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Universidade Estadual de Campinas

Faculdade de Ciências Médicas

Rosanna Tarkany Basting

Avaliação da associação do extrato bruto diclorometânico de frutos de Pterodon

pubescens Benth. e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC na atividade

antinociceptiva e anti-inflamatória

Evaluation of the association of the crude dichloromethane extract from fruits

of Pterodon pubescens Benth. and the essential oil of Cordia verbenacea DC

in antinociceptive and anti-inflammatory activity

CAMPINAS

2018

2

Rosanna Tarkany Basting

Avaliação da associação do extrato bruto diclorometânico de frutos de Pterodon

pubescens Benth. e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC na atividade

antinociceptiva e anti-inflamatória

Evaluation of the association of the crude dichloromethane extract from fruits

of Pterodon pubescens Benth. and the essential oil of Cordia verbenacea DC

in antinociceptive and anti-inflammatory activity

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade

Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a

obtenção do título de doutora em Ciências Médicas, Área de

concentração Ciências Biomédicas

Thesis presented to the Faculty of Medical Sciences at University of

Campinas in partial fulfillment of the requiriments to obtain a PhD in

Medical Sciences, area of concentration Biomedical Sciences

Orientadora: Profª. Drª. Mary Ann Foglio

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA TESE

DEFENDIDA PELA ALUNA

ROSANNA TARKANY BASTING E

ORIENTADA PELA PROFA. DRA.

MARY ANN FOGLIO

CAMPINAS

2018

4

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

ROSANNA TARKANY BASTING

ORIENTADOR: Mary Ann Foglio

MEMBROS:

1. PROF. DR. Mary Ann Foglio

2. PROF. DR. Jorg Kobarg

3. PROF. DR. Rodrigo Ramos Catharino

4. PROF. DR. Angela Regina Araújo

5. PROF. DR. Dulce Helena Siqueira Silva

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora

encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

Data: DATA DA DEFESA [31/01/2018]

5

Dedico esta tese ao meu noivo Fabrício, aos meus pais Elisabeta e Roberto,

E aos meus irmãos Roberta e Roberto

6

AGRADECIMENTOS

À minha querida orientadora, Profª Drª Mary Ann Foglio, pela confiança no meu

trabalho, por me abrir novas oportunidades, pelos ensinamentos, conselhos, dedicação e

amizade. Obrigada por me ajudar a concluir mais um sonho de forma tão ética e afetuosa.

Admiro-te muito.

Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências

Médicas (FMC) – Unicamp por possibilitar a realização do meu doutorado e aos funcionários

da Seção de Pós-Graduação, em especial à Marcinha, pela competência e por resolver toda a

parte burocrática de forma sempre eficiente.

Ao Centro de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) - Unicamp,

pela infraestrutura para a realização do trabalho.

À Faculdade de Ciências Farmacêuticas (FCF) – Unicamp.

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela

concessão das bolsas de mestrado, doutorado direto, bolsa de estágio em pesquisa no exterior

(Processos 2013/15709-5; 2015/08600-2; 2016/23816-4) e suporte financeiro.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à

Coordenadoria de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte

financeiro.

Aos prezados membros da banca examinadora por aceitarem o meu convite, pelo

interesse, disposição e contribuição com o meu trabalho.

Ao coorientador Beto, pelos conhecimentos compartilhados e auxílio nos testes.

Ao Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho pela amizade, apoio e ensinamentos.

Às queridas amigas Ilza, Núbia, Marianinha e Leila Servat pela amizade, carinho,

ajuda e companheirismo. Esse trabalho também é de vocês.

Às queridas Ana Possenti e Sica pela ajuda fundamental nos ensaios

farmacológicos, pela disposição, carinho e alegria sempre compartilhada e a Drª Ana Lúcia

por sempre estar disposta a ensinar.

Aos queridos amigos da Divisão da Farmacologia e Toxicologia e da Divisão de

Química de Produtos Naturais: Vanessa, Fabi, Rogério, Naty, Lúcia, Adriana, Ellen,

Michelle, Tuany, Patricia Zago, Paula Paiva, Elaine, Débora, Fabrício, Patricia, Gisele.

Obrigada a todos pela amizade, sugestões e por tornar meus momentos no laboratório mais

leves e felizes. Desejo muito sucesso a todos vocês.

Ao Institute for Pharma Techonolgy (IPT) da University of Applied Sciences and

7

Arts Northwestern (FHNW) – Basel, Suiça, pela parceria de colaboração.

A Profª. Drª. Veronika Butterweck e toda equipe seu laboratório da FHNW, pela

oportunidade de relizar os ensaios in vitro deste trabalho. Obrigada pelo grande crescimento

profissional e pessoal.

Ao meu amor Fabrício, que me acompanhou desde o começo desta jornada.

Obrigada pelo amor, paciência, companheirismo, apoio, incentivo e por me fazer acreditar

que posso ir além do que penso ser capaz.

Aos meus queridos pais, Elisabeta e Roberto, pelo suporte e incentivo, e por tudo

o que me ensinaram e continuam me ensinando até hoje. Obrigada por me amparar em mais

esta etapa.

Aos meus amados irmãos, Roberto e Roberta, pelo companheirismo, amizade,

carinho e apoio. Agradeço especialmente à Roberta, por desde pequena me despertar o

interesse pela pesquisa e me incentivar a seguir este caminho. Um dia quero ser pelo menos

metade do que você é.

Aos meus queridos sobrinhos, Vinícius e Gustavo, por representarem uma das

maiores fontes de alegria e amor da minha vida.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram e incentivaram a realização

deste trabalho.

E a Deus, por sempre me iluminar, me amparar e dar forças para mais essa etapa

concluída.

Muito Obrigada a todos!

8

“...É melhor tentar e falhar,

que preocupar-se em ver a vida passar;

É melhor tentar ainda que em vão,

que sentar-se fazendo nada até o final.

Eu prefiro na chuva caminhar,

que em dias tristes em casa me esconder.

Prefiro ser feliz, embora louco,

que em conformidade viver...”

Martin Luther King

“Por vezes, sentimos que aquilo que fazemos não é, senão, uma gota de água no mar.

Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.

Madre Teresa de Calcutá

9

RESUMO

As espécies Pterodon pubescens Benth. (sucupira) e Cordia verbenacea DC são

plantas utilizadas pela população pelas suas propriedades analgésicas, anti-inflamatórias e

antirreumáticas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito farmacológico da

associação do extrato bruto dos frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo

essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) em modelos experimentais in vivo de nocicepção e

inflamação. Adicionalmente, os extratos, a associação dos extratos e dois dos principais

compostos ativos, α-Humuleno e os isômeros de posição éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-

vouacapano-17β-oato de metila e éster 6α-hidroxi -7β- acetoxi -vouacapano-17β-oato de

metila (vouacapano com m/z 404 – C1) foram avaliados na migração e proliferação de

queratinóticos imortalizados humanos (HaCaT) e na atividade anti-inflamatória (VEGF e IL-

8) in vitro em células estimuladas pelo fator de necrose tumoral alpha (TNF-α).

A administração oral das associações não causou alterações nos parâmetros

comportamentais dos animais, no aumento de peso nos testes de toxicidade aguda e teste de

campo aberto. A interação entre a associação dos extratos avaliada pelo método do

isobolograma foi classificada como uma interação de sinergismo. No teste de formalina, as

associações foram apenas significativas na fase inflamatória. Nos modelos de placa quente e

retirada de cauda, as associações não mostraram eficácia. No modelo de edema de pata

induzido por carragenina, as associações mostraram uma redução significativa do edema. No

modelo de edema de pata induzido por PGE2, a associação mostrou uma redução significativa

do edema. Na migração de leucócitos na peritonite induzida por carragenina, as associações

não reduziram significativamente a migração de leucócitos. Na alodinia mecânica induzida

por Adjuvante Completo de Freund, os dados mostraram que as associações foram efetivas na

fase aguda com pronunciado efeito na fase crônica. A análise realizada por HPLC-DAD e FID

mostrou concentrações determinadas importantes de α-Humuleno (0,64% Pp; 1,23% Cv),

trans-Cariofileno (4,54% Pp; 4,03% Cv), geranilgeraniol (0,21% Pp; 0,12% Cv) e compostos

m/z 404 (14,61% Pp) e m/z 362 (6,55% Pp).

Na avaliação da migração celular in vitro, foi demonstrado que o Pp, o Cv e a

associação de ambos inibiram a proliferação e a migração celular in vitro. O composto m/z

404 (C1) também apresentou ação antiproliferativa e inibiu a migração celular em

concentrações mais elevadas. Assim, estes compostos teriam potencial uso como um

tratamento local contra doenças cutâneas envolvidas na hiperproliferação. O α-Humuleno

demonstrou atividade na migração celular em todas as concentrações testadas. Nas células

10

estimuladas por TNF-α, Pp e Cv aumentaram a produção de VEGF, concentração-dependente.

A associação na maior concentração aumentou os níveis de VEGF. C1 aumentou os níveis de

VEGF em concentrações mais elevadas. O α-Humuleno aumentou significativamente os

níveis de VEGF em concentrações mais elevadas. Todas as amostras reduziram os níveis de

IL-8 na atividade anti-inflamatória in vitro. Portanto, sugerimos que o α-Humuleno pode ter

uma atividade dupla - em concentrações mais altas, o composto mostra um efeito anti-

inflamatório e angiogênico, enquanto em concentrações mais baixas, exerce atividade anti-

angiogênica inibindo a migração, possivelmente pela prevenção da secreção de VEGF. O

tratamento com α-Humuleno pode ser uma estratégia terapêutica potencial para promover a

cicatrização de feridas e para prevenir a inflamação em uma condição inflamatória persistente.

Os resultados apresentados demonstram que a associação do extrato bruto dos

frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial da Cordia verbenacea DC

(Cv) apresentam efeito sinérgico e demonstram importantes atividades antinociceptivas e anti-

inflamatórias, em doses mais baixas do que os extratos brutos separados, provavelmente

atuando em diferentes receptores farmacológicos, sem demonstrar efeitos colaterais. No

entanto, este efeito sinérgico não foi observado nos testes in vitro.

Palavras chave: Pterodon pubescens Benth. Cordia verbenacea DC. Anti-inflamatórios.

Antinociceptivo. Sinergismo farmacológico. Migração celular.

11

ABSTRACT

Pterodon pubescens Benth. (sucupira) and Cordia verbenacea DC are plants

popurlaly used due to their analgesic, anti-inflammatory and antirheumatic properties. This

work aimed to evaluate the pharmacological effect of the association of the crude extract of

the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential oil of Cordia verbenacea DC

(Cv) in in vivo experimental models of nociception and inflammation. Futhermore, the

extracts, the association of the extracts and two of the main active compounds, α-Humulene

and the position isomers 6α- hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester and 6α-

acetoxy-7β-hydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 404) were evaluated in the

migration and proliferation of human immortalized keratinocytes (HaCaT) and in anti-

inflammatory activity (VEGF and IL-8) in vitro in cells stimulated by tumor necrosis factor

alpha (TNF-α).

The oral administration of the associations did not cause changes in the animal´s

behavioral parameters, of the weight gain in the acute toxicity tests and in the open field test.

The interaction between the extracts association evaluated by the isobologram method was

classified as an interaction of synergism. In the formalin test, the associations were only

significant in the inflammatory phase. In the hot plate and tail withdrawal models, the

associations did not show significant efficacy against nociception due to thermal stimulation.

In the paw edema model induced by carrageenan, the associations showed a significant

reduction of edema. In the paw edema model induced by PGE2, the association showed a

significant reduction of edema. In the migration of leukocytes into carrageenan-induced

peritonitis, the associations did not significantly reduce leukocyte migration. In mechanical

allodynia induced by Freund's Complete Adjuvant, the data showed that the associations were

effective in the acute phase with a pronounced effect in the chronic phase. The analysis

performed by HPLC-DAD and FID showed important determined concentrations of α-

Humulene (0.64% Pp, 1.23% Cv), trans-Cariophilene (4.54% Pp, 4.03% Cv), geranylgeraniol

0.21% Pg, 0.12% Cv) and m / z 404 compounds (14.61% Pg) in / z 362 (6.55% Pg).

The in vitro cell migration evaluation, demonstrated that Pp, Cv and the

association of both inhibited proliferation and cell migration in vitro. Compound m/z 404

(C1) also showed antiproliferative effect and inhibited cell migration at higher concentrations.

Thus, these compounds would have potential use as a local treatment against cutaneous

diseases involved in hyperproliferation. α-Humulene demonstrated activity in cell migration

at all concentrations tested. In cells stimulated by TNF-α, Pp and Cv increased the production

12

of VEGF, in a concentration-dependent way. The association at the highest concentration

increased VEGF levels, whereas the lowest concentrations had no effect. Both C1 and α-

Humulene increased VEGF levels at higher concentrations. All samples reduced IL-8 levels

in anti-inflammatory activity in vitro. Therefore, we suggest that α-Humulene may have a

dual activity – since at higher concentrations, the compound shows an anti-inflammatory and

angiogenic effect, while at lower concentrations, anti-angiogenic activity is exerted, inhibiting

migration, possibly by preventing secretion of VEGF. Treatment with α-Humulene may be a

potential therapeutic strategy to promote wound healing and to prevent inflammation in a

persistent inflammatory condition.

The results showed that the association of the crude extract of the fruits of

Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential oil of Cordia verbenacea DC (Cv) showed

a synergistic effect and demonstrated important antinociceptive and anti-inflammatory

activities at lower doses than the separate crude extracts, probably acting at different

pharmacological receptors, without showing any side effects. However, this synergistic effect

was not observed in the in vitro tests.

Key words: Pterodon pubescens Benth. Cordia verbenacea DC. Anti-inflammatory agents.

Analgesics. Drug synergism. Cell migration.

13

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Cordia verbenacea DC 29

Figura 2. Estrutura química do α-Humuleno e trans-Cariofileno 30

Figura 3. Pterodon pubescens Benth. 33

Figura 4. Compostos identificados com atividade antinociceptiva e anti-inflamatória isolados

dos frutos de Pterodon pubescens Benth. 34

Figura 5: Exemplo ilustrativo de isobolograma 37

Figura 6. Procedimento para o ensaio de migração celular 51

Figura 7. Intervalo causado pelo insert 52

Capítulo 1:

Figure 1. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing test induced by

acetic acid of mice treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit

dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 66

Figure 2. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing induced by acetic

acid test of mice treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane

extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 67

Figure 3. Isobologram demonstrating the antinociceptive interaction between the Pterodon

pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil in the

abdominal writhing test induced by acetic acid 67

Figure 4. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin

model in the mice treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit

dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 69

Figure 5. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin

model in the mice treated orally with the with the association of the crude Pterodon pubescens

(Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 69

Figure 6. Evaluation on total number of leukocytes in the peritoneum in carrageenan-induced

peritonitis model in mice treated orally with the with the association of the crude Pterodon

pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil 72

Figure 7. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the

association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia

verbenacea (Cv) essential oil 74

Figure 8. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the

association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia

14

verbenacea (Cv) essential oil. 75

Capítulo 2:

Figure 1. Chemical structure of α-Humulene 96

Figure 2. Compounds identified with antinociceptive and anti-inflammatory activity isolated

from the fruits of Pterodon pubescens Benth (isomers m/z 404 – C1) 97

Figure 3. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (ratio ½ :

½) (C), C1 (D) and α-Humulene (E) on the cellular ATP level 103

Figure 4. BrdU incorporation in de novo synthesized cellular DNA by Pterodon pubescens

extract (A), Cordia verbenacea essential oil (B), Association (C), C1 (D) and α-Humulene (E)

104

Figure 5. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging

interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the

momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated

with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and LY294002 (10 μM) 106

Figure 6. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were

taken every hour during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images

at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 106




with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and Pterodon pubescens

extract (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL) 107



at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 108




with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and essential oil of Cordia

verbenacea (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL) 109



at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 109

Figure 11. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse

15

imaging interval snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show

the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a representative experiment. HaCaT cells were

treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and association of

Pterodon pubescens extract and essential oil of Cordia verbenacea (3.125; 6.25 and 12.5

μg/mL) 110



at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 111



at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 111




treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and C1 (6.25; 12.5 and

25 μM) 112



at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 113




treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2% FCS) and α-Humulene (6.25;

12.5 and 25 μM) 114



at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h 114

Figure 18. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1

(D), α-Humulene (E), LY 294002 and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) VEGF

secretion in HaCaT cells 115

Figure 19. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1

(D), α-Humulene (E) and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) IL-8 secretion in

HaCaT cells 116

16

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Atividades farmacológicas descritas de Cordia verbenacea DC utilizando

diferentes tipos de solventes extratores 31

Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de extratos de frutos de Pterodon pubescens

Benth utilizando diferentes tipos de solventes extratores 34

Tabela 3. Descrição de sinergismo, adição e antagonismo em estudos de combinação de

substâncias, através do método de determinação do Índice Combinatório (IC) 38

Tabela 4. Associações do extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens Benth (Pp) e do óleo

essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) 46

Capítulo 1:

Table 1. Associations of crude dichloromethane of Pterodon pubescens Benth (Pp) fruit

extract and Cordia verbenacea DC (Cv) leaves’ essential oil tested in various combination

mixtures (25, 50, 75, 100 and 200 % of the ED50 of each extract tested alone) tested on

abdominal writhing experimental model induced by acetic acid for visualization of

pharmacological interaction effect 63

Table 2. Percentage amounts of active compounds present at crude dichloromethane

Pterodon pubescens fruits extract and Cordia verbenacea DC essential oil 67

Table 3. Ambulatory activity of Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and

Cordia verbenacea (Cv) essential oil 67

Table 4. Combination Index of the different proportions of the association of the crude

Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential

oil in the abdominal writhing test induced by acetic acid 70

Table 5. Compounds present in associations selected for pharmacological tests 72

Table 6. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with

the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and

Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100%

and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the association 73

Table 7. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with

the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and

Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100%

and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the association 74

Capítulo 2:

Table 1. Percentage amounts of active compounds present at crude dichloromethane

17

Pterodon pubescens fruits extract and Cordia verbenacea DC essential oil

102

18

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 20

2. REVISÃO DA LITERATURA 22

2.1. Inflamação e dor 22

2.2. Terapêutica para dor e inflamação 25

2.3. Plantas Medicinais 27

2.3.1. Cordia verbenacea DC 28

2.3.2. Pterodon pubescens Benth. (sucupira) 33

2.4. Interações farmacológicas 36

2.5. Justificativa 39

3. OBJETIVO 40

3.1. Objetivo Geral 40

3.2. Objetivos específicos 40

4. MATERIAL E MÉTODOS 41

4.1. Obtenção do material vegetal 41

4.2. Preparação dos extratos 41

4.2.1. Pterodon pubescens Benth. 41

4.2.2. Cordia verbenacea DC 41

4.2.3. Análise fitoquímica 42

4.2.3.1. Isolamento dos voucapanos 42

4.2.3.2. Análise GC-MS 42

4.2.3.3. Análise dos compostos voláteis por GC-FID (cromatografia gasosa

com detector de ionização de chamas) 42

4.2.3.4. Compostos vouacapanos – HPLC-DAD 43

4.3. Atividade Farmacológica 43

4.3.1. Animais e cuidados éticos 43

4.3.2. Estudo da toxicidade em dose única 43

4.3.3. Avaliação da atividade locomotora (campo-aberto) 44

4.3.4. Determinação da Dose Efetiva 50 (DE50) no modelo de contorção abdominal

induzida por ácido acético 44

4.3.5. Análise isobolográfica e construção do índice combinatório (IC) 44

4.3.6. Teste de lambedura de pata induzido por formalina 46

4.3.7. Retirada de cauda 47

19

4.3.8. Placa quente 47

4.3.9. Edema de pata por carragenina 48

4.3.10. Edema de pata induzido por prostaglandina E2 (PGE2) 48

4.3.11. Peritonite induzida por carragenina 48

4.3.12. Alodinia induzida por CFA – Adjuvante completo de Freund 49

4.4. Experimentos in vitro 49

4.4.1. Cultura de células 50

4.4.2. Ensaio de viabilidade celular (ATP) 50

4.4.3. Ensaio de proliferação celular 50

4.4.4. Ensaio de migração celular (“scratch assay”) 51

4.4.5. Atividade anti-inflamatória (VEGF e IL-8) 52

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA 54

6. RESULTADOS 55

6.1. Capítulo 1 55

6.2. Capítulo 2 93

7. DISCUSSÃO GERAL 126

8. CONCLUSÃO 139

9. PERSPECTIVAS FUTURAS 140

10. CONSIDERAÇÕES FINAIS 141

11. REFERÊNCIAS 142

12. ANEXOS 159

Anexo 1: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 3181-1) 159

Anexo 2: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 4392-1) 160

Anexo 3: Depósito de Patente Nacional 161

Anexo 4: Depósito de Patente Internacional 162

Anexo 5: Submissão de artigo a Journal of Etnopharmacology 163

20

1. INTRODUÇÃO

Esta Tese está de acordo com a Informação CCPG/001/2015, UNICAMP, de

17/06/2015, que regulamenta o formato alternativo para dissertação e tese, permitindo a

inserção de artigos científicos de autoria ou coautoria do candidato. Os resultados desta Tese

estão apresentados em capítulos, onde cada capítulo corresponderá a um artigo científico

distinto totalizando dois capítulos, sendo que os artigos encontram-se em fase de submissão

em revistas científicas.

A natureza é uma fonte fundamental no processo de busca pelo desenvolvimento

de novos fármacos. O Brasil apresenta a maior biodiversidade total do mundo,

compreendendo mais de 45.000 espécies de plantas superiores (20 -22% do total existente no

planeta) (Dutra et al., 2016). A enorme biodiversidade vegetal é capaz de fornecer insumos

para gerar fitoterápicos, fitofármacos e protótipos de novas drogas com importância

econômica (Cragg & Newman, 2013). De acordo com as estimativas, cerca de um terço dos

medicamentos de uso clínico são baseados em produtos naturais, incluindo constituintes

diretamente isolados a partir de produtos naturais, sintetizados ou semi-sintetizados por

modificação estrutural dos seus compostos naturais (Sticher, 2014). Em 2016, Cragg &

Newman estimavam que aproximadamente 55,1% de todas as novas drogas aprovadas no

período de 1981 a dezembro de 2014, eram derivados diretamente ou indiretamente de

produtos naturais (Cragg & Newman, 2016).

Dentre as espécies brasileiras nativas, encontram-se a Pterodon pubescens Benth.

e a Cordia verbenacea DC, com diversas atividades farmacológicas relatadas, como

antinociceptiva e anti-inflamatória (Spindola et al., 2009, Dutra et al., 2016). A literatura

científica tem demonstrado que frequentemente a ação farmacológica do princípio ativo

isolado, difere da ação encontrada nos extratos brutos. Acredita-se que essas vantagens

terapêuticas encontradas em medicamentos fitoterápicos e associações sejam decorrentes de

interações sinérgicas que potencializam os seus efeitos farmacológicos com redução dos

efeitos colaterais (Heinrich et al, 2007).

Como exemplo de combinações de fármacos com efeito sinérgico clinicamente

comprovado, a preparação fitofarmacêutica Iberogast® comercializada na Alemanha, e

composta por nove extratos de plantas, é utilizada para o tratamento de dispepsia funcional e

síndrome do intestino irritável. A preparação mostrou equivalência terapêutica quando

comparado com as drogas sintéticas usualmente utilizadas cisaprida e metoclopromida, porém

com a vantagem adicional de que o preparo fitoterápico mostrou pouco ou nenhum efeito

21

colateral (Allescher & Wagner, 2007).

A melhor eficácia de associações de compostos ou extratos pode demonstrar que

os efeitos sinérgicos são multialvos, onde a associação atua não apenas em um único alvo,

mas em vários alvos e, portanto cooperam de uma forma sinérgica. A estratégia de uso para

uma associação multialvo baseia-se na etiologia pluri-causal de muitas doenças e

fisiopatologia complexa, podendo ser tratados de forma mais eficaz com combinações

farmacêuticas bem escolhidas do que com uma única droga (Wagner & Ulrich-Merzenich,

2009; Ulrich-Merzenich, 2014). Portanto, apesar da descoberta dos compostos responsáveis

pela atividade, a mistura ainda pode propiciar melhores resultados (Heinrich et al., 2007).

No Brasil, o Ministério da Saúde em 1994, estabeleceu a primeira normativa para

avaliar a segurança, qualidade e eficácia de medicamentos à base de plantas comercializados.

Este regulamento proposto foi baseado principalmente nas orientações da Organização

Mundial da Sáude (WHO – World Health Organization) e nas diretivas francesas e alemãs

(Dutra et al., 2016). Atualmente, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária)

através da resolução RDC nº 17 de 16/04/2010 e RDC 26/2014, que regulamentam as boas

práticas de fabricação de medicamentos, que estabelece que estes devam apresentar

comprovação de eficácia, segurança e reprodutibilidade.

Portanto para aprimorar o conhecimento sobre os efeitos farmacológicos, efeitos

colaterais e garantia de uso seguro e eficaz de fitoterápicos, é importante a realização de

estudos químicos, biológicos e farmacológicos, para o alcance de um padrão de qualidade

necessário a um medicamento.

22

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Inflamação e dor

A inflamação pode ser definida como o conjunto de alterações bioquímicas,

fisiológicas e imunológicas em resposta a estímulos agressivos ao organismo. Ocorre após

dano tecidual e/ou celular causada por estímulos químicos (toxinas), físicos (radiação,

queimaduras traumas), imunológicos ou microbianos (Hume & Fairlie, 2005; Serhan & Savil,

2005, Stables & Gilroy, 2010). Foi caracterizada clinicamente em 30 a.C. pelo médico

romano Aulus Cornélius Celsus por quatro sinais cardinais: calor, rubor, edema e dor.

Posteriormente, Cláudio Galeno acrescentou a perda da função do membro afetado. A

inflamação tem como objetivo levar a resolução do dano tecidual, porém, quando esta

resposta não é modulada, ocorre exacerbação do processo com o quadro que pode tornar-se

crônico, culminando com a perda de função do tecido e diminuição da qualidade de vida do

organismo (Gilroy et al., 2004).

O processo inflamatório envolve uma complexa cascata de eventos bioquímicos e

celulares, que inclui extravasamento de plasma, ativação enzimática, migração celular,

sensibilização e ativação de receptores, lise e reparo tecidual (Carvalho & Lemônica, 1998).

Em geral, as lesões teciduais desencadeiam uma reação inflamatória local, iniciadas e

reguladas por mediadores inflamatórios: aminas (histamina e serotonina de mastócitos),

proteases plasmáticas [sistema complemento, cininas (bradicinina e calidina) e proteínas

fibrinolíticas e de coagulação], mediadores lipídicos [prostaglandinas, leucotrienos e fator

ativador de plaquetas (PAF)], citocinas (de linfócitos ativados e macrófagos – interleucinas e

fator de necrose tumoral), NO, entre outros (Rosenberg et al., 1999; Roberts II & Morrow,

2003; Stables & Gilroy, 2010).

A dor aparece devido aos efeitos diretos de mediadores resultantes tanto do dano

inicial quanto da resposta inflamatória em si, como pela compressão dos nervos sensoriais

ocasionada pelo edema local. Uma resposta inflamatória aguda bem sucedida resulta na

eliminação do agente infeccioso seguida pela fase de resolução e reparo, que é mediada

principalmente por macrófagos residentes e recrutados. Se a inflamação aguda falha em

eliminar o patógeno, o processo inflamatório persiste e adquire novas características. O

infiltrado de neutrófilos é substituído por macrófagos, e no caso de infecção por linfócitos T.

Se o efeito combinado dessas células ainda continua insuficiente, um estado inflamatório

crônico segue, envolvendo a formação de granulomas (Medzhitov, 2008).

Precisamente, a dor é um resultado subjetivo da nocicepção, que é definida como

processos neurais de codificação e processamento do estímulo nocivo (Loeser & Treede,

23

2008). Descrevendo melhor, a nocicepção é o processo pelo qual estímulos térmicos,

mecânicos ou químicos nocivos são detectados por uma subpopulação de fibras nervosas

periféricas, chamadas nociceptores, definidos por Sherrigton em 1906, como terminações

livres de neurônios aferentes primários (Basbaum et al., 2009).

Os nociceptores podem ser ativados por diversos estímulos, classificados como

dolorosos mecânicos, térmicos e químicos. Os mediadores inflamatórios promovem de forma

sinérgica uma alteração no mecanismo de transdução periférica desses estímulos, aumentando

a sensibilidade de transdução de receptores de elevado limiar, com consequente redução no

limiar de percepção do estímulo doloroso, exagerada resposta a estímulos nociceptivos supra

limiares e dor espontânea (Bonica et al., 1990; Meyer et al., 1994).

Estes nociceptores são extremamente heterogêneos, diferindo quanto aos tipos de

neurotransmissores que contêm, os receptores e canais iônicos que expressam, na velocidade

de condução, nas suas propriedades de resposta ao estímulo nocivo e sua capacidade de serem

sensibilizados durante a inflamação, lesão e doença (Stucky et al., 2001). Há três tipos de

transmissão do estímulo nociceptivo, de acordo com as características da fibra aferente

envolvida na transmissão nervosa. Estas são classificadas de acordo com sua anatomia e

função.

As fibras Aβ são mielinizadas, de amplo diâmetro, rápida condutância e em sua

maioria respondem por estímulos mecânicos inócuos, como um toque suave na pele (Meyer et

al., 2008). As fibras Aδ são pouco mielinizadas, com diâmetro de 2,0 a 6,0 μm, e propagam o

impulso mais rapidamente (responsáveis pela dor rápida ou primeira dor). Existem duas

principais subclasses de nociceptores Aδ e ambas respondem aos estímulos mecânicos

intensos, mas podem ser diferenciados pela sua responsividade ao calor intenso (tipo I-

ativadas a temperaturas de 53 °C; e tipo II - ativadas a 43°C) (Millan, 2002; Basbaum et al.,

2009). Em geral, a dor rápida é desencadeada por tipos de estímulos mecânicos e térmicos,

enquanto a dor crônica pode ser desencadeada pelos três tipos de estímulos (Guyton & Hall,

2011). A fibra do tipo C é amielinizada e seu diâmetro varia entre 0,4 a 1,2 µm, e são capazes

de propagar o impulso nervoso de maneira mais lenta (responsáveis pela dor lenta ou segunda

dor). As terminações desse tipo de fibra são receptores termossensíveis ao calor e ao frio e

também são sensibilizados por substâncias como acetilcolina, serotonina e histamina, bem

como a capsaicina, e são consideradas importantes no estudo da dor clínica (Stein et al., 2009;

Guyton & Hall, 2011).

A primeira sinapse da via da dor ocorre no corno dorsal espinal, sendo a chave da

regulação da transmissão da nocicepção (Heinricher et al., 2009). A sensibilização no corno

24

espinal resulta da liberação pré-sináptica de mediadores tais como glutamato e substância P.

Receptores de glutamato (NMDA, AMPA, cainato) e substância P agem

sinergicamente para promover aumento da excitabilidade neuronal, sensibilização central e

caracterizam um processo periférico conhecido como inflamação neurogênica (Geppetti et al.,

1996). Podem ainda estimular a síntese de óxido nítrico (NO) pelo endotélio vascular,

causando vasodilatação e extravasamento de plasma para os tecidos (edema), aumento da

liberação de enzimas lisossômicas e de prostaglandinas (Sung et al., 2004; Sherwood &

Toliver-Kinsky, 2004).

Após a transmissão sináptica e modulação do sinal nociceptivo pelos neurônios

sensoriais, esses sinais são finalmente percebidos como dor em um contexto que envolve

fatores cognitivos e ambientais (Woolf & Salter, 2000). A dor é uma qualidade sensorial

complexa e indefinida, pois é uma experiência que envolve múltiplos fatores que não inclui

apenas a nocicepção, mas implica também em componentes cognitivos, afetivos e emocionais

(Neugebauer et al., 2009). A via supraespinal do controle da dor se origina em muitas regiões

cerebrais, tais como substância periarquedutal cinzenta (PAG), núcleos medianos da rafe e

medula rostral ventromedial (RVM) e possuem papel crítico na determinação da dor crônica e

aguda (Heinricher & Ingram, 2008; Heinricher et al., 2009).

A sensação de dor nos alerta para uma real ou provável lesão e desencadeia

respostas apropriadas para proteger o organismo. Os nociceptores não sinalizam somente a

dor aguda, mas também contribuem em condições dolorosas persistentes de cunho patológico.

Embora a dor aguda possua um papel protetor como um sistema de alerta, a dor crônica como

a dor neuropática, é produzida pela disfunção ou lesão do sistema nervoso periférico ou

central e pode persistir por dias, meses ou anos após a lesão nervosa (Somers & Clemente,

2009). A dor neuropática é caracterizada por sintomas de hipersensibilidade dolorosa,

representados pela alodínia mecânica (respostas dolorosas a estímulos táteis normalmente

inócuos) e hiperalgesia mecânica e térmica (responsividade aumentada a estímulos

previamente nocivos) (Ji & Strichartz, 2004). A transição para a fase crônica envolve

mudanças na medula espinhal e encéfalo, resultando em duas diferentes condições: aumento

da responsividade dos neurônios da medula espinhal (sensibilização central) ou diminuição do

limiar de ativação dos nociceptores (sensibilização periférica). Também ocorre modulação

significativa nos locais onde as mensagens da dor são iniciadas no nível do primeiro neurônio

sensorial (Basbaum et al., 2009).

A dor é a razão mais comum para que as pessoas procurem cuidados médicos

(Melnikova, 2010). Estimativas da Sociedade Americana de Dor mostram que a dor afeta

25

mais de 100 milhões de adultos nos Estados Unidos e são gastos cerca de 635 bilhões de

dólares por ano em tratamento médico e perda de produtividade (Borsook et al., 2014).

A dor crônica é uma das principais causas de incapacidade e afastamento do

trabalho, perda de funcionalidade e da qualidade de vida sendo um dos principais problemas

econômicos de saúde. Estimativas mostraram que a prevalência da dor neuropática é acima de

5% na população geral, onde um quarto desses sofre com uma intensidade severa (Baron,

2009). Apesar dos avanços nas diversas áreas de conhecimentos relacionadas à dor, como

epidemiologia, fisiopatologia e terapêutica, os resultados dos tratamentos como prevenção das

recorrências ainda não são satisfatórios devido a eventos adversos potenciais e falta de

eficácia (Recio et al., 2012).

2.2. Terapêutica para dor e inflamação

O papel dos opióides no tratamento da dor é conhecido há milhares de anos

(Tsagareli, 2012). Os analgésicos opióides são amplamente utilizados para aliviar dor severa

aguda, dor pós-operatória, crônica e dores mal localizadas (geralmente visceral) (Gurtskaia et

al., 2014). O uso de doses repetidas pode causar tolerância a estes fármacos e dependência de

modo que uma cessação súbita de analgésicos opióides pode precipitar síndrome de

abstinência, além de efeitos adversos, como náusea, constipação, depressão respiratória, e, em

longo prazo hipogonadismo, osteoporose, imunossupressão e hiperalgesia (Raghavan et al.,

2011; Gurtskaia et al., 2014). Para além dos fármacos opióides, a abordagem terapêutica

comumente utilizada para reduzir a dor e inflamação envolve o uso de drogas anti-

inflamatórias não esteroidais (AINEs) (McGettigan & Henry, 2013).

Os anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) representam um grupo de mais de

20 fármacos que desfrutam de ampla aplicação clínica e apresentam compostos com

estruturas químicas heterogêneas que demonstram eficácia para o tratamento da dor,

inflamação e propriedades anti-piréticas (Rigas & Tsioulias, 2015; Cornejo-Garcia et al.,

2009). O primeiro AINE, sintetizado por Felix Hoffmann em 1897, foi a Aspirina®, derivado

a partir do ácido salicílico encontrado na casca do salgueiro (Spiraea ulmaria, Salix species),

utilizado tradicionalmente para tratar febre e inflamação, tornou-se um dos medicamentos

mais usados mundialmente (Floyd & Ferro, 2014).

Com base na sua capacidade para inibir a isoforma de ciclooxigenase, os AINEs

são classificados como não seletivos, que inibem de forma significativa tanto a COX-1 e

COX-2, e seletivos que inibem a COX-2 (Rigas & Tsioulias, 2015).

26

A ciclooxigenase-1 (COX-1) é uma enzima expressa constitutivamente e catalisa

a produção de prostaglandinas que estão envolvidas em numerosas funções fisiológicas,

incluindo a manutenção da função renal normal nos rins, à proteção da mucosa no trato

gastrointestinal e o tromboxano A2 pró-agregatório nas plaquetas (Rao & Knaus, 2008).

Nos locais de inflamação está presente a isoforma ciclooxigenase-2 (COX-2) e

sua expressão é induzida por citocinas e outros mediadores inflamatórios em diversos tecidos,

incluindo as células endoteliais, que originam prostaglandinas que medeiam a inflamação

(Rigas & Tsioulias, 2015).

O uso indiscriminado e contínuo de AINEs pode levar a efeitos adversos sérios

podendo até mesmo ser letal (Salvo et al., 2011).

Ambos os efeitos terapêuticos e adversos dos AINEs são principalmente devido à inibição da

biossíntese de prostanóides (Patrono et al., 2001). Os principais efeitos colaterais dos AINEs

incluem distúrbios gastrointestinais, úlceras gástricas, toxicidade renal, insuficiência renal

aguda, principalmente pela inibição de COX-1, riscos cardiovasculares e no sistema nervoso

central pela atuação dos inibidores seletivos da COX-2, que atuam no desequilíbrio da

homeostase em favor da trombogênese e da vasoconstrição (Massó et al., 2010; Patrignani et

al., 2011; Adam, 2011; Doña et al., 2012; Bruno et al., 2014; Rigas & Tsioulias, 2015).

A inibição da COX-1 leva ao aparecimento de efeitos gastrointestinais que podem

variar de dispepsia a sangramentos do estômago e duodeno, lesões agudas na mucosa,

ativação de doenças inflamatórias intestinais quiescentes e dano tecidual, como úlceras no

trato gastrointestinal. As úlceras gástricas são decorrentes do efeito tópico e sistêmico de

alguns AINEs que promovem a alteração do pH, redução da secreção de muco e bicarbonato,

alterações microvasculares e indução de infiltração leucocitária na mucosa gástrica (Massó et

al., 2010; Patrignani et al., 2011).

Em 1999, baseado em resultados de estudos clínicos, o FDA aprovou a

comercialização do celecoxibe e o rofecoxibe, drogas inibidoras seletivas da COX-2, que

atingiram US$ 10 bilhões em vendas, por serem eficazes no tratamento de sinais e sintomas

de osteoartrite e artrite reumatoide, da dor aguda em adultos e dismenorreia (Bombardier,

2002; Fitzgerald, 2004). Inibidores da COX-2 (coxibes) são diferenciados dos AINEs

tradicionais farmacologicamente pela inibição apenas da enzima COX-2, e clinicamente por

taxas mais baixas de dano gastrointestinal superior e inferior (Salvo et al., 2011). Entretanto,

o mecanimo de inibição da COX-2 promovidos pelos coxibes acarretam a diminuição da

produção de prostaciclinas (PGI2) antitrobóticas e vasodilatadoras e um aumento da

incidência de eventos trombóticos foram detectados em ensaios controlados envolvendo os

27

inibidores da COX-2, celecoxibe, rofecoxibe (Bressalier et al., 2005; Solomon et al., 2005;

Nussmeier et al., 2005; Ott et al., 2005), predispondo os pacientes a eventos cardiovasculares

(Saraiva, 2007).

Em meados da década de 2000, em razão do risco de infarto do miocárdio e

acidentes vasculares cerebrais, houve a retirada do rofecoxibe do mercado, gerando uma

redução na prescrição de todos os AINEs, impulsionado principalmente por uma diminuição

marcada no uso de agentes de COX-2 seletivos. Um estudo prospectivo usando dados de

registros americanos demonstrou que o uso de agentes de COX-2 seletivos diminuiu 55,1 -

29,2% entre os pacientes com artrite reumatoide ou artrite psoriática entre 2003 e 2005. Em

contraste, o uso de AINES não seletivos aumentou 50,2 - 73,9% (Greenberg et al., 2009;

Conaghan, 2012).

Em 2015, a FDA (Food and Drug Administration), órgão governamental dos

Estados Unidos, publicou um anúncio de segurança para fortalecer o aviso já existente nos

rótulos dos AINEs que alertam os consumidores sobre o aumento de riscos de ataque cardíaco

e acidente vascular encefálico com o uso de AINES. Além disso, solicitaram a atualização de

todos os rótulos dos AINES que precisam de prescrição médica para inclusão de informações

de segurança (FDA, 2015).

2.3. Plantas Medicinais

O uso de plantas medicinais é frequente em muitas comunidades onde a

população utiliza as plantas de forma empírica para combater os sintomas da doença,

utilizando-se de chás e infusões. A união do conhecimento popular e a investigação científica

são denominadas etnofarmacologia, definida por Rivier & Bruhn em 1979, como sendo uma

“área multidisciplinar de pesquisa baseada na observação, descrição e investigação

experimental de drogas indígenas e sua atividade biológica”.

A natureza é uma fonte fundamental no processo de busca pelo desenvolvimento

de novos fármacos. O Brasil apresenta a maior biodiversidade total do mundo,

compreendendo mais de 45.000 espécies de plantas superiores (20 -22% do total existente no

planeta) (Dutra et al., 2016). A enorme biodiversidade vegetal é capaz de fornecer insumos

para gerar fitoterápicos, fitofármacos e protótipos de novas drogas com importância

econômica (Cragg & Newman, 2013).

De acordo com as estimativas, cerca de um terço dos medicamentos de uso clínico

são baseados em produtos naturais, incluindo constituintes diretamente isolados a partir de

produtos naturais, sintetizados ou semi-sintetizados por modificação estrutural dos seus

28

compostos naturais (Sticher, 2014). Exemplos bem conhecidos são a colchicina, morfina,

aspirina® semi-sintética, taxol, entre outros (Cragg & Newman, 2013).

Em 2016, Cragg & Newman estimavam que aproximadamente 55,1% de todas as

novas drogas aprovadas no período de 1981 a dezembro de 2014, eram derivados diretamente

ou indiretamente de produtos naturais (Cragg & Newman, 2016).

No Brasil, o Ministério da Saúde em 1994, estabeleceu a primeira normativa para

avaliar a segurança, qualidade e eficácia de medicamentos à base de plantas comercializados.

Este regulamento proposto foi baseado principalmente nas orientações da Organização

Mundial da Sáude (WHO – World Health Organization) e nas diretivas francesas e alemãs

(Dutra et al., 2016). Atualmente, a ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária)

através da resolução RDC nº 17 de 16/04/2010, regulamenta as boas práticas de fabricação de

medicamentos, que estabelece que estes devam apresentar comprovação de eficácia,

segurança e reprodutibilidade. Em adição, a RDC nº 26 de 02/06/2015, dispõe sobre o

registro de medicamentos fitoterápicos e o registro e a notificação de produtos tradicionais

fitoterápicos (http://portal.anvisa.gov.br/).

Na literatura, vários estudos relatam que extratos derivados de plantas demostram

atividade anti-inflamatória através do controle de níveis de citocinas inflamatórias ou

mediadores inflamatórios, como Il-1, Il-6, Il-10, iNOS e COX-2 e atividade antinociceptiva e

anti-inflamatória em modelos animais (Koretz et al., 2004; Debnath et al., 2013; Riegsecker

et al., 2013; Walker et al., 2013; Dutra et al., 2016).

2.3.1. Cordia verbenacea DC

A Cordia verbenacea DC (Cv), sinonímia de Varronia verbenacea (DC.) Borhidi

(Trópicos, 2017), é um arbusto perene nativo da Mata Atlântica, amplamente distribuída ao

longo da costa sudeste do Brasil, pertencente à família botânica Boraginaceae, popularmente

conhecida como erva baleeira, maria milagrosa, catinga preta, baleeira-cambará, camaradinha,

caraminha, caramoneira do brejo e maria-pretinha e suas folhas são popularmente utilizados

por sua atividade anti-inflamatória e cicatrizante (Michielin et al., 2009; Dutra et al., 2016).

Vários compostos são encontrados nas suas partes aéreas, incluindo taninos, flavonoides,

mucilagens além de óleos essenciais. Essas partes, folhas e inflorescências, são utilizadas na

medicina popular devido a suas ações antirreumática, anti-inflamatória, antimicrobiana,

analgésica sob a forma de extrato alcoólico, decocção e infusão (De Carvalho et al., 2004;

Passos et al., 2006; Dutra et al., 2016).

http://portal.anvisa.gov.br/

29

Figura 1. Cordia verbenacea DC. Fonte: Campo experimental CPQBA/UNICAMP, Basting, R.T.

Lins et al., segundo Barroso et al. (2002), em 1980 e 1990, estudando o extrato

etanólico desta espécie isolaram duas flavonas pentametoxiladas: 5,6'-diidroxi-3,6,7,3',4'-

pentametoxiflavona e a 5, 6'-diidroxi-3,3',4',6,7-pentametoxiflavona. Identificaram também a

presença de sitosterol. Valde et al., apud Barroso et al. (2002), confirmaram em 1982 a

presença das duas flavonas e isolaram da espécie o composto 5-hidroxi-3,6,7,3',4'-

pentametoxiflavona. Esses autores também isolaram dois triterpenos do grupo damarano, que

foram denominados de cordialina A e cordialina B.

Os primeiros estudos das propriedades anti-inflamatórias da C. verbenacea foram

iniciados na década de 80 por Sertié et al. (1988, 1990, 1991) que identificaram o composto

artemetina nos extratos avaliados em modelos farmacológicos atribuindo a atividade anti-

inflamatória a esse flavonoide. Porém Bayeux et al.(2002), avaliaram a atividade anti-

edematogênica do extrato bruto diclorometânico e da fração enriquecida com artemetina no

modelo de edema de pata induzido por carragenina. O extrato inibiu o edema, mas a fração de

artemetina não mostrou atividade. Esses resultados indicaram que a atividade estava

relacionada com componentes de baixa polaridade. O extrato diclorometânico também

mostrou atividade antinociceptiva. Passos et al., (2006) demonstraram a presença de vários

componentes através da análise fitoquímica do extrato etanólico, tais como taninos,

flavonóides, mucilagens e óleo essencial. Os principais constituintes do óleo essencial de

Cordia verbenacea DC identificados por cromatografia gasosa acoplada a detector de massas

foram α-Humuleno (29,69%), trans-Cariofileno (25,27%) e allo-aromadendrene (9,99%)

30

(Passos et al., 2006). Vila et al., em 2009, também analisaram o óleo essencial de Cordia

verbenacea e identificaram mais de 91% da composição (46 constituintes). O óleo avaliado

foi composto principalmente por hidrocarbonos terpênicos, monoterpenos (41,5%) e

sesquiterpenos (42,7%). Os principais compostos identificados foram α-pineno (36,5%), β-

Cariofileno (11,7%) e α-santaleno (8,6%). Também apresentou quantidades significativas de

allo-aromadendrene (4,3%) e α-Humuleno (3%) (Vila et al., 2009).

Dentre os diferentes componentes encontrados no óleo essencial, há o destaque

para dois compostos principais com importante atividade anti-inflamatória e anti-

edematogênica, o α-Humuleno e trans-Cariofileno ilustrados na Figura 2 (Passos et al., 2006).

Figura 2. Estrutura química do α-Humuleno e trans-Cariofileno (fonte: Sigma-Adrilch®)

Devido à diversidade de grupos químicos encontrados nos extratos dessa espécie,

há diversas atividades farmacológicas relatadas: antibacteriana, antinociceptiva, anti-

inflamatória, anti-edematogênica, antiulcerogênica, anticâncer, antitumoral, antifúngica,

antimicrobiana, entre outras. As ações dos diferentes extratos de C. verbenacea estão descritas

na Tabela 1.

31

Tabela 1. Atividades farmacológicas descritas de Cordia verbenacea DC utilizando diferentes tipos de solventes

extratores.

Atividade farmacológica Autores

Óleos essenciais

Atividade antifúngica Schlemper et al., 2000

Antibacteriana para bactérias Gram positivas De Carvalho et al., 2004

Larvicida para Aedes aegypti Santos et al., 2006

Compostos isolados do óleo essencial: α-Humuleno e trans-Cariofileno

apresentaram atividade anti-inflamatória e antialérgica contra veneno de

abelha

Passos et al., 2006

Os compostos isolados do óleo essencial α-Humuleno e trans-Cariofileno

apresentaram redução do edema de pata em ratos induzido por bradicinina

e carragenina, redução da atividade plaquetária. Também reduziram a

produção de prostaglandina E2 (PGE2), indução da sintase de óxido nítrico

(iNOS) e expressão de Ciclooxigenase (COX-2).

Fernandes et al., 2007

O composto α-Humuleno apresentou redução do edema de pata induzido

por histamina, prevenção da geração do TNF-α e da IL-1β na geração do

edema.


O composto trans-Cariofileno diminui a liberação do TNF-α na geração

do edema de pata


Os compostos α-Humuleno e trans-Cariofileno inibiram a ativação do NF-

kB induzida por LPS e migração de neutrófilos em modelo de inflamação

aguda na pata induzido por LPS, embora apenas α-Humuleno teve a

capacidade de impedir a produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF-α e

Il-1β)1.

Medeiros et al., 2007

Antibacteriana para as gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC 6538

e Enterococcus faecalis ATCC 29212

Meccia et al., 2009

Formulação em gel base provocou o aumento de fibroblastos em pele de

ratos Wistar, sem aumento do número de leucócitos, sugerido a redução

da reação inflamatória

Leonardi et al., 2010

Antimicrobiana e antifúngica, apresentando resultados positivos para a

inibição de Candida albicans e C. krusei e para as linhagens de bactérias

gram-positivas e gram-negativas multirresistentes

Rodrigues et al., 2012

Diminuição da reabsorção alveolar do osso, em modelo de periodontite

em ratos, além de reduzir a frequência de detecção de P. gingivalis

Pimentel et al., 2012

Extratos hidroalcoólico

Não apresentou efeitos tóxicos ou mudanças nos parâmetros do plasma

sanguíneo e na função cardíaca após 30 dias da administração oral,

sugerindo um efeito não tóxico

Oliveira et al., 1998

Ação anti-inflamatória, administrado por via oral ou tópica. Ação Sertié et al., 1991

32

protetora da mucosa gástrica

Extratos etanólicos

Atividade antifúngica Schlemper et al., 2000

Antiulcerogênica, atribuindo seu efeito provavelmente ao estar associado

com o aumento do mecanismo antioxidante. Ausência de toxicidade aguda

e atividade em modelos de analgesia (tail flick e hot plate)

Roldão et al., 2008

A atividade antifúngica moderada sobre Candida albicans e C. krusei e

que possui alta toxicidade em bioensaios realizados com Artemia salina

Oliveira et al., 2010

Antioxidante Michielin et al., 2011

Redução da secreção de histamina em células mastócitas de ratos em

modelos in vitro e in vivo, demonstrando um efeito antialérgico

Costa de Oliveira et al.,

2011

Extratos metanólicos

Diminuição na formação de edemas e diminução da miotoxicidade

induzida pelo veneno de Bothrops jararacuçu

Ticli et al., 2005

Eficácia no tratamento de infecções causadas por bactérias, tendo ação

fototóxica contra Staphylococcus aureus e Escherichia coli

Matias et al., 2010

Atividade antibacteriana moderada para Staphylococcus aureus,

Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa

Matias et al., 2016

Extratos obtidos por fluido supercrítico

Atividade anticâncer, citotoxicidade e a apoptose de células de carcinoma

de Ehrlich

Kviecinski et al., 2010

Atividade in vitro antitumoral na redução, viabilização e proliferação de

células tumorais e redução na expressão de COX-2

Parisotto et al., 2012

Acheflan®

O fitoterápico Acheflan® demonstrou propriedades terapêuticas para

cicatrização de feridas in vivo, provavelmente devido à seu envolvimento

com o aumento da angiogênese e remodelação dérmica.

Perini et al., 2015

No ano de 2005, a empresa Aché Laboratórios S.A., lançou o primeiro anti-

inflamatório fitoterápico, desenvolvido inteiramente no Brasil, obtido a partir do óleo volátil

da planta Cordia verbenacea DC. O desenvolvimento do produto, cujo nome fantasia é

Acheflan®, utilizado para o tratamento de tendinites crônicas, dor miofacial, traumas

musculares e injúrias, (Chaves et al., 2008; Michielin, 2009). Este medicamento fitoterápico

pode ser considerado o primeiro caso de sucesso de uma tecnologia que foi desenvolvida no

Brasil baseada em uma planta nativa, cujo produto decorrente está no mercado, figurando

entre uns dos 20 fitoterápicos mais vendidos no Brasil (Dutra et al., 2016).

33

2.3.2. Pterodon pubescens Benth. (sucupira)

O gênero Pterodon compreende quatro espécies nativas do Brasil: Pterodon

abruptus Benth., Pterodon apparicioi Pedersoli, Pterodon pubescens Benth. (Pterodon

emarginatus Vog.) e Pterodon polygalaeflorus Benth. que se encontram amplamente

distribuídas na região central do Brasil (Dutra et al., 2016).

A espécie vegetal Pterodon pubescens Benth. (Pp), sinonímia botânica de

Pterodon emarginatus Vog., é uma árvore pertencente à família das Leguminosae-

Papillonoideae, conhecida popularmente como sucupira, faveiro, sucupira-branca, fava-de-

sucupira ou sucupira-lisa e estão distribuídas principalmente no cerrado dos estados de Minas

Gerais, São Paulo, Goiás e Mato Grosso do Sul. O uso popular da sucupira foi relatado

através de estudo etnobotânico em 30 cidades do interior de Minas Gerais, onde a população

fazia uso da espécie para tratamento de reumatismo, dores de garganta, problemas da coluna,

como tônico e depurativo, além do seu uso como anti-inflamatório e analgésico (Carvalho et

al., 1999).

Figura 3. Pterodon pubescens Benth. Fonte: Servat, L., 2010.

Na literatura estão descritas diversas atividades farmacológicas relatadas dessa

espécie: atividade antinociceptiva, anti-inflamatória, anti-edematogênica, antiartrítica,

antiproliferativa, antiplaquetária, antitumoral, entre outras (Denny, 2002; Coelho et al., 2001;

Vieira et al., 2008; Calixto et al., 2007; Spindola et al., 2009; Servat et al., 2012; Nucci-

Martins et al., 2015).

Alguns autores têm sugerido que o esqueleto diterpenos vouacapânico e o

sesquiterpeno geranilgeraniol estejam envolvidos com as propriedades anti-inflamatórias e

antinociceptiva do óleo dos frutos de P. pubescens (Nunan et al., 1982; Carvalho et al., 1999;

34

Silva et al., 2004, Spindola et.al, 2009). Esses compostos estão ilustrados na Figura 4.

Figura 4. Compostos identificados com atividade antinociceptiva e anti-inflamatória isolados dos frutos de

Pterodon pubescens Benth.

As atividades farmacológicas dos diferentes tipos de extratos de Pterodon

pubescens Benth. estão descritas na Tabela 2.

Tabela 2. Atividades farmacológicas descritas de extratos de frutos de Pterodon pubescens Benth utilizando

diferentes tipos de solventes extratores.

Atividade farmacológica Autores

Extratos hidroalcoólico

Atividade no modelo de artrite experimental e ausência de toxicidade

subaguda

Coelho et al., 2001

Extratos etanólicos

Atividade supressora de linfócitos T e B, relacionada à atividade anti-

inflamatória

Cardoso et al., 2008

Atividade antiproliferativa Vieira et al., 2008

Frações e composto geranilgeraniol obtidos do extrato etanólico -

Atividade contra T. cruzi

Menna-Barreto et al., 2008

Subfração terpênica contendo farnesol, geranilgeraniol e derivados Pereira et al., 2012

O

R

R

1

2

3 45

67

8

9

10

1112

13

14

15

17

18

O

OH

O

O

R

O

OHOH

OH

OH

O

OH

OH

CO2CH3

O

OAc

OH

O

OH

OAc

CO2CH3

O

OAc

OH

CO2CH3

O

OH

OH

CH2OH

O

R

R

1

2

3 45

67

8

9

10

1112

13

14

15

17

18

O

OH

O

O

R

O

OHOH

OH

OH

O

OH

OH

CO2CH3

O

OAc

OH

O

OH

OAc

CO2CH3

O

OAc

OH

CO2CH3

O

OH

OH

CH2OH

Éster 6α-hidroxi-7β- acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila

Éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila

Éster 6α ,7β-dihidroxivouacapano- 17β- oato de metila

OH

Geranilgeraniol

35

vouacapânicos induz apoptose em células humanas de leucemia

mielogênica crônica da linhagem K562. A ação anti-leucemia está

relacionada a inibição das vias de sinalização das ERKs, NF-kB e c-myc

resultando na redução da expressão da ciclina E2 mRNA.

O extrato inibiu a hiperalgesia mecânica e térmica na dor pós-operatória

em modelos animais

Nucci et al., 2012

Fração hexânica: anti-inflamatório em modelo de artrite induzido por CFA

e em modelo de pleurisia induzido por carragenina. A bioquímica

hematológica e histológica indicou decréscimo na glicose, colesterol e

níveis de triglicérides e redução do número total de leucócitos e células

mononucleares.

Hoscheid et al., 2013

Administração oral do extrato diminuiu a hiperalgesia mecânica e térmica

no modelo de ligação parcial do nervo ciático. Sugerido participação do

glutamato, NMDA, cainato, trans-ACPD, citocinas pró-inflamatórias

(TNF-α e IL-1β) e canais TRPV1 e TRPA1 ativadores (capsaicina e

cinamaldeído) como possíveis mecanismos de ação.

Nucci-Martins et al., 2015

Extrato bruto diclorometânico

Compostos com esqueleto vouacapânico de diterpernos furânicos isolados

do extrato diclorometânico

Nunan et al., 1982;

Carvalho et al., 1999; Silva

et al., 2004, Spindola et.al,

2009

Anti-inflamatória, anti-edematogênica nos modelos induzidos por

bradicinina e histamina, antinociceptiva, antiproliferativa em células

tumorais humanas

Denny, 2002

Fração ativa purificada – composto majoritário 6- hidroxi, 7-

acetoxivouacapano (responsável pela atividade antinociceptiva) - Não

participação de receptores opióides na atividade antinociceptiva

Spindola et al., 2011

Compostos isolados do extrato diclorometânico: 6α acetoxi-7β-

hidroxivouacapano (inédito), éster 6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de

metila e 6α,7β-diidroxivouacapano-17β-metilenol - Atividades

antinociceptiva e antitumoral, potencial quimioterápico em estudos in

vitro contra diversas linhagens tumorais


Compostos isolados do extrato diclorometânico: geranilgeraniol e éster

6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de metila - Potencial quimioterápico

em estudos in vivo


Compostos isolados do extrato diclorometânico: mistura dos isômeros

éster 6α-hidroxi-7β-acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila e éster 6α-

acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila - A atividade

antinociceptiva destes compostos estava mais relacionada à dor de origem

Servat et al., 2012

36

neurogênica; especificidade para as linhagens de ovário e mama na

atividade anticâncer in vitro. Foi observada a presença do sinergismo

existente entre os compostos ativos do extrato, evidenciado pela

similaridade nas doses efetivas apresentadas para a mistura de isômeros

isolados e o extrato bruto

Compostos isolados do extrato bruto diclorometânico: vouacapanos com

atividade antiproliferativa, indicando a seletividade desses compostos para

linhagem de próstata


Compostos isolados do extrato diclorometânico: geranilgeraniol e éster

6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de metila - Mecanismos da ação

antinociceptiva receptor-específica através de diferentes modelos

experimentais in vivo, revelando principalmente atividade relacionada a

receptores imidazólicos e serotonérgicos

Spindola et al., 2010, 2011

Óleo essencial

Composto isolado da fração do óleo: ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-

17-óico - Atividade anti-edematogênica nos ensaios de edema de pata

induzido por carragenina e edema de orelha induzido por óleo de cróton,

sugerindo o envolvimento desse composto na atividade anti-inflamatória

Silva et al., 2004

Ação cicatrizante, possivelmente atribuída aos compostos

biciclogermacreno, trans-Cariofileno e α-Humuleno

Dutra et al., 2009

Geranilgeraniol isolado do óleo - Antiplaquetária, com ação atribuída a

inibição da enzima ciclooxigenase

Calixto et al., 2007

Fração hexânica

Rica no composto ácido 6-α,7β-dihidroxivouacapano-17-óico -

Atividade cicatrizante

Dutra et al., 2009

Óleo

Não apresentou efeitos tóxicos após administração aguda do óleo, com

doses extremamente mais altas do que as usadas pela população (2, 4 e 8

mg/kg por via oral). Não citotóxica e não mutagênica em ensaios com

células mononucleares de sangue periférico humano.

Sabino et al., 1999

Subfração terpênica

Induziu citotoxicidade e efeitos anti-proliferativo em células K562. A

down-regulação do gene de transcrição DNMT1 e a super expressão de

Apaf-1 mRNA sugere que a fração pode induzir a apoptose das células

K562 por regulação epigenética

Pereira et al., 2011

2.4. Interações farmacológicas

O interesse em estudar os efeitos sinérgicos ou antagônicos através de

experimentos com misturas tem crescido imensamente nas últimas duas décadas (Ritz &

37

Streibig, 2014). A palavra sinergia é derivada da palavra grega synergo´z, que significa

“trabalhando juntos” e sua busca no campo da farmacologia referem-se à elucidação e

quantificação da ação de medicamentos administrados em combinação (Sucher, 2014).

A literatura científica tem demonstrado que frequentemente a ação farmacológica

do princípio ativo isolado, difere da ação encontrada nos extratos brutos e fitoterápicos.

Acredita-se que essas vantagens terapêuticas encontradas em medicamentos fitoterápicos

sejam decorrentes de interações sinérgicas que potencializam os seus efeitos farmacológicos

com redução dos efeitos colaterais (Heinrich et al, 2007).

Os mecanismos de sinergismo podem ser divididos em quatro tipos (Hildebert,

2011; Wagner & Ultich-Merzenich, 2009): 1- Efeitos sinérgicos devido à atuação em vários

alvos; 2- Efeitos farmacocinéticos ou físico-químicos; 3- Interferência com mecanismos de

resistências em bactérias e 4- Efeitos de eliminação e neutralização. Dentre os métodos

descritos na literatura para avaliação da existência de efeitos sinérgicos em extratos vegetais,

destaca-se o método de Isobolograma descrito por Berenbaum em 1989. Esse é um modelo

muito utilizado, pois permite a avaliação das interações farmacológicas independente de seu

mecanismo de ação (Wagner, 2011).

Teoricamente o método de isobolograma permite visualizar três tipos de

interações farmacológicas como sinergismo, adição e antagonismo. Em um isobolograma, a

dose de um composto A está nas abcissas e a dose do outro composto B está representada nas

ordenadas, onde cada ponto marcado representa um par de doses dos dois compostos (A e B)

que atingem o DE50 quando administrados em associação. Na Figura 5 está representado um

Isobolograma.

Figura 5: Exemplo ilustrativo de isobolograma demostrando o efeito da associação de compostos (A e B) e a

representação de antagonismo, adição e sinergismo. Fonte: Wagner & Ulrich-Merzenich, 2009.

38

De acordo com Berenbaum (1989), a interação aditiva ocorre quando há uma pura

soma dos efeitos farmacológicos dos fármacos testados. Já a interação de antagonismo ocorre

quando o feito global atingido pela associação dos compostos é menor que o efeito de soma

das doses. Com isso será obtida uma curva convexa. Quando existe um sinergismo real, o

efeito global dos dois compostos será melhor que a somação dos efeitos dos compostos

separados. O resultado será uma curva côncava (Ulrich-Merzenich, et al., 2010; Geary, 2013).

Outro método utilizado para avaliação da interação entre compostos é o teorema

de Chou-Talalay, elaborado através do programa computacional CompuSyn®, que simula e

calcula automaticamente os parâmetros a partir de dados de dose-efeito observados em

qualquer nível de dose e efeito. Este software permite a expressão das principais

características das interações observadas através de um índice de combinação. Trata-se de um

processo analítico de resultados que permite a comparação com os dados obtidos com o

modelo do isobolograma (Chou, 2006; 2011). Neste método o índice de combinação (IC)

resultante é baseado em valores numéricos que indicam a interação entre os compostos

analisados e oferecem definição quantitativa para os efeitos observados, como descritos na

Tabela 3:

Tabela 3. Descrição de sinergismo, adição e antagonismo em estudos de combinação de substâncias, através do

método de determinação do Índice Combinatório (IC), de acordo com Chou (2006).

Faixa do IC Interpretação

< 0,10 Sinergismo muito forte

0,10 – 0,30 Sinergismo forte

0,30 – 0,70 Sinergismo

0,70 – 0,85 Sinergismo moderado

0,85 – 0,90 Sinergismo fraco

0,90 – 1,10 Adição

1,10 – 1,20 Antagonismo fraco

1,20 – 1,45 Antagonismo moderado

1,45 – 3,30 Antagonismo

3,30 – 10,00 Antagonismo forte

> 10,00 Antagonismo muito forte

Como exemplo de combinações de fármacos com efeito sinérgico clinicamente

comprovado, temos a preparação fitofarmacêutica Iberogast®, comercializada na Alemanha,

e composta por nove extratos de plantas, utilizada para o tratamento de dispepsia funcional e

síndrome do intestino irritável. A preparação mostrou equivalência terapêutica quando

comparado com as drogas sintéticas usualmente utilizadas cisaprida e metoclopromida, porém

39

com a vantagem adicional de que o preparo fitoquímico mostrou pouco ou nenhum efeito

colateral (Allescher & Wagner, 2007). Para o tratamento da málaria Falciparum, também é

utilizado a mistura de diversos compostos como a artemisinina, artemeter, lumefantrina,

doxiciclina e mefloquina, que demonstrou êxito no tratamento de casos graves de malária

(Wilairatana et al., 2002).

A melhor eficácia de associações de compostos ou extratos pode demonstrar que

os efeitos sinérgicos são multialvos, onde a associação atua não apenas em um único alvo,

mas em vários alvos e, portanto cooperam de uma forma sinérgica. A estratégia de uso para

uma associação multialvo baseia-se na etiologia pluri-causal de muitas doenças e

fisiopatologia complexa, podendo ser tratados de forma mais eficaz com combinações

farmacêuticas bem escolhidas do que com uma única droga (Wagner & Ulrich-Merzenich,

2009; Ulrich-Merzenich, 2014).

2.5. Justificativa

A descoberta e desenvolvimento de novos medicamentos continuam a ser um

desafio, com cada vez mais elevados custos em pesquisa e desenvolvimento. Apesar dos

principais avanços no conhecimento dos mecanismos moleculares envolvidos na dor e

inflamação, as terapias atuais são usualmente insuficientes por possuírem efeitos colaterais

severos ou eficácia limitada. Por esta razão, a identificação dos mecanismos da dor, a busca

por novas moléculas que sejam eficazes aliados a menos efeitos adversos, torna-se

extremamente necessária para as possíveis aplicações terapêuticas (Burgess & Williams,

2010; Rigas & Tsioulias, 2015).

40

3. OBJETIVO

3.1. Objetivo Geral:

Avaliar o efeito farmacológico da associação do extrato bruto dos frutos de

Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) em

modelos de antinocicepção e anti-inflamatórios.

3.2. Objetivos específicos

Avaliar a toxicidade aguda de dose única da mistura dos extratos;

Determinar a dose efetiva (DE50) de cada extrato no modelo de contorção

abdominal induzida por ácido acético;

Avaliar o efeito farmacológico da associação dos extratos através da

construção do isobolograma e construção do índice combinatório (IC) para determinação do

sinergismo entre os extratos no modelo de contorção abdominal induzida por ácido acético;

Avaliar as propriedades antinociceptivas da associação dos extratos em

modelos experimentais in vivo: contorção abdominal, tail flick, hot plate e formalina;

Avaliar a atividade anti-edematogênica da associação dos extratos no modelo

de edema de pata induzido por carragenina e por prostaglandina E2 (PGE2);

Avaliar a atividade anti-inflamatória da associação dos extratos no modelo de

peritonite induzida por carragenina e no modelo de alodinia induzida por CFA (Adjuvante

completo de Freund) – tratamento único e diário.

Avaliar a atividade dos extratos, da associação dos extratos e compostos

isolados ativos (α-Humuleno e composto m/z 404 – C1) na migração e proliferação de

queratinócitos (HaCaT) em testes in vitro;

Avaliar a atividade dos extratos, da associação dos extratos e compostos

isolados ativos nos níveis de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e Interleucina-8

(IL-8) em queratinócitos (HaCaT) em testes in vitro.

41

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Obtenção do material vegetal

Os frutos de Pterodon pubescens Benth. foram coletados em Ponto Chique (MG)

– (coordenadas 16°38'23.3"S 45°03'54.0"W). A identificação foi realizada pelo Prof. Dr. Jorge

Yoshio Tamashiro do departamento de Botânica do IB-UNICAMP. As exsicatas foram

depositadas no Herbarium da Universidade Estadual de Campinas do IB-UNICAMP com o

número 179739.

As folhas de Cordia verbenacea DC foram coletadas no campus experimental do

CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas) –

UNICAMP – Paulínia (SP). A espécie Cordia verbenacea faz parte da Coleção de Plantas

Medicinais e Aromáticas (CPMA) do CPQBA/UNICAMP, depositada com o voucher 115

CPQBA.

Os materiais vegetais utilizados possuem autorização de acesso ao patrimônio

genético (Conselho Nacional de Pesquisa - CNPq/Conselho de Gestão do Patrimônio

Genético - CGEN) sob o número 010829/2014-8.

4.2. Preparação dos extratos

4.2.1. Pterodon pubescens Benth.

O processo de extração dos frutos de Pterodon pubescens foi realizado em tanque

de aço inox com agitação mecânica utilizando diclorometano como líquido extrator. Os frutos

foram triturados com gelo seco para aumentar a superfície de contato propiciando maior

rendimento de extração. A relação massa de material vegetal (kg) por volume de solvente

extrator (l) foi de 1:3 realizando-se três extrações de 1,5 horas cada totalizando 4,5 horas à

temperatura ambiente, com renovação do solvente a cada etapa. Os extratos parciais obtidos

foram filtrados, reunidos e concentrados sob vácuo em sistema de evaporação rotativo na

temperatura de 40ºC (Buchi RE 120). O extrato foi acondicionado em frasco âmbar e

armazenado em temperatura ambiente. A análise residual do solvente diclorometano foi

realizadas por cromatografia gasosa com detector por ionização de chama.

4.2.2. Cordia verbenacea DC

O óleo essencial de Cordia verbenacea DC foi obtido através da técnica de arraste

a vapor, realizado pelo período de 1,5 a 2 horas. Folhas frescas e rasuradas foram colocadas

em dorna de aço inox com capacidade de 1500 l adicionando água até a cobertura das folhas.

O óleo foi separado da água, inicialmente no vaso florentino anexo à dorna e posteriormente

42

em laboratório, em um funil de separação, seguido do uso de sulfato de sódio anidro P.A para

eliminar traços residuais de água. O óleo foi armazenado em freezer até seu uso.

4.2.3. Análise fitoquímica

4.2.3.1. Isolamento dos voucapanos

Os isomeros Éster 6α-hidroxi-7β- acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila e Éster

6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila (m/z 404) e Éster 6α ,7β-

dihidroxivouacapano- 17β- oato de metila (m/z 362) foram isolados a partir do extrato bruto

dos frutos de Pterodon pubescens Benth. por cromatografia em coluna (25x 500 mm),

utilizando gradiente de solvente de hexano e acetato de etila como descrito anteriormente

(Spindola et al., 2009). Os compostos purificados foram comparados com compostos

previamente identificados por Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de hidrogênio e

carbono -13 e Espectrometria de Massas (MS). Os padrões possuem pureza maior que 90%.

4.2.3.2. Análise GC-MS

A análise GC-MS (cromatografia gasosa acoplada a detector de massas) foi

realizada com um sistema Agilent 5975 GC-MS. A coluna HP5 (30 m × 0,25 mm, 0,25 μm de

espessura da película) foi utilizada com hélio como gás transportador (1,0 ml / min). A

temperatura do forno GC foi mantida a 60 ° C durante 3 minutos e programada para 240 ° C a

uma taxa de 3 ° C / min e mantida constante a 240 ° C durante 5 minutos e depois programada

para 240 ° C a uma taxa de 1 ° C / min. A relação de divisão foi ajustada em 40: 1. A

temperatura do injector foi ajustada a 250 ° C. Os espectros de massa foram registrados a 70

eV. O intervalo de massa foi de m/z 100 a 600.

4.2.3.3. Análise dos compostos voláteis por GC-FID (cromatografia gasosa com

detector de ionização de chamas)

A análise dos compostos voláteis por cromatografia gasosa foi realizada

utilizando um sistema GC Agilent 6890N. A temperatura da ionização da chama foi de 250

°C. Para obter a mesma ordem de eluição com GC-MS, a auto-injeção simultânea foi feita em

uma duplicata da mesma coluna, aplicando as mesmas condições operacionais. As

quantificações foram realizadas usando o padrão analítico α-Humuleno, trans-Cariofileno e

geranilgeraniol (Sigma Aldrich Saint Louis, EUA).

43

4.2.3.4. Compostos vouacapanos – HPLC-DAD

O sistema HPLC-DAD (Shimadzu) consistiu em coluna de fase reversa C18

(Gemini -C18 250 mm × 4,6 mm x 5 μm) com 10 μL de injeção de amostra. A fase móvel foi

uma mistura de 70:30 acetronitrila:água com 0,1% de ácido acético (v:v). A taxa de fluxo e o

comprimento de onda UV foram fixados em 1 ml/min e 220 nm, respectivamente.

4.3. Atividade Farmacológica

4.3.1. Animais e cuidados éticos

Foram utilizados camundongos Swiss albinos fêmeas (para o teste de toxicidade

aguda) e machos (para todos os outros experimentos) (25-35g), provenientes do Centro de

Bioterismo da Unicamp (CEMIB) aclimatados às condições do biotério setorial por pelo

menos sete dias antes da manipulação experimental, sob temperatura (23 2C) e ciclo claro-

escuro de 12 horas controlado. Os animais foram alimentados com ração Purina e água ad

libitum. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da

UNICAMP – número 3181-1 e 4392-1 (Anexo 1 e 2).

4.3.2. Estudo da toxicidade em dose única

Foram utilizados camundongos Swiss fêmeas divididas em grupos (n=6): um

grupo foi tratado com o veículo - 10 ml/kg (NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween®

80%) e os demais grupos tratados com uma dose única de 50, 100 e 500 mg/kg da mistura do

extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens (Pp) e do óleo essencial de Cordia verbenacea

(Cv) na proporção de 1:1. Os tratamentos foram realizados oralmente através de sonda

gástrica flexível e após a administração da mistura foram realizadas observações

comportamentais sistemáticas (screening hipocrático) (OECD, 2002). Esta avaliação fornece

uma estimativa geral da toxicidade da amostra sobre o estado consciente e disposição geral,

atividade e coordenação do sistema motor, reflexos e atividades sobre o sistema nervoso

central e sobre o sistema nervoso autônomo. Parâmetros (tais como atividade geral, frênito

vocal, irritabilidade, resposta ao toque, resposta aperto cauda, contorção, posição trem

posterior, reflexo endireitamento, tônus do corpo, força para agarrar, ataxia, reflexo auricular,

reflexo corneal, tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptose, micção,

defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose, hiperemia, morte) foram avaliados no

tempo de 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h e 8 h após a administração e, diariamente, até o décimo

quarto dia (Britto, 1994). No décimo quarto dia, os animais sobreviventes foram anestesiados

44

e após o óbito foi realizada a análise macroscópica dos órgãos (coração, pulmão, baço, rins,

fígado, ovários e úteros) e a pesagem para determinar seus pesos relativos (peso do órgão por

100 g do peso corpóreo).

4.3.3. Avaliação da atividade locomotora (campo-aberto):

O método utilizado foi o “campo-aberto” (open-field) como descrito previamente

(Royce, 1977). O aparato consiste em uma caixa plástica medindo 45 x 45 x 20 cm, com o

fundo dividido em 9 áreas iguais (15 x 15 cm). O número de áreas cruzadas pelas quatro patas

dos animais (n = 6 por grupo) foram contadas em sessões de 6 minutos e tomadas como

índice comportamental. Os animais foram tratados, por via oral, com a mistura do extrato

bruto de Pp e óleo essencial de Cv (1:1) nas doses de 50, 100 e 500 mg/kg. O grupo controle

negativo foi tratado com veículo - 10 ml/kg (NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween®

80%) e o grupo controle positivo foi tratado com pentobarbital (35 mg/kg, i.p.).

4.3.4. Determinação da Dose Efetiva 50 (DE50) no modelo de contorção abdominal

induzida por ácido acético

Neste modelo foi avaliado se a amostra apresentava ou não ação analgésica, por

ser um modelo sensível a substâncias analgésicas de ação central e/ou periférica, dotadas dos

mais variados mecanismos de ação (Shafiee et al., 2003). Foram utilizados seis

camundongos Swiss machos tratados pela via oral, por grupo experimental.

Inicialmente, os grupos foram tratados por via oral com doses de 50, 100, 200 e

300 mg/kg de cada extrato (Pp ou Cv), separadamente, para a determinação da dose efetiva

(DE50). O controle negativo foi tratado com veículo - 10 ml/kg (NaCl 0,9% em tampão

fosfato pH 7 + Tween® 80%). Após 60 minutos, os animais receberam injeção

intraperitoneal de ácido acético (0,8% em solução de NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7, 10

ml/kg) e as contrações da parede abdominal seguida de torções do tronco e extensão dos

membros posteriores foram contadas durante 15 minutos (Koster et al., 1959).

4.3.5. Análise isobolográfica e construção do índice combinatório (IC)

Em um isobolograma, a dose de um fármaco (A) é representada nas abcissas,

enquanto a dose do outro fármaco (B) é representada nas ordenadas. Cada ponto marcado no

gráfico representa um par de doses dos dois fármacos que atingem o DE50 quando

administrados em associação. A linha que une os dois pontos dos fármacos isolados é

designada de linha de aditividade. Geralmente, em modelos experimentais farmacológicos, a

45

análise isobolográfica consiste em vários passos básicos (Luszczki, 2003). Neste trabalho,

foram realizadas as seguintes etapas:

a) Avaliação da atividade antinociceptiva do extrato bruto de frutos de Pterodon

pubescens (Pp) e do óleo essencial de Cordia verbenacea (Cv) através da determinação dos

valores da dose efetiva 50 (DE50) para cada extrato administrado isoladamente no teste de

contorção abdominal induzida por ácido acético. Os valores de DE50 foram determinados

diretamente através de respectiva curva dose/efeito.

b) Escolha teórica das proporções fixas para a combinação dos dois extratos pelo

cálculo do DE50,ad (ad=adição) para cada combinação. O DE50,ad representa a adição total

da dose dos fármacos, que teoricamente promovem 50% de antinocicepção nos animais diante

do teste de contorção abdominal induzido por ácido acético.

As DE50 de cada extrato foram aplicadas isoladamente em um gráfico de

dispersão em escala logarítmica, formando dois pontos que, unidos deram origem à curva de

aditividade. As doses da associação necessárias para inibir 50% das contorções abdominais

foram determinadas através de escala logarítmica e transformadas em mg/kg.

As três combinações determinadas pelo gráfico de modo a detectar possíveis

interações representam à mistura em combinações de 1:3; 3:1 e 1:1, que correspondem a 25%

dose efetiva de Pp + 75% da dose efetiva de Cv; a 75% dose efetiva de Pp + 25% da dose

efetiva de Cv e a 50% da dose efetiva de Pp + 50% da dose efetiva de Cv.

c) Determinação experimental das DE50,ad para as respectivas razões de

combinações dos fármacos através do teste de contorção abdominal induzido por ácido

acético utilizando grupos experimentais (n=6) de camundongos Swiss machos.

d) Por fim, os dados experimentais encontrados em relação à inibição de 50% no

teste de contorção abdominal induzido por ácido acético, foram encontrados através de

regressão linear, plotados no gráfico em escala logarítmica e transformadas em mg/kg e

lançadas no gráfico.

Para a análise do efeito farmacológico, a curva experimental foi comparada a

curva de aditividade. Se os pontos se posicionarem em torno da isobole de aditividade, a ação

será de aditividade; ao se colocarem abaixo, a ação será considerada como sinergismo e caso

se situem acima, a ação será considerada de antagonismo (Berembaum, 1989).

Para a construção do índice combinatório (IC) e avaliação quantitativa da

interação entre os extratos, foi utilizado o modelo de análise do efeito mediano utilizando o

software CompuSyn® 1.0 (Chou, 2006; 2011). Os dados experimentais da resposta

antinociceptiva das misturas obtidos pelo teste de contorção abdominal induzido por ácido

46

acético foram inseridos no software e o índice combinatório foi calculado.

Os extratos separadamente também foram avaliados no teste de contorção

abdominal nas doses efetivas encontradas e a 50% destas doses, correspondendo a 65 mg/kg

de Pp e 32,5 mg/kg de Pp e a 165 mg/kg de Cv e 82,5 mg/kg de Cv e também nas misturas

com 100% da dose efetiva de Pp + 100% da dose efetiva de Cv e a 200% da dose efetiva de

Pp + 200% da dose efetiva de Cv, para efeito de comparação da resposta antinociceptiva

com a associação dos extratos.

4.3.6. Teste de lambedura de pata induzido por formalina

O modelo de nocicepção induzido pela formalina permite avaliar dois tipos

distintos de nocicepção: a de origem neurogênica (estimulação direta das fibras nociceptivas)

e a de origem inflamatória (caracterizada pela liberação de mediadores inflamatórios)

(Hunskaar e Hole, 1987). Este experimento foi baseado nas descrições de Hunskaar & Hole

(1987), com algumas modificações. Foi utilizada uma câmara de observação, que consiste em

um funil com 20 cm de diâmetro. Cada camundongo foi previamente colocado no funil

câmara por 30 minutos antes da injeção intraplantar de formalina para permitir aclimatação

com o novo ambiente. Os grupos (n=6) foram tratados por via oral com veículo - 10 ml/kg

(NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), com os extratos separadamente nas

doses efetivas encontradas no experimento anterior (contorção abdominal) e em diferentes

combinações, conforme Tabela 4.

Tabela 4. Associações do extrato bruto de frutos de Pterodon pubescens Benth (Pp) e do óleo essencial de

Cordia verbenacea DC (Cv).

Associação Cv Pp

A25 25% (41,25 mg/kg) 75% (48,75 mg/kg)

A50 50% (82,5 mg/kg) 50% (32,5 mg/kg)

A75 75% (123,75 mg/kg) 25% (16,25 mg/kg)

A100 100% (165 mg/kg) 100% (65 mg/kg)

A200 200% (330 mg/kg) 200% (130 mg/kg)

Após uma hora, 20 μl de solução de formalina 2,7 % em tampão fosfato foram

inoculados no coxim plantar da pata traseira direita. Os animais foram observados de 0 a 5

minutos (fase neurogênica) e de 15-30 minutos (fase inflamatória) após a injeção de

formalina. O tempo (em segundos) dispendido pelo animal lambendo/mordendo a pata

47

inoculada foi registrado e considerado como indicativo de dor.

4.3.7. Retirada de cauda

O teste da retirada de cauda consiste na submersão da cauda do animal em água a

50 ºC ± 0,5 °C provocando uma reação de retirada da cauda através de um movimento de

reflexo de origem espinhal, rápido e vigoroso. Quando há um aumento no tempo de retirada

da cauda, interpretra-se como uma ação antinociceptiva (Janssen et al., 1963). Grupos de

camundongos machos Swiss (n = 6) foram utilizados. Foi determinado o valor basal

submergindo a cauda do animal em banho com temperatura de 50ºC e anotado o tempo que o

animal levou a retirar a cauda do banho, 24 horas antes da administração das amostras

testadas. No dia seguinte, a resposta foi novamente avaliada após 30, 60, 90 e 120 minutos da

administração das amostras. O tempo máximo de contato do animal com a água quente foi de

20 s. Os camundongos foram pré-tratados oralmente com 10 ml/kg veículo (NaCl 0,9% em

tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%) e com a mistura de Pp + Cv nas 3 proporções das

doses efetivas encontradas anteriormente (contorção abdominal) : A50, A100 e A200. Como

controle positivo foi utilizada morfina (5 mg/kg s.c.), administrada 30 minutos antes do início

da avaliação.

4.3.8. Placa quente

Para o teste de placa quente os animais foram colocados em um cilindro de vidro

de 24 cm de diâmetro em uma placa de alumínio aquecida (56 ± 0,5 °C) e o tempo (s) para

que o animal tivesse a resposta de lamber, chacoalhar, retirar a pata ou pular foi registrado

como tempo de latência (Ankier, 1974). Os animais (n=6) foram previamente selecionados 24

horas antes do experimento, estabelecendo-se um padrão de tempo de latência de 15

segundos. Além disso, foi determinado o tempo limite de 30 s para que não houvesse lesão

tissular. No dia seguinte, a resposta foi novamente avaliada após 30, 60, 90 e 120 minutos da

administração das amostras. Os camundongos foram pré-tratados oralmente com 10 ml/kg

veículo (NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%) e com a mistura de Pp + Cv

nas 3 proporções das doses efetivas encontradas anteriormente (contorção abdominal) : A50,

A100 e A200. Como controle positivo foi utilizada morfina (5 mg/kg s.c.), administrada 30

minutos antes do início da avaliação.

48

4.3.9. Edema de pata por carragenina

Para verificar a possível atividade anti-edematogênica da mistura do extrato bruto

de Pterodon pubescens e do óleo essencial de Cordia verbenacea foi utilizado o método de

indução de edema de pata com carragenina em camundongos Swiss (Winter et al., 1962). Os

animais em jejum (n=6) foram divididos em grupos: controle negativo (10 ml/kg veículo -

NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), controle positivo (dexametasona 5

mg/kg) e a mistura de Pp + Cv nas 3 proporções das doses efetivas encontradas anteriormente

(contorção abdominal): A50, A100 e A200.

Os tratamentos (associação e grupos controles) foram administrados pela via oral

1 hora antes da indução do edema através da injeção subcutânea de 40 μl/pata de carragenina

(3%) na região subplantar da pata posterior direita. O edema foi determinado pelo volume

mensurado após a injeção da carragenina (1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas após) empregando-se um

pletismômetro digital (UGO-Basile). A porcentagem de inibição do edema foi calculada da

seguinte forma: [(A - B) / A] × 100, onde A = volume de edema do grupo de controle

negativo e B = volume do edema do grupo experimental.

4.3.10. Edema de pata induzido por prostaglandina E2 (PGE2)

O procedimento experimental foi semelhante ao utilizado no modelo de edema de

pata por carragenina, sendo os animais divididos nos seguintes grupos: controle negativo (10

ml/kg veículo - NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), controle positivo

(indometacina 20 mg/kg) e a associação de Pp + Cv nas 3 proporções das doses efetivas

encontradas anteriormente (contorção abdominal): A50, A100 e A200. Após 1 hora, a

inflamação foi induzida através da injeção intraplantar de 20 μL de prostaglandina E2

(Sigma®), 1 μg/animal. As avaliações foram realizadas após 15, 30, 60 e 90 minutos da

indução da inflamação (Claudino et al., 2006).

4.3.11. Peritonite induzida por carragenina

Os animais (n=6) foram tratados oralmente com controle negativo (10 ml/kg

veículo - NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80%), controle positivo

(dexametasona 5 mg/kg) ou a associação de Pp + Cv nas 3 proporções das doses efetivas

encontradas anteriormente (contorção abdominal): A50, A100 e A200. A peritonite foi induzida

1 hora após o tratamento por injeção intraperitoneal de uma solução de carragenina (500 μg /

250 μL) (Iwamoto et al., 2015). Quatro horas depois, os animais foram eutanásicos e a

cavidade peritoneal foi lavada com 5 ml de PBS (solução salina tamponada com fosfato)

49

contendo heparina 5 UI / ml. O líquido peritoneal foi recuperado para análise de números de

leucócitos totais usando um analisador de hematologia (modelo Sysmex Poch-100iV).

4.3.12. Alodinia induzida por CFA – Adjuvante completo de Freund

Os procedimentos foram semelhantes ao método descrito por Villetti et al., (2003)

com mudanças nos protocolos e análise dos dados. A inflamação foi induzida por uma

solução de CFA (complete freund´s adjuvant - 1 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis

atenuado por calor em 85% de parafina em óleo e 15% manide monoleato). Grupos

experimentais de 6 camundongos machos Swiss receberam o volume de 40 µl (s.pl.) de CFA

na pata direita. A alodinia mecânica foi mensurada utilizando um Anestesiômetro (Dynamic

Plantar Anaestesiomether- Ugo Basile, mod- 37450- Itália) que consiste em uma plataforma

elevada, com perfurações que permitem o acesso a superfície ventral das patas posteriores.

Uma haste de aço (diâmetro 0,5 mm) foi pressionada contra a pata em análise com uma força

crescente (0 a 8 g em 5 segundos para camundongos). Com a retirada da pata, o estímulo

mecânico foi automaticamente cessado e a força que cada animal suportou, gravada pelo

próprio equipamento. A avaliação da alodinia mecânica (resposta ao toque) foi realizada

conforme descrito: mensuração do estímulo basal na pata posterior direita por três vezes

(média); injeção do CFA intraplantar; 24 horas após a injeção mensuração do estado basal em

estado hiperálgico; tratamento com as amostras, com posterior mensuração da alodinia

mecânica aguda (30, 60 e 90 minutos). Após sete dias, os procedimentos foram repetidos para

a avaliação da alodínia mecânica crônica (basal, 30, 60 e 90 min pós-tratamento). Veículo (10

ml/kg - NaCl 0,9% em tampão fosfato pH 7 + Tween® 80% – controle negativo), morfina (5

mg/kg, s.c. – controle positivo) ou a associação de Pp + Cv nas 3 proporções das doses

efetivas encontradas anteriormente (contorção abdominal): A50, A100 e A200 foram

administradas por via oral 60 minutos antes da aplicação do estímulo em cada fase do

experimento.

Neste experimento, também foi avaliado o tratamento prolongado da associação

de Pp + Cv, onde os grupos foram tratados diariamente desde o dia 1 (primeiro dia após a

injeção de CFA) até o dia 7 com a mistura de Pp + Cv nas mesmas doses e proporções

descritas acima e também tratados com os controles positivo (dexametasona 5 mg/kg, v.o.) ou

negativo (veículo).

4.4. Experimentos in vitro

Estes experimentos foram realizados durante estágio de pesquisa no exterior no

50

laboratório da Prof. Dra. Veronika Butterweck - Institute for Pharma Technology (IPT) -

University of Applied Sciences and Arts Northwestern Switzerland (FHNW) – Muttenz –

Suíça.

4.4.1. Cultura de células

Os queratinócitos HaCaT não-tumorigênicos humanos (Cell Line Services,

Eppelheim, Alemanha) foram mantidos em meio DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s

medium) com alta glucose 1 x suplementado com 1% (v/v) de Penicilina 10000 U/ml e

Estreptomicina 10000 μg/mL e 10% de soro fetal bovino inativado por calor (FBS) a 37 ° C

numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. Os experimentos foram realizados com

aproximadamente 80-90% de confluência e realizados entre as passagens 43 e 52.

4.4.2. Ensaio de viabilidade celular (ATP)

O ensaio de viabilidade celular foi realizado através do kit Luminescente

CellTiter-Glo® e realizado de acordo com o protocolo da fabricação. Foram feitas as

seguintes alterações: as células foram cultivadas em uma placa transparente e estéril de 96

poços com uma densidade de 2,5 x 105 células/ml. Após um período de incubação de 24 h

(37º C, 5% de CO2), as células foram lavadas com PBS, subsequentemente tratadas de acordo

com 100 μL de solução e incubadas durante mais 24 h. Foram testadas as seguintes

concentrações dos extratos e compostos: para os extratos separados e associação (Pp + Cv - A

- relação ½ : ½ ) 50; 25; 15; 10; 5; 1 e 0,5 μg/mL e para os compostos isolados 50; 25; 12,5;

6,25; 3.125; 1,5625 e 0,78125 μM. Adicionou-se então 100 μL de reagente CellTiter-Glo® a

cada poço, resultando numa diluição 1: 1. As placas de amostra foram agitadas durante 2

minutos em um agitador orbital e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente. 100

μL de cada poço foram então transferidos para uma placa branca e opaca de 96 poços estéril e

imediatamente realizou-se a leitura por um leitor de microplacas (SpectraMAX L, Molecular

Devices).

4.4.3. Ensaio de proliferação celular

O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante. 100 μL de uma

suspensão de células HaCaT foram plaqueadas em placas estéril de 96 poços a uma

concentração de 2,5 × 105 células/ml. Após 24 h de incubação (37 ° C, 5% de CO2), o meio

contendo 10% de FBS foi descartado e a placa foi lavada com 200 μL/poço de PBS. Pterodon

pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) e a associação (Pp + Cv - A - relação ½ :

51

½) foram testadas em concentrações de 25; 12,5; 6,25; 3.125 e 1.5625 μg/mL e os compostos

isolados foram testados em concentrações de 50; 25; 12,5; 6,25 e 3,125 μM, respectivamente.

Após o período de incubação de 24 h com as amostras, adicionou-se reagente BrdU (10 μM,

10 μl) em todos os poços, exceto o controle não tratado. Após o descarte do meio, foram

adicionados 200 μL de uma solução de fixação/desnaturação e incubados durante mais 30

minutos. Posteriormente, o líquido foi trocado pelo anticorpo monoclonal anti-BrdU primário

e incubado durante 1 hora. Posteriormente, o anticorpo não ligado foi lavado e adicionou-se

“horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG”, que se liga ao anticorpo do

detector. Finalmente, foram adicionados 50 μL de substrato 3,3', 5,5''-tetrametilbenzidina

(TMB) e convertidos pelo conjugado de peroxidase e a reação foi parada por solução de ácido

sulfúrico 2,5 N. A leitura da placa foi realizada a 450 nm (Spectramax i3x Plataforma de

detecção multimodo, Molecular Devices).

4.4.4. Ensaio de migração celular (“scratch assay”)

Após o posicionamento dos inserts nas placas de 12 poços de cultura celular, as

células HaCaT foram inoculadas em uma concentração de 2,5 × 105 células/ml nos poços.

Após um período de incubação de 24 horas, as células atingiram a confluência e os inserts

foram removidos causando uma lacuna de 450 μm (Figuras 6 e 7). Os poços foram lavados

com 1 ml de PBS, aspirados e adicionou-se 1 ml dos extratos de teste, associação e

compostos.

Figura 6. Procedimento para o ensaio de migração celular. 1) Coloque a inserção aderida na parte inferior da

placa. 2) Coloque 70 μl da suspensão celular em cada parte da inserção e incube durante 24 horas para

semeadura e fixação. 3) Retire a inserção após o cultivo, aspirar o meio e lavar cuidadosamente com 1 ml de

PBS. Remova imediatamente o PBS e 4) preencha com as amostras a serem testadas.

52

Figura 7. Intervalo causado pelo insert.

As amostras foram colocadas nos poços de acordo com as diferentes

concentrações. Os extratos, associação e compostos isolados foram dissolvidos em DMEM

contendo 0,1% de DMSO. O DMEM suplementado com 2% de FBS foi utilizado como

controle positivo e 0% de FBS + 0,1% de DMSO (DMEM sem suplementos) foi utilizado

como controle.

As imagens em tempo real foram realizadas com o microscópio invertido

automatizado Olympus IX83 para imagens de células vivas. A ampliação da imagem foi

ajustada para 10x. As imagens de cinco momentos específicos em 0, 6, 12, 18 e 24 h após a

adição do tratamento foram analisadas usando o software Olympus cellSens Dimension

1.81®. Para calcular o tamanho das lacunas ao longo do tempo, foi utilizado o software Image

J®, incluindo a ferramenta de cicatrização de feridas e a área da lacuna livre de células foi

medida com base no número de pixels. Portanto, os espaços detectados foram convertidos em

porcentagens: 0% refere-se a nenhum movimento de células e 100% representa um

fechamento da lacuna total. Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) e a

associação (Pp + Cv - A - relação ½ : ½) foram testadas em concentrações de 12,5; 6,25 e

3,125 μg/mL e os compostos foram testados em concentrações de 25; 12,5 e 6,25 μM,

respectivamente.

4.4.5. Atividade anti-inflamatória

A metodologia experimental, incluindo a concentração de TNF-α, foi escolhida de

acordo com Park et al., 2010, com algumas modificações. Para amostras não estimuladas, as

células foram semeadas em placas de 12 poços a uma densidade de 2,5 × 105 células/ml. Após

um tempo de incubação de 24 h (37 °C, 5% de CO2), o meio DMEM foi descartado e as

células foram lavadas com 1 ml/poço de PBS e as amostras foram adicionadas como se segue:

Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) e a associação (Pp + Cv - A -

relação ½ : ½) em concentrações de 12,5; 6,25 e 3,125 μg/mL e os compostos isolados em

concentrações de 25; 12,5 e 6,25 μM, respectivamente. Hidrocortisona (10 μM) e LY294002

53

(10 μM) foram utilizadas como controle. Para avaliar a secreção basal de VEGF ou IL-8 em

queratinócitos, o DMEM com 0% de FBS foi aplicado como controle. Em contraste, todos os

poços das células estimuladas foram suplementados com TNF-α 20 ng/ml e substâncias testes

e incubadas durante 24 horas. Os sobrenadantes foram armazenados em tubos de

microcentrífuga estéril e congelados (- 20 ° C) imediatamente. O VEGF-ELISA e IL-8-

ELISA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (PeproTech®). A

absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas (SpectraMax M2e).

54

5. ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os resultados foram expressos na forma de média erro padrão da média (e.p.m)

dos parâmetros obtidos. Os valores médios obtidos foram submetidos à análise de variância

de uma via (ANOVA), seguida do teste de Dunnett para comparação entre o grupo controle e

os grupos testes, ou teste de Student (t) para comparar dois grupos. O programa estatístico

utilizado foi o GraphPad Prism 5®. O nível de significância mínimo utilizado foi de p < 0,05.

55

6. RESULTADOS

6.1. Capítulo 1

Synergistic effect of Pterodon pubescens and Cordia verbenacea plant

extracts association in antinociception and anti-inflammatory experimental

models

Artigo submetido para a Journal of Etnopharmacology

56

Abstract:

Pharmacology relevance:

Cordia verbenacea DC leaves are used in folk medicine due to their anti-

rheumatic, anti-inflammatory, antimicrobial, analgesic actions. Pterodon pubescens Benth.,

popularly known as sucupira, is used in folk medicine for the treatment of rheumatism, sore

throats, inflammation and as analgesic.

The present study aimed to evaluate the pharmacological effect of the association

of crude dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the

essential oil of Cordia verbenacea DC (Cv) in antinociception and anti-inflammatory

experimental models.

Material and methods:

Preliminary safety characterizations of the association of both extracts were

evaluated though acute toxicity and open field test. Data of acetic acid-induced writhing test

defined the effective doses of each extract and synergism between the extracts assessed by

isobologram method. Evaluation of the antinociceptive effect was performed through acetic

acid-induced writhing test, formalin test, tail flick and hot plate. The anti-inflammatory

activity was evaluated in paw edema model induced by carrageenan and PGE2 in mice,

carrageenan-induced peritonitis and mechanical allodynia induced by Complete Freund´s

Adjuvant (CFA). Phytochemical analysis and quantification of active compounds was

assessed by HPLC-DAD and FID.

Results:

Oral administration of the associations did not cause changes in the behavioral

parameters of the animals and in the weight gain. The associations were significant effective

in reducing abdominal writhings. The interaction between the extracts was a synergism

interaction evaluated by isobologram method. At the formalin test, associations were only

significant effective at inflammatory phase. In tail flick and hot plate models, the association

did not show significant efficacy against the nociception due to thermal stimulation. In the

paw edema model induced by carrageenan, the association showed a significant reduction of

edema. In the paw edema model induced by PGE2, the association showed a significant

reduction of edema. At carrageenan-induced leukocyte migration in the mouse peritoneal

cavity test, associations did not significantly reduced leukocyte migration. At mechanical

allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant our results showed that the associations

were effective at acute phase with pronounced effect at chronic phase. Phytochemical analysis

showed important estimated concentrations of α-Humulene, trans-Caryophyllene,

57

geranylgeraniol and compounds m/z 404 and m/z 362.

Conclusions:

The results presented herein demonstrate that the association of crude

dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the essential

oil of Cordia verbenacea DC (Cv) promote synergistic antinociceptive and anti-inflammatory

activities, at lower doses than the separate crude extracts, probably acting in different

pharmacological receptors, without demonstrating side effects.

Keywords: Pterodon pubescens Benth., Cordia verbenacea DC, natural products, synergism,

antinociceptive, anti-inflammatory.

1. Introduction

Inflammation is typically viewed as a localized protective response to tissue

damage and/or microbial invasion, which serves to isolate and destroy the injurious agent and

the injured tissue preparing the organ for eventual repair and healing (Medzhitov, 2008;

Granger & Senchenkova, 2010). This protective response is mainly achieved by increased

movement of the blood-defending cells in injured or infected tissues. Inflammation is usually

regulated by a cascade of many molecular interactions and biochemical reactions responsible

for propagating and maturing the inflammatory response involving the local vascular system,

the immune system and various cell types (Pomin, 2015). Inflammation has been studied

universally in an attempt to combat the deleterious effects on the human body. Though,

inflammation plays a central role in the pathogenesis of various disorders such as rheumatoid

arthritis, cancer, diabetes, obesity, cardiovascular complications the role in the pathogenesis

may vary from disease to disease (Kotas & Medzhitov, 2015). Pain is a common symptom of

various inflammatory diseases defined as an unpleasant sensory experience associated with

actual or potential tissue damage (IASP taxonomy, 2012). Precisely, pain is a subjective result

of nociception, which is defined as neural processes of coding and processing of noxious

stimulus (Loeser & Treede, 2008). The sensitization occurs initially in nociceptive neurons

near the injured tissue and leads to an increase in local pain sensation (Pinho-Ribeiro et al.,

2015). According to the National Institutes of Health (NIH), pain is one of the most important

national public health issues, a silent epidemic (Lippe et al., 2010). Estimations from the

American Pain Society show that pain affects more than 100 million adults in the United

States spending about $ 635 billion a year in medical treatment and lost productivity (Institute

of Medicine, 2011; Borsook et al. 2014).

The therapeutic approach commonly used to reduce pain and inflammation

58

involves the use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (McGettigan & Henry,

2013). NSAIDs represent a group of more than 20 drugs that enjoy wide clinical application

and present compounds with heterogeneous chemical structures that demonstrate efficacy for

the treatment of pain, inflammation, and antipyretic properties (Rigas & Tsioulias, 2015) but

their long-term use has a straight relationship with complications of the gastrointestinal tract,

including peptic ulcers, renal toxicity, cardiovascular risks (Tielemans et al., 2014; Bruno et

al., 2014). In this sense, the development of novel drugs to treat inflammatory and painful

states, with minimal adverse effects, constitutes a challenge and is constantly under debate

and research (Knowles, 2014).

Nature has a fundamental role in the process of developing new drugs. The

enormous plant biodiversity provides inputs to generate phytotherapics, phytopharmaceuticals

and prototypes of new drugs of economical importance (Cragg & Newman, 2013). By 2016,

Cragg & Newman estimated that approximately 55.1% of all new drugs approved from 1981

to December 2014 were derived directly or indirectly from natural products (Cragg &

Newman, 2016). Brazil has the highest total biodiversity in the world, comprising more than

45.000 species of higher plants (20-22% of the total on the planet) (Dutra et al., 2016).

One example of a native species of the Brazilian flora is Cordia verbenacea DC

(Boraginaceae), a botanical synonymy of Varronia verbenacea DC Borhidi (Tropicos, 2017)

that is a perennial shrub native to the Atlantic Forest, widely distributed along the

southeastern coast of Brazil, popularly known as miracle maria, black catinga, camaradinha,

caraminha, and maria-pretinha. Several compounds are found in their aerial parts, including

tannins, flavonoids, mucilages in addition to essential oils. The leaves and inflorescences are

used in folk medicine due to their anti-rheumatic, anti-inflammatory, antimicrobial, analgesic

actions in the form of alcoholic extract, decoction and infusion (De Carvalho et al., 2004;

Dutra et al., 2016). Due to the diversity of chemical groups found in extracts of this species,

there are several pharmacological activities reported, antibacterial, anti-inflammatory, anti-

edematogenic, antiulcerogenic, antitumor, healing properties, among others (Matias et al.,

2016; Passos et al., 2006; Fernandes et al., 2007; Roldão et al., 2008; Parisotto et al., 2012;

Perini et al., 2015). Of the different components found in the essential oil, there are two main

compounds with important anti-inflammatory and anti-edematogenic activity, α-Humulene

and trans-Caryophyllene (Passos et al., 2006).

The other example of a native species of the Brazilian flora is Pterodon pubescens

Benth. (Leguminosae-Papillonoideae,), a botanical synonym of Pterodon emarginatus Vog.,

widely distributed in the central region of Brazil and popularly known as sucupira, faveiro,

59

sucupira-branca or sucupira-lisa. The folk use of sucupira was reported through an

ethnobotanical study in 30 cities in the interior of Minas Gerais State, where the population

used the species for the treatment of rheumatism, sore throats, as well as anti-inflammatory

and analgesic (Carvalho et al., 1999). A number of reported pharmacological activities of this

species have been described: antinociceptive, anti-inflammatory, anti-edematogenic, anti-

arthritic, antiproliferative and other activities (Servat et al., 2012; Nucci-Martins et al., 2015;

Spindola et al., 2011; Spindola et al., 2009; Grando et al., 2017). Some authors have

suggested that the diterpenes vouacapane and the geranylgeraniol sesquiterpene moities are

involved with the anti-inflammatory and antinociceptive properties of P. pubescens (Silva et

al., 2004, Spindola et al., 2009).

The interest in studying synergistic or antagonistic effects through experiments

with associations has grown immensely since mid-1990’s (Ritz & Streibig, 2014). The word

synergy is derived from the Greek word synergo'z, meaning "working together" and the idea

in the field of pharmacology refers to the elucidation and quantification of the action of drugs

administered in combination (Sucher, 2014). The scientific literature has shown that often the

pharmacological action of the active principle alone differs from the action found in crude

extracts with believe that the advantage of herbal medicines is due to synergistic interactions

that potentiate their pharmacological effects with reduced side effects (Wagner & Ulrich-

Merzenich, 2009). The increased effectiveness of combinations of compounds or extracts can

be understood by the synergistic effects of multi-target where the association acts in a

synergistic manner. The strategy of use for a multivalued association is that many diseases

have a pluri-causal etiology and complex pathophysiology, being treated more effectively

with well-chosen pharmaceutical combinations than with a single drug (Wagner & Ulrich-

Merzenich, 2009; Ulrich-Merzenich, 2014). Therefore, the present study was carried out using

an association of extracts aiming to evaluate the pharmacological effect of the association of

crude dichloromethane extract from the fruits of Pterodon pubescens Benth. (Pp) with the

essential oil of Cordia verbenacea DC (Cv) in antinociception and anti-inflammatory

experimental models.

2. Material and methods

2.1.1. Plant material and extraction

Fruits of Pterodon pubescens Benth were collected from Ponto Chique (MG –

Brazil - coordinates 16 ° 38'23.3 "S 45 ° 03'54.0 " W). The dried specimen was deposited at

the Herbarium of the University of Campinas (Unicamp) under number 179739.

Leaves of Cordia verbenacea DC were collected in CPQBA – Unicamp experimental field

60

(Multidisciplinary Center for Chemical, Biological and Agricultural Researches – Paulínia –

SP - Brazil). The dried specimen was deposited at Herbarium of the University of Campinas

(Unicamp) under number 112744. The plant materials received authorization to use the

Brazilian genetic resources under number 010829/2014-8.

The extraction process of Pterodon pubescens Benth fruits was carried out in

stainless steel tank with mechanical stirring using dichloromethane as liquid extractor. The

fruits were ground with dry ice to increase the contact surface providing a higher extraction

yield. The plant material (kg) by volume of organic solvent (l) ratio was a 1: 3 by performing

three extractions of 1.5 hours each, a total of 4.5 hours (3 times 1.5 h) at room temperature

renewing the solvent at each step. The partial extracts were filtered, combined and

concentrated under vacuum by rotary evaporation system at 40°C (Büchi RE 120). The

extract was stored in amber bottle and stored at room temperature.

Cordia verbenacea DC leaves’ essential oil was obtained by steam distillation

technique, carried out during a 1.5 to 2 hours period. Therefore, crushed fresh leaves were

used in stainless steel vat with capacity for 1500 l. The oil was separated from the water

initially in the annex to the florentine vase vat and afterwards in a separating funnel, followed

by the use of anhydrous sodium sulfate to remove residual traces of water. The oil was stored

in a freezer until use.

2.1.2. Isolation of voucapan

The isomers voucapan 6α- hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester

and 6α-acetoxy-7β-hydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 404) and 6α,7β-

dihydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 362) from crude dichloromethane extract

from the fruits of Pterodon pubescens Benth. were isolated by column chromatography (25x

500 mm), using solvent gradient of hexane and ethylacetate as previously described (Spindola

et al., 2009). The purified compounds of data were compared to previously identified

compounds by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Mass Spectrometry (MS).

2.1.3. GC–MS analysis

The GC–MS (Gas chromatography–mass spectrometry) analysis was carried out

with an Agilent 5975 GC–MS system. HP5 column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm film

thickness) was used with helium as carrier gas (1.0 ml/min). GC oven temperature was kept at

60°C for 3 minutes and programmed to 240°C at a rate of 3°C/ min, and kept constant at

240°C for 5 minutes and then programmed to 240°C at a rate of 1°C/min. Split ratio was

adjusted at 40:1. The injector temperature was set at 250°C. Mass spectra were recorded at 70

eV. Mass range was from m/z 100 to 600.

61

2.1.4. GC analysis essential oil quantification

The GC (Gas chromatography) analysis was carried out using an Agilent 6890N

GC system. FID (Flame ionization detector) temperature was 250°C. To obtain the same

elution order with GC–MS, simultaneous auto-injection was done on a duplicate of the same

column applying the same operational conditions. Quantifications were accomplished using

analytical standard α-Humulene, trans-caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich

Saint Louis USA).

2.1.5. HPLC analysis voucapan compounds

The HPLC-DAD system (Shimadzu) consisted of C18 reverse phase column

(Gemini -C18 250 mm × 4.6 mm x 5µm) with 10 µL sample inject. The mobile phase was a

mixture of 70:30 Acetronitrile: water with 0.1% acetic acid (v:v). The flow rate and UV

wave-length were set at 1 ml/min and 220 nm, respectively.

2.2. Pharmacological evaluations

2.2.1. Animals

Swiss mice of either sex were used (25-35 g) for experiments. Animals were

obtained from CEMIB (Multidisciplinary center for biological research in the field of animal

laboratory science) - Unicamp and adapted to laboratory conditions for at least seven days

prior to experimental manipulation under temperature (23 2 C) and light-dark cycle of 12

hours controlled. The animals were fed with Purina and water ad libitum. Efforts were made

to minimize animal suffering and to reduce the number of animals used. The experimental

protocols were approved by Institute of Biology Ethics Committee for Animal Research

(CEUA) of Unicamp nº 3181-1 and 4392-1. All animals were withdrawn from food 4 hours

prior of each experiment.

2.2.2. Acute toxicity test

The acute toxicity test for the association of crude dichloromethane Pterodon

pubescens Benth (Pp) fruits extracts and Cordia verbenacea DC leaves’ essential oil (Cv) was

carried out to evaluate any possible toxicity. Female Swiss mice (n=6) were tested by

administering different doses of the association (50, 100 e 500 mg/kg of each extract at ratio

1:1), while the control group received 10 ml/kg of vehicle (saline solution 0,9 % sodium

chloride with Tween® 80 1%). The treatments were accomplished by oral route and all

groups were observed for any side effect during the first 8 hours and daily until the fourteenth

day, when surviving animals were anesthetized and post mortem macroscopic analysis of the

organs (heart, lung, spleen, kidney, ovary and uterus) was performed and weighed to

determine their relative weights (organ weight per 100 grams of body weight) (OECD, 2002).

62

2.2.3. Open field test

The open field test was performed as previously described (Royce, 1977) with

some modifications. The apparatus used for this activity consisted of a plastic white box

divided into 9 squares (15 x 15 cm) by black lines. Female Swiss mice (n=6) were treated

orally by the association of Pp + Cv at doses of 50, 100 and 500 mg/kg at a ratio of 1:1. The

negative control group received vehicle (10 ml/kg, v.o.) and the positive control group was

treated with pentobarbital (35 mg/kg, i.p.). After one hour of treatment each animal was

placed in the center of the box and the numbers of lines crossed by the four legs of the

animals were counted for each mouse during 6 minutes and taken as behavioral session index.

2.2.4. Determination of effective dose 50 (ED50) with abdominal writhing test

induced by acetic acid

Male Swiss mice (n=6) were treated orally, for each experimental group.

Initially, the groups were treated with different doses (50, 100, 200 and 300 mg/kg) for each

extract (Pp or Cv), separately, to determine separate dose-response curves. Negative control

was treated with 10 ml/kg of vehicle. After 60 minutes of the treatments, animals received

i.p. injection with 0.8% acid acetic (0.1 ml/10 g) and the numbers of abdominal writhes was

counted after 5 minutes of acetic acid injection for the period of 15 minutes (Koster et al.,

1959). The extracts were also evaluated at the effective doses found and at 50% of these

doses, for comparison effect of the antinociceptive response with those of the extracts

association.

2.2.5. Isobolographic analysis and construction of combinatorial index (CI)

Standard isobologram analysis was used to evaluate the potential synergistic

interaction between these two extracts, according to Berenbaum method (1978): the crude

dichloromethane extract of Pterodon pubescens Benth fruits (Pp) and Cordia verbenacea DC

(Cv) leaves’ essential oil were tested in various combination associations shown in Table 1,

according to ED50 previously determined at abdominal writhing test induced by acetic acid

(2.2.4.).

63

Table 1. Associations of crude dichloromethane of Pterodon pubescens Benth (Pp) fruit extract and Cordia

verbenacea DC (Cv) leaves’ essential oil tested in various combination mixtures (25, 50, 75, 100 and 200 % of

the ED50 of each extract tested alone) tested on abdominal writhing experimental model induced by acetic acid

for visualization of pharmacological interaction effect.

Associations Cv Pp

A25 25% (41,25 mg/kg) 75% (48,75 mg/kg)

A50 50% (82,5 mg/kg) 50% (32,5 mg/kg)

A75 75% (123,75 mg/kg) 25% (16,25 mg/kg)

A100 100% (165 mg/kg) 100% (65 mg/kg)

A200 200% (330 mg/kg) 200% (130 mg/kg)

For the analysis of the pharmacological effect, the experimental curve was

compared to the additivity curve. If the points were positioned around the isobole of

additivity, the action was additivity; if they were placed below, the action was considered as

synergism and if they were situated above, the action was considered antagonism

(Berembaum, 1989). Male Swiss mice (n=6) were treated with different associations and

submitted to the abdominal writhing test induced by acetic acid as previously described.

For the construction of the combinatorial index (CI) and quantitative evaluation of

the interaction between the extracts, the median effect analysis model was used using

CompuSyn® 1.0 software (Chou, 2006). Experimental data of the antinociceptive response of

the associations obtained by the acetic acid-induced abdominal writhing test were entered into

the software and the combinatorial index was calculated.

2.2.6. Formalin test

This experiment was based on the descriptions of Hunskaar & Hole (1987), with

some modifications. An observation chamber was used, consisting of a funnel 20 cm in

diameter. Each mouse was previously placed in the funnel chamber for 30 minutes prior to the

intraplantar injection of formalin to allow for adaption with the new environment. The groups

(n = 6) were orally treated with vehicle - 10 ml/kg, extracts separately at the effective doses

found in the previous experiment (acetic acid induced writhing test) and 50% of these doses,

corresponding to 65 mg/kg and 32.5 mg/kg of Pp and 165 mg/kg and 82.5 mg/kg of Cv, and

with the associations of the extracts at the doses describe previously. After one hour, 20 μl of

2.7% formalin solution in phosphate buffer were inoculated into the plantar pad of the right

hind paw. The animals were observed from 0 to 5 minutes (neurogenic phase) and from 15-30

minutes (inflammatory phase) after formalin injection. The time (in seconds) spent by the

animal licking/biting the inoculated paw was recorded and considered as indicative of pain.

64

For the following experiments, the 3 associations with the best performance in abdominal

writhing test induced by acetic acid and formalin test were selected.

2.2.7. Hot plate test

Male Swiss mice (n=6) were for used for each experimental group. Animals were

subjected to pre-testing on hot plate maintained at 55 ± 0.5 °C and having latency time greater

than 15 seconds on hot plate during the pre-testing were rejected (latency time). Mice were

pre-treated orally with vehicle (10 ml/kg), association of Pp + Cv in different 3 doses as

described previously (A50, A100 and A200) and morphine (5 mg/kg, s.c.) as positive control.

After 60 minutes for treatments and 30 minutes for morphine, animals were placed on hot

plate and the latency time (time for which mouse remains on the hot plate 55 ± 0.5 °C without

licking or flicking of hind limb or jumping) was measured in seconds. In order to prevent the

tissue damage a cut-off time of 30 seconds were imposed for all animals. The latency time for

all groups was recorded at 0, 30, 60, 90 and 120 minutes (Ankier, 1974).

2.2.8. Tail flick

Groups of Swiss male mice (n=6) were used. A basal value was determined by

submerging the tail of the animal in a bath at a temperature of 50° C and noted the time the

animal took to remove the tail of the bath 24 hours prior to the administration of the samples

tested. The next day, the response was again evaluated after 30, 60, 90 and 120 minutes of

sample administration. The maximum contact time of the animal with hot water was 20 s. The

mice were pre-treated orally with 10 ml/kg vehicle and association of Pp + Cv in different 3

doses as described previously (A50, A100 and A200). As a positive control, morphine (5 mg/kg,

s.c.) was administered 30 minutes before the beginning of the test (Janssen et al., 1963).

2.2.9. Paw edema induced by carrageenan

To verify the possible anti-edematogenic activity from the association of extracts,

the methodology of paw edema induced by carrageenan in male Swiss mice were performed

(Winter et al., 1962). The animals were divided in groups (n=6): negative control (10 ml/kg –

vehicle), positive control (dexamethasone – 5 mg/kg) and the association in 3 doses (A50, A100

and A200). All treatments were administrated orally 1 hour before the induction of the edema

through the subcutaneous injection of 40 µl of carrageenan (3%) at the sub plantar region of

posterior right paw. The edema was determined by the volume measured after the injection of

carrageenan (1, 2, 4, 6, 24 and 48 hours after) using a digital plethysmometer (UGO-Basile).

The percentage of edema inhibition was calculated as follows: [(A − B) / A] × 100, where

A = edema volume of negative control group and B = edema volume of experimental group.

65

2.2.10. Paw edema induced by PGE2 (Prostaglandin E2)

Swiss male mice were divided in groups (n=6): negative control (10 ml/kg –

vehicle), positive control (indomethacin – 20 mg/kg) and the association in 3 doses (A50, A100

and A200). All treatments were administrated orally 1 hour before edema induction by

subcutaneous injection of PGE2 (1 μg/paw) at the sub plantar region of posterior right paw.

The edema was determined by the volume measured after the injection (15, 30, 60 and 90

minutes after) using a digital plethysmometer (UGO-Basile). The percentage of inhibition of

edema was calculated as follows: [(A − B) / A] × 100, where A = edema volume of negative

control group and B = edema volume of experimental group (Claudino et al., 2006).

2.2.11. Carrageenan-induced leukocyte migration in the mouse peritoneal cavity

(peritonitis)

Swiss male mice (n = 6) were treated orally with vehicle, associations (A50, A100

and A200) or dexamethasone (5 mg/kg). Peritonitis was induced 1 hour min later, by i.p.

injection of carrageenan solution (500 μg/250 μL) (Iwamoto et al., 2015). Four hours later,

mice were euthanized, and the peritoneal cavity was washed with 5 ml of PBS (phosphate-

buffered saline) containing heparin 5 IU/ml. The peritoneal fluid was recovered for analysis

of total leukocyte numbers using a hematology analyser (Sysmex model Poch-100iV).

2.2.12. Mechanical allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant (CFA)

The procedures were similar to the method described by Villetti (2003) with

protocol adaptions and data analysis. The inflammation was induced by a solution of CFA

(complete freund's adjuvant - 1 mg/ml heat-attenuated Mycobacterium tuberculosis in 85%

paraffin in oil and 15% manide monoleate). Experimental groups of 6 Swiss male mice

received the volume of 40 μl (s.pl.) of CFA on the right hind paw. Mechanical allodynia was

measured using an Anesthesiometer (Dynamic Plantar Anaestesiomether-Ugo Basile, mod-

37450- Italy) consisting of a raised platform with perforations that allow access to the ventral

surface of the hind legs. A steel rod (diameter 0.5 mm) was pressed against the paw under

increasing force (0 to 8 g in 5 seconds for mice). With the withdrawal of the paw, the

mechanical stimulus was automatically ceased and the strength that each animal endured,

recorded by the equipment. The evaluation of mechanical allodynia (touch response) was

performed as described: three measurement (mean)of the basal stimulus in the right hind paw;

Intraplantar CFA injection; 24 hours after injection measurement of basal state in

hyperalgesic state; Treatment with the samples, with subsequent measurement of acute

mechanical allodynia (30, 60 and 90 minutes). After seven days, procedures were repeated for

evaluation of chronic mechanical allodynia (baseline, 30, 60 and 90 min post-treatment).

66

Vehicle (10 ml/kg -negative control), morphine (5 mg/kg, s.c. - positive control) and

association of Pp + Cv in different 3 doses as described previously (A50, A100 and A200) were

administered orally 60 minutes before the application of the stimulus in each phase of the

experiment. In this experiment, the prolonged treatment of the Pp + Cv association was also

evaluated, where the groups were treated daily from day one (first day after CFA injection)

until day seven with the Pp + Cv association at the same doses, positive control

(dexamethasone 5 mg/kg, v.o.) and negative (vehicle).

3. Statistical analysis

Results were expressed as mean mean standard error (S.E.M.) of the measured

parameters. Mean values were subjected to analysis of variance of one way (ANOVA)

followed by Dunnett's test to compare treated groups with control group or Student´s test (t)

to compare two groups. The statistical program used was GraphPad Prism 5. The minimum

level of significance was set at p < 0.05.

4. Results

4.1. Plant extraction

For the crude dichloromethane Pterodon pubescens fruits extract 1500 g of

ground fruits were placed in a stainless steel tank with mechanical stirring. The extraction

process provided approximately 675 g, representing 45% yield.

Cordia verbenacea DC essential oil was obtained by means of the steam

distillation technique for 1 ½ to 2 hours, using crushed fresh leaves using a stainless steel set

containing 1500 l capacity providing the essential oil in 0.34% yield.

4.2. Phytochemical analysis

Quantifications were accomplished using analytical standard α-Humulene, trans-

Caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich Saint Louis USA). The peak area

calculated from HPLC chromatograms was correlated linearly with compound m/z 404

concentrations in the range of 17–2180 µg/ml (R2= 0.999) and compound m/z 362 range of

8.7-1117 µg/ml (R2= 0.999). The peak area calculated from FID chromatograms was

correlated linearly with α-Humulene concentrations in the range of 15–1000 µg/ml (R2=

0.9996), trans-Caryophyllene 20-1300 µg/ml (R²=0.9971) and geranylgeraniol 19-1230 µg/ml

(R²=0.9995). The percentage amounts of the separated compounds were calculated in samples

test (Table 2).

67

Table 2. Percentage amounts of active compounds present at crude dichloromethane Pterodon pubescens fruits

extract and Cordia verbenacea DC essential oil

Extract

trans-

Caryophyllene

(% w/w)

α-Humulene

(% w/w)

Geranylgeraniol (%

w/w)

Voucapane

362

(% w/w)

Voucapane

404

(% w/w)

P. pubescens extract 4.54 ±0.51 0.64 ±0.04 0.21 ±0.01 6.55 ± 0.83 14.61 ± 1.25

C. verbenacea

essential oil 4.03 ±0.08 1.23 ±0.03 0.12 ±0.01 - -

4.2. Pharmacological evaluations

4.2.1. Acute toxicity test

Oral administration of the association (ratio 1: 1) of crude Pterodon pubescens

Benth. fruit dichloromethane extract (Pp) and Cordia verbenacea DC leaves essential oil (Cv)

at 50, 100 and 500 mg/kg doses for each extract in association did not cause changes in

behavioral parameters of the animals analyzed compared to the parameters obtained by the

group treated with vehicle with no mortality observed. The animals were active and gained

weight normally. Another parameter analyzed was the relative weight of organs obtained by

the ratio of organ weight and total weight of the animal. After performing statistical test

(Student´s t test), there was no significant difference (p> 0.05) between groups treated with

the mixture of the extracts and treated with the vehicle (data not shown).

4.2.2. Open field test

In this experimental model, the association of the extracts did not change the

behavior of the animals compared with the control group (vehicle 10 ml/kg), while the

positive control group (pentobarbital 35 mg/kg i.p.) exhibited maximum sedation which was

significantly (p<0.001) different from vehicle control (Table 3).

Table 3. Ambulatory activity of Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea

(Cv) essential oil. The values represent the numbers of lines crossed by the four legs by animal in box, after one

hour of treatment with vehicle, the association of Pp + Cv and pentobarbital. Data expressed by mean ± S.E.M.

(n=6), Dunnett´s Test. ***p<0.001 level of significant compared with control.

Treatment Dose (mg/kg) Number of line crossed in 6 min

Vehicle 10 ml/kg 113.8 ± 1.377

Pentobarbital 35 27.75 ± 4.956***

Pp + Cv 50 + 50 102.5 ± 5.737

Pp + Cv 100 + 100 105.5 ± 3.122

Pp + Cv 500 + 500 102.8 ± 1.493

4.2.3. Determination of effective dose 50 (ED50) with abdominal writhing test

induced by acetic acid

For the determination of the effective doses Pp and Cv extracts, the animals were

68

treated orally with 50, 100, 200 and 300 mg/kg doses of each extract and submitted to the

abdominal writhing test induced by acetic acid. The effective dose (ED50) were calculated

using a mathematical model of non-linear regression employing GraphPad Prism® software.

For the crude Pterodon pubescens Benth fruit dichloromethane extract the effective dose

found was 65 mg/kg and Cordia verbenacea essential oil the effective dose found was 165

mg/kg.

4.2.4. Isobolographic analysis and construction of combinatorial index (CI)

After determination of the effective doses for each extract, specific combinations

of the associations were tested in the abdominal writhing model for the construction of the

isobologram. The combinations tested correspond to A25; A50 and A75 as described on Table 1.

For the purpose of comparison, experimental groups were treated with the extracts separately

at 65 mg/kg of Pp (effective dose - 100%) and 32.5 mg/kg doses of Pp (50% of the effective

dose) and at 165 mg/kg of Cv (effective dose - 100%) and 82.5 mg/kg of Cv (50% of the

effective dose) and in associations A100 and A200.

For the groups treated with the extracts separately, the 32.5 mg/kg and 65 mg/kg

doses of Pp showed inhibition of 29% (39 ± 2) and 48% (28 ± 2) respectively and 82, 5 mg/kg

and 165 mg/kg Cv doses showed inhibition of 31% (38 ± 1) and 47% (30 ± 3) respectively,

when compared to the negative control group (vehicle). The vehicle group presented mean

contortions of 55 ± 3. The result is expressed in Figure 1.

0

20

40

60

80Vehicle

32,5 mg/kg Pp

65 mg/kg Pp

82,5 mg/kg Cv

165 mg/kg Cv***29%

***31%

48 %

*** ***47%

Abdominal writhing induced by aceticacid

Treatments

Nu

mb

er

of

Wri

thin

gs

Figure 1. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing test induced by acetic acid of mice

treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv)

essential oil at doses corresponding to 100% and 50 % of the effective dose of each extract. Data expressed by

the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test *** p <0.001. The values (%)

correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).

For the groups treated with the associations the inhibitions were 66% (18 ± 2),

70% (16 ± 1), 65% (19 ± 2), 73% (14 ± 1.3) and 74% (14 ± 0.6) for the respective

associations. The vehicle group presented mean contortions of 55 ± 3. The result is shown in

Figure 2.

69

0

20

40

60

80

******

****** ***

65%66%70%

73% 74%

Vehicle

A75

A25A50

A100A200

Abdominal writhing induced by aceticacid

TreatmentsN

um

ber

of

Wri

thin

gs

Figure 2. Evaluation of antinociceptive activity in the abdominal writhing induced by acetic acid test of mice

treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp)fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv)

essential oil in doses corresponding to 75% + 25%; 50% + 50%; 25% + 75%; 100% + 100% and 200% + 200%

of the effective dose of each extract in the association. Data expressed by the mean (bars) ± standard error of the

mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test *** p <0.001. The values (%) correspond to the reduction of the

mean in relation to the control group (vehicle - saline).

Finally, we evaluated antinociceptive effects of different combinations of extracts

by the isobologram method presented in Figure 3.

Figure 3. Isobologram demonstrating the antinociceptive interaction between the Pterodon pubescens (Pp)fruit

dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil in the abdominal writhing test induced by

acetic acid. Results were plotted using an isobologram analysis based on the ED50 of each extract. The concave

slope of the isobologram plots indicates synergistic interactions between the extracts, whereas a straight isobole

similar to the theoretical additive line would indicate an additive effect.

The results obtained in the abdominal writhing test induced by acetic acid of the

associations in their different proportions were used in the analysis model of the median effect

for the construction of the combinatorial index, using CompuSyn® 1.0 software. The

combination index (CI) and their respective interactions are described in Table 4.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 50 100 150 200

Pte

rod

on

pu

bes

cen

s B

en

th (

mg/

kg) i

n

asso

ciat

ion

Cordia verbenacea DC (mg/kg) in association

Additive line

70

Table 4. Combination Index of the different proportions of the association of the crude Pterodon pubescens (Pp)

fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil in the abdominal writhing test induced by

acetic acid.

Associations Cv Pp CI Interaction

A25 25% (41,25 mg/kg) 75% (48,75 mg/kg) 0,28 Strong Synergism

A50 50% (82,5 mg/kg) 50% (32,5 mg/kg) 0,27 Synergism

A75 75% (123,75 mg/kg) 25% (16,25 mg/kg) 0,41 Synergism

A100 100% (165 mg/kg) 100% (65 mg/kg) 0,46 Synergism

A200 200% (330 mg/kg) 200% (130 mg/kg) 0,87 Weak Synergism

4.2.5. Formalin test

For the formalin test, the animals were treated with both the extracts separately

and in pre-established mixtures to better visualize the suggested synergistic effect between the

extracts. In a first experiment, the animals were treated with the pure extracts at the

corresponding effective doses found in the abdominal writhing test, as well as at 50% of the

effective dose. Thus, the groups of animals were treated with Pp extract at 65 mg/kg (ED50)

and 32.5 mg/kg (50% of the effective dose) doses and with Cv essential oil at 165 mg/kg

(ED50) and 82.5 mg/kg (50% of the effective dose) doses. In the neurogenic phase, both Pp

and Cv at the doses used did not present antinociceptive activity when compared to the

vehicle group (negative control). The lick means (s) were 105 ± 6 for the vehicle, 82 ± 9 for

65 mg/kg of Pp; 106 ± 8 for 32.5 mg/kg of Pp; 90 ± 11 for 165 mg/kg of Cv and 97 ± 88 for

82.5 mg/kg of Cv.

In the inflammatory phase, both the 65 mg/kg of Pp extract and the Cv essential

oil at 165 mg/kg and 82.5 mg/kg doses had an antinociceptive effect with inhibition of 38%

(200 ± 19 S), 38% (176 ± 12 s) and 36% (181 ± 25 s) respectively when compared to vehicle

(285 ± 26 s) (Figure 4).

71

0

100

200

300

400Vehicle

32,5 mg/kg Pp

65 mg/kg Pp

165 mg/kg Cv

82,5 mg/kg Cv** ** *38% 38%

36%29%

Inflammatory phase

Treatments

Tim

e o

f li

ckin

g (

s)

Figure 4. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin model in the mice

treated orally with the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv)

essential oil at doses corresponding to 100% and 50% of the effective dose of each extract. Data expressed by

the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and ***

p <0.001. The values (%) correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle -

saline).

In a second experiment, the animals were orally treated with the associations of

the extracts in concentrations previously described in Table 1. In the neurogenic phase, the

associations did not present any antinociceptive activity when compared to the vehicle group

(negative control). The lick means (s) were 105 ± 6 for the vehicle, 87 ± 16 s; 85 ± 13 s; 85 ±

6 s; 92 ± 15 s; 85 ± 6 s and 99 ± 11 s for the associations, respectively.

In the inflammatory phase, all the associations showed significant efficacy against

the nociception caused by the injection of formalin when compared to the vehicle. Inhibitions

were 51% (137 ± 21 s); 70% (85 ± 27 s); 56% (125 ± 26 s); 66% (95 ± 4 s) and 62% (106 ±

19 s) for the respective mixtures described above. The negative control group presented a

mean of 285 ± 26 s (Figure 5).

0

100

200

300

400Vehicle

A25

A100

A50

A75

A200** ****** *** ***

56%51%

70% 66% 62%

Inflammatory phase

Treatments

Tim

e o

f li

ckin

g (

s)

Figure 5. Evaluation of the antinociceptive activity in the inflammatory phase of the formalin model in the mice

treated orally with the with the association of the crude Pterodon pubescens (Pp)fruit dichloromethane extract

and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 75% + 25%; 50% + 50%; 25% + 75%; 100%

+ 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the association. Data expressed by the mean

(bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001.

The values (%) correspond to the reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).

72

With these results, the three best doses of the associations with the best

performances in the formalin test were selected to continue the pharmacological tests. The

doses that were chosen corresponded to 50% of the effective dose of each extract in the

association A50 (32.5 mg/kg Pp + 82.5 mg/kg Cv), at 100% of the effective dose of each

extract in the association A100 (65 mg/kg Pp + 165 mg/kg Cv) and 200% of the effective dose

of each extract in the association A200 (130 mg/kg Pp + 330 mg/kg Cv). For the selected

combinations the following concentrations of the active compounds in mg (Table 5) were

expected to be found.

Table 5. Compounds present in associations selected for pharmacological tests.

Association

trans-

Caryophyllene

(mg)

α-Humulene

(mg)

Geranylgeraniol

(mg)

Voucapane

362

(mg)

Voucapane

404

(mg)

A50 4.79 1.21 0.16 2.12 4.74

A100 9.59 2.43 0.33 4.25 9.49

A200 19.20 4.88 0.67 8.51 18.99

4.2.6. Tail flick and Hot plate

In the tail flick and hot plate models, the association of Pp + Cv in the three doses

tested did not show significant efficacy against the nociception due to thermal stimulation

during the times of 30, 60, 90 and 120 minutes after the administration of the treatment (data

not shown).

4.2.7. Paw edema induced by carrageenan

In the paw edema model induced by carrageenan, the association of Pp + Cv in

the 3 doses tested showed a significant reduction of edema from the fourth hour after

carrageenan administration, maintaining the effect after 48 hours of the beginning of the test.

For the first and second hours of evaluation, the values were not significant when compared to

vehicle control. From the fourth hour of evaluation on, A200 showed 26% inhibition in edema

volume when compared to the negative control (vehicle). After 6 hours of edema induction,

the doses A50 and A100, respectively, showed edema inhibition in 19% and 23%, while A200

showed reduction of about 39% when compared to the negative control (vehicle). The results

and percentages of inhibitions of the associations in edema and the positive control

(dexamethasone) are shown in Table 6, when compared to the negative control (vehicle).

73

Table 6. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with the association of

the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at

doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the

association. The animals were evaluated at the basal state and times of 1, 2, 4, 6, 24 and 48 hours after treatment.

Data expressed by the mean (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%)


Volume difference (%)

Treatments Dose

(mg/kg)

Basal 4 6 24 48

Control - 0.19 ± 0.03 0.28 ± 0.03 0.31 ± 0.05 0.26 ± 0.01 0.24 ± 0.01

Dexamethasone 5 0.23 ± 0.02 0.22 ± 0.03

(22%)*

0.19 ± 0.02

(38%)***

0.17 ± 0.03

(33%)***

0.16 ± 0.01

(31%)***

A50 32.5 Pp +

82.5 Cv

0.18 ± 0.01 0.29 ± 0.03 0.25 ± 0.02

(19%)*

0.18 ± 0.01

(31%)***

0.16 ± 0.01

(30%)***

A100 65 Pp +

165 Cv

0.16 ± 0.02 0.29 ± .040 0.24 ± 0.03

(23%)**

0.17 ± 0.02

(34%)***

0.17 ± 0.01

(29%)***

A200 130 Pp +

330 Cv

0.18 ± 0.01 0.21 ± 0.01

(26%)**

0.19 ± 0.02

(39%)***

0.16 ± 0.03

(36%)***

0.16 ± 0.01

(32%)***

4.2.8. Paw edema induced by PGE2

In the paw edema model induced by PGE2, the association of Pp + Cv in the 3

doses tested showed a significant reduction of edema at different times of evaluation after

administration of PGE2.

The A50 was the only dose that showed significate edema reduction at all

evaluation times at 29%, 18%, 17% and 13% for 15, 30, 60 and 90 minutes of evaluation,

respectively.

The A100 only showed significant edema reduction (25% and 24%, respectively) at

15 minutes and 30 minutes after administration and of PGE2 when compared to negative

control (vehicle). The A200 only showed significant edema reduction (25%) at 15 minutes

after administration of PGE2 when compared to negative control (vehicle). The results and

percentages of inhibitions of the associations in edema and the positive control

(indomethacin) are shown in Table 7, when compared to the negative control (vehicle).

74

Table 7. Evaluation of the anti-edematogenic activity in mice previously treated orally with the association of

the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at

doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the

association. The animals were evaluated at the basal state and times of 15,30,60 and 90 minutes after treatment.

Data expressed by the mean (n = 6). Dunnett's test * p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%)


Volume difference (%)

Treatments Dose

(mg/kg)

Basal 15 30 60 90

Control - 0.158 ± 0.018 0.281 ± 0.052 0.235 ± 0.052 0.200 ± 0.030 0.185 ± 0.023

Indomethacin 20 0.151 ± 0.023 0.223 ± 0.034

(20%)*

0.19 ± 0.017

(19%)*

0.178 ± 0.02

(11%)

0.145 ± 0.001

(21%)***

A50 32.5 Pp +

82.5 Cv

0.166 ± 0.017 0.198 ± 0.021

(29%)***

0.191 ± 0.026

(18 %)*

0.166 ± 0.012

(17 %)*

0.161 ± 0.009

(13 %)*

A100 65 Pp +

165 Cv

0.16 ± 0.012 0.210 ± 0.27

(25%)**

0.178 ± 0.02

(24 %)*

0.178 ± 0.017

(11 %)

0.160 ± 0.010

(13 %)*

A200 130 Pp +

330 Cv

0.163 ± 0.018 0.210 ± 0.015(

25%)**

0.200 ± 0.017

(15 %)

0.181 ± 0.007

(9 %)

0.168 ± 0.007

(9 %)

4.2.9. Carrageenan-induced leukocyte migration in the mouse peritoneal

cavity (peritonitis)

Administration of carrageenan increased the total number of leukocytes in the

peritoneal fluid and oral pre-treatment with different doses of associations did not

significantly reduced leukocyte migration, whereas with dexamethasone (5 mg/kg)

significantly reduced by 75% (3.47 ± 1.2 x 106 cells/ml) (Figure 6).

0

5

10

15

20Vehicle

Dexamethasone 5 mg/kg

A50

A100

A200

*

ns

nsns

Carrageenan-induced peritonitis

75%

Treatments

Nu

mb

er

of

leu

ko

cyte

s

(10

6 c

ell

s/m

L)

Figure 6. Evaluation on total number of leukocytes in the peritoneum in carrageenan-induced peritonitis model

in mice treated orally with the with the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane

extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and

200% + 200% of the effective dose of each extract in the association. Data expressed by the mean (bars) ±

standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p <0.05. The values (%) correspond to the

reduction of the mean in relation to the control group (vehicle - saline).

75

4.2.10. Mechanical allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant (CFA)

For experimental groups treated with a unique dose on day one of assessment

(acute pain), the association A100 showed significant activity after 30 and 60 minutes of

administration, increasing the paw withdrawal threshold (PWT) in 53% and 77% respectively

when compared to the control group (vehicle). The association A200 demonstrated significant

activity after 60 and 90 minutes of administration, increasing the PWT supported by 71% and

79% respectively when compared to the control (vehicle) group. The lower dose administered

was able to increase the PWT, although this did not show significant inhibition when

compared to the vehicle group, as shown in Figure 7 A.

On seventh day of evaluation (chronic pain), the associations in the three doses

administered were significantly effective since the first evaluation, after 30 minutes of

administration. Sample A50 showed activity after 30, 60 and 90 minutes of evaluation,

increasing PWT by 74%, 94% and 92% respectively. A100 showed activity after 30, 60 and 90

minutes of administration, increasing the PWT by 51%, 81% and 87% respectively. A200

demonstrated significant activity after 30, 60 and 90 minutes of administration, increasing the

PWT by 70%, 93% and 83% respectively. All data were compared to the control (vehicle)

group and are shown in Figure 7 B.

76

0

2

4

6

8

Baseline before CFA Acute baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment

A

*53%

****

77%

71%***96%

***79%

Time points - 1 day post CFA injection (acute phase)

Paw

wit

hd

raw

al

thre

sh

old

(g

)

0

2

4

6

8

Chronic baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment

Time points - 7 days post CFA injection (chronic phase)

***84%

***74%

*51%

***70%

*** ***

******

96% 94%

81%93%

******

******

91% 92%

87%

83%

B

VehicleMorphine 5 mg/kgA50A100A200

Paw

wit

hd

raw

al

thre

sh

old

(g

)

Figure 7. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the association of the crude

Pterodon pubescens (Pp)fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses

corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the

association at the baseline assessment times and after 30, 60 and 90 minutes of the unique treatment. A. Day 1.

B. Day 7. Data expressed by the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test

* p <0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%) correspond to the mean increase in relation to the

control group (vehicle - saline).

For the experimental groups treated daily (from day 1 to day 7 and half hour

before the evaluations), on the first day of evaluation (acute pain), A100 presented activity

after 30 minutes of administration, increasing the PWT by 50% when compared to the control

group (vehicle). After 60 minutes of administration A50 showed an increase of 67% while A200

exhibited an increase in PWT of 82% when compared to the control group (vehicle). At 90

minutes, the three associations did not demonstrate significant effect (Figure 8 A).

77

On the seventh day of evaluation (chronic pain), the association at the three doses

administered were significantly effective since the first evaluation and the baseline value was

elevated due to the daily treatment of the samples. Figure 8 B best illustrates the increase in

PWT with the different treatment times and the respective percentages when compared to the

control (vehicle) group.

0

2

4

6

8

10

Baseline before CFA Acute baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment

A

**50%

Time points - 1 day post CFA injection (acute phase) daily treatment

***99%

**67% **

82%

Paw

wit

hd

raw

al

thre

sh

old

(g

)

0

2

4

6

8

10

Chronic baseline 30 min post-treatment 60 min post-treatment 90 min post-treatment

Time points - 7 days post CFA injection (chronic phase) daily treatment

***92%

B

**

*****69%

80%74%

******

***

****** *** *** ***

***

*** ***

***

82%88%

80%

93%84% 92%92%94%

92%

70%72%

119%

Vehicle

Dexamethasone 5 mg/kg

A50A100

A200

Paw

wit

hd

raw

al

thre

sh

old

(g

)

Figure 8. Effect on mechanical allodynia induced by complete Freund´s adjuvant by the association of the crude

Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil at doses

corresponding to 50% + 50%; 100% + 100% and 200% + 200% of the effective dose of each extract in the

association at the baseline assessment times and after 30, 60 and 90 minutes of the daily treatment. A. Day 1. B.

Day 7. Data expressed by the mean (bars) ± standard error of the mean (vertical lines) (n = 6). Dunnett's test * p

<0.05; ** p <0.01 and *** p <0.001. The values (%) correspond to the mean increase in relation to the control

group (vehicle - saline).

5. Discussion

The World Health Organization has encouraged public investments in medicinal

plants. The world market for herbal medicines generated approximately US $ 27 billion in

78

2014, mainly in Europe, Asia and the United States (Dutra et al., 2016). Many plant

substances, belonging to the most diverse chemical classes, have proven to display anti-

inflammatory activity, such as the anti-inflammatory herbal medicine Acheflan®, a Brazilian

research product that resulted in a product that inhibits inflammatory cytokines and is

indicated for topical use in relieving pain associated with inflammation of muscles and

tendons.

The objective of this study was to evaluate the antinociceptive and / or anti-

inflammatory activity of the association of the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit

dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential oil. With the in vivo

experimental models, the acute toxicity, motor performance, antinociceptive and/or anti-

inflammatory activity and the pharmacological effect of the association through the

construction of the isobologram and the combination index were verified.

In the acute toxicity model, the possible toxic effects of 50, 100 and 500 mg/kg doses of the

association of Pp + Cv in a 1: 1 ratio were observed. Acute toxicity test provided preliminary

information on the toxic nature of the material for which no other toxicological information

was available (Asare et al., 2011). The treatment of the animals with the association of the

extracts showed no toxic effects due to the lack of relevant clinical signs in the hippocratic

screening, as well as the absence of death during the observation period. No changes in body

weight were also recorded during the 14 days of observation, demonstrating that the

association of the extracts at the doses evaluated did not appear to interfere with the

metabolism of the animals. In order to completely rule out the toxicity of the association

Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and Cordia verbenacea (Cv) essential

oil new chronic toxicity tests with repeated doses need to be performed.

To elucidate whether the Pp + Cv association would cause possible changes in the

motor behavior, the evaluation of the locomotor activity was evaluated in the open field test.

In nociception models the behavioral factor is directly involved, so the study of extracts that

interfere with locomotion could produce a false positive result. The open field test showed

that acute oral treatment with the association at 50, 100 and 500 mg/kg doses each, did not

alter the locomotor performance of the animals when compared to the negative control group

(vehicle) while the treatment with the positive control (pentobarbital 35 mg/kg) significantly

reduced the locomotor activity of the animals (Table 2). With this result, the antinociceptive

effects of Pp + Cv association most probably does not have any effect on the locomotor

system, since the doses tested in the open field experiment did not alter the ambulatory and

rearing activities. Once the preliminary safety characterization of the use of extracts in

79

animals was carried out, the tests were continued to characterize the pharmacological actions.

The distinction between nociception and pain is important when using preclinical

murine models. According to the International Association for the Study of Pain (IASP,

2012), nociception is defined as "the neural processes of coding and processing harmful

stimuli," while pain is "an unpleasant sensory and emotional experience associated with a

tissue injury real or potential". Nociception includes the mechanisms by which harmful

stimuli are detected by the peripheral nervous system, encoded, transferred, and

unconsciously treated by the nervous system. Detection can be ensured by specific molecular

transducers supported by nociceptive neurons whose cell bodies are grouped in the dorsal root

or in the trigeminal ganglia. This afferent signal is treated by complex networks within the

dorsal horn of the spinal cord or the equivalent in the brainstem (Todd, 2010; Barrot, 2012).

In contrast, pain is a subjective and a complex experience, with discriminative sensations and

cognitive components. As such, pain is evaluated and quantified by verbal expression, which

is not possible in rodents. Thus, what is commonly referred to as "pain tests" in rodents, are

nociceptive tests (Barrot, 2012). Among the nociception tests, the stimuli used may be

electrical, thermal, mechanical or chemical (Le Bars et al., 2001) and among the different

nociception models are the acetic acid-induced abdominal writhing test used as a screening

tool for the evaluation of analgesic or anti-inflammatory properties of natural or synthetic

compounds (Spindola et al., 2011). This model characterized by stereotypical behavior of

abdominal constriction involves peripheral nociceptive mechanisms. Most importantly is the

release of biogenic amines (e.g., histamine and serotonin), bradykinin, prostaglandin E2 and

PGF2α which activates visceral nociceptors (Duarte et al., 1988).

In this study, the abdominal writhing induced by acetic acid test was chosen as the

screening model to find the effective doses of the extracts. For Pp extract the effective dose

found was 65 mg/kg and for Cv essential oil an effective dose of 165 mg/kg. With the

effective doses defined, a graphical analysis was performed to evaluate the effect of the

association of the extracts through a mathematical model called isobologram.

Isobolographic analysis is an experimental method applied to the pharmacological

determination of drug interactions, being a convenient tool for the detection of

pharmacological interactions as well as understanding the real nature of these interactions,

regardless of their mechanism of action or the nature of the dose-response relationships

(Tallarida, 2001). In fact, this experimental method allows the evaluation of the concomitant

administration of drugs or extracts in effective doses, allowing further extrapolation of the

results to determine the pharmacological effect resulting from the association (Deckers,

80

2000). Therefore, in the present study, this technique was used to determine the nature of

interaction between the crude Pterodon pubescens (Pp) fruit dichloromethane extract and

Cordia verbenacea (Cv) essential oil. After the construction of the graphical analysis where

the theoretical and experimental data from the abdominal writhing induced by acetic acid test

were plotted, the graph showed a convex curve of the association of the extracts,

demonstrating a real synergistic effect for Pp + Cv association, where the ED50 of the

experimentally defined mixtures, in addition to showing an inhibition effect greater than 50%

- approximately 65% to 75% (Figure 2), the doses required for 50% inhibition were lower

than theoretically defined values (Figure 3), whereas the theoretical values were 48.75; 32.5

and 16.25 mg/kg for Pp extract and observing experimental values were 16.48; 13.44 and 8.71

mg/kg, demonstrating that the dose concentrations required for a 50% inhibition in abdominal

writhing were approximately 3 to 2 times lower than the doses presented in the additivity line.

Regarding the combinatorial index found, all the associations demonstrated a synergistic

effect, corroborating with data found through isobologram analysis.

The formalin test is a useful tool not only to evaluate the potential of an analgesic

or anti-inflammatory substance but also to elucidate the mechanism of action (Hunskaar &

Hole 1985, Lenardão et al., 2016). This test has a biphasic response of pain: 1) initial or

neurogenic phase: pain is the result of the direct irritant effect on the nociceptors activating

the primary afferent fibers, resulting in the release of neuropeptides like SP and CGRP in

peripheral terminals and central (Tjolsen et al., 1992). This phase lasts 5 minutes after

formalin injection. At this stage the nociceptive response may be inhibited by administration

of opioid agonists such as morphine and by bradykinin B1 and B2 receptor agonists or

antagonists (Hunskaar et al., 1985, Hunskaar & Hole, 1987; Zhang & Ren, 2011). The second

stage or inflammatory phase is characterized by peripheral sensitization through inflammatory

mediators modulated by the spinal cord and begins after 15 minutes of induction by formalin

and remains during the subsequent 45 minutes (Le Bars et al., 2001; Sayyah et al., 2011) and

involves a period of sensitization of nociceptors by inflammatory mediators (serotonin,

histamine and PGE2) released in response to tissue injury, with the onset of inflammatory

pain (Tjolsen et al., 1992).

The analgesic mechanisms of the association were analyzed in the formalin test.

The extracts separately and the associations at five doses tested did not show significate

reduction of the licking time during the neurogenic phase of the test. In the inflammatory

phase, the extracts separately and the five doses tested from the combination reduced the paw

licking time of the animals when compared to the vehicle. The extracts separately showed an

81

inhibition at licking time around 30 to 38% (Figure 4) while the mixture of the extracts

showed an inhibition of licking time around 50 to 70% (Figure 5), demonstrating more

efficacy when the extracts were in association. The results on the second phase point to a

possible anti-inflammatory effect of the association due to the action on the release of

mediators involved with inflammation, such as prostaglandins, histamine, serotonin and

bradykinin and leukotrienes (Santos et al., 2006; Zhang & Ren, 2011). Furthermore, the

association may be acting as a cyclooxygenase inhibitor, since inhibition only of the second

phase of the formalin test is typical of inhibitors of this enzyme (Rosland et al., 1990).

For the continuity of the tests, the association doses of the extracts that showed

the greatest inhibition of nociception in the models of abdominal writhing induced by acetic

acid test and in the formalin test were chosen. The doses that were chosen corresponded to

50% of the effective dose of each extract in the mixture (32.5 mg/kg Pp + 82.5 mg/kg Cv) –

A50, at 100% of the effective dose of each extract in the mixture (65 mg/kg Pp + 165 mg/kg

Cv) – A100 and 200% of the effective dose of each extract in the mixture (130 mg/kg Pp + 330

mg kg Cv) – A200.

To confirm the possible antinociceptive activity of the association, the tail flick

test that shows a central-medullary action and hot plate, which shows a central-cerebral

action, were performed. Previous studies performed with the ethanolic extract (250 mg/kg

dose) and the dichloromethane crude extract (100-1000 mg/kg dose) of Cordia verbenacea

DC leaves showed no antinociceptive response to nociception models with thermal stimuli

(Bayeux et al., 2002; Roldão et al., 2008). However, these experiments were performed to

analyze if the association of both extracts would be able to produce a positive protective

response against this stimulus.

The tail flick test is one of the oldest nociceptive tests (D'Amour & Smith, 1941)

and results from a spinal reflex (Millan, 2002). The three doses of the association of the

extracts used did not increase the latency time in the tail flick model, however, the positive

control group (morphine 5 mg/kg) showed a significant increase in latency versus thermal

stimulation since the first evaluation (data not shown). With these results, we suggest that the

association Pp + Cv may not demonstrate a central-medullary action.

The hot plate test is a central model, valid for drugs derived from opioids

(Morucci et al., 2012) and is characterized by supraspinal responses through two behavioral

components: paw licking and jumping. Paw licking is suppressed by opioid analgesics,

whereas jumping can be inhibited by less potent analgesics such as acetylsalicylic acid or

paracetamol (Le Bars et al., 2001). According to the results observed, morphine was very

82

active increasing latency time to thermal stimulus, whereas the three doses of the association

did not alter the response time when compared to the vehicle group suggesting that the

antinociceptive effect of the association is not mediated by supraspinal mechanisms. The data

corroborate results found in the first phase of the formalin test, where the association of the

extracts did not demonstrate activity in the neurogenic phase of the model.

Carrageenan-induced paw edema, originally described by Winter et al. in 1962, is

one of the most widely used and highly reproducible models of inflammation for the

screening of novel anti-inflammatory drugs (Vazquez et al., 2015). The inflammatory edema

induced by the injection of carrageenan is the result of sequential and integrated action of

several inflammatory mediators, describing three phases. In the first two hours of

carrageenan-induced paw edema, histamine, serotonin, substance P and bradykinin are

released. In the second stage, which extends from the first or second hour to the sixth hour,

the edematogenic effect is attributed to the elevation of prostaglandin production and

activation of cyclooxygenase-2, in addition to neutrophil migration. In the last phase,

inflammatory mediation depends mainly on the production of cytokines, such as TNF-α, IL-

1α and IL-1β, IL-6 (Iwata et al., 2010; Zhang & Ren, 2011). Our results demonstrated that the

association at the three doses tested was able to significantly inhibit carrageenan-induced

edema from the sixth hour of evaluation, suppressing the acute inflammation, and prolonging

this activity until the 48th hour of paw volume measurement, similar to the effect produced by

the control positive - dexamethasone. These results suggest that the association might act in

the production of inflammatory mediators, due to the significant effect observed in the second

and third stage of the carrageenan-induced paw edema model.

PGE2 is one of the main products of arachidonic acid through the metabolism

of cyclooxygenase (COX) in the response of inflammation and plays a vital role in

inflammation (Blatteis et al., 2005). In this work we explored the possible involvement of this

inflammatory mediator by the paw edema induced by PGE2 test. Therefore, the blockade of

PGE2 receptors is another approach for the development of drugs or alternative therapies for

pain and inflammation (Spindola et al., 2017). Our results demonstrated an inhibition at 15

and 30 minutes after administration of PGE2 with all doses, suggesting the inhibition of this

pathway is also involved in the anti-inflammatory effect of the association. A stronger

significant inhibition with the lowest dose at all evaluated times suggesting a non-dose-

dependent inhibition was also observed.

As the association inhibited the second phase of carrageenan-induced

inflammation (Table 6), we performed the carrageenan-induced peritonitis model to evaluate

83

activity on leukocyte migration. Carrageenan-induced peritonitis is largely employed to test

novel anti-inflammatory therapies, as this allows the evaluation of cellular recruitment, as

well as changes in other inflammatory parameters such as vascular permeability and

cytokine production (Okoye et al., 2013). Concomitantly, exerts a chemotactic effect on

inflammatory cells mediated by a synergistic action between prostaglandins, leukotrienes and

other chemotactic agents (Damasceno et al., 2014). In the carrageenan-induced peritonitis

model, leukocytes migration in the vehicle group was 14.15 ± 2.90 x 106 cells/ml and cell

migration was inhibited by dexamethasone in 75%. The association at the three doses tested

did not inhibit significantly the leukocytes migration in the peritoneal cavity, suggesting that

anti-inflammatory activities of the association are not related to cell recruitment.

Persistent nociception caused by intraplantar administration of CFA is a widely

used nociception model. This is a model of inflammatory pain that has similarity to human

chronic diseases such as rheumatoid arthritis and as severe inflammation in joints (Tjolsen &

Hole, 1997). CFA administration produces a local inflammatory reaction characterized by

erythema, increased local temperature, edema, plasma entrapment, infiltration of

inflammatory cells and the production of inflammatory mediators such as cytokines and

eicosanoids (Ganju et al., 2001). As a result, an injection of CFA causes hyperalgesia and

allodynia, which is mediated by local nociceptor sensitization and by systemic neural and

immune mechanisms (Samad et al., 2004). Mechanical allodynia measure is one of the most

useful method for mimicking clinical conditions with enhanced cutaneous sensitivity such

as neuropathic pain, postoperative pain and inflammation (Gregory et al., 2013). The

evaluation of inflammatory pain at the acute and chronic phase was assessed by the

mechanical allodynia induced by Complete Freund´s Adjuvant (CFA) test. In this study, we

evaluated the associations at two different treatments: one experimental set that received

treatment on the acute and chronic phase evaluation days and another set that received daily

treatment during the seven days of the test. Our results showed that the associations were

effective with this model, showing an increase at the PWT (paw withdrawal threshold), at

acute phase and more effective at chronic phase. The results was more interesting for the

group treated daily, at seventh day of evaluation, where the chronic baseline showed a PWT

greater than 70%, demonstrating that the daily treatment significantly reduced the sensitivity

induced by CFA and with the last treatment, displayed values close to or greater than the

positive control, dexamethasone. According to Burstein et al. (2010), an antinociceptive effect

in the CFA model, occurs by inhibiting the synthesis of proinflammatory mediators, such as

cyclooxygenase 2, interleukin 1β and nitric oxide synthase, via inhibition of nuclear factor k.

84

Authors have also pointed PGE2 as the major mediator responsible for the mechanical

hypersensitivity (Wang et al., 2007). The significantly inhibited chronic inflammation

suggested the association to have a role in the inhibition of proinflammatory mediators and at

PGE2 pathway.

The antinociceptive and anti-inflammatory effects of association of crude


oil of Cordia verbenacea DC (Cv) is related to the chemical composition of the plant extract.

Indeed the phytochemical analysis, the association showed an important concentration of

Trans-caryophyllene and α-Humulene. Previous studies suggested some mechanisms of

actions of both compounds (50 mg/kg) via platelet activating factor, bradykinin, prostaglandin

E2 (PGE2), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase (COX-2) expression in

in vivo experiments. α-Humulene has a relationship with edema formation caused by

histamine injection, prevented tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β)

generation whereas (−)-trans-caryophyllene decrease only TNFα release (Fernandes et al.,

2007). Cordia verbenacea essential oil (300–600 mg/kg) has relationship with carrageenan-

induced rat paw edema reduction, myeloperoxidase activity and the mouse edema elicited by

carrageenan, bradykinin, substance P, histamine and platelet-activating factor. The essential

oil significantly decreased TNF-α, without affecting IL-1β production, in carrageenan-

injected rat paws (Passos et al., 2007).

Regarding the compounds present in Pterodon pubescens extract previous studies

from our group suggested some mechanisms of actions. Geranylgeraniol (30 mg/kg) has

relationship with 5-HT3 serotonin receptors and imidazoline I1 receptors. Compound m/z 362

(30 mg/kg) is probably involved with the synthesis or release of serotonin and both

compounds reduce response in the writhing, capsaicin, glutamate and hot-plate tests, with

relationship to vanilloid receptors VR1, and/or glutamate peripheral receptors (Spindola et al.,

2010, Spindola et al., 2011). Compound 404 demonstrated more efficacy on the neurogenic

pain then inflammatory pain of formalin test, suggesting an action related to both central and

peripheral mechanisms (Servat et al., 2012). These studies also suggest that compounds

within the crude Pterodon pubescens Benth. extract may exert a synergistic interactive effect,

since the crude extract (300 mg/kg) containing lower concentrations of geranylgeraniol (34.6

mg/kg) and m/z 362 (4.7 mg/kg) gave statistically the same effect to the pure compounds

when tested separately (300 mg/kg) in writhing experimental model (Spindola et al., 2011).

In the present study, the associations were tested at lower doses and consequently lower

concentrations of active compounds than those tested in these previous studies (Table 5),

85

however, they showed significant effects, especially on inflammatory pain, suggesting a

synergistic effect.

The concept of combination therapy is based on synergistic or additive potential

of two or more drugs to improve therapeutic efficacy (World Health Organization, 2015).

Synergism is a type of pharmacological response obtained from the association of two or

more drugs, which result is greater than the simple sum of the isolated effects of each. Two or

more drugs may be administered in combination primarily to increase efficacy, reduce

individual dosages and possible side effects of each (Ulrich-Merzenich, 2014). Our results

points for a possible synergism between the active compounds at the associations, probably

acting in different pharmacological receptors as studies previously report.

6. Conclusion

The results presented herein demonstrate that the association of crude


oil of Cordia verbenacea DC (Cv) promote synergistic antinociceptive and anti-inflammatory

activities, at lower doses than the separate crude extracts, without demonstrating side effects.

The significantly inhibited inflammation suggested the association to have a role in the

inhibition of inflammatory mediators and at PGE2 pathway. Our results points for a possible

synergism between the active compounds at the associations, probably acting in different

pharmacological receptors. Nevertheless, further studies will be necessary to understand the

mechanisms of action underlying the effects of the association.

7. Acknowledgements

We would like to thank to Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e

Tecnológico (CNPq) for financial support and Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de

São Paulo (FAPESP) for grant support and fellowship to RTB (#2013/15709-5; #2015/08600-

2).

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93

6.2. Capítulo 2

Pterodon pubescens and Cordia verbenacea: evaluation of the association

and their active compounds in in vitro wound healing and anti-

inflammatory assays

Artigo em redação para submissão à revista Planta Medica

94

Abstract:

Pterodon pubescens Benth. (sucupira) and Cordia verbenacea DC leaves are

popularly used due to their anti-rheumatic, anti-inflammatory and analgesic actions. In this

study, wound-healing effects of the extracts, association of extracts and their active

compounds (isomers 6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester and 6α-

acetoxy-7β-hydroxy-vouacapan-17β-oate methyl ester – m/z 404 – C1 and α-Humulene) were

investigated in immortalized human keratinocytes for the first time. As vascular endothelial

growth factor (VEGF) and Interleukin 8 (IL-8) are important angiogenic factors involved in

skin inflammation, we evaluated the extracts and compounds in HaCaT cells stimulated

with the proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor alpha (TNF-α).

For evaluation of the wound gap, a time-lapse microscopy was used. It was shown

that Pterodon pubescens extract (Pp) and Cordia verbenacea essential oil (Cv) exerted

inhibitory effects on cell migration at all tested concentrations (3.125; 6.25 and 12.5 μg/mL)

without affecting cell viability. Their association exerted inhibitory effects on cell migration

at 3.125 and 12.5 μg/mL. For the intermediary concentration (6.25 μg/mL), the cell migration

was significantly higher, at t=24 h, a gap closure of 56.2 % was reached. The C1 exerted

inhibitory effects on cell migration at higher concentrations (12.5 and 25 μM). In lower

concentration (6.25 μM), the wound clousure was significantly higher, at t=24 h, a gap

closure of 71.8 % was reached. The compound α-Humulene improved wound clousure at all

concentrations tested (at t= 24 h: 56.5% for 6.25 μM and 69.5 % for 12.5 μM), and a higher

effect at 25 μM, approximately 88% gap closure after 24 h.

In the TNF-α-stimulated cells, Pp and Cv increased VEGF production in HaCaT

cells concentration-dependently. Association at the higher concentration increased the levels

of VEGF, while the lower concentrations had no effect. C1 increased the levels of VEGF in

higher concentrations, while the lowest concentration had no effect. α-Humulene significantly

decreased the levels of VEGF at the lowest concentration, but significantly increased the

levels of VEGF in higher concentrations. All the different treatments reduced levels of

interleukin 8 in tumor necrosis factor alpha-α-treated immortalized human keratinocytes cells.

In conclusion, Pp, Cv and their association significantly inhibited the proliferation and

migration of human keratinocytes in vitro. C1 also presented antiproliferative and inhibited

migration of HaCaT cells in higher concentrations. Thus, these compounds would have

potential as a local treatment against hyper proliferation-involved skin diseases, for example.

We therefore suggest that α-Humulene might have a dual activity – in higher

concentrations (12.5 and 25 µM) the compound show an anti-inflammatory and angiogenic

95

effect, while in lower concentrations (6.25 µM), exert anti-angiogenic activity by inhibiting

migration, possibly by prevention of VEGF secretion. Finally, treatment with α-Humulene

may be a potential therapeutic strategy to promote wound healing and to prevent

inflammation in a persistent inflammatory condition.

Keywords: Pterodon pubescens Benth.; Cordia verbenacea DC; synergism; wound healing;

anti-inflammatory; time-lapse microscopy

1. Introduction

Wounds are defined as physical injuries that result in an opening or break of the

skin that causes a disturbance in the normal skin anatomy and function (Strodtbeek, 2001).

Normal wound healing is a dynamic series of events involving the coordinated interaction of

blood cells, proteins, proteases, growth factors and extracellular matrix components and are

divided into three phases: inflammatory, proliferative and remodeling (Sinno & Prakash,

2013).

Progression of the inflammatory phase leads to the recruitment of leukocytes,

neutrophils and macrophages, as the production of growth factors and the activation of dermal

and epidermal cells (Demidova-Rice et al., 2013). It is highly regulated and depends upon

proinflammatory mechanisms, which are gradually neutralized by various anti-inflammatory

pathways mediated by factors like interleukin 10 (IL-10), hormones, and neurotransmitters

(Singer & Clark, 1999).

As the inflammatory phase subsides, the proliferative phase of repair begins. At this stage,

growth factors produced by remaining inflammatory cells and migrating epidermal and

dermal cells act to induce and maintain cellular proliferation while initiating cellular

migration and stimulation of keratinocytes, fibroblasts and angiogenesis. Epithelial cells

replace dead cells, while fibroblasts are responsible for the production of collagen,

fibronectin, hyaluronan, glycosaminoglycans, and proteoglycans, which are the major

constituents of the extracellular matrix and confer strength to the skin (Boateng et al., 2008;

Enoch & Leaper, 2007). These events are important for the formation of granulation tissue

while supporting epithelialization (Hart et al., 2012; Pereira & Bártolo, 2016).

As inflammation resolves and the number of leukocytes diminishes, the wound

undergoes a lengthy period of remodeling of the tissue´s architecture and resolution (Gurtner

et al., 2008; Koh & DiPietro, 2011). Completion of the proliferative phase of wound healing

leads to formation of extracellular matrix-rich and vascularized granulation tissue. Maturation

of the keratinocytes leads to a restoration of the epitheliumʼs barrier function (Gurtner et al.,

96

2008).

Vascular endothelial growth factor (VEGF) and interleukin 8 (IL-8) have

important participation in terms of wound healing and its production can be stimulated by the

presence of TNF-α (Wedler et al., 2014).

VEGF is one of the most potent angiogenic growth factors and promotes all steps

in the angiogenic cascade (Brown et al., 2002). Besides being related to angiogenesis, it is

also involved in inflammation, which is closely integrated processes in a number of

physiological and pathological conditions, including psoriasis, rheumatoid arthritis,

arteriosclerosis, and tumor (Presta et al., 2009).

IL-8 is a potent chemotactic factor that attracts neutrophils, basophils and T-cells during the

inflammatory process (Schmidt et al., 1996).

Cells in unhealed wounds constantly produce inflammatory mediators in an uncoordinated

and self-sustaining phase of inflammation that impairs the restoration of anatomic and

functional integrity in the normal period of time (Heinlin et al., 2010; Prantl et al., 2010)

delaying the last objective of the wound healing process, that is the regeneration of the injured

skin without scar formation.

Natural compounds have been used in skin wound care for many years due to

their therapeutic activities, including anti-inflammatory, antimicrobial, and cell-stimulating

properties. The clinical efficacy of these compounds has been investigated through in

vitro and in vivo trials (Pereira & Bártolo, 2016).

Cordia verbenacea DC (Cv), a synonym of Varronia verbenacea (DC) Borhidi

(Trópicos, 2017), is a perennial shrub native to the Atlantic Forest, belonging to the botanical

family Boraginaceae, popularly known as erva baleeira. The leaves are popularly used for

their anti-inflammatory, antimicrobial, anti-rheumatic and healing activities (Michielin et al.,

2009; Dutra et al., 2016). Among the different components found in the essential oil, there is

a main compound with important anti-inflammatory and anti-edematogenic activity, α-

Humulene (Passos et al., 2006) (Figure 1).

Figure 1. Chemical structure of α-Humulene

The plant species Pterodon pubescens Benth. (Pp), a botanical synonym of

97

Pterodon emarginatus Vog., is a tree belonging to the family Leguminosae-Papillonoideae,

popularly known as sucupira, used for the treatment of rheumatism, sore throats, as well as

its use as an anti-inflammatory and analgesic (Dutra et al., 2016). In the literature, a number

of reported pharmacological activities of this species have been described: antinociceptive,

anti-inflammatory, anti-edematogenic, anti-arthritic and other activities (Calixto et al., 2007;

Spindola et al., 2011; Nucci-Martins et al., 2015). Some authors have suggested that

furanoditerpenes possessing vouacapan skeleton (isomers 6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-

17β-oate methyl ester and 6α-acetoxy-7β-hydroxy-vouacapan-17β-oate methyl ester – m/z

404 – C1) are involved with the anti-inflammatory and antinociceptive properties of Pterodon

pubescens fruit crude extract (Servat et.al, 2012) (Figure 2).

Figure 2. Compounds identified with antinociceptive and anti-inflammatory activity isolated from the fruits of

Pterodon pubescens Benth (isomers m/z 404 – C1).

In previous study, the association of both extracts showed a synergic effect and

interesting activities as anti-inflammatory. The word synergy is derived from the Greek word

synergo'z, which means "working together" and its search in the field of pharmacology refer

to the elucidation and quantification of the action of drugs administered in combination

(Sucher, 2014). The best efficacy of combinations of compounds or extracts can be

understood that the synergistic effects are multi-target where the association acts not only on a

single target but on several targets and thus cooperates in a synergistic manner (Ulrich-

Merzenich, 2014).

Bearing in mind the promising anti-inflammatory activities of association of

Pterodon pubescens Benth (Pp) and Cordia verbenacea DC (Cv) as previous report, the aim

of this study was to investigate the effect of the Association of both extracts on cell migration

assays and anti-inflammatory potential (VEGF and IL-8) in comparison to the separate

extracts and their major isolated compounds, α-Humulene and compound m/z 404 (C1).

O

R

R

1

2

3 45

67

8

9

10

1112

13

14

15

17

18

O

OH

O

O

R

O

OHOH

OH

OH

O

OH

OH

CO2CH3

O

OAc

OH

O

OH

OAc

CO2CH3

O

OAc

OH

CO2CH3

O

OH

OH

CH2OH

6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester

6α-acetoxy-7β-hydroxy-vouacapan-17β-oate methyl ester

98

2. Material and Methods

2.1. Plant material and extraction

Fruits of Pterodon pubescens Benth were collected from Ponto Chique (MG –

Brazil - coordinates 16 ° 38'23.3 "S 45 ° 03'54.0 " W). The dried specimen was deposited at

the Herbarium of the University of Campinas (Unicamp) under number 179739.

Leaves of Cordia verbenacea DC were collected in CPQBA – Unicamp experimental field

(Multidisciplinary Center for Chemical, Biological and Agricultural Researches – Paulínia –

SP - Brazil). The dried specimen was deposited at Herbarium of the University of Campinas

(Unicamp) under number 112744. The plant materials received authorization to use the

Brazilian genetic resources under number 010829/2014-8.

The extraction process of Pterodon pubescens Benth fruits was carried out in

stainless steel tank with mechanical stirring using dichloromethane as liquid extractor. The

fruits were ground with dry ice to increase the contact surface providing a higher extraction

yield. The plant material (kg) by volume of organic solvent (l) ratio was a 1: 3 by performing

three extractions of 1.5 hours each, a total of 4.5 hours (3 times 1.5 h) at room temperature

renewing the solvent at each step. The partial extracts were filtered, combined and

concentrated under vacuum by rotary evaporation system at 40°C (Büchi RE 120). The

extract was stored in amber bottle and stored at room temperature. Cordia verbenacea DC

leaves’ essential oil was obtained by steam distillation technique, carried out during a 1.5 to 2

hours period. Therefore, crushed fresh leaves were used in stainless steel vat with capacity for

1500 l. The oil was separated from the water initially in the annex to the florentine vase vat

and afterwards in a separating funnel, followed by the use of anhydrous sodium sulfate to

remove residual traces of water. The oil was stored in a freezer until use.

2.1.2. Isolation of voucapan

The isomers voucapan 6α-hydroxy-7β-acetoxy-vouacapan-17β-oate methyl ester

and 6α-acetoxy-7β-hydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 404) and 6α,7β-

dihydroxyvouacapan-17β-oate methyl ester (m/z 362) from crude dichloromethane extract

from the fruits of Pterodon pubescens Benth. were isolated by column chromatography (25 x

500 mm), using solvent gradient of hexane and ethylacetate as previously described (Spindola

et al., 2009). The purified compounds of data were compared to previously identified

compounds by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) and Mass Spectrometry (MS).

2.1.3. GC–MS analysis

The GC–MS (Gas chromatography–mass spectrometry) analysis was carried out

with an Agilent 5975 GC–MS system. HP5 column (30 m × 0.25 mm, 0.25 μm film

99

thickness) was used with helium as carrier gas (1.0 ml/min). GC oven temperature was kept at

60 °C for 3 minutes and programmed to 240 °C at a rate of 3 °C/ min, and kept constant at

240 °C for 5 minutes and then programmed to 240 °C at a rate of 1 °C/min. Split ratio was

adjusted at 40:1. The injector temperature was set at 250 °C. Mass spectra were recorded at 70

eV. Mass range was from m/z 100 to 600.

2.1.4. GC analysis essential oil quantification

The GC (Gas chromatography) analysis was carried out using an Agilent 6890N

GC system. FID (Flame ionization detector) temperature was 250 °C. To obtain the same

elution order with GC–MS, simultaneous auto-injection was done on a duplicate of the same

column applying the same operational conditions. Quantifications were accomplished using

analytical standard α-Humulene, trans-Caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich

Saint Louis USA).

2.1.5. HPLC analysis voucapan compounds

The HPLC-DAD system (Shimadzu) consisted of C18 reverse phase column

(Gemini -C18 250 mm × 4.6 mm x 5µm) with 10 µL sample inject. The mobile phase was a

mixture of 70:30 Acetronitrile: water with 0.1% acetic acid (v:v). The flow rate and UV

wave-length were set at 1 mL/min and 220 nm, respectively.

2.2. In vitro experiments

2.2.1. Cell culture

Human non-tumorigenic HaCaT keratinocytes (Cell Line Services, Eppelheim,

Germany) were maintained in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) high glucose

1× supplemented with 1% (v/v) Penicillin 10.000 U/mL/Streptomycin 10.000 μg/mL and 10%

(v/v) heat inactivated fetal bovine serum (FBS) at 37 °C in a humidified atmosphere

containing 5% CO2. Experiments were conducted at approximately 80–90% confluence and

carried out between passages 43 and 52.

2.2.2. ATP Assay

The CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability assay was carried out according

to the manufacture´s protocol. The following alterations were made: cells were grown in a

transparent, sterile 96-well plate at a density of 2.5 x 105 cells/mL. After an incubation period

of 24 h (37º C, 5% CO2), cells were washed with PBS, subsequently treated accordingly with

100 μL solution and incubated for another 24 h. The following concentrations of the extracts

and compounds were tested: for the separated extracts Pp, Cv and Association (Pp + Cv -

ratio ½ : ½) 50; 25; 15; 10; 5; 1 and 0.5 μg/mL and for the isolated compounds 50; 25; 12.5;

6.25; 3.125; 1.5625 and 0.78125 μM. 100 μL of CellTiter-Glo® reagent was then added to

100

each well resulting in a 1:1 dilution. The sample plates were agitated for 2 minutes by an

orbital shaker and incubated for 10 minutes at room temperature. 100 μL of each well was

then transferred to a white, opaque sterile 96-well plate and immediately read by a microplate

reader (SpectraMAX L, Molecular Devices).

2.2.3. Cell proliferation assay

The assay was conducted according to the manufacture´s protocol. 100 μL of a

HaCaT cells suspension was seeded into sterile 96-well plates at a concentration of 2.5 × 105

cells/mL. After an incubation time of 24 h (37°C, 5% CO2), the medium containing 10% FBS

was discarded and the plate was washed with 200 μL/well PBS. Pterodon pubescens Benth.

(Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) and the Association (Pp + Cv - A - ratio ½ : ½) were tested

in concentrations of 25; 12.5; 6.25; 3.125 and 1.5625 μg/mL and the isolated compounds were

tested in concentrations of 50; 25; 12.5; 6.25 and 3.125 µM, respectively. After incubation

period of 24 h with the samples, BrdU reagent (10 μM, 10 μL) was added into all wells except

the unstained control. After discarding the medium, 200 μL of a fixing/denaturing solution

was added and incubated for another 30 minutes. Subsequently, the liquid was exchanged by

the primary anti-BrdU monoclonal antibody and incubated for 1 hour. Subsequently, the

unbound antibody was washed off and horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse

IgG was added, which binds to the detector antibody. Finally, 50 µL of 3,3´,5,5´´-

tetramethylbenzidine (TMB) substrate were added and converted by the peroxidase conjugate

and the reaction was stopped by 2.5 N sulfuric acid stop solution before the plate was read at a

wavelength of 450 nm using a plate reader (Spectramax i3x Multimode detection plataform,

Molecular Devices).

2.2.4. Cell migration assay (wound-healing scratch assay)

After positioning the cell culture inserts in the 12-well dishes, the HaCaT cells

were inoculated in a concentration of 2.5 × 105 cells/mL into the wells. After an incubation

time of 24 hours, the cells reached confluence, and the inserts were removed causing a gap of

450 μm. The wells were washed with 1 mL PBS, aspirated and the wells were charged with 1

mL of the test extracts, association and compounds.

The wells were charged with the test compounds accordingly to the different

concentrations. The extracts, association and isolated compounds were dissolved in DMEM

containing 0.1% DMSO. DMEM supplemented with 2% FBS was used as a positive control

and 0% FBS + 0.1% DMSO (DMEM without supplements) was used as a control. Long-term,

time-lapse imaging was performed using the Olympus IX83 automated inverted microscope

platform for live cell imaging. The image magnification was adjusted to 10×. The pictures of

101

five specific moments at 0, 6, 12, 18, and 24 h after the addition of the treatment were

analyzed by using the Olympus software package cellSens Dimension 1.81®. To calculate the

size of the gaps over time, post-analysis of the snapshots were conducted by utilizing the

software Image J including the wound healing tool macro© and the area of the cell-free gap

was measured based on the number of pixels. Therefore, detected spaces were converted into

percentages; 0% refers to no movement of cells and 100% depicts a total gap closure.

Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) and the Association (A “Pp +

Cv - A - ratio ½ : ½”) were tested in concentrations of 12.5; 6.25 and 3.125 μg/mL and the

compounds were tested in concentrations of 25; 12.5 and 6.25 µM, respectively.

2.2.5. Anti-inflammatory activity

The experimental setup including the TNF-αconcentration was chosen according

to Park et al. 2010, with some modifications. For unstimulated samples, cells were seeded

into 12-well plates at a density of 2.5 × 105 cells/mL. After an incubation time of 24 h (37°C,

5% CO2), DMEM was discarded and the cells were washed with 1 mL/well PBS and samples

were added as following: Pterodon pubescens Benth. (Pp), Cordia verbenacea DC (Cv) and

the Association (Pp + Cv - A - ratio ½ : ½) in concentrations of 12.5; 6.25 and 3.125 μg/mL

and the isolated compounds in concentrations of 25; 12.5 and 6.25 µM, respectively.

Hydrocortisone (10 µM) and LY294002 (10 µM) were used as control. To assess the basal

secretion of VEGF or IL-8 in keratinocytes, DMEM with 0% FBS was applied as a control. In

contrast, all wells of the stimulated cells were supplemented with TNF-α 20 ng/mL and

substances accordingly and incubated for 24 h. Supernatants were stored in sterile

microcentrifuge tubes and deep-frozen (− 20°C) immediately. The VEGF and IL-8 Enzyme

Linked ImmunonoSorbent Assay (ELISA) were exerted according to manufacturersʼ

instructions (PeproTech®). Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader

(SpectraMax M2e).

2.3. Data analysis

Data are shown as the mean ± SD. All experiments were performed at a minimum

in triplicate. Statistical analysis of the data was carried out by one-way analysis of variance

(ANOVA) followed by Dunnettʼs multiple comparison test using the software package

GraphPad Prism (version 6.01, GraphPad Software, Inc.). In all cases, differences were

considered significant if p < 0.05.

3. Results

3.1. Plant extraction

For the crude dichloromethane Pterodon pubescens fruits extract 1500 g of

102

ground fruits were placed in a stainless steel tank with mechanical stirring. The extraction

process provided approximately 675 g, representing 45% yield.

Cordia verbenacea DC essential oil was obtained by means of the steam

distillation technique for 1 ½ to 2 hours, using crushed fresh leaves using a stainless steel set

containing 1500 L capacity providing the essential oil in 0.34% yield.

3.2. Phytochemical analysis

Quantifications were accomplished using analytical standard α-Humulene, trans-

Caryophyllene and geranylgeraniol (Sigma Aldrich Saint Louis USA). The peak area

calculated from HPLC chromatograms was correlated linearly with compound m/z 404

concentrations in the range of 17–2180 µg/mL (R2= 0.999) and compound m/z 362 range of

8.7-1117 µg/mL (R2= 0.999). The peak area calculated from FID chromatograms was

correlated linearly with α-Humulene concentrations in the range of 15–1000 µg/mL (R2=

0.9996), trans-Caryophyllene 20-1300 µg/mL (R²=0.9971) and geranylgeraniol 19-1230

µg/mL (R²=0.9995). The percentage amounts of the separated compounds were calculated in

samples test (Table 1).

Table 1. Percentage amounts of active compounds present at crude Pterodon pubescens fruits extract and Cordia

verbenacea DC essential oil

Extract

trans-

Caryophyllene

(% w/w)

α-Humulene

(% w/w)

Geranylgeraniol (%

w/w)

Voucapane

362

(% w/w)

Voucapane

404

(% w/w)

P. pubescens extract 4.54 ±0.51 0.64 ±0.04 0.21 ±0.01 6.55 ± 0.83 14.61 ± 1.25

C. verbenacea

essential oil 4.03 ±0.08 1.23 ±0.03 0.12 ±0.01 - -

3.3. ATP Assay

All the extracts and compounds tested did not show a significant effect on cell

viability compared to the untreated control (Figure 3).

103

0

25

50

75

100

125

150

Control 0.5 1 5 10 15 25 50

Pterodon pubescens [µg/mL]

Ce

ll V

iab

ility

[%

of

co

ntr

ol]

0

25

50

75

100

125

150

Control 0.5 1 5 10 15 25 50

Cordia verbenacea [µg/mL]

Ce

ll V

iab

ility

[%

of

co

ntr

ol]

0

25

50

75

100

125

150

Control 0.5 1 5 10 15 25 50

Association [µg/mL]

Ce

ll V

iab

ility

[%

of

co

ntr

ol]

0

25

50

75

100

125

150

Control 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50

C1 [µM]

Ce

ll V

iab

ility

[%

of

co

ntr

ol]

0

25

50

75

100

125

150

Control 0.78 1.56 3.12 6.25 12.5 25 50

-Humulene [µM]

Ce

ll V

iab

ility

[%

of

co

ntr

ol]

Figure 3. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1 (D) and α-Humulene

(E) on the cellular ATP level. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates.

3.4. Cell proliferation assay

In this study, proliferative effects of the samples were examined on HaCaT cell

line at five concentrations (1.5625, 3.125, 6.25, 12.5 and 25 μg/mL for the extracts and

Association and 3.125, 6.25, 12.5, 25 and 50 µM for the isolated compounds). The

proliferation rate of keratinocytes was determined using the BrdU assay. Proliferation in

HaCaT cells decreased with the concentrations tested of Pp. At a concentration of 25 μg/mL,

A B

C D

E

104

BrdU incorporation was inhibited by approximately 40%. For Cv, proliferation decreased

from the concentration of 3.125 μg/mL. At a concentration of 25 μg/mL, BrdU incorporation

was inhibited by 35%. Association and C1 decreased proliferation for all concentrations

tested. α-Humulene in lower concentrations (3.125 – 6.25 µM) did not significantly decreased

proliferation. In higher concentrations (12.5 – 50 µM), BrdU incorporation was inhibited by

approximately 50% (Figure 4).

0

20

40

60

80

100

120

Control 1.5625 3.125 6.25 12.5 25

***

***

*** ***

***

Pterodon pubescens [µg/mL]

Brd

U in

co

rpo

ratio

n [

% o

f co

ntr

ol]

0

20

40

60

80

100

120

Control 1.5625 3.125 6.25 12.5 25

***

******

***

Cordia verbenacea [µg/mL]

Brd

U in

co

rpo

ratio

n [

% o

f co

ntr

ol]

0

20

40

60

80

100

120

Control 1.5625 3.125 6.25 12.5 25

******

****** ***

Association [µg/mL]

Brd

U in

co

rpo

ratio

n [

% o

f co

ntr

ol]

0

20

40

60

80

100

120

Control 3.125 6.25 12.5 25 50

*** ******

******

C1 [µM]

Brd

U in

co

rpo

ratio

n [

% o

f co

ntr

ol]

0

20

40

60

80

100

120

Control 3.125 6.25 12.5 25 50

** ** **

-Humulene [µM]

Brd

U in

co

rpo

ratio

n [

% o

f co

ntr

ol]

Figure 4. BrdU incorporation in de novo synthesized cellular DNA by Pterodon pubescens extract (A), Cordia

verbenacea essential oil (B), Association (C), C1 (D) and α-Humulene (E). DMSO 0.1% was used as a control

group. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates; ** p < 0.01, and *** p < 0.001 vs. untreated

control.

A B

C D

E

105

3.5. Cell migration assay (wound-healing scratch assay)

The effects of extracts, association and compounds on the migration of HaCaT

cells were tested in an in vitro wound-healing model, in which a gap in the cell layer had been

created by placing silicone inserts into 12-well plates. The migration process started with the

removal of the inserts. Cell migration was observed for 24 h, and pictures were taken every 30

min. For better data presentation, the 24-h observation period was divided into five time

points (0, 6, 12, 18, and 24 h) and described below separated by each sample tested. All the

figures showed representative images and gap closure values only from a single experiment.

All values presented in graphics are the results of triplicates and are presented as the mean ±

SD.

DMEM supplemented with 2% FBS was used as a positive control, because it

provides a mixture of most factors needed for cell proliferation and maintenance such as

growth factors, hormones, trace elements, lipids, and attachment and spreading factors. The

addition of 2% FBS to the medium significantly increased cell migration over a period of 18 h

resulting in a 89.4 ± 9.8% gap closure and for a period of 24 h gap closure were 98.7 ± 1.0%

(Figure 5).

A clear difference was observed between cells treat with DMEM + 2% FBS and

DMEM + 0.1% DMSO without any supplementation. The non-supplemented control, at t=18

h, a gap closure of 28.4 ± 1.3% was reached and for t= 24 h, were 43.8 ± 3.5% closed (Figure

5).

LY294002, a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor and the strongest among the

references in terms of inhibition of cell migration, was used as a negative control. At t=24 h, a

gap closure of 5.9 ± 0.3% was reached.

106

0 h 6 h 12 h 18 h 24 h

2%

FBS

0 %

34%

88%

100%

100%

0.1

%

D

M

S

O

0 %

10%

20%

30%

43%

LY

29

400

2 1

0 µ

M

0%

0%

0%

3%

6%

Figure 5. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval snapshots

of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and 24 h of a

representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive control (2%

FCS) and LY294002 (10 μM).

0

20

40

60

80

100

2% FBS 10 M

6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24

Incubation time [h]

0.1% DMSO

LY294002

***

***

***

***

Ga

p c

losu

re (

%)

Figure 6. Time-lapse microscopy was performed as described above and snapshots were taken every hour

during 12 h, whereof values for statistical calculation were used from images at t = 0, 6, 12, 18, and 24 h. Gap

size was calculated by using Image J software including the wound healing tool macro. Detected spaces were

converted into percentages; 0% refers to no movement of cells (open gap), 100% depicts a total gap closure.

Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. untreated

group 0.1% DMSO.

107

3.5.1. Pterodon pubescens

Pterodon pubescens crude extract exerted inhibitory effects on cell migration at

all tested concentrations (at t= 24 h: 25.2 ± 2.9% for 3.125 μg/mL, 21.4 ± 6.8% for 6.25

μg/mL and 41.3 ± 2.5% for 12.5 μg/mL) in comparison to the untreated control (at t=24 h

43.8 ± 3.5%).

0 h 6 h 12 h 18 h 24 h

3,12

5

µg/

mL

0%

4%

10%

21%

28%

6,25

µg/

mL

0%

4%

8%

16%

28%

12,5

µg/

mL

0%

10%

14%

27%

41%




FCS) and Pterodon pubescens extract (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL).

However, multiple post hoc comparisons between groups revealed a significant

difference between the 12.5 μg/mL and 3.125 and 6.25 μg/mL of Pterodon pubescens groups

(p < 0.01), indicating a weaker cell migration inhibitory effect in higher concentrations.

108

0

20

40

60

80

100

2% FBS 3.125 g/mL 6.25 g/mL 12.5 g/mL

6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24

Incubation time [h]

0.1% DMSO

Pterodon pubescens

***

***

***

***

#

#

#

Ga

p c

losu

re (

%)






group 0.1% DMSO. #p < 0.1 vs. 3.125 and 6.25 µg/mL Pterodon pubescens extract.

3.5.2. Cordia verbenacea

Cordia verbenacea essential oil exerted inhibitory effects on cell migration at all

tested concentrations (at t= 24 h: 32.3 ± 3.2% for 3.125 μg/mL, 15.7 ± 2.3% for 6.25 μg/mL

and 31.5 ± 10.5% for 12.5 μg/mL) in comparison to the untreated control (at t=24 h 43.8 ±

3.5%).

109

0 h 6 h 12 h 18 h 24 h

3,12

5

µg/

mL

0%

6%

16%

26%

32%

6,25

µg/

mL

0%

3%

7%

11%

18%

12,5

µg/

mL

0%

4%

15%

27%

37%




FCS) and essential oil of Cordia verbenacea (3.125, 6.25 and 12.5 μg/mL).

In multiple post hoc comparisons between groups revealed a significant difference

between the 6.25 μg/mL and 3.125 and 12.5 μg/mL of Cordia verbenacea groups (p < 0.01),

indicating a stronger cell migration inhibitory effect in this concentration.

0

20

40

60

80

100

2% FBS 3.125 g/mL 6.25 g/mL 12.5 g/mL

6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24

Incubation time [h]

0.1% DMSO

Cordia verbenacea

***

***

***

***

#

Ga

p c

losu

re (

%)






group 0.1% DMSO. #p < 0.1 vs. 3.125 and 12.5 µg/mL Cordia verbenacea essential oil.

110

3.5.3. Association

The association of the crude extract of Pterodon pubescens and essential oil of

Cordia verbenacea exerted inhibitory effects on cell migration at 3.125 and 12.5 μg/mL tested

concentrations (at t= 24 h: 28.6 ± 1.3% for 3.125 μg/mL and 46.3 ± 10.7% for 12.5 μg/mL) in

comparison to the untreated control (at t=24 h 43.8 ± 3.5%). For 6.25 μg/mL, the cell

migration was significantly higher, at t=24 h, a gap closure of 56.2 ± 11.0% was reached.

0 h 6 h 12 h 18 h 24 h

3,12

5

µg/

mL

0%

5%

15%

22%

30%

6,25

µg/

mL

0%

13%

32%

48%

68%

12,5

µg/

mL

0%

10%

26%

46%

57%

Figure 11. Cell migration in response to an artificial injury using long-term time-lapse imaging interval

snapshots of predefined positions in the wound gap (450 μm). Pictures show the momentum at 0, 6, 12, 18, and

24 h of a representative experiment. HaCaT cells were treated with the control (DMSO 0.1%), the positive

control (2% FCS) and association of Pterodon pubescens extract and essential oil of Cordia verbenacea (3.125;

6.25 and 12.5 μg/mL).

Multiple post hoc comparisons between groups revealed a significant difference

between the 3.125 μg/mL and 6.25 and 12.5 μg/mL of Association groups (p < 0.01),

indicating a stronger cell migration inhibitory effect in lower concentrations.

111

0

20

40

60

80

100

2% FBS 3.125 g/mL 6.25 g/mL 12.5 g/mL

Incubation time [h]

0.1% DMSO

Association

***

***

***

***

*

**

##

*

6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24

Ga

p c

losu

re (

%)





Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. *p < 0.1, **p < 0.01, ***p

< 0.001 vs. untreated group 0.1% DMSO. #p < 0.1 vs. 6.25 and 12.5 µg/mL Association.

The results from the cell migration assays by the extracts and the association were

also compared. Only the concentration of 6.25 μg/mL of Association showed a significant

difference when compared to the extracts separately presenting a higher cell migration.

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

P te ro d o n p u b e s c e n s 6 .2 5 g/m L C o rd ia v e rb e n a c e a 6 .2 5 g /m L A s s o c ia t io n 6 .2 5 g/m L

6 1 2 1 8 2 4 6 1 2 1 8 2 4 6 1 2 1 8 2 4

In c u b a t io n t im e [h ]

Ga

p c

los

ure

(%

)

* * *

* * *

* * *





Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. ***p < 0.001 vs. Pterodon

pubescens and Cordia verbenacea.

112

3.5.4. C1

The C1 exerted inhibitory effects on cell migration at 12.5 and 25 μM tested

concentrations (at t= 24 h: 11.6 ± 2.7% for 12.5 μM and 14.7 ± 2.1% for 25 μM) in

comparison to the untreated control (at t=24 h 43.8 ± 3.5%). Interestingly, for 6.25 μM, the

cell migration was significantly higher, at t=24 h, a gap closure of 71.8 ± 1.8% was reached.

0 h 6 h 12 h 18 h 24 h

6.25

µM

0%

8%

29%

53%

73%

12.5

µM

0%

2%

5%

7%

13%

25

µM

0%

2%

3%

5%

14%




control (2% FCS) and C1 (6.25; 12.5 and 25 μM).

113

0

20

40

60

80

100

2% FBS 6.25 M 12.5 M 25 M

6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24

Incubation time [h]

0.1% DMSO

C1

***

***

***

***

***

***

***

Ga

p c

losu

re (

%)






control (0.1% DMSO).

3.5.5. α-Humulene

The compound α-Humulene exerted significant effects on cell migration at all

concentrations tested (at t= 24 h: 56.5 ± 1.3% for 6.25 μM and 69.5 ± 7.5% for 12.5 μM), and

a higher effect at 25 μM, where value was on the level of treated control (approximately 88%

gap closure after 24 h). This was the only treatment that demonstrated significant cell

migration activity at all as concentrations tested.

114

0 h 6 h 12 h 18 h 24 h

6.25

µM

0%

9%

21%

49%

58%

12.5

µM

0%

15%

43%

67%

78%

25

µM

0%

7%

38%

73%

98%




control (2% FCS) and α-Humulene (6.25; 12.5 and 25 μM).

0

20

40

60

80

100

2% FBS 6.25 M 12.5 M 25 M

6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24 6 12 18 24

Incubation time [h]

0.1% DMSO

-Humulene

***

***

***

***

**

***

***

***

***

******

Ga

p c

losu

re (

%)





Values represent the mean ± SD of the closed area in percent calculated by triplicates. **p < 0.01, ***p < 0.001

vs. untreated control (0.1% DMSO).

115

3.7. Anti-inflammatory activity

To investigate the effect of the extracts, association and compounds in TNF-α-

induced VEGF expression, HaCat cells were treated with TNF-αand the various treatments

for 24 hours. The results were compared to the TNF-α-stimulated group. Pterodon pubescens

(A) and Cordia verbenacea (B) increased TNF-α-stimulated VEGF production in HaCaT

cells concentration-dependently. Association (C) at the higher concentration increased

significantly the levels of VEGF, while the lower concentrations had no effect on the TNF-α-

stimulated VEGF production. C1 (D) increased significantly the levels of VEGF in higher

concentrations, while the lowest concentration had no effect on TNF-α-stimulated VEGF

production. α-Humulene (E) was the only treatment that significantly decreased the levels of

VEGF at the lowest concentration, but significantly increased the levels of VEGF in higher

concentrations.

0

50

100

150

200

250

Control + TNF-

Control

P. pubescens + TNF-

Hydrocortison + TNF-

12.5 6.25 3.125 3.6

***

***+++

***

[µg/mL]

VE

GF

[p

g/m

L]

0

50

100

150

200

250

Control + TNF-

Control

C. verbenacea + TNF-


12.5 6.25 3.125 3.6

***

***

***+++

***

[µg/mL]

VE

GF

[p

g/m

L]

0

50

100

150

200

250

Control + TNF-

Control

Association + TNF-


12.5 6.25 3.125 3.6

***

***

+++

[µg/mL]

VE

GF

[p

g/m

L]

0

50

100

150

200

250Control

Control + TNF-

C1 + TNF-


25 12.5 6.25 10 10

+++

***

***LY 294002 + TNF-

*** ***

[µM]

VE

GF

[p

g/m

l]

0

50

100

150

200

250Control

Control + TNF-

-Humulene + TNF-


25 12.5 6.25 10 10

+++

***

***

***

LY 294002 + TNF-

*** ***

[µM]

VE

GF

[p

g/m

l]

Figure 18. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1 (D), α-Humulene

(E), LY 294002 and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) VEGF secretion in HaCaT cells. VEGF

secretions were quantified by corresponding ELISA kits. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates.

*** p < 0.001 vs. TNF-α-stimulated group; +++ p < 0.001 vs. untreated control group.

To investigate the effect of the extracts, association and compounds in TNF-α-

A B

C D

E

116

induced IL-8 expression, HaCat cells were treated with TNF-α and the various treatments for

24 hours. The results were compared to the TNF-α-stimulated group. All the different

treatments significantly decreased the levels of IL-8 (Figure 19).

0

10

20

30

40Control

Control + TNF-

P. pubescens + TNF-


12.5 6.25 3.125 3.6

*** *** ******

+++

[µg/mL]

IL-8

[p

g/m

l]

0

10

20

30

40Control

Control + TNF-

C. verbenacea + TNF-


12.5 6.25 3.125 3.6

+++

*** ***

******

[µg/mL]

IL-8

[p

g/m

l]

0

10

20

30

40Control

Control + TNF-

Association + TNF-


12.5 6.25 3.125 3.6

+++

******

***

***

[µg/mL]

IL-8

[p

g/m

l]

0

10

20

30

40Control

Control + TNF-

C1 + TNF-


25 12.5 6.25 10

+++

***

***

*****

[µM]

IL-8

[p

g/m

l]

0

10

20

30

40Control

Control + TNF-

-Humulene + TNF-


25 12.5 6.25 10

+++

***

*********

[µM]

IL-8

[p

g/m

l]

Figure 19. Effects of Pterodon pubescens (A), Cordia verbenacea (B), Association (C), C1 (D), α-Humulene

(E) and hydrocortisone on TNF-α-induced (20 ng/mL) IL-8 secretion in HaCaT cells. IL-8 secretions were

quantified by corresponding ELISA kits. Results are expressed as the mean ± SD of triplicates. ** p < 0.01, and

*** p < 0.001 vs. TNF-α-stimulated group; +++ p < 0.001 vs. untreated control group.

Discussion

Acute wounds are a common health problem, with 11 million people affected

(Singer & Dagum, 2008). More than 7 million chronic skin ulcers caused by pressure, arterial

or venous insufficiency and diabetes mellitus each year in the United States are affected by

abnormal wound healing (Sinno & Prakash, 2013). This translates to annual costs of $9

billion in attempt to reduce the major disability and consequent death of such severe skin

injury (Ashcroft et al., 2002).

In the present study, the cell line HaCaT, an immortalized human keratinocyte cell, was used

A B

C D

E

117

for the evaluation of wound healing and anti-inflammatory activities of the extracts, their

association and their major isolated compounds α-Humulene and compound m/z 404 (C1).

ATP assay was chosen to assess cell viability. Subsequent measuring of the ATP levels

provided information about the survival and death rate of the cells under the influence of the

corresponding substances (Wedler et al., 2016). All the extracts, association and compounds

did not show a significant effect on cell viability at the concentration range tested when

compared to the untreated control (Figure 3). ATP is a marker for cell viability because of its

presence in metabolically active cells levels decrease rapidly when the cells undergo necrosis

or apoptosis (Reid et al., 2004).

Next, we examined the ability of the tested samples to induce keratinocyte

proliferation using the BrdU incorporation assay. Cell proliferation is an important step for

the epidermal renewal. BrdU incorporation allowed us to determine the rate of DNA synthesis

and cell proliferation activity (Bosq & Bourhis, 1997). Our results showed a decrease in

proliferation of HaCaT cells with the treatment of the Pp extract and their isolated compound

C1 and the association of Pp + Cv. At all the concentrations tested for these samples, the

BrdU incorporation was inhibited by 40 ~ 60%. For Cv extract, proliferation decreased as the

concentrations was increase (3.125 to 25 μg/mL). At concentration of 25 μg/mL, BrdU

incorporation was inhibited by 35%. Interestingly, α-Humulene in lower concentrations

(3.125 – 6.25 µM) had only weak antiproliferative effects, but in higher concentrations (12.5

– 50 µM), BrdU incorporation was inhibited by approximately 50% (Figure 4).

Antiproliferative effects of crude ethanolic extract of Pterodon pubescens have

been reported earlier in melanoma (SK MEL 37) cells. An isolated compound with vouacapan

skeleton (vouacapan-6α, 7β, 14β, 19-tetraol; IC=32 µM) also exhibited antiproliferative

effects in this cell line (Vieira et al., 2008). Another study demonstrated an antiproliferative

effect for another isolated compound from Pterodon pubescens. The compound 6α-acetoxy-

7β-hydroxy-vouacapan, that has the vouacapan skeleton as the C1 tested in this study, showed

high selectivity for cell line of prostate cancer (PC-3) (Spindola et al., 2009). The C1 tested in

this study has the same vouacapan skeleton that the previous studies. It can be suggested that

this structure exerted antiproliferative effects.

Previous study compared the supercritical fluid extract and ethanolic extract of

Cordia verbenacea in antiproliferative in vitro and antitumor in vivo assays. Supercritical

extract was more effective as antiproliferative and cytotoxic against cancer cells line (MCF-7)

and in vivo assays (Parisotto et al., 2012). Despite being another extract and another cell line,

the essential oil of Cordia verbenacea also showed antiproliferative effects in HaCaT cells.

118

The effects on in vitro wound healing were evaluated by cell migration assay

using a long-term, time-lapse microscopy. This is an accurate and reproducible model to study

wound healing by monitoring cell migration over an extended period.

As positive control, medium supplemented with 2% FBS was used, leading to

98.7 ± 1.0% gap closure after 24 h. As expected, the addition of FBS resulted in a significant

acceleration of the gap closure process, and thus implied that the experimental protocol

provided reliable results (Figure 5). LY294002, a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor,

showed a gap closure of 6%. In previous study, it was demonstrated that the LY294002

clearly inhibited cell migration compared to the control group (Wedler et al., 2016).

The effects of Pterodon pubescens extract and Cordia verbenacea essential oil on cell

migration are comparable to cells treated with the medium and 0.1% of DMSO. As shown in

Figures 7 and 8, the extracts did not affect cell migration in any concentration tested, since the

values remained on the level of untreated control after 24 h.

For the association of extracts, synergistic response was expected according to

previous study. However, this effect was not observed at the cell migration assay. All the

concentrations tested exerted inhibitory effects on cell migration (Figure 9).

For C1, only at the lowest concentration (6.25 μM), the cell migration was

significantly higher, a gap closure of 71.8% was reached after 24 h of treatment (Figure 14).

Of all samples tested in this study, only α-Humulene exerted significant effects on

cell migration at all concentrations tested. Wound closure was improved by 56%; 69% and

88% after 24 h of treatment, respectively, in the presence of 6.25; 12.5 and 25 μM. Higher

concentrations stimulated cell migration without considerable toxic effects as seen on ATP

assay.

It is known that the inflammatory phase is one of the most important stages in the

healing process. Therefore, the inhibition of proinflammatory mediators may be an effective

therapeutic approach to regulate the progression of the wound-healing process (Wedler et al.,

2014).

Several natural compounds and plant extracts have been previously reported to

have anti-inflammatory effects in activated keratinocytes (Kao et al., 2009; Kim et al., 2012;

Park et al., 2010; Wedler et al., 2016).

VEGF and IL-8 play an important role in skin inflammation and are produced by

activated keratinocytes (Takematsu & Tagami, 1993; Viac et al., 1997). VEGF is also

produced by most inflammatory cells including eosinophils, lymphocytes, macrophages, and

neutrophils (Taichmann et al., 1997) and play key roles at three phases of wound healing

119

(Stone & Bhimji, 2017). Both mediators are overexpressed in skin diseases that are associated

with aberrant angiogenesis (Pietrazk et al., 2008; Smith et al., 2007; Xia et al., 2003).

In the present study, we demonstrate that Pp, Cv, Association of extracts and C1,

boosts the production of VEGF (Figure 18). Pp and Cv presented an increased response

concentration-dependently. Association and C1 also presented an increased response in higher

concentrations. These samples seem to possess potent angiogenic effects, despite presenting

antiproliferative and anti-migratory responses. In the inflammatory response mediated by

TNF-α to IL-8 in HaCaT cells, all the different treatments significantly decreased the levels of

IL-8 (Figure 19).

When cells were pretreated with α-Humulene (12.5 and 25 µM), the secretion of

VEGF was increased, comparable to TNF-α-stimulated group. However, when the cells were

treated with lower concentrations of the compound (6.25 µM), presented an inhibition in

VEGF levels. α-Humulene had the strongest reduced in IL-8 production, concentration-

dependently, with better results than the hydrocortisone, suggestion a strong anti-

inflammatory activity. IL-8 inhibition by α-Humulene was not due to a general cytotoxic

effect, since cell viability in all cultures remained constant throughout the incubation period in

the presence the compound tested.

The effect of α-Humulene on cell migration seems be related with VEGF, as this

growth factor is the most prevalent signaling molecule that is specific for endothelial cells,

and it particularly stimulates cell migration and proliferation (Frank et al., 1995; Wilgus et al.,

2005), as the higher concentrations (12.5 – 25 µM) demonstrated a gap closure of almost 90%

and high levels of VEGF.

This compound also has an anti-inflammatory action, as presented a strong anti-

inflammatory activity, inhibiting IL-8 stimulated by TNF-α in HaCaT cells. Pharmacological

studies performed with Cordia verbenacea have validated the anti-inflammatory activity,

attributing this effect to the presence of α-Humulene and trans-caryophyllene isolated from

the plant, which inhibited significantly the expression of cyclooxygenase (COX-1 and COX-

2) and NO synthase (Fernandes et al., 2007). This study is in line with our own data.

To our knowledge, no data have been published previously on the effects of Pp,

Cv, C1 and α-Humulene on cell migration and on the secretion of VEGF and IL-8.

Despite the α-Humulene being one of the major active compound in Cordia

verbenacea essential oil and is present expressively in the crude extract of Pterodon

pubescens, both extracts have not demonstrated activity in cell migration. The moderate anti-

inflammatory effects of both extracts in TNF-α-induced production of IL-8 can be related to

120

the presence of this compound. A synergic response was expected to the association of both

extracts, however it is was not seen on the assays here presented, indicating that the synergic

effect of association previously reported are related to another mechanism of action.

We therefore suggest that α-Humulene might have a dual activity – in higher

concentrations (12.5 and 25 µM) the compounds show an anti-inflammatory and angiogenic

effect, while in lower concentrations (6.25 µM), exert anti-angiogenic activity by inhibiting

migration, possibly by prevention of VEGF secretion.

In conclusion, the Pp extract, Cv essential oil and their association significantly

inhibited the proliferation and migration of human keratinocytes in vitro. C1 also presented

antiproliferative and inhibited migration of HaCaT cells in higher concentrations. Thus, these

compounds would have potential as a local treatment against hyper proliferation-involved

skin diseases, for example. Finally, treatment with α-Humulene may be a potential therapeutic

strategy to promote wound healing and to prevent inflammation in a persistent inflammatory

condition.

Acknowledgements

We would like to thank to Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São

Paulo (FAPESP) for grant support and fellowship to RTB (#2015/08600-2, #2016/23816-4)

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126

7. DISCUSSÃO GERAL

A Organização Mundial da Saúde tem incentivado investimentos públicos em

plantas medicinais. O mercado mundial de fitomedicamentos gerou cerca de 27 bilhões de

dólares em 2014, principalmente na Europa, Ásia e Estados Unidos (Dutra et al., 2016).

Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), para a transformação de uma

planta em medicamento deve-se visar à preservação da integridade química e farmacológica

do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de utilização, além de

valorizar o seu potencial terapêutico. Portanto, a produção de medicamentos fitoterápicos

requer, necessariamente, estudos prévios envolvendo aspectos botânicos, agronômicos,

químicos, estudos farmacológicos e toxicológicos, além do desenvolvimento de metodologias

analíticas e tecnológicas, para garantia da padronização do medicamento fitoterápico.

Nosso grupo de pesquisas estuda a espécie Pterodon pubescens Benth. desde

(1999), com abordagens de pesquisas na área tecnológica, química e farmacológica para

obtenção de dados pré-clínicos de segurança, eficácia e reprodutibilidade que contribuam para

a produção de um medicamento fitoterápico. Em um dos trabalhos publicados, observou-se

que as doses utilizadas dos compostos ativos isolados desta espécie tinham atividade

farmacológica semelhante ao extrato bruto, onde no extrato bruto havia uma menor

concentração destes compostos, sugerindo um efeito sinérgico entre os componentes desta

planta (Spindola et al., 2011). A partir deste estudo, surgiu o projeto de associar a Pterodon

pubescens Benth. com a Cordia verbeancea DC, para observar se este efeito sinérgico

ocorreria com a associação de uma outra espécie vegetal, tendo como objetivo avaliar a

atividade antinociceptiva e/ou anti-inflamatória da associação.

Para caracterização da segurança da associação, os possíveis efeitos tóxicos da

administração das associações foram observados através do teste de toxicidade aguda. Esta é

uma avaliação importante no início da pesquisa para fornecer subsídios sobre o modo de ação

tóxico da substância testada e determinante para a continuidade da pesquisa de produtos

naturais (Brito, 1994). O tratamento dos animais com a associação de Pp + Cv na proporção

de 1:1 nas doses de 50, 100 e 500 mg/kg, não evidenciou efeitos tóxicos pela ausência de

sinais clínicos relevantes no screening hipocrático, bem como ausência de morte durante o

período de observação. Também não foram registradas alterações do peso corporal durante os

14 dias de observação, demostrando que a associação dos extratos nas doses avaliadas não

pareceu interferir no metabolismo dos animais.

Outro parâmetro analisado neste experimento foi o peso relativo de alguns órgãos

(coração, pulmão, baço, rins, fígado, ovários e úteros), obtidos pela razão entre o peso do

127

órgão e o peso corpóreo total do animal. Este parâmetro também não evidenciou nenhuma

alteração significativa quando comparado com o grupo controle (veículo). Durante a análise

macroscópica dos órgãos dos animais tratados com a associação dos extratos não foram

observados alterações na coloração quando comparados aos órgãos do grupo controle. É

recomendada a realização de novos testes de toxicidade crônica com doses repetidas para

descartar completamente o efeito tóxico da associação.

Para elucidar se a associação do extrato bruto de Pterodon pubescens Benth. (Pp)

e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) causaria possíveis alterações no

comportamento motor, foi realizada a avaliação da atividade locomotora através do teste de

campo aberto (open field). Modificações no desempenho motor que o animal possa vir a

sofrer, é proveniente de uma ação miorelaxante ou sedativa, podendo induzir a um grande

número de erros em estudos sobre drogas que atuam na nocicepção central e periférica

(Millan, 2002). Nos modelos de nocicepção o fator comportamental está diretamente

envolvido, portanto o estudo de extratos que interfiram na locomoção poderia produzir um

resultado falso positivo.

O teste de campo aberto demonstrou que o tratamento agudo por via oral com a

associação dos extratos nas doses de 50, 100 e 500 mg/kg, não alterou o desempenho

locomotor dos animais quando comparado ao grupo controle negativo (veículo) enquanto o

tratamento com o controle positivo (pentobarbital 35 mg/kg) reduziu significativamente a

atividade locomotora dos animais. Uma vez realizada a caracterização preliminar de

segurança do uso da associação dos extratos em animais, iniciou-se os testes para caracterizar

as ações farmacológicas.

Dentre os diferentes modelos de nocicepção encontra-se o teste de contorções

abdominais induzidas por ácido acético utilizado como uma ferramenta de rastreio para a

avaliação de propriedades analgésicas ou anti-inflamatórias de compostos naturais ou

sintéticos (Spindola et al., 2012). Quando injetado por via intraperitoneal, o ácido acético

induz de forma indireta o aparecimento de contorções abdominais, agindo através da liberação

de mediadores endógenos que estimularão os neurônios nociceptivos sensíveis (Fischer et al.,

2008). O estímulo produzido pelo ácido acético causa nocicepção por um mecanismo que

envolve eicosanóides e aminas simpatomiméticas, que também estão envolvidas na

hiperalgesia induzida por estímulos inflamatórios, como os da carragenina. Além disso, a

liberação de prostaglandinas e aminas simpatomiméticas são secundária à liberação de

citocinas pró-inflamatórias, tais como TNF-α, IL-1β e IL-8, o que demonstra a relação entre

as vias inflamatórias e nociceptivas (Ribeiro et al, 2000).

128

Neste trabalho, o teste de contorção abdominal induzido por ácido acético foi

escolhido como modelo de triagem para encontrar as doses efetivas do extrato bruto de

Pterodon pubescens Benth. (Pp) e do óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv).

Para o extrato de Pp a dose efetiva encontrada foi de 64,2 mg/kg e para o óleo

essencial de Cv de 165,4 mg/kg. Para melhor cálculo e administração das doses, foram

fixadas para o Pp a dose efetiva de 65 mg/kg e para o Cv de 165 mg/kg.

Roldão et al., 2008 demostraram que o extrato etanólico de folhas de Cordia

verbenacea na dose de 250 mg/kg por via oral, não exibiu atividade analgésica no teste de

contorção abdominal induzida por ácido acético. Entretanto, estudos realizados com o extrato

diclorometânico mostrou dose dependência (100-1000 mg/kg), onde a dose de 1000 mg/kg

inibiu em 65% o número de contorções quando comparado ao grupo controle (Bayeux et al.,

2002). A dose efetiva encontrada para o óleo essencial de Cordia verbenacea neste trabalho

foi de 165 mg/kg, sendo menor do que as descritas anteriormente, provavelmente ao fato do

óleo essencial possuir compostos que apresentam maior atividade analgésica e anti-

inflamatória, como por exemplo, o alfa-Humuleno (Fernandes et al., 2007).

Com as doses efetivas definidas, foi realizada uma análise gráfica para avaliar o

efeito da mistura dos extratos através de um modelo matemático denominado isobolograma.

A análise isobolográfica é um método experimental aplicável na determinação farmacológica

de interações entre fármacos sendo uma ferramenta conveniente na detecção de interações

farmacológicas bem como na compreensão da real natureza dessas interações,

independentemente do seu mecanismo de ação ou da natureza das relações dose-resposta

(Tallarida, 2001). De fato, este método experimental permite a avaliação da administração

concomitante de fármacos ou extratos vegetais em doses efetivas, permitindo uma posterior

extrapolação dos resultados obtidos para a determinação do efeito farmacológico resultante da

mistura (Deckers, 2000). Portanto, no presente estudo, utilizou-se esta técnica para determinar

a natureza de interação entre o extrato bruto de Pterodon pubescens Benth. (Pp) e do óleo

essencial de Cordia verbenacea DC (Cv).

Após a construção da análise gráfica onde foram plotados os dados teóricos e

experimentais oriundos do teste de contorção abdominal induzida por ácido acético, o gráfico

mostrou uma curva convexa da associação dos extratos, comprovando real efeito sinérgico da

mistura de Pp + Cv, onde as DE50 das misturas definidas experimentalmente, além de

mostrarem um efeito na inibição maior que 50% - em torno de 65% a 75%, as doses

necessárias para a inibição de 50% se mostraram inferiores aos valores definidos

teoricamente, onde os valores teóricos foram de 48,75; 32,5 e 16,25 mg/kg para o extrato de

129

Pp e os valores experimentais foram de 16,48; 13,44 e 8,71 mg/kg para o extrato de Pp,

demonstrando que as concentrações das doses necessárias para uma inibição de 50% nas

contorções abdominais foram em torno de 3 a 2 vezes menores que as doses apresentadas na

linha de aditividade. Em relação ao índice combinatório encontrado, todas as associações

demostraram um efeito sinérgico, corroborando com os dados encontrados através do

isobolograma.

O teste da formalina é uma ferramenta útil não só para avaliar o potencial de uma

substância analgésica ou anti-inflamatória, mas também para elucidar o mecanismo de ação

(Hunskaar & Hole, 1985; Lenardão et al., 2016). É também um dos modelos mais utilizados

em ensaios de dor e que mais se assemelha a dor clínica (Tjolsen et al., 1992).

Os mecanismos analgésicos da mistura foram analisados no teste de formalina que

envolve duas fases com respostas distintas. A primeira fase ocorre bem rapidamente e é mais

sensível a fármacos opióides. Isso se deve à dor exclusivamente neurogênica com excitação

de fibras nervosas Aδ mielinizadas e fibras C não mielinizadas (Mcnamara et al., 2007). As

associações nas três doses testadas e também os extratos separadamente não apresentaram

redução do tempo de lambida durante a fase neurogênica do teste.

A segunda fase, mais tardia do teste de formalina, envolve um período de

sensibilização dos nociceptores por parte dos mediadores inflamatórios (serotonina, histamina

e PGE2) liberados em resposta à lesão tecidual, com o aparecimento da dor de origem

inflamatória (Tjolsen et al., 1992). Na fase inflamatória do teste, as três doses testadas da

associação reduziram o tempo de lambida da pata dos animais quando comparados ao veículo.

O resultado sobre a segunda fase aponta para um possível efeito anti-inflamatório da

associação devido a sua ação sobre a liberação de mediadores envolvidos com inflamação,

tais como prostaglandinas, histamina, serotonina e bradicinina e leucotrienos (Santos et al,

2006; Zhang & Ren, 2011). Em adição, é sugerido que a associação possa estar agindo como

um inibidor de ciclooxigenases, já que uma inibição somente da segunda fase do teste da

formalina é característica típica de inibidores desta enzima (Rosland et al., 1990).

Para a continuidade dos testes de atividade antinociceptiva e anti-inflamatória,

foram escolhidas as doses de associação dos extratos que apresentaram maior inibição da

nocicepção nos modelos de contorção abdominal induzida por ácido acético e no teste de

formalina. As doses que foram escolhidas correspondem a 50% da dose efetiva de cada

extrato na associação (A50 = 32,5 mg/kg de Pp + 82,5 mg/kg de Cv), a 100% da dose efetiva

de cada extrato na associação (A100 = 65 mg/kg de Pp + 165 mg/kg de Cv) e a 200% da dose

efetiva de cada extrato na associação (A200 = 130 mg/kg de Pp+ 330 mg/kg de Cv).

130

Para confirmar a possível atividade antinociceptiva da associação dos extratos

foram realizados os testes de retirada de cauda (tail flick), que mostra uma ação central-

medular, e placa quente (hot plate), que mostra uma ação central-cerebral.

Estudos anteriores realizados com o extrato etanólico (dose de 250 mg/kg) e o

extrato bruto diclorometânico (dose de 100 – 1000 mg/kg) de folhas de Cordia verbenacea

DC separadamente, não mostraram resposta antinociceptiva para modelos de nocicepção com

estímulos térmicos (Bayeux et al., 2002; Roldão et al., 2008). Contudo, estes experimentos

foram realizados com a mistura para observar se a associação de ambos seria capaz de

produzir uma resposta protetora positiva frente a este estímulo.

O teste de retirada de cauda é um dos mais antigos testes nociceptivos (D'Amour & Smith,

1941). O parâmetro analisado é a latência, em segundos, do reflexo da ponta da cauda do

animal após a exposição a um estímulo térmico (Lenardão et al., 2016). A retirada da cauda é

um reflexo espinhal, mas está sujeita a influências supra-espinhais que podem afetar este

reflexo (Yaksh & Rudy, 1978; Millan, 2002). As três doses empregadas da associação dos

extratos A50, A100 e A200 não aumentaram o tempo de latência ao estímulo térmico no modelo

de retirada de cauda, no entanto o grupo controle positivo (morfina 5 mg/kg) mostrou

significativo aumento da latência desde a primeira avaliação.

O teste da placa quente (hot plate) é um modelo central, válido para fármacos

derivados de opióides (Morucci et al., 2012) e é caracterizado por respostas supraespinhais

através de dois componentes comportamentais: a lambida de pata e o salto. A lambida de pata

é suprimida por analgésicos opióides, enquanto que o salto pode ser inibido por analgésicos

menos potentes, como ácido acetilsalicílico ou paracetamol (Le Bars et al., 2001). Este

modelo experimental é objetivo, fácil de ser desenvolvido, além de prover medidas de

respostas nociceptivas supraespinhais, semelhante a dor humana, mediada por respostas

supraespinhais que se diferem dos reflexos nociceptivos espinhais (Gunn et al., 2011; Barrot,

2012). De acordo com os resultados obtidos a morfina mostrou-se bastante ativa aumentando

o tempo de latência ao estímulo térmico, enquanto as três doses da associação não alteraram o

tempo de resposta quando comprados ao grupo veículo, mostrando que o efeito

antinociceptivo da associação não é mediado por mecanismos supraespinhais. Os dados

complementam o que foi apresentado no teste de retirada de cauda, e corroboram com os

resultados encontrados na primeira fase do teste de formalina, onde a associação dos extratos

não demonstrou atividade na fase neurogênica do modelo.

O edema de pata induzido por carragenina, descrito originalmente por Winter et

al., 1962, é um dos modelos de inflamação mais utilizados e altamente reprodutíveis para o

131

rastreio de novas drogas com ação anti-inflamatória, como os produtos naturais, sendo o

edema utilizado como parâmetro desta resposta (Fehrenbacher et al., 2012; Vazquez et al.,

2015). A carragenina é um mucopolissacarídeo derivado de algas marinhas denominadas

Chondrus, que causa uma inflamação do tipo adaptativa, não produz efeitos sistêmicos e

proporciona alto grau de reprodutividade (Boleta-Ceranto et al, 2005).

Os sinais cardinais da inflamação, tais como edema, hiperalgesia e eritema, são

desenvolvidos imediatamente após a injeção subplantar de carragenina, como resultados da

ação de agentes pró-inflamatórios, tais como bradicinina, histamina, prostaglandinas,

tromboxanos, espécies reativas de oxigênio que podem ser gerados no local da lesão ou por

infiltração das células (Di Rosa et al., 1971; Salvemini et al., 1996; Guay et al., 2004;

Vazquez et al., 2015).

O edema inflamatório induzido pela injeção de carragenina é resultante da ação

sequencial e integrada de vários mediadores inflamatórios e sua sequência de eventos é bem

delineada, descrevendo três fases. Nas duas primeiras horas do edema de pata induzido por

carragenina ocorrem à liberação de histamina, serotonina, substância P e bradicinina-

dependente. Na segunda etapa, que se estende da primeira ou segunda hora até a sexta hora,

atribui-se o efeito edematogênico à elevação da produção de prostaglandinas e ativação da

ciclooxigenase-2, além da migração de neutrófilos. Na última fase, a mediação inflamatória

depende principalmente da produção de citocinas, como TNF-α, IL-1α e IL-1β, IL-6

(Salvemini et al., 1996; Iwata et al., 2010; Zhang & Ren, 2011). As três associações testadas

foram capaz de inibir significativamente o edema induzido por carragenina a partir da sexta

hora de avaliação e prolongar esta atividade até a 48ª hora da mensuração do volume da pata,

assemelhando-se ao efeito produzido pelo controle positivo – dexametasona. Estes resultados

sugerem que a associação possa estar agindo na produção de mediadores inflamatórios,

devido ao efeito significativo observado na terceira etapa do modelo de edema de pata

induzido por carragenina.

Em estudo anterior, Passos et al., 2007 demonstraram que o tratamento por via

oral do óleo essencial de Cordia verbenacea (150-600 mg/kg) reduziu o edema de pata

induzido por carragenina e também em modelos de edema de pata induzido por vários

mediadores da inflamação, incluindo histamina, bradicinina, substância P e fator de ativação

plaquetário (PAF). A dose de 600 mg/kg do óleo mostrou-se significativa inibindo o edema

na primeira, segunda e quarta hora após a injeção da carragenina. A administração da dose de

150 mg/kg do óleo essencial, entretanto, não apresentou efeito significativo no edema de pata

induzido por carragenina quando comparado ao grupo controle. Diferentemente dos

132

resultados exibidos neste trabalho, a associação dos extratos inibiu o edema de pata induzido

por carragenina a partir de 4 horas após a injeção de carragenina, na maior dose utilizada (330

mg/kg de Cordia). Provavelmente, esta inibição da fase inicial do edema, deve-se a elevada

dose utilizada (600 mg/kg), já que a dose de 150 mg/kg não demostrou atividade. Estudos

sugerem que a atividade anti-inflamatória do óleo essencial de Cordia verbenacea esteja

relacionada com a diminuição de níveis de TNF-α, porém, esta ação anti-inflamatória não está

relacionada com a capacidade de inibição da produção de prostaglandinas (PGE2), inibição da

atividade de COX-1 e COX-2 in vitro e redução de níveis de IL-1β (Passos et al., 2007).

A PGE2 é um dos principais produtos do ácido araquidônico através do

metabolismo da ciclooxigenase (COX) na resposta da inflamação e desempenha um papel

vital na inflamação (Blatteis et al., 2005). Neste trabalho, exploramos o possível

envolvimento deste mediador inflamatório através do modelo de edema de pata induzido por

PGE2, onde o bloqueio dos receptores de PGE2 pode ser uma abordagem para o

desenvolvimento de drogas ou terapias alternativas para dor e inflamação (Spindola et al.,

2017). Nossos resultados demonstraram uma inibição aos 15 e 30 minutos após a

administração de PGE2 com todas as doses administradas, sugerindo que a inibição dessa via

também está envolvida no efeito anti-inflamatório da associação.

Devido à inibição da segunda fase no modelo de pata induzida por carragenina,

foi realizado o modelo de peritonite induzida por carragenina para avaliar a atividade da

associação na migração de leucócitos. A peritonite induzida por carragenina é amplamente

empregada para testar novas terapias anti-inflamatórias, pois permite a avaliação do

recrutamento celular, bem como mudanças em outros parâmetros inflamatórios, como

permeabilidade vascular e produção de citoquinas (Okoye et al., 2013). Concomitantemente,

exerce um efeito quimiotáctico em células inflamatórias mediadas por uma ação sinérgica

entre prostaglandinas, leucotrienos e outros agentes quimiotáticos (Damasceno et al., 2014).

No modelo de peritonite induzida por carragenina, a associação nas três doses testadas não

inibiu significativamente a migração de leucócitos na cavidade peritoneal, sugerindo que as

atividades anti-inflamatórias da associação não estão relacionadas ao recrutamento de células.

A nocicepção persistente causada pela administração intraplantar de CFA é um

modelo de nocicepção amplamente utilizado. O CFA é composto por óleo de parafina

contendo mono-oleato de manitol como um surfactante em suspensão com uma micobactéria

(Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium butyricum) morta. A administração de CFA

na cauda ou nas patas de ratos, camundongos ou coelhos produz um processo inflamatório

intenso, que se desenvolve rapidamente e pode persistir por várias semanas (Billiau &

133

Matthys, 2001). Este ensaio constitui um modelo de dor inflamatória que tem similaridade

com doenças crônicas humanas tais como artrite reumatóide e as inflamações severas nas

articulações (Tjolsen & Hole, 1997). A administração de CFA produz reação inflamatória

local caracterizada por eritema, aumento da temperatura local, estravasamento plasmático,

infiltração de células inflamatórias, associado com a produção de vários mediadores

inflamatórios e nociceptivos tais como citocinas, neurotrofinas e eicosanoides (Ganju et al.,

2001). Em conseqüência, a injeção de CFA causa hiperalgesia e alodínia, que é mediada pela

sensibilização local do nociceptor e por mecanismos sistêmicos neurais (como a

sensibilização central) e imunes (como o aumento dos níveis locais e séricos de citocinas)

(Samad et al., 2004).

Neste estudo, avaliamos as associações em dois tratamentos diferentes: um grupo

experimental que recebeu tratamento nos dias de avaliação de fase aguda e crônica e outro

grupo que recebeu tratamento diário ao longo dos sete dias do teste. Nossos resultados

mostraram que as associações foram efetivas neste modelo, mostrando um aumento no limiar

da retirada de pata, tanto na fase aguda e com maior eficácia na fase crônica. Os resultados

foram mais interessantes para o grupo tratado diariamente, no sétimo dia de avaliação, onde a

avaliação basal mostrou um aumento no limiar da retirada de pata superior a 70%,

demonstrando que o tratamento diário reduziu significativamente a sensibilidade induzida

pelo CFA e com o último tratamento, mostrou valores próximos ou superiores ao controle

positivo, dexametasona. De acordo com Burstein et al., 2010, um efeito antinociceptivo no

modelo CFA, ocorre inibindo a síntese de mediadores pró-inflamatórios, como a

ciclooxigenase 2, interleucina 1β e óxido nítrico sintase, por meio da inibição do fator nuclear

k. A PGE2 também participa como o principal mediador responsável pela hipersensibilidade

mecânica (Wang et al., 2007). Com a inflamação crônica significativamente inibida, sugere-se

que a associação tenha um papel na inibição de mediadores pró-inflamatórios e na via PGE2.

Os efeitos antinociceptivos e anti-inflamatórios da associação do extrato bruto dos

frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial de Cordia verbenacea DC

(Cv) estão relacionado à composição química do extrato vegetal. Na análise fitoquímica, a

associação mostrou uma importante concentração de Trans-Cariofileno e α-Humuleno.

Estudos anteriores sugeriram alguns mecanismos de ação de ambos os compostos (50 mg/kg)

através do fator ativador de plaquetas, bradicinina, prostaglandina E2 (PGE2), indução de

sintetase de óxido nítrico induzível (iNOS) e expressão de ciclooxigenase (COX-2) em testes

in vivo (Fernandes et al., 2007).

Em relação aos compostos presentes no extrato da Pterodon pubescens, estudos

134

anteriores do nosso grupo sugeriram alguns mecanismos de ação. O geranilgeraniol (30

mg/kg) tem relação com receptores de serotonina 5-HT3 e receptores de imidazolina I1. O

composto m/z 362 (30 mg/kg) provavelmente está envolvido com a síntese ou liberação de

serotonina e ambos os compostos reduziram a resposta nos testes de contorção, capsaicina,

glutamato e placa quente, com relação aos receptores vaniloid VR1 e/ou receptores periféricos

de glutamato (Spindola et al., 2010, Spindola et al., 2011).

O composto m/z 404 demonstrou mais eficácia na dor neurogênica, do que na dor

inflamatória do teste de formalina, sugerindo uma ação relacionada aos mecanismos central e

periférico (Servat et al., 2012). Estes estudos também sugeriram que os compostos presentes

no extrato de Pterodon pubescens Benth. podem exercer um efeito sinérgico, uma vez que o

extrato bruto (300 mg/kg) contendo concentrações menores de geranilgeraniol (34,6 mg/kg) e

m/z 362 (4,7 mg/kg) apresentou o mesmo efeito dos compostos puros quando testados

separadamente (300 mg/kg) no modelo de contorção abdominal induzido por ácido acético

(Spindola et al., 2011).

No presente estudo as associações foram testadas em doses mais baixas e,

conseqüentemente, menores concentrações de compostos ativos do que as testadas nestes

estudos anteriores, no entanto, apresentaram efeitos significativos, especialmente na dor

inflamatória, sugerindo um efeito sinérgico.

O conceito de terapia combinada é baseado no potencial sinérgico ou aditivo de

dois ou mais medicamentos para melhorar a eficácia terapêutica (Organização Mundial da

Saúde, 2015). O sinergismo é um tipo de resposta farmacológica obtida a partir da associação

de dois ou mais fármacos, o que resulta ser maior do que a soma simples dos efeitos isolados

de cada um. Dois ou mais fármacos podem ser administrados em combinação principalmente

para aumentar a eficácia, reduzir as dosagens individuais e os possíveis efeitos colaterais de

cada um (Ulrich-Merzenich, 2014). Nossos resultados apontam para um possível sinergismo

entre os compostos ativos nas associações, provavelmente atuando em diferentes receptores

farmacológicos como estudos anteriormente relatados.

Devido aos resultados promissores do efeito sinérgico e da ação anti-inflamatória

da associação nos estudos in vivo, estudos in vitro, utilizando linhagem celular imortalizada

de queratinócitos humanos (HaCaT), foram realizados com os extratos separadamente, a

associação dos extratos e seus principais compostos ativos, composto m/z 404 (C1) e α-

Humuleno, com o objetivo de investigar a ação destas amostras em teste de cicatrização in

vitro (migração celular) e o potencial anti-inflamatório (VEGF e IL-8), já que a cicatrização

de feridas e a inflamação estão diretamente relacionadas.

135

As feridas são definidas como lesões físicas que resultam em uma abertura ou

ruptura da pele que causa um distúrbio na anatomia e função normal da pele (Strodtbeek,

2001). A cicatrização normal de feridas é uma série dinâmica de eventos que envolvem a

interação coordenada de células sanguíneas, proteínas, proteases, fatores de crescimento e

componentes da matriz extracelular e são divididos em três fases: inflamatória, proliferativa e

remodelação (Sinno & Prakash, 2013).

As células presentes em feridas não cicatrizadas produzem constantemente mediadores

inflamatórios em uma fase de inflamação não coordenada e autossustentável que prejudica a

restauração da integridade anatômica e funcional no período normal de tempo (Heinlin et al.,

2010; Prantl et al., 2010), atrasando o último objetivo do processo de cicatrização de feridas,

que é a regeneração da pele ferida sem a formação de cicatrizes.

Neste estudo, o ensaio de ATP (adenosina trifosfato) foi escolhido para avaliar a

viabilidade celular. A medição subseqüente dos níveis de ATP fornece informações sobre a

taxa de sobrevivência e mortalidade das células sob a influência das substâncias

correspondentes (Wedler et al., 2016). Todos os extratos, associação e compostos não

mostraram efeito significativo na viabilidade celular no intervalo de concentração testado

quando comparado ao controle não tratado. O ATP é um marcador para a viabilidade celular

devido à sua presença nos níveis metabolicamente ativos das células, que diminuem

rapidamente quando as células sofrem necrose ou apoptose (Reid et al., 2004).

Em seguida, foi avaliada a capacidade das amostras testadas para induzir a

proliferação de queratinócitos usando o ensaio de incorporação de BrdU (5-bromo-2'-

desoxiuridina). A proliferação celular é um passo importante para a renovação epidérmica. A

incorporação de BrdU permite determinar a taxa de síntese de DNA e atividade de

proliferação celular (Bosq & Bourhis, 1997). Nossos resultados mostraram uma diminuição

na proliferação celular com o tratamento do extrato Pp e seu composto isolado C1 e a

associação de Pp + Cv. Em todas as concentrações testadas para essas amostras, a

incorporação de BrdU foi inibida em 40 ~ 60%. Para o extrato Cv, a proliferação diminuiu à

medida que as concentrações aumentaram (3,125 a 25 μg/mL). Na concentração de 25 μg/mL,

a incorporação de BrdU foi inibida em 35%. O α-Humuleno em concentrações mais baixas

(3.125-6.25 μM) apresentou efeitos antiproliferativos menores, mas em maiores

concentrações (12,5 - 50 μM), a incorporação de BrdU foi inibida em aproximadamente 50%.

Os efeitos antiproliferativos do extrato etanólico bruto de Pterodon pubescens

foram relatados anteriormente em células de melanoma (SK MEL 37). O composto isolado

com esqueleto vouacapânico (vouacapano-6α, 7β, 14β, 19-tetraol, IC = 32 μM) também

136

apresentou efeito antiproliferativo nesta linha celular (Vieira et al., 2008). Outro estudo

demonstrou efeito antiproliferativo para outro composto isolado de Pterodon pubescens. O

composto 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano, que possui o esqueleto vouacapânico como o

C1 testado neste estudo, mostrou alta seletividade para linhagem celular de câncer de próstata

(PC-3) (Spindola et al., 2009). O C1 testado neste estudo possui o mesmo esqueleto

vouacapânico que os estudos anteriores, onde sugere-se que essa estrutura possua efeitos

antiproliferativos.

Estudo anterior comparou o extrato por fluído supercrítico e o extrato etanólico de

Cordia verbenacea em ensaios antiproliferativos in vitro e antitumoral in vivo. O extrato

supercrítico foi mais eficaz como antiproliferativo e citotóxico contra linhagens de células

tumorais (MCF-7) e ensaios in vivo (Parisotto et al., 2012). Apesar de ser outro extrato e outra

linhagem celular, o óleo essencial da Cordia verbenacea também mostrou efeitos

antiproliferativos em células HaCaT.

Os efeitos na cicatrização de feridas in vitro foram avaliados pelo ensaio de

migração celular utilizando um microscópio de tempo real. Este é um modelo preciso e

reprodutível para estudar a cicatrização de feridas monitorando a migração celular durante um

período prolongado.

Como controle positivo, utilizou-se meio suplementado com 2% de FBS (soro

fetal bovino), levando a um fechamento da ferida em 98,7 ± 1,0% após 24 h. Como esperado,

a adição de FBS resultou em uma aceleração significativa do processo de fechamento de das

feridas e, portanto, implicou que o protocolo experimental forneceu resultados confiáveis. O

LY294002, um inibidor de fosfatidilinositol-3-quinase, mostrou uma porcentagem de

fechamento de 6%. Em estudo anterior, foi demonstrado que o LY294002 inibiu claramente a

migração celular em comparação com o grupo controle (Wedler et al., 2016).

Os efeitos do extrato de Pp e do óleo essencial de Cv na migração celular são

comparáveis às células tratadas com o meio e 0,1% de DMSO. Os extratos não afetaram a

migração celular em qualquer concentração testada, uma vez que os valores permaneceram

semelhantes ao controle não tratado após 24 horas.

Para a associação dos extratos, uma resposta sinérgica era esperada de acordo com

o estudo anterior. No entanto, este efeito não foi observado no ensaio de migração celular.

Todas as concentrações testadas (3,25 – 12,5 µg/ml) exerceram efeitos inibitórios sobre a

migração celular.

Para o composto C1, apenas na menor concentração avaliada (6,25 μM), a

migração celular foi significativamente maior, apresentando uma porcentagem no fechamento

137

da ferida de 71,8 após 24 horas de tratamento.

De todas as amostras testadas neste estudo, apenas o α-Humulene exerceu efeitos

significativos sobre a migração celular em todas as concentrações testadas. O fechamento da

ferida foi de 56%; 69% e 88% após 24 horas de tratamento, respectivamente, na presença de

6,25; 12,5 e 25 μM. Concentrações mais elevadas estimularam a migração celular sem efeitos

tóxicos consideráveis como observado no ensaio de ATP.

Sabe-se que a fase inflamatória é um dos estágios mais importantes no processo

de cicatrização. Portanto, a inibição de mediadores pró-inflamatórios pode ser uma

abordagem terapêutica efetiva para regular a progressão do processo de cicatrização de feridas

(Wedler et al., 2014).

O VEGF e a IL-8 desempenham um papel importante na inflamação da pele e são

produzidos por queratinócitos ativados (Takematsu & Tagami, 1993; Viac et al., 1997). O

VEGF também é produzido pela maioria das células inflamatórias, incluindo eosinófilos,

linfócitos, macrófagos e neutrófilos (Taichmann et al., 1997) e desempenham papéis

fundamentais nas três fases da cicatrização de feridas (Stone & Bhimji, 2017). Ambos os

mediadores são super expressos em doenças da pele que estão associadas à angiogênese

aberrante (Pietrazk et al., 2008; Smith et al., 2007; Xia et al., 2003).

No presente estudo, demonstramos que o extrato de Pp, o óleo essencial de Cv, a

associação dos extratos e C1, impulsionaram a produção de VEGF. Pp e Cv apresentaram

uma resposta aumentada dos níveis de VEGF dependente da concentração. A associação e C1

também apresentaram uma resposta aumentada em concentrações mais elevadas. Essas

amostras parecem possuir potentes efeitos angiogênicos, apesar de apresentar respostas

antiproliferativas e anti-migratórias. Na resposta inflamatória mediada por TNF-α a IL-8 em

células HaCaT, todos os diferentes tratamentos diminuíram significativamente os níveis de

IL-8.

Quando as células foram pré-tratadas com α-Humuleno (12,5 e 25 μM), a

secreção de VEGF foi aumentada, comparável ao grupo sem tratamento e estimulado por

TNF-α. No entanto, quando as células foram tratadas com concentrações mais baixas do

composto (6,25 μM), apresentou uma inibição nos níveis de VEGF. O α-Humuleno

apresentou a maior redução na produção de IL-8, concentração dependente, com resultados

mais expressivos do que a hidrocortisona, sugerindo uma forte atividade anti-inflamatória.

Esta inibição não está relacionada a um efeito citotóxico geral, uma vez que a viabilidade

celular em todas as concentrações testadas permaneceu constante ao longo do período de

incubação.

138

O efeito do α-Humuleno na migração celular parece estar relacionado com o

VEGF, pois este fator de crescimento é a molécula de sinalização mais prevalente e específica

para células endoteliais e particularmente estimula a migração e proliferação celular (Frank et

al., 1995; Wilgus et al., 2005), uma vez que as concentrações mais elevadas (12,5-25 μM)

demonstraram um fechamento da ferida de quase 90% e níveis elevados de VEGF.

Este composto também possui ação anti-inflamatória, apresentando uma forte

atividade anti-inflamatória, inibindo a IL-8 estimulada pelo TNF-α em células HaCaT.

Estudos farmacológicos realizados com Cordia verbenacea validaram a atividade anti-

inflamatória, atribuindo esse efeito à presença do α-Humuleno e Trans-Cariofileno isolados

da planta, que inibiu significativamente a expressão da ciclooxigenase (COX-1 e COX-2) e

NO sintase (Fernandes et al., 2007).

Para o nosso conhecimento, nenhum dado foi publicado anteriormente sobre os

efeitos do extrato de Pp, óleo essencial de Cv, C1 e α-Humuleno sobre a migração celular e

sobre a secreção de VEGF e IL-8.

Apesar do α-Humuleno ser um dos principais compostos ativos no óleo essencial

da Cordia verbenacea e está presente em quantidades expressiva no extrato bruto da Pterodon

pubescens, ambos os extratos não demonstraram atividade na migração celular. Os efeitos

anti-inflamatórios moderados de ambos os extratos na produção induzida por TNF-α de IL-8

podem estar relacionados à presença deste composto. Uma resposta sinérgica da associação de

ambos os extratos era esperada, no entanto, não foi observado este efeito nos testes realizados

in vitro, indicando que o efeito sinérgico da associação anteriormente relatada pode estar

relacionado a outro mecanismo de ação.

139

8. CONCLUSÃO

O presente trabalho apresentou novos dados aos estudos com as espécies vegetais

Pterodon pubescens Benth. e Cordia verbenacea DC, contribuindo com parâmetros de

eficácia, segurança e reprodutibilidade, necessários para viabilizar o desenvolvimento de um

produto final.

Os resultados aqui apresentados demonstram que a associação do extrato bruto

dos frutos de Pterodon pubescens Benth. (Pp) com o óleo essencial de Cordia verbenacea DC

(Cv) possui atividades antinociceptivas e anti-inflamatórias sinérgicas, em doses mais baixas

do que os extratos brutos separados, sem demonstrar efeitos colaterais. A inflamação

significativamente inibida sugeriu que a associação tenha um papel na inibição de mediadores

inflamatórios e na via da Prostaglandina E2. Nossos resultados apontam para um possível

sinergismo entre os compostos ativos nas associações, provavelmente atuando em diferentes

receptores farmacológicos. No entanto, estudos adicionais serão necessários para

compreender os mecanismos de ação subjacentes aos efeitos da associação.

Na atividade cicatrizante in vitro, o extrato bruto dos frutos de Pterodon

pubescens Benth. (Pp), o óleo essencial de Cordia verbenacea DC (Cv) e associação de

ambos, inibiram significativamente a proliferação e migração de queratinócitos humanos in

vitro. C1 também apresentou atividade antiproliferativa e inibiu a migração das células

HaCaT em concentrações mais elevadas. Assim, estes compostos apresentam um potencial

uso como um tratamento local contra doenças cutâneas que apresentam hiperproliferação, por

exemplo.

Os estudos in vitro demonstraram a potencial atividade do composto α-Humuleno

na migração de queratinócitos. Sugere-se que o α-Humuleno pode ter uma atividade dupla -

em concentrações mais elevadas (12,5 e 25 μM), os compostos apresentam efeito anti-

inflamatório e angiogênico, enquanto em concentrações mais baixas (6,25 μM), exercem

atividade anti-angiogênica inibindo a migração celular, possivelmente pela prevenção da

secreção de VEGF.

Na atividade anti-inflamatória in vitro, todas as amostras demonstraram inibição

pela via da Interleucina-8, onde o α-Humuleno demonstrou maior atividade. O tratamento

com α-Humuleno pode ser uma estratégia terapêutica potencial para promover a cicatrização

de feridas e para prevenir a inflamação em uma condição inflamatória persistente

140

9. PERSPECTIVAS FUTURAS

Para a compreensão de como a associação dos extratos está agindo na resposta

anti-inflamatória, testes in vitro serão realizados com os extratos separadamente, a associação

e também seus compostos ativos.

Durante este trabalho de doutorado, a padronização e implantação de um modelo

in vitro para a investigação de propriedades anti-inflamatórias, utilizando o macrófago da

linhagem RAW 264.7, foi um dos objetivos iniciais e ainda encontra-se em fase de

desenvolvimento devido à dificuldade de padronização deste modelo.

Posteriormente estes experimentos serão realizados para a dosagem dos níveis de

óxido nítrico e determinação dos níveis de citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF, IL-17A e

IL-10) por citometria de fluxo.

Em adição, um dos compostos testados durante o estágio de pesquisa no

exteriror, demonstrou grande eficácia no teste de cicatrização in vitro (α-Humuleno). Para

complentar o estudo e determinar a ação cicatrizante do composto, serão realizados o teste

de cicatrização in vivo em ratos e a histologia dos tecidos.

141

10. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Dados da presente tese de doutorado contribuíram para elaboração de um pedido

de patente depositado junto a INOVA-UNICAMP no Instituto Nacional de Propriedade

Intelectual (INPI). O trabalho do grupo de pesquisas com a associação da Pterodon pubescens

e da Cordia verbenacea resultou no processo “Composição e formulação a base de

extratos/óleos essenciais de Pterodon pubescens benth. e Cordia verbenacea DC, e usos”.

Processo número: BR 102015012438-4 A2 (Anexo 3). Esta patente também foi depositada

internacionalmente, processo número: PCT/BR2016/000018 (Anexo 4). Este trabalho também

resultou na submissão de uma publicação para a revista Journal of Etnopharmacology, com o

título “Synergistic effect of Pterodon pubescens and Cordia verbenacea plant extracts

association in antinociception and anti-inflammatory experimental models” (Anexo 5).

142

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12. ANEXOS

Anexo 1: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 3181-1)

160

Anexo 2: Comitê de Ética em Experimentação Animal (nº 4392-1)

161

Anexo 3: Depósito de Patente Nacional

162

Anexo 4: Depósito de Patente Internacional

163

Anexo 5: Submissão de artigo a Journal of Etnopharmacology

universidade estadual de campinas faculdade de...

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