g de

CaCO3 por litro, pH 6.0). El medio se distribuyó en volúmenes de 50 ml en matraces erlenmeyer de 250 ml y fue

esterilizado a calor húmedo por 15 min (121°C, 1.2 kg cm-2). Posteriormente, en cada matraz fueron sembradas 4

colonias jóvenes y vigorosas del hongo de 15 días de edad, de aproximadamente 0.5 cm de diámetro, obtenidas

de cultivos monospóricos del medio PDA. Los cultivos se incubaron en un agitador orbital (Lab-Line) en

oscuridad a 150 rpm y 26 ± 1 °C durante 10 días según Carlier et al., (1996).

3.5 Extracción del DNA genómico de M. fijiensis

Para la extracción del DNA genómico de los aislados monospóricos de M. fijiensis se utilizó el método

descrito por Reader y Broda (1985). El micelio producido en medio líquido caldo V8 después de 10 días de

incubación fue colectado por centrifugación y posteriormente lavado en 5 ml del amortiguador TES (1 M Tris -

HCl, pH 8.5, 5 M NaCl y 0.5 M EDTA) y enjuagado con agua destilada desionizada estéril. El micelio libre de

exceso de TES y medio de cultivo fue colocado en tubos de ensaye de plástico estériles, los cuales se sellaron con

película plástica, posteriormente fueron liofilizados durante 96 h a -49 ± 1°C y 47 x 10-3 mbares de vacío en una

liofilizadora digital (Lyph-Lock, Labconco, Inc).

El micelio liofilizado fue molido dentro de un mortero frío en presencia de nitrógeno líquido hasta

obtener un polvo fino. Muestras de 40 mg del polvo se colocaron en tubos eppendorf estériles de 2.0 ml

conteniendo 1000 µl del amortiguador de extracción (200 mM Tris -HCl, pH 8.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA,

PVP 1% y SDS 1%), luego se incubaron a baño maría durante 30 min con agitaciones constantes, posteriormente

se les adicionó 1 vol de la solución fenol-cloroformo -alcohol isoamílico (25:24:1) y se mezclaron hasta formar un

homogenizado; enseguida se centrifugó a 12,000 rpm durante 20 min a 4°C. La fase acuosa obtenida fue

transferida a un tubo eppendorf y se le adicionaron 0.1 vol de acetato de sodio 3.0 M pH 5.2, se agitó suave y se

le adicionó 0.6 vol de isopropanol frío, se incubó en frío para la formación de las hebras del DNA y se centrifugó

a 12, 000 rpm durante 5 min. El sobrenadante se decantó y quedó la pastilla del DNA, esta se lavó con 500 µl de

etanol 70% durante dos veces, posteriormente fue secada al vacío durante 20 min en el equipo (HetoDry Gel,

Heto Lab Equipment), las pastilla se resuspendió en 400 µl de TE (Tris -EDTA).

Al DNA extraído se le adicionó 4 µl RNasa, la mezcla se incubó durante 30 min a 37° C, posteriormente

fue adicionada una cantidad de 500 µl de fenol-cloroformo y se mezcló durante 1 min, se centrifugó durante 5

min, se tomó la fase acuosa y fue extraído dos veces con la solución de fenol (como ya se indicó anteriormente),

después fue precipitado con 500 µl de isopropanol frío, se mezcló por inversión y se centrifugó durante 5 min. El

sobrenadante fue desechado y la pastilla se lavó dos veces con 500 µl de etanol al 70% enseguida la pastilla fue

secada al vacio como anteriormente se indicó y por último la pastilla se resuspendió en 40-80 µl de agua

desionizada estéril dependiendo su tamaño, se cuantificó la cantidad de DNA de todas las muestras en un gel de

agarosa al 0.8% comparada con un DNA estándar, por último se mantuvieron las muestras a 4°C para su

conservación.

3.6 Marcadores RAPDs en M. fijiensis

Para determinar la diversidad genética de los aislamientos de M. fijiensis, el DNA extraído (50 ng/ìl) fue

analizado por la técnica de los RAPD con la ayuda del termociclador (Robo cycler gradient 40, Stratagene). La

mezcla de reacción se realizó según Williams et al., (1990); cada una de las muestras tuvo un volumen final de 25

µl conteniendo: 50 ng de DNA templado, 1.5 mM MgCl2, 1.0 mM dNTPs (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 200

ìM de cada uno de los iniciadores (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 0.5 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL,

Gaithersburg, MD) y por último dos gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la mezcla de reacción

(Sigma BioScience, St. Louis, MO).

Las condiciones de la PCR consistieron de una desnaturalización inicial de 94°C por 3 min, 40 ciclos a

94°C por 1 min, 35°C por 1 min y 72°C por 3 min, seguida de una extensión final de 72°C por 5 min (Kema et

al., 1996). Esta reacción fue realizada con cada uno de los iniciadores (Cuadro 5) y para cada una de las muestras

de DNA de los aislados del hongo.

Cuadro 5. Iniciadores utilizados en la determinación de los RAPD de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos

distintos. Nombre del iniciador Secuencia (5´ - 3´) % GC

A-01 CAG GCC CTT C 70

H-06 ACG CAT CGC A 60 H-12 ACG CGC ATG T 60 M-04 GGC GGT TGT C 70 M-07 CCG TGA CTC A 60 P-13 GGA GTG CCT C 70

3.7 Marcadores SSR (Microsatélites) en M. fijiensis

Para determinar la diversidad alelica en los aislamientos de M. fijiensis, el DNA extraído fue analizado

con la técnica de los SSR con la ayuda del termociclador antes mencionado. La mezcla de reacción se realizó de

acuerdo a Neu et al., (1999), esta fue de un volumen final de 25 µl conteniendo 2 ng de DNA templado, 2 mM

MgCl2, 0.2 mM dNTPs (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 12.5 pmol de cada par de iniciadores (Gibco BRL,

Gaithersburg, MD) (Cuadro 6), 0.625 U de Taq DNA polimerasa (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) y por último

dos gotas de aceite mineral para evitar la evaporación de la mezcla de reacción (Sigma BioScience, St. Louis,

MO).

Las condiciones de la PCR consistieron de una desnaturalización inicial de 94°C por 2 min, 30 ciclos a

94°C por 30 s, 55°C por 45 s y 72°C por 45 s, seguida de una extensión final de 72°C por 7 min. Esta reacción

fue realizada para cada uno de los iniciadores (Cuadro 6) y para cada una de las muestras de DNA de todos los

aislamientos del hongo.

Cuadro 6. Iniciadores utilizados en la determinación de los SSR de los aislados de Mycosphaerella fijiensis, obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

Nombre del iniciador Secuencia (5´ - 3´) MfSSR175 AACCTCACATAGGCTGCCAC TATACCTTTCGTTTCGGCAAAGC MfSSR005 TCCAAATTCCATCGTCA CGATGATTTGGGTGGTCA AGCTA

3.8 Visualización de los productos

Los productos amplificados de los RAPD (25 µl), y el marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL,

Gaithersburg, MD) fueron separados por medio de electroforesis en geles de agarosa (UltraPure Agarose, Gibco

BRL, Gaithersburg, MD) al 1.4%, y los de SSR (microsatélites) en agarosa al 2% ambos preparados con

amortiguador TAE (Tris 1M, ácido acético, EDTA 0.5 M, pH 8.0) y corridos a 90V por 120 min. Los geles

fueron teñidos por 15 min en una solución de bromuro de etidio (5 µg ml –1) de amortiguador TAE (Tris 1M,

ácido acético, EDTA 0.5 M, pH 8.0) y un lavado en agua por 15 min según Sambrok et al., (1989). Las bandas de

DNA enel gel fueron visualizadas por medio de un transiluminador de UV y fotografiado con la ayuda del

sistema de análisis de imágenes Eagle Eye I (Strategene).

3.9 Análisis de los datos

Este análisis inicia con la observación directa de los polimorfismos que se obtuvieron en el gel de

agarosa fotografiado como un patrón de bandas específico para cada individuo, en el cual, dichas bandas han sido

numeradas en relación con su migración a través del gel a partir de la de mayor a menor peso molecular. Se

asume que tales bandas o fragmentos amplificados en diferentes individuos son idénticos si tienen el mismo peso

molecular.

La presencia y/o ausencia de cada banda particular asumirá un valor numérico: 1 como presencia y 0

como ausencia. Las distancias genéticas fueron estimadas usando el método de Skroch et al., (1992) que es un

coeficiente de apareamiento simple, igual a la proporción de diferencias con respecto al número total de bandas

comparadas.

Con estas distancias se genera una matriz (conteniendo las distancias entre todos los posibles pares de

individuos), la cual es usada para generar el dendograma por el método de promedio aritmético de grupos de

pares no ponderados (UPGMA) (Avise, 1994) usando el paquete software del programa S-Plus 2000 professional

(S-Plus, 2000).

La distancia genética (D) entre dos muestras, A y B, se calculó por el método de Skroch et al., (1992)

siguiendo la fórmula DAB = [∑i |Ai – Bi|]/ N, donde A i y Bi son análisis asignados (1 ó 0) para la banda ith de A y

B, respectivamente, y N = al número total de bandas presentes dentro de toda las muestras.

IV RESULTADOS

4.1 Caracterización morfológica de M. fijiensis

Las cajas de petri que contenían medio agar-agar con las muestras de tejido foliar dañado, mostraron la

presencia de ascosporas en cantidades muy variables por caja después de 24 h incubadas a 26 ± 2°C en oscuridad.

Según las observaciones realizadas con la ayuda del microscopio estereoscópico bajo condiciones asépticas, las

ascosporas generalmente fueron, hialinas, globosas, con un septo y una pequeña constricción en el septo. Además

de una de las células siempre fue ligeramente más abultada que la otra, el tamaño de varió de 10.8 a 15.5 de largo

y de 2.6 a 4.8 µm de ancho con un promedio de 13.1 x 3.8 µm.

Las ascosporas cultivadas en medio PDA influyó sobre la aparición visual del número

de colonias, apareciendo como pequeños puntos de color verde claro, cuyo crecimiento fue

muy lento, obteniendo un total de 20 aislamientos monospóricos de M. fijiensis, 7 de ellos

fueron de cultivos con manejo intensivo, 8 de semintensivo y 5 de rústico (Cuadro 8). Su color

fue diferente en la parte superior, en principio fueron de color gris oscuro, luego cambiaron a

color blanco claro y finalmente se observó un color rosado o blanco, por la parte inferior,

generalmente siempre fue negro o en algunos aislamientos fueron blancos. La forma de las

colonias fue globosa, circular y la apariencia de la morfológica de 3 aislados que fueron

seleccionados fue diferente en relación al tipo de manejo del cultivo (Cuadro 7).

Cuadro 7. Apariencia en medio PDA de la morfología de 3 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis. INIFAP-Tecomán (INI-2), poblados de Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).

Clave Apariencia

INI-2 Las colonias tuvieron micelio aéreo blanco, con apariencia algodonosa,

redonda y mayor crecimiento; al reverso de la caja muestra color blanco con un pequeño punto negro en el centro de la colonia.

PC-3 Las colonias tuvieron micelio aéreo blanco, con apariencia algodonosa y crecimiento lento; al reverso de la caja muestra un color negro con los bordes blancos.

IB-2 Las colonias tuvieron micelio compacto, gris rosado, sin apariencia algodonosa. La colonia fue de forma irregular (no circular); al reverso de la caja muestra un color negro con los bordes blancos.

Cuadro 8. Aislamientos monospóricos obtenidos de Mycosphaerella fijiensis de la región productora del estado

de Colima.

Clave Origen Tipo de manejo

CO-1 Colomos, Colima

COA-1 Coahuayana, Michoacán

IB-2 Cerro de Ortega, Colima

IB-4 Cerro de Ortega, Colima Intensivo (I)

OCH-1 Cerro de Ortega, Colima

GLE-2 Coahuayana, Michoacán

GLE-4 Coahuayana, Michoacán

FIE-2 Armería, Colima

FIE-3 Armería, Colima

AS-1 Asmoles, Colima

PC-1 Puerta de Caleras, Colima

PC-2 Puerta de Caleras, Colima Semintensivo (SI)

PC-3 Puerta de Caleras, Colima

ORT-3 Armería, Colima

ORT-4 Armería, Colima

CA-1 Caleras, Colima

CA-2 Caleras, Colima

INI-2 INIFAP-Tecomán, Colima Rústico (R)

INI-3 INIFAP-Tecomán, Colima

INI-6 INIFAP-Tecomán, Colima

reverso reverso

IB-2 Figura 5. Características morfológicas de los aislamientos de Mycosphaerella fijiensis de tres predios con manejo

diferente de la región del Estado de Colima. INIFAP-Tecomán (INI-2); Puerta de Caleras (PC-3) y Cerro de Ortega (IB-2).

4.2 Análisis de los marcadores RAPDs en M. fijiensis

El número de bandas de DNA amplificadas y polimórficas por la PCR con cada uno de los iniciadores

en los aislamientos de M. fijiensis utilizados, varió de 6 a 12 por aislamiento. Los iniciadores con un 60 % de GC

amplificaron un mayor número de bandas analizadas dando un total de 58 bandas, mientras que los que contienen

un 70% tuvieron de 4 a 10 bandas polimorficas de un total de 51 (Cuadro 9).

Cuadro 9. Número de bandas de DNA amplificadas y polimórficas obtenidas con los

aislamientos de Mycosphaerella fijiensis de huertos de plátano con tres

manejos distintos.

Nombre del Secuencia % de Bandas Bandas iniciador (5´ - 3´) GC amplificadas polimórficas

A-01 CAG GCC CTT C 70 6 4 H-06 ACG CAT CGC A 60 10 10 H-12 ACG CGC ATG T 60 12 10

reverso

INI-2 PC-3

IB-2

M-04 GGC GGT TGT C 70 8 7 M-07 CCG TGA CTC A 60 12 11 P-13 GGA GTG CCT C 70 11 10 Total 58 51

M R I SI SI R R R R SI

Figura 6. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador A-01 (5´

CAGGCCCTTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL), carril 1 : CA-2, carril 2: IB-2, carril 3: FIE-2, carril 4: AS-1, carril 5: CA-1, carril 6 : INI-2, carril 7: INI-3, carril 8 : INI-6 y carril 9: ORT-3.

Con el iniciador A-01 (5´ CAGGCCCTTC 3´) fue amplificado un total de 2 a 6 bandas de DNA por

aislamiento (Fig. 6), con un peso entre 3,054 a 990 pb. En el aislamiento FIE-2 se amplificaron solamente 2

bandas, mientras que en los aislamientos CA-1, INI-2 y INI-3 se amplificaron 6 bandas de DNA, siendo estos de

huertos de manejo rústico. Del total de las bandas amplificadas sólo 4 fueron polimórficas, esto indica que es

muy poca la información que se obtiene con este iniciador para análisis de diversidad genética del hongo. Por lo

cual, se sugiere no debe contemplarse en estudios posteriores sobre la determinación de la diversidad genética de

M. fijiensis en relación al tipo de manejo del cultivo.

M R R I SI SI I R

12,026

3,054

2,036

1,018

Figura 7. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador H-12 (5´

ACGCGCATGT 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco, BRL), carril 1 : CA-1, carril 2: CA-2, carril 3: IB-2, carril 4: FIE-3, carril 5: PC-1, carril 6: IB-4 y carril 7: INI-2.

En la Fig. 7, se muestra el parámetro de bandas de DNA amplificadas con el iniciador

H-12 (5´ ACGCGCATGT 3´). Con este iniciador fue posible obtener una buena cantidad de

bandas amplificadas y polimórficas 12 y 10, respectivamente. Con es iniciador se amplificaron

tres bandas que estuvieron presentes en todas las muestras con un peso de 2036, 1254 y 1018

pb. En IB-2, se presentaron dos bandas de 800 y 900 pb, las cuales solamente fueron

amplificadas en este aislamiento, pero la mayoría de las bandas de DNA amplificas también

estuvieron en la muestra CA-2, sin embargo, en FIE-3 muestra un perfil de bandas muy

similar a CA-2, procedentes de huertos de manejo semintensivo y rústico, respectivamente;

pero IB-4 e INI-2 tuvieron un perfil de bandas muy similares, siendo estos de manejo

intensivo y rústicos.

M R R I SI SI R I

3,054

2,036

1,018

12,026

Figura 8. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-07 (5´

CCGTGACTCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb, carril 1: CA-2, carril 2 : INI-2, carril 3: IB-2, carril 4: PC-1, carril 5: ORT-4, carril 6 : INI-3 y carril 7: OCH-1.

Con el iniciador M-07 (5´ CCGTGACTCA 3´) se amplificó una banda de DNA de 1018 pb (Fig. 8) que

estuvo presente en todos los aislamientos analizados, talvez puede ser una característica genética muy en

particular de este hongo, bajo estas condiciones ambientales. Con este iniciador se observó una cantidad de 12

bandas amplificadas de las cuales 10 fueron polimórficas, siendo uno de los iniciadores que pudo amplificar una

mayor cantidad de bandas. En IB-2, se amplificó una banda de 1100 pb que en los demás aislamientos estuvo

ausente, indicando alguna característica en particular de este aislamiento, el cual es procedente de un huerto de

manejo intensivo. El aislamiento CA-2 de un huerto de manejo rústico se amplificaron 6 bandas, una de 1980 pb

que estuvo también presente en INI-3 el cual es también procedente de un huerto rústico, esta banda no se

presentó en ninguno de los otras muestras analizadas con este iniciador. En IB-2, ORT -4 y OCH-1 amplificaron

bandas de DNA que estuvieron en estas muestras, precedentes de huertos de manejo intensivo y semintensivo. En

PC-1 solamente se amplificaron 4 bandas, de las cuales tres estuvieron también en aislamientos de manejo

semintensivo e intensivo.

M R R I SI SI I M

1,018

2,036

3,054

12,026

Figura 9. Marcadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador P-13 (5´

GGAGTGCCTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb, carril 1: INI-3, carril 2: INI-6, carril 3: GLE-2, carril 4: PC-2, carril 5: ORT-3 y carril 6: GLE-4.

Con el iniciador P-13 (5´ GGAGTGCCTC 3´) se amplificó una gran cantidad de

bandas de DNA por aislamiento (Fig. 9). En 1a muestra INI-6 no se amplificó una banda de

2,036 pb la cual estuvo presente en todas las demás colectas analizadas con este iniciador, así

como también en GLE-4 procedente de un huerto con manejo intensivo se produjo una banda

de 1,000 pb la cual estuvo ausente en los demás aislamientos, pero en este se amplificó un

perfil de bandeo muy similar a GLE-3 originarios del mismo huerto. En INI-3 procedente de

manejo rústico se amplificaron bandas de DNA similares a las observadas en ORT-3 y PC-2

los cuales son de manejo semintensivo.

M R R I SI SI R I

Figura 10. Marcadores RAPDs de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generados por el iniciador M-O4 (5´

GGCGGTTGTC 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco, BRL), carril 1: CA-1, carril 2: INI-2, carril 3: OCH-1, carril 4: FIE-2, carril 5 : AS-1, carril 6 : INI-3 y carril 7: GLE-2.

En la Fig. 10 se observa el número de bandas amplificadas de DNA con el iniciador M-04 (5´ GGCGGTTGTC 3´) en aislamientos de M. fijiensis, con este iniciador se amplificaron de 4 a 6 bandas de DNA por cada muestra, de las cuales todas fueron polimorficas. Una banda de 2000 pb estuvo presente en todas las colectas, en CA-1 e INI-3, se presentó más intensa, ambos aislamientos de huertos de manejo rústico. En INI-2, OCH-1 y FIE-2 se presentaron dos bandas, las cuales solamente estuvieron presentes en estos aislamientos. En AS-1 todas las bandas amplificadas estuvieron también presentes en GLE-2, los cuales son de manejo semintensivo e intensivo respectivamente.

M R R I SI SI I

Figura 11. Marcadores RAPD de aislamientos de Mycosphaerella fijiensis generador por el iniciador H-06 (5´

ACGCATCGCA 3´) obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M = marcador de peso molecular 1 kb (Gibco, BRL), carril 1 : CA-1, carril 2 : INI-2, carril 3: IB-2, carril 4: PC-1, carril 5: ORT-4 y carril 6 GLE-2.

Con el iniciador H-06 (5´ ACGCATCGCA 3´) amplificó 10 bandas de las cuales todas

fueron polimórficas en los aislamientos analizados. La colecta CA-1 de manejo rústico

presentó una banda de 1480 pb, la cual estuvo ausente en todos los demás, también se observó

en este aislamiento, al igual que en INI-2 de manejo rústico e IB-2 manejo intensivo que se

amplificó una banda de 1980 pb y ausente en todos los demás. ORT-4 y GLE-2 de manejo

semintensivo e intensivo respectivamente, tuvieron un perfil de bandeo similar, así como

también en IB-2 y PC-1 intensivo y semintensivo respectivamente, pero PC-1 no presentó una

banda que estuvo en CA-1, INI-2 y IB-2.

Distancias genéticas 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

1

Figura 12. Dendrograma derivado de UPGMA del análisis de seis iniciadores RAPD en aislamientos de

Mycosphaerella fijiensis de 6 campos con diferente manejo técnico (CA-2 e IN-3: Rústico; IB-4 y CO-1: Intensivo; ORT-4 y FIE-3: Semintensivo). Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 réplicas.

El dendrograma obtenido del análisis de DNA de 2 aislamientos de M. fijiensis por

cada tipo de manejo, utilizando 6 iniciadores, muestra 2 grupos bien definidos (Fig. 12): el A

integrado por CA-2 e IN-3 de manejo rústico y el B por IB-4, CO-1 intensivo, ORT-4 y FIE-3

semintensivo, el A tuvo una distancia genética de 0.43, mientras que B presento 0.27. Los

grupos fueron representativos también por el origen del aislamiento. IB-4 fue el que tuvo la

mayor distancia genética (H: 0.38) entre todos los demás aislamientos analizados, siguiéndoles

CO-1 de H: 0.34, ambos procedentes de manejo intensivo, pero los aislamientos ORT-4 y FIE-

3 procedentes de huertos con un manejo semintensivo, formaron un grupo que tuvo una H:

0.18. Algo similar también ocurrió con el grupo A formado por los aislamientos CA-2 y IN-3

de manejo rústico que tuvieron la menor distancia genética de H: 27.

4.3 Análisis de los microsatélites en M. fijiensis

CA-2

IN-3 (R)

IB-4 (IN)

CO-1 (IN)

ORT-4 (SI)

FIE-3 (SI)

A

B

88

49

51

96

12,026 3,054

2,036

1,018

El número de microsatélites obtenidos con el uso del par de iniciadores para el locus MfSSR175 vario de

1 a 3 alelos (Cuadro 10). En los aislamientos CA-1 e INI-2 amplificaron un alelo, mientras que INI-6 se

presentaron 3 alelos, estos son de manejo rústico. En AS-1, FIE-2, FIE-3, PC-1 y PC-2 se obtuvo solamente un

alelo, en comparación a PC-3 que amplifico 2 alelos, sin embargo, en ORT-3 y ORT-4 se obtuvieron 3 alelos en

cada uno de los aislamientos, siendo de manejo semintensivo. En los aislamientos de manejo intensivo IB-2, IB-

4, GLE-4 y CO-1 se obtuvo un alelo, en cambio en GLE-2 se obtuvo 2 alelos, pero en OCH-1 y COA-1 se

obtuvieron 3 alelos (Fig. 13).

Cuadro 10. Número de alelos en los aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos.

Locus Secuencia del iniciador 5 - 3´ No. de alelos

MfSSR005 TCCAAATTCCATCGTCA 3 CGATGATTTGGGTGGTCA AGCTA

MfSSR175 AACCTCACATAGGCTGCCAC 1 TATACCTTTCGTTTCGGCAAAGC

M I I I I SI SI SI SI I I SI SI SI R R R I SI

Figura 13. Análisis de microsatélites para el locus MfSSR175 de 18 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M =marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL), carril 1: IB-2, carril 2: IB-4, carril 3 : GLE-2, carril 4: GLE-4, carril 5: AS-1, carril 6: ORT-3, carril 7: FIE-2, carril 8: FIE-3, carril 9: OCH-1, carril 10: COA-1, carril 11: PC-1, carril 12: PC-2, carril 13: PC-3, carril 14: CA-1, carril 15: INI-3, carril 16: INI-6, carril 17: CO-1 y carril 18: ORT-4

12,026

2,036

1

3,054

1,018

M I I I I SI SI SI SI I I SI SI SI R R R I SI

Figura 14. Análisis de microsatélites para el locus MfSSR005 de 18 aislamientos de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. M =marcador de peso molecular 1 kb (Gibco BRL), carril 1: IB-2, carril 2: IB-4, carril 3 : GLE-2, carril 4: GLE-4, carril 5: AS-1, carril 6: ORT-3, carril 7: FIE-2, carril 8: FIE-3, carril 9: OCH-1, carril 10: COA-1, carril 11: PC-1, carril 12: PC-2, carril 13: PC-3, carril 14: CA-1, carril 15: INI-3, carril 16: INI-6, carril 17: CO-1 y carril 18: ORT-4.

Para el locus MfSSR005, únicamente fue amplificado un alelo en los 18 aislamientos de M. fijiensis

analizados, de los cuales fueron obtenidos de cultivos con manejo rústico, semintensivo e intensivo (Fig. 14).

Esto demuestra uniformidad genética entre los aislamientos procedentes de cultivos con diferente manejo.

Distancias genéticas

0.0 0.2 0.4 0.6

1

Figura 15. Dendrograma derivado de UPGMA de los análisis de SSR de 16 aislados de Mycosphaerella fijiensis obtenidos de predios de plátano con tres manejos distintos. Los números en los nodos representan un bootstrap para 1000 réplicas.

El dendrograma obtenido del análisis de los locus MfSSR005 y MfSSR175 de 18 aislamientos de M.

fijiensis de diferentes manejo del cultivo, muestra dos grupos bien definidos (Fig. 15): el A integrado por IB-2,

IB-4, CO-1, OCH-1, COA-1, GLE-2, de manejo intensivo, también estuvieron presentes ORT -3, ORT-4, PC-1,

PC-2 y AS-1, de manejo semintensivo. El grupo B se presentaron los de manejo semintensivo FIE-2, FIE-3 y PC-

1, uno de manejo rústico INI-3, pero GLE-4 formo un subgrupo. El grupo B presento una distancia genética de

H:0.38.

IB-2

IB-4 CO-1

ORT -3

OCH-1

COA-1 PC-1

AS-1

ORT -4

PC-2 GLE-2

GLE-4

FIE-2

CA-1

INI-6 INI-3

FIE-3 PC-1

87

54

51

A

B

VII CONCLUSIÓN

Las características morfologías de las colonias de M. fijiensis fueron su lento

crecimiento y la coloración de gris oscuro a rosado, dependiendo del aislamiento, así

como su forma globosa y circular.

Los marcadores RAPD permitieron determinar los niveles de diversidad

genética dentro de los 29 aislamientos analizados, agrupándolos de acuerdo a su origen

geográfico y nivel de manejo del cultivo de plátano.

El uso de los SSR permitió establecer que los aislamientos analizados

presentaron de 1 a 3 alelos dependiendo el locus estudiado y agruparlos según su

origen geográfico y nivel de manejo del cultivo de plátano.

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