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UNIVERSIDAD DEL MAR
CAMPUS PUERTO ESCONDIDO
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
NOMBRE DEL PROGRAMA:
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE AGENTES CAUSALES DE LA
REDUCCIÓN DE RENDIMIENTO EN EL CULTIVO DE PAPAYA EN LA COSTA DE
OAXACA
REPORTE FINAL
ALUMNO:
MARIO NAHUM ESPINOZA CALLEJA
RESPONSABLE INMEDIATO:
M. en C. JULIETA KARINA CRUZ VÁZQUEZ
PUERTO ESCONDIDO, OAXACA A 08 DE FEBRERO DE 2016
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ÍNDICE
Contenido ÍNDICE ................................................................................................................................................. 2
OBJETIVOS........................................................................................................................................... 3
ACTIVIDADES ...................................................................................................................................... 3
RESULTADOS ....................................................................................................................................... 6
CONCLUSIÓN ..................................................................................................................................... 13
SUGERENCIAS ................................................................................................................................... 13
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 13
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OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL
Identificar mediante PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) cepas
fúngicas aisladas del fruto de la papaya.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Identificar morfológicamente las cepas fúngicas mediante claves
taxonómicas
Preparar cultivos en medio PDA y PDB
Extraer DNA
Cuantificar extracción por espectrofotometría
Identificar cepas mediante PCR
ACTIVIDADES Durante el tiempo en el que se realizó el servicio social se llevó a cabo una serie de
actividades, en las cuales se mantuvo un constante trabajo a fin de cumplir nuestros
objetivos planteados.
En un comienzo se me asignaron 50 cepas fúngicas contenidas en viales, de las
cuales tenía que identificar la viabilidad de estas cepas, para esta actividad se
necesitaba sembrar las cepas contenidas en los viales en un medio de cultivo solido
llamado PDA (Agar de Papa Dextrosa), preparado anticipadamente (Figura 1) y
observar si eran viables.
Figura 1. Cajas de Petri con medio PDA
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Para esta actividad se requirió de mucho tiempo, debido que para alcanzar un
crecimiento optimo en los hongos se necesitaba una semana aproximadamente y
cada semana se realizaba un sembrado de 10 cepas para llevar un control (Figura
2)
Después de tener un porcentaje de la viabilidad de las cepas, se prosiguió a
continuar con las cepas que habían presentado ser viables.
Las cepas fúngicas que resultaron viables fueron caracterizadas, observando sus
características morfológicas (Figura 3), para esto se requirió de intensa observación
y fotografiado de estructuras morfológicas, como hifas, estructuras reproductoras y
esporas si es que las había.
Figura 2. Crecimiento completo de cepas fúngicas
Figura 3. Observación de cepas viables con microscopio estereoscópico.
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Una de las principales razones por las que se llevó a cabo la observación
microscópica fue para detectar posible contaminación de otros hongos y determinar
si las cepas que habían resultado viable estaban diferenciadas, es decir, si eran
capaces de producir esporas para realizar cultivos monosporicos.
Teniendo una aproximación de las cepas diferenciadas se prosiguió a preparar
medio líquido para crecimiento fúngico y así poder obtener micelio para las futuras
actividades como extracción de DNA y la identificación de cepas diferenciadas por
medio de la técnica conocida como PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).
Una vez colocadas las cepas en el medio liquido PDB se introdujeron en una
incubadora orbital con agitación constante durante una semana a 37 °C. Después
de una semana, se obtuvo el micelio, filtrando con ayuda de un embudo y gasas, a
fin de obtener un micelio libre de medio líquido y posteriormente se dejó en el
refrigerador a -80 °C para congelar el tejido durante una semana. Esto con la
finalidad de que al momento de macerar el tejido micelial, las células pudieran
romperse con facilidad y poder extraer el DNA.
En cuanto se hubo congelado el tejido, se procedió a realizar la siguiente actividad
que consistía en extraer el DNA. Anticipadamente, se prepararon las soluciones que
se utilizarían durante el proceso de extracción del DNA, este proceso duró
aproximadamente un día, en el cual solo se pudo extraer DNA para 3 cepas, siendo
11 cepas diferenciadas que fueron colocadas en medio PDB para obtención de
micelio, por lo que la extracción duro aproximadamente 4 días, días que no fueron
consecutivos debido a la falta de tiempo.
Teniendo el DNA de las cepas diferenciadas se llevó a cabo una electroforesis para
analizar si realmente había buen DNA. Para llevar a cabo la técnica de electroforesis
se preparó la cámara de electroforesis colocando el gel de agarosa solidificado y se
agregó 250 ml de TBE 0.5X, posteriormente se tomaron las muestras de DNA
obtenido y se cargaron 5µl de DNA más 2µl de buffer de carga, junto 5 µl de
marcador molecular (Figura 4).
Figura 4. Cargando DNA al gel de agarosa
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Terminando esta actividad se prosiguió a verificar la calidad y cantidad de DNA
obtenido, una vez finalizada la actividad se inició con el proceso para realizar el PCR
y así poder diferenciar a estas cepas utilizando una técnica molecular.
RESULTADOS De las 50 cepas asignadas en el inicio del servicio social sólo 30 cepas resultaron
viables para estudios posteriores, en las cuales se realizaron las actividades
posteriores (Figura 5).
Durante la diferenciación de las cepas se llevó a cabo la caracterización
morfológica, para esta actividad se observaron las estructuras microscópicas de
cada cepa, en las cuales se tenía que observar las cepas diferenciadas y no
diferenciadas. Las cepas diferenciadas mostraban estructuras reproductoras y la
única diferencia era la presencia de esporas (Figura 6), para llevar a cabo esta
actividad se realizaron frotis por cada cepa (Figura 7).
Figura 5. Cepas fúngicas viables.
Figura 6. Esporas de una cepa diferenciada con aumento 40X.
7
En cambio, las cepas no diferenciadas solo presentaron estructuras
correspondientes a cada hongo, ninguna presentó estructuras reproductoras,
únicamente micelio, sin presencia de esporas (Figura 8).
Figura 7. Portaobjetos con frotis de estructuras fúngicas.
Figura 8. Micelio de cepa no diferenciada
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Habiendo observado todas las cepas solo 11 cepas se determinaron como
diferenciadas, de las que por medio de claves taxonómicas se diferenciaron como
Colletotrichum gloeosporioides. Fue con estas cepas con las que se inició el trabajo,
las cepas no diferenciadas se mantuvieron aisladas para futuros trabajos. Ahora
bien, se necesitaba extraer DNA de las cepas diferenciadas pero se necesitaba
mucho micelio por lo que se preparó medio liquido PDB para mantener el
crecimiento de estas cepas y así proseguir con el trabajo. En cuanto se tuvo el medio
líquido, se introdujeron cinco núcleos de agar solido con micelio, los cuales se
mantendrían en crecimiento en el medio líquido por una semana.
Al finalizar la semana se procedió a recuperar todo el micelio que había crecido en
el medio líquido contenido en matraces (Figura 9). El micelio recuperado se secó y
guardó en papel aluminio para después congelar a -80 °C.
La congelación del micelio perduró por una semana, antes de eso se esterilizó el
material requerido para llevar a cabo la extracción del DNA. Después de una
semana se llevó a cabo la extracción del DNA para lo cual se machacó el micelio
en morteros de porcelana y se realizó una serie de pasos hasta obtener el DNA de
cada cepa, como el tiempo no era suficiente se procedió a guardar el DNA contenido
en tubos eppendorf de 1.5 µl dentro de un refrigerador a -20 °C.
Teniendo el DNA de cada cepa se realizó una electroforesis para visualizar si
realmente había buen DNA y para realizar esta actividad se requirió de una cámara
de electroforesis donde sería colocado un gel de agarosa con las muestras de DNA
Figura 9. Micelio contenido en medio líquido PDB
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(Figura 10) y mediante cargas eléctricas opuestas se revelaría el estado de nuestro
DNA.
Al finalizar la electroforesis se reveló el gel de agarosa mediante luz ultravioleta,
esperando observar las bandas donde supuestamente estaría la marca de nuestro
DNA, y efectivamente pudimos obtener un buen DNA (Figura 11). En este caso se
hicieron tres repeticiones para cada cepa.
Figura 10. Cámara de electroforesis con gel de agarosa.
Figura 11. Gel de agarosa con visualización de bandas que representan al DNA
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Estas bandas nos indicaron que teníamos presencia de DNA y en algunos casos se
observa que había buena calidad de DNA, pero para tener una mayor seguridad se
realizó la cuantificación mediante un espectrofotómetro, en donde se determinó la
calidad y concentración de las muestras de DNA. Con ayuda del espectrofotómetro
Genesys 6, se midió la absorbancia de longitudes de onda UV y Vis con una alta
reproductibilidad (Figura 12).
Figura 12. Uso de Espectrofotómetro Genesys 6
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El proceso de medida consistió en la introducción de 10 µl de muestra de DNA en
990 de agua destilada desionizada y se midieron a tres rangos de absorbancia.
Tomando en cuenta que la absorbancia del DNA es máxima a 260, el DNA puede
ser semicuantificado y su calidad verificarse dividiendo la lectura por
espectrofotometría a 260 nm entre la lectura a 280 nm. Por lo que un buen DNA de
buena calidad deberá dar un valor entre 1.8 y 2.0. A continuación se muestra una
tabla de los resultados obtenidos al medir la absorbancia entres diferentes rangos
(Tabla 1).
De estos resultados podemos observar que tenemos una buena calidad de DNA y
no presenta muchas impurezas.
Una vez obtenido los resultados de la cuantificación y calidad del DNA de nuestras
cepas, se llevó a cabo la técnica de PCR con ayuda de un termociclador donde se
colocaron todas las muestras obtenidas de DNA, previamente colocadas en un tubo
eppendorf para PCR, en los cuales se agregaron los DNTPs, MgCl 25 mM, Buffer
10X, los dos primers (ITS4 y CgInt, para C. gloeosporioides), agua desionizada
estéril, una muestra de DNA y por último la Taq (Figura 13). Colocando un programa
para los cambios de temperatura. Iniciando con una temperatura de 94°C por 5 min.,
seguido de 34 ciclos así: 94°C por 1 min.; 59°C por 2 min. y 72°C por 1 min.,
seguidos por un ciclo de extensión final de 5 min. a 72°C y 4 °C al infinito (Figura
14).
MUESTRAS ABSORBANCIA 260/280
ABSORBANCIA 260/230
ABSORBANCIA 230/260
A1 1,593 42,00 0,140
A2 1,543 5,917 0,194
A3 1,844 19,33 0,086
A4 1,929 -3,857 -0,500
A5 1,264 2,401 0,701
B1 1,524 2,667 0,375
B2 1,500 2,500 0,875
B3 1,487 4,214 0,483
B4 1,628 7,000 0,200
B5 1,378 6,889 0,349
B6 1,447 6,111 -0,083
Tabla 1. Resultados de tres diferentes rangos de absorbancias.
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Por último, nuestras muestras se retiraron del termociclador y se preparó un nuevo
gel de agarosa para realizar una electroforesis en la cual se amplificarían las
muestras de PCR, esto nos dio como resultado un nuevo gel en el que se mostraban
las bandas de que efectivamente pertenecían a Colletotrichum gloesporioides, solo
en una muestra que no se amplificaron muy bien, quedó en duda debido que no
amplificaron correctamente (Figura 15).
Figura 13. Termociclador con muestras cargadas.
Figura 14. Programa de PCR para Colletotrichum gloeosporioides.
Figura 15. Amplificación de PCR
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10 11
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Terminada la amplificación se terminó la caracterización de las 11 cepas que se
determinaron mediante la morfología de las cepas y su genética de las mismas.
Observando las bandas vemos que las cepas en su mayoría pertenecían a C.
gloeosporioides, un hongo causante de antracnosis en diversos frutos, en este caso
pertenecía al fruto de la papaya.
CONCLUSIÓN Los hongos fitopatógenos son causantes de muchas pérdidas económicas en el
mundo y en Oaxaca una de las cosechas que más auge es la papaya donde se
tiene registro de pérdidas económicas a gran escala, por lo que se han realizado
innumerables estudios para crear medidas en la detección del hongo y su muerte,
en este caso antifúngicos.
El hongo estudiado en este trabajo ha sido encontrado en distintas plantas por lo
que no ha sido un hongo muy raro, su importante estudio durante este periodo ha
producido un gran basto conocimiento sobre su modo de infección, sabiendo que al
utilizar técnicas moleculares es más fácil identificar hongos que aún se desconocen
o que no se tiene total aceptación con la identificación morfológica.
SUGERENCIAS Una de mis sugerencias para los que tengan que continuar con este estudio es que
mantengan la paciencia, debido que el trabajo con hongos in vitro requiere de
mucho tiempo, de la misma manera que los estudios más recientes se encuentran
en inglés y es de suma importancia aprender inglés.
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