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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
Curso de Pós-Graduação em BIOTECNOCIÊNCIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carlos Eduardo de Castro
Santo André
2015
O PAPEL DE PARÂMETROS ESTRUTURAIS NA
INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE SISTEMAS
POLIMÉRICOS NANOESTRUTURADOS
Curso de Pós-Graduação em BIOTECNOCIÊNCIA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Carlos Eduardo de Castro
Trabalho apresentado como requisito parcial para
obtenção do titulo de mestre em
Biotecnociência, sob orientação do Professor
Doutor Fernando Carlos Giacomelli
Santo André
2015
O PAPEL DE PARÂMETROS ESTRUTURAIS NA
INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE SISTEMAS
POLIMÉRICOS NANOESTRUTURADOS
A presente dissertação foi realizada inteiramente pelo autor no
período de setembro de 2013 a agosto de 2015, no Programa de Pós-
Graduação em Biotecnociência da UFABC sob a orientação do Prof. Dr.
Fernando Carlos Giacomelli.
Carlos Eduardo de Castro
Orientador: Prof. Dr. Fernando Carlos Giacomelli
“O meu olhar alcança o longe. Contempla o território que me separa da
concretização de meu desejo. O destino final que o olhar já reconhece como
recompensa, aos pés se oferece como lonjura a ser vencida. Mas não há pressa que seja
capaz de diminuir esta distância. Estamos sob a prevalência de uma imposição
existencial, regra que ensina, que entre o ser real e o ser desejado, há o senhorio
inevitável do tempo das esperas”
Pe. Fábio de Melo
À minha família, em especial ao meu pai José, e minha mãe Fátima pelo incondicional
apoio. À minha esposa Ellen, pelo incentivo e motivação que serviram de suporte e
inspiração para o desenvolvimento desse projeto, pois “ um homem honrado não
encontrará uma amiga melhor do que sua esposa”.
Jean Jacques Rousseau
AGRADECIMENTOS
Há muito que agradecer e início agradecendo a Deus, que me ensinou que a
simplicidade só é possível aos que ousaram trilhar os caminhos da maturidade, que me
mostrou que Ele nunca esteve longe nem perto, Deus apenas é.
Agradeço infinitamente ao meu caro e estimado orientador Dr. Fernando Carlos
Giacomelli, que tanto me ensinou, me guiando pelos caminhos da ciência, me
silenciando nos momentos de profunda confusão e barulho, clareando em minha mente
que todo silêncio fecundo já tem sabor de palavra e respostas. Te agradeço por ter
consolidado a química dentro de meu saber, agregando valores sólidos às minhas metas,
contribuindo para o cumprimento de cada missão que depositou em mim a
responsabilidade de realizar. Obrigado por me mostrar que a sabedoria carece de
esforço e dedicação para crescer.
Aos estimados professores Dr. Jean-Jacques Bonvent e Dr. Wanius Garcia, que
me mostraram gratuitamente os valores da física para a ciência que me dedico hoje,
obrigado por me fazer olhar a física, não como sabedoria distante, mas como arte
presente e viva.
Agradeço ao apoio e dedicação dos professores Dr. Arnaldo Rodrigues dos
Santos Junior, Dr. Maria Cristina Carlan, Dr. Renata Simões, Dr. Fabiane Lucy Ferreira
Castro, por terem me acolhido e confiado em mim, obrigado pelos ensinamentos nas
ciências biológicas que contribuíram para iluminar meu percurso até aqui, pois suas
palavras me fizeram buscar na bioquímica e no íntimo molecular da vida, as perguntas
reais a serem feitas e as respostas a serem buscadas.
Agradeço ao professor Dr. Mauricio Baptista, por ter aberto as portas de seu
laboratório no instituto de química, USP, e ao Dr. Tiago Rodrigues por ter me ajudado
com as pesquisas e ensaios de SPR.
Agradeço às agências de fomento, FAPESP, CNPq e à UFABC que tornaram
este projeto viável.
Aos meus amigos que me mostraram o valor da amizade e que ela é um encontro
de almas que se reverenciam. Obrigado por terem me apoiado neste momento de minha
história. Em especial ao meu amigo Alex Sandro Casemiro, que a tantos anos
compartilhamos nossas histórias e pelo apoio a prosseguir meus estudos, meu super
abraço.
Quero agradecer ao meu pai José e minha mãe Fátima, por sempre terem me
estimulado aos estudos desde criança, me mostrando o valor da ciência e da sabedoria.
Por fim, agradeço à mulher que Deus colocou na minha vida, que desde os
tempos de namoro, me inspirou a buscar dentro de mim meu potencial. Obrigado a você
minha esposa Ellen, por ter me inspirado, impulsionado, acreditado nos momentos
difíceis, me mostrando o caminho. Obrigado por cada passo dado junto comigo, por ter
compartilhado este momento de minha e de nossa história, por ser a razão de minha
ciência, meu amor e a alegria de minha pesquisa, eu te amo.
Por fim, agradeço de uma forma geral, a todas as pessoas que estiveram
envolvidas direta ou indiretamente neste projeto, e contribuíram de forma impar para
seu amadurecimento e realização.
SUMÁRIO
RESUMO .......................................................................................................................... 16
ABSTRACT ...................................................................................................................... 17
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 18
2. OBJETIVOS ........................................................................................................... 19
3. REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................. 20
3.1. O CÂNCER E A UTILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ................................ 20
3.2. INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE NANOPARTÍCULAS .............................. 22
3.3. INTERAÇÃO NANOPARTÍCULA-MEMBRANA CELULAR .......................... 26
3.4. PARÂMETROS QUE INFLUENCIAM A INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE
NANOPARTÍCULAS ............................................................................................ 28
3.4.1. TAMANHO ............................................................................................................ 28
3.4.2. FORMA .................................................................................................................. 29
3.4.3. NATUREZA QUÍMICA DA SUPERFÍCIE .......................................................... 29
4. METODOLOGIA ................................................................................................... 31
4.1. MATERAIS UTILIZADOS ................................................................................... 31
4.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ....................................................... 32
4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ............................................. 33
4.3.1. ESPALHAMENTO DE LUZ ................................................................................. 33
4.3.1.1. ESPALHAMENTO DE LUZ DINÂMICO (DLS) ......................................... 33
4.3.1.2. ESPALHAMENTO DE LUZ ESTÁTICO (SLS) ........................................... 34
4.3.1.3. ESPALHAMENTO DE LUZ ELETROFORÉTICO (ELS) ........................... 35
4.3.2. MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA ........................................................... 35
4.4. INTERAÇÃO NANOPARTÍCULA-MEMBRANA ............................................. 36
C.E.de Castro
6
4.4.1. PREPARAÇÃO DA MEMBRANA DE BICAMADA HIBRIDA ........................ 36
4.4.2. VERIFICAÇÃO DA ADSORÇÃO DE NANOPARTÍCULAS ............................ 37
4.5. INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE NANOPARTÍCULAS .............................. 38
4.5.1. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL ...................................... 38
4.5.2. CITOMETRIA DE FLUXO ................................................................................... 38
4.5.3. ANÁLISES ESTATISTICAS ................................................................................ 39
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 40
5.1 CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS ............................................. 40
5.1.1. ESPALHAMENTO DE LUZ ................................................................................. 40
5.1.2. MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA ............................................................ 46
5.2. ADSORÇÃO DE NANOPARTÍCULAS EM MEMBRANA BIOMIMÉTICA .. 48
5.3. INVESTIGAÇÕES DA CAPTURA CELULAR DOS NANOCARREADORES
POLIMÉRICOS ..................................................................................................... 52
5.3.1. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL ...................................... 52
5.3.2. CITOMETRIA DE FLUXO ................................................................................... 57
6. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 60
7. REFERÊNCAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 61
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Representação esquemática do acúmulo de nanopartículas em regiões de
tumor sólido devido ao efeito EPR. ................................................................................ 22
FIGURA 2. Representação esquemática das principais vias de internalização celular de
sólidos e fluidos. ............................................................................................................. 24
FIGURA 3. Processo de captura de nanopartículas na superfície da membrana celular.
As elipses em azul representam clatrina e as esferas vermelhas representam NPs
funcionalizadas (pontos amarelos) que se ligam ao receptores de membrana em forma
de Y. (Figura adaptada Ref. 46). .................................................................................... 27
FIGURA 4. Representação da captura celular e as forças interfaciais envolvidas. As
características intrínsecas das NPs que promovem a ligação com a superfície
(rugosidade, hidrofobicidade, carga catiônica) geralmente levam a forças de ligação não
específicas que promovem a adsorção celular. ............................................................... 27
FIGURA 5. Estrutura química dos copolímeros em bloco PEOm-b-PCLn (A), PEOm-b-
PLAn (B) e do copoliéster não anfifílico PLGA (C). ..................................................... 32
FIGURA 6. Esquema de preparação de uma membrana de bicamada hibrida (HBM)
sobre superfície de ouro utilizando monocamada hidrofóbica de tiol.( figura adaptada)
........................................................................................................................................ 36
FIGURA 7. Funções de correlação temporal (ACFs) monitoradas em diferentes ângulos
e a distribuição de tempos de relaxação determinada a partir da ACF monitorada a 90°
(A), vs. q2 (B), Kc/R vs. q
2 (C) e distribuição de potencial- (D) para NPs de PLGA
produzidas a partir de THF ( THF = 1,00). ..................................................................... 41
FIGURA 8. Influência de THF nos parâmetros estruturais (RG, RH, potencial-ζ, Mw(NPs),
PDI e densidade estimada) dos diferentes sistemas poliméricos nanoestruturados
produzidos conforme a legenda mostrada em (A). ......................................................... 42
FIGURA 9. Imagens obtidas por AFM para NPs de PLGA e PEO113-b-PLA236
produzidas a partir de THF juntamente com os respectivos histogramas de distribuição
de tamanho. ..................................................................................................................... 48
FIGURA 10. Variação da reflectância em função do tempo durante a formação da
bicamada hibrida em fluxo de água milli-Q® e posterior solução tampão Hepes 10mM
pH 7,5 conforme indicado. ............................................................................................. 50
FIGURA 11. Variação da reflectância em função do tempo durante a injeção de
diferentes nanopartículas poliméricas de acordo com a Tabela 2. ................................. 51
C.E.de Castro
6
FIGURA 12. Imagens de microscopia de fluorescência confocal para células de
glioblastoma U251 incubadas com nanopartículas de PLGA preparadas a partir de (A)
acetona (THF =0,00) e (B) THF (THF = 1,00) e contendo a mesma quantidade da sonda
hidrofóbica fluorescente cumarina-6, que pode ter a fluorescência verde evidenciada na
coluna 1. A coluna 2 mostra o canal DAPI e se refere a fluorescência azul do meio de
montagem Hoechst marcando o núcleo celular. Na coluna 3 se evidencia a sobreposição
das colunas 1 e 2. O tempo de incubação foi de 2 horas e as imagens são mostradas em
aumento de 63X. ............................................................................................................. 53
FIGURA 13. Imagens de microscopia de fluorescência confocal para células de
glioblastoma U251 incubadas com NPs produzidas a partir de copolímeros em bloco a
partir da mistura 50:50 de THF e acetona (THF =0,50) e contendo a mesma quantidade
da sonda hidrofóbica fluorescente cumarina-6 encapsulada. O tempo de incubação foi
de 2 horas e as imagens são mostradas em aumento de 63X. ........................................ 55
FIGURA 14. Histograma de intensidade de fluorescência para PEO250-b-PLA153 e
PEO45-b-PCL118 marcadas com cumarina-6 após incubação de 2 horas em células de
glioblastoma U251. O controle diz respeito à autofluorescência das respectivas células.
........................................................................................................................................ 57
FIGURA 15. Análise quantitativa da internalização celular de NPs marcadas com
cumarina-6 capturadas por células de glioblastoma U251 após 2 horas de incubação.. 58
ÍNDICE DE TABELAS
TABELA 1. Características moleculares dos copolímeros PEOm-b-PLAn, PEOm-b-
PCLn e PLGA (L:G 50:50). (subscritos fazem referência ao grau de polimerização de
cada bloco). ..................................................................................................................... 31
TABELA 2. Nanopartículas selecionadas para as medidas de SPR. ............................. 50
TABELA 3. Tempo de adsorção de diferentes NPs sobre a superfície da membrana de
bicamada hibrida............................................................................................................. 52
LISTA DE ABREVIATURAS
DLS * espalhamento de luz dinâmico
SLS * espalhamento de luz estático
DLS * espalhamento de luz eletroforético
AFM * microscopia de força atômica
PDI * índice de polidispersão
ACF * função de correlação temporal
NPs nanopartículas poliméricas
PCL * policaprolactona
PEO * polioxietileno
PLA * poli ácido láctico
PLGA * poli (ácido láctico-co-glicólico)
DMPE * 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfatidiletanolamina-N,N-dimetil)
DMPC * 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
CL cardiolipina
VEGF * Fator de crescimento vascular endotelial
VPF * Fator de permeabilidade vascular
* siglas em inglês
C.E.de Castro
16
RESUMO
O presente estudo se insere na emergente área da nanomedicina, tendo como base a
ciência de coloides e interfaces, e teve como objetivo inicial a síntese de nanopartículas
poliméricas usando diferentes copolímeros para se obter sistemas nanoestruturados com
diferentes características no que se refere à dimensão, carga superficial e estrutura
interna. Os dados experimentais de espalhamento de luz e imagem mostraram que foi
possível obter sistemas poliméricos nanoestruturados de diferentes tamanhos e carga
superficial utilizando o protocolo de nanoprecipitação. Haja vista a diferença estrutural
dos polímeros utilizados, as nanopartículas produzidas são estruturalmente diferentes do
ponto de vista de tamanho de núcleo hidrofóbico e coroa hidrofílica. Também foi
possível elucidar a influência destes parâmetros estruturais na captura e internalização
celular das entidades. Os resultados sugerem que a espessura da coroa hidrofílica de
polioxietileno (PEO), que tem o papel fundamental de estabilizar as nanoestruturas
produzidas, é decisiva no processo. Na medida em que foram utilizados copolímeros em
bloco de longa cadeia hidrofílica, percebeu-se uma redução semi-quantitativa e
quantitativa na internalização celular das entidades. A carga superficial também possui
importante papel no processo que, porém, é ofuscado pelo fator dimensão da coroa,
onde para nanopartículas de elevado potencial- (~ - 40 mV), que é o caso de NPs de
PLGA, a internalização celular não apresentou diferença estatisticamente significativa
em comparação com outros sistemas. Por outro lado, NPs apresentando cadeias
estabilizantes de PEO mais curtas (Mw ~ 2000 g.mol-1
) foram mais eficientemente
internalizadas, apesar de seu potencial- negativo (~ -20 mV). Para NPs com o mesmo
tamanho de cadeia estabilizante de PEO, os dados experimentais sugerem que NPs
formadas por um bloco hidrofóbico de policaprolactona (PCL) são internalizadas de
maneira mais eficiente em comparação com NPs formadas por um bloco hidrofóbico de
poli ácido lático (PLA). Este último efeito foi atribuído a maior hidrofobicidade do
bloco de PCL, o que vai de encontro com o modelo teórico da molhabilidade, apesar
dos resultados de SPR mostrar adsorção a membrana mimética somente das NPs a base
de PLA.
Palavras-Chave: nanopartículas poliméricas, internalização celular.
C.E.de Castro
17
ABSTRACT
Herein, the cellular uptake of naked PLGA and PLA- and PCL-based block
copolymer nanoparticles (NPs) have been evaluated. The nanoparticles were produced
containing the same amount of loaded fluorescent cumarina-6 (0.5 % wprobe/wpolymer) by
using the so-called nanoprecipitation protocol. This procedure yielded nano-sized
objects with distinct structural features dependent on the length of the hydrophobic and
hydrophilic blocks and volume ratio. They were further detailed characterized by
scattering techniques and atomic force microscopy. The cellular uptake of selected
nanoparticles has been evaluated by laser confocal scanning microscopy and flow
cytometry analysis. The cellular uptake events were examined in relation to size, surface
charge, hydrophobic core nature and hydrophilic chain length of the produced NPs. The
experimental results indicated that cellular uptake was considerably enhanced as the
length of the hydrophilic PEO-stabilizing shell reduces. Additionally, it has been also
evidenced that a high negative surface charge restricts cellular uptake and that, on the
other hand, nanoparticles comprising a hydrophobic core of higher degree of
hydrophobicity (PEO-b-PCL) are more efficiently internalized as compared to PEO-b-
PLA NPs. In summary, there should be a compromise regarding protein fouling and
cellular uptake as resistance to non-specific protein adsorption and enhanced cellular
uptake are respectively directly and inversely related to the length of the PEO
stabilizing shell.
Keywords: polymeric nanoparticles, cellular uptake.
C.E.de Castro
18
1. INTRODUÇÃO
A possibilidade de se desenvolver nanomateriais com estruturas e dimensões
similares a entidades biológicas tais como DNA, vírus, proteínas e bactérias e a
potencial aplicação de sistemas nanoestruturados na área da saúde humana deu origem a
nanomedicina. A nanomedicina tem se destacado como um dos principais ramos
científicos interdisciplinares por exigir daqueles que se envolvem nas pesquisas,
conhecimento das mais diversas áreas tais como bioquímica, físico-química, biologia
molecular e celular, farmacodinâmica e farmacocinética. A aplicação de nanomedicina
no combate ao câncer tem sido foco de investigações tanto da academia quanto da
indústria farmacêutica, principalmente depois das possibilidades que surgiram após a
descoberta do efeito de aumento da permeabilidade e retenção (do inglês Enhanced
Permeability and Retention Effect - EPR)1 Neste cenário, agentes ativos são
encapsulados no interior de sistemas nanoestruturados sendo liberados em sítios
específicos de ação como por exemplo em sítios tumorais, diminuindo efeitos colaterais
e aumento a eficácia terapêutica.
Por outro lado, a compreensão da interação de nanomateriais com superfícies
biológicas é um dos grandes desafios da área da nanobiotecnologia. A interação de
nanopartículas com proteínas, membranas e células promove a formação de nano-
biointerfaces2,3
que em um primeiro olhar podem ser compreendidas utilizando-se os
mesmos princípios da ciência de coloides, onde forças de van der Waals (VDW),
eletrostáticas, hidratação e efeitos solvofóbicos desempenham papel fundamental.
Principalmente o processo de interação NP-membrana celular inevitavelmente afeta o
processo de absorção celular de sistemas carreadores de agentes ativos (drug delivery) o
que por consequência afeta a eficácia do tratamento proposto. A interação NP-
membrana depende das características físico-químicas da membrana celular e também
da estrutura do sistema nanométrico, ou seja, do seu tamanho, forma, natureza química,
rugosidade e hidrofobicidade. Levando-se em conta as considerações supracitadas, no
presente projeto de mestrado procurou-se compreender como as características
estruturais de sistemas poliméricos dimensionados na escala nanométrica afetam o
processo de internalização celular dos mesmos. Os resultados podem futuramente
contribuir para a fabricação de sistemas de entrega de fármacos e terapias contra o
câncer mais eficazes.
C.E.de Castro
19
2. OBJETIVOS
Com base nas considerações preliminares supracitadas, a presente dissertação teve
como objetivos principais:
Produzir nanopartículas poliméricas com diferentes propriedades físico-
químicas a partir de copolímeros biocompatíveis através da técnica de
nanoprecipitação utilizando combinações de solventes puros ou misturas de
solventes apropriadas;
Caracterizar estruturalmente as NPs produzidas por técnicas de microscopia e
espalhamento de luz;
Verificar a força de adsorção das NPs a membranas miméticas;
Avaliar o perfil de captura celular das nanopartículas;
Quantificar a eficiência da internalização celular dos sistemas produzidos e
discutir como os parâmetros estruturais das nanopartículas poliméricas
produzidas (tamanho, carga e cobertura superficial) influenciam o processo de
internalização celular.
C.E.de Castro
20
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1. O CÂNCER E A UTILIZAÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
Há muito tempo já se sabe que a granulometria de fármacos constitui um parâmetro
importante em tecnologias farmacêuticas. Pela trituração e a redução do tamanho de
partículas, a área superficial é aumentada resultando em benefícios farmacêuticos e
clínicos que podem incluir um aumento das taxas de dissolução aquosa de substâncias
pouco solúveis, melhor biodisponibilidade, possibilidade de administração de dosagens
menores por via oral e um maior número de opções para o preparo de suspenções
estáveis e dispersões coloidais.4 Por outro lado, uma elevada porcentagem de fármacos
candidatos para terapia do câncer é de difícil solubilização em água o que constitui um
grande desafio atual para o aumento da eficácia de agentes anti-neoplasicos.5
Uma interessante estratégia para aumentar a solubilidade destes agentes é a
utilização de nanocarreadores, promovendo também um maior tempo de circulação
sanguínea para o agente ativo, bem como evitando a sua rápida captura pelo sistema
fagocitário mononuclear. Em que pese às aplicações biomédicas, a utilização de
sistemas nanoestruturados à base de matéria mole (polímeros) é que têm se difundido de
maneira acelerada, principalmente como nanocarreadores terapêuticos. Nesta classe,
podem ser citados os conjugados polímero-fármaco, lipossomas, micelas e
nanopartículas poliméricas biodegradáveis. Estes sistemas nanoestruturados podem
acomodar em seu interior um enorme número de diferentes agentes ativos, tais com
fármacos, agentes de contraste, proteínas e ácidos nucleicos, podendo assim ser
utilizados em uma miríade de aplicações. Sistemas à base de matéria mole vêm
recebendo tamanha atenção devido à sua versatilidade, pelo fato de suas características
estruturais poderem ser modificadas mediante alteração do protocolo de fabricação e
pelo fato de poderem responder a estímulos externos ou fisiológicos específicos.6,7
As nanopartículas (NPs) poliméricas biodegradáveis são entidades nanométricas
onde o agente ativo (geralmente hidrofóbico) está fisicamente aprisionado no seu
interior por meio de interações hidrofóbicas ou através de conjugação química.8 Nos
últimos anos, estas entidades têm atraído atenção considerável como sistemas de entrega
de fármacos devido a sua grande vantagem de que os produtos de degradação não são
tóxicos ao organismo quando polímeros tais como poli ácido láctico (PLA), poli (ácido
láctico-co-glicólico) (PLGA), polioxietileno (PEO) e policaprolactona (PCL) são
C.E.de Castro
21
considerados. Estes biopolímeros, além de não apresentarem toxicidade significativa,
são eliminados do corpo por vias metabólicas naturais.9 Este tipo de NPs tem sido uma
ferramenta importante no tratamento de doenças neurodegenerativas, devido a sua
habilidade de atravessar a barreira hemato- encefálica,10
bem como para o tratamento de
doenças cardiovasculares, devido ao seu tamanho, forma e vasta área superficial
disponível para conjugação de biomoléculas.11
Entretanto, é na vetorização de fármacos anticarcinogênicos que esta tecnologia
avançou substancialmente. No sistema circulatório, estes nanomateriais tem se livrado
da eliminação pelas defesas do organismo, evitando também a ligação com proteínas
não especificas e aumentando assim seu tempo de circulação, o que por consequência
aumenta a probabilidade das entidades alcançarem alvos tumorais promovendo
liberação mais seletiva de agentes ativos.12
Geralmente, nanocarreadores (com
dimensões entre 20-100 nm) são muito grandes para extravasarem e se acumularem em
tecidos saudáveis. Entretanto, possuem dimensões adequadas para atravessarem a
vasculatura desorganizada e porosa das regiões tumorais, sendo acumulados no interior
de seus interstícios. Além disso, os vasos linfáticos estão ausentes ou não-funcionais
nestes locais, contribuindo para uma ineficiente drenagem. Este fenômeno é conhecido
com efeito do aumento da permeabilidade e retenção (efeito EPR) conforme
esquematizado na Figura 1.
Em tecidos normais, as fenestras dos vasos sanguíneos estão bem justapostas
formando uma barreira celular que vetores dimensionados na escala nanométrica não
são capazes de atravessar. Por outro lado, em regiões de tumores sólidos há uma alta
permeabilidade devido a super expressão de fatores como o de permeabilidade vascular
(VPF) e fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), além da secreção de vários
hormônios como o fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) além de óxido
nítrico. Tudo isso também contribui eficazmente para dilatação dos vasos.13
Sendo
assim, nanovetores penetram e se acumulam com maior facilidade em sítios tumorais
uma vez que as dimensões nos poros endoteliais variam de 10 nm a 2 µm.14
Outra
peculiaridade é a alteração do pH no sítio de tumores sólidos que é mais ácido em
relação aos tecidos sadios, sendo que isto está associado ao tipo de respiração celular,
uma vez que células tumorais tendem a fazer anaerobiose em relação a maioria das
outras células, alterando o metabolismo da glicose para o processo fermentativo, com
geração de lactato no final da via glicolítica. As células tumorais consomem maiores
quantidades de glicose em relação as quantidades consumidas por células não tumorais,
C.E.de Castro
22
e mesmo em tensões de O2 suficientes para a oxidação completa da glicose, células
tumorais tendem a fermentar este açúcar em lactato, gerando quantidades suficientes de
energia, substratos e coenzimas reduzidas, importantes para síntese.15
A secreção de
altas concentrações de lactato e íons H3O+ para o meio extracelular contribuem para a
acidificação do mesmo, o que também está relacionado com a facilidade da mobilidade
e metástase celular pela ativação de metaloproteinases, importantes para angiogênese e
processo metastático.16
FIGURA 1. Representação esquemática do acúmulo de nanopartículas em regiões de
tumor sólido devido ao efeito EPR.
Assim, o conhecimento do efeito EPR está se tornando um paradigma promissor
no desenvolvimento de terapias contra o câncer. Como resultado destas características
anatômicas e patofisiológicas únicas dos tecidos tumorais em comparação com tecidos
normais, a concentração tumorotrópica de macromoléculas e nanopartículas poliméricas
encontradas nestes tecidos chega a ser 100 vezes maior do que a encontrada em tecidos
normais.17,18,19,20
3.2. INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE NANOPARTÍCULAS
Adicionalmente, em muitos casos, não basta que NPs se acumulem no interior de
interstícios tumorais. Para uma ação eficaz de agentes ativos encapsulados, geralmente é
necessário que estas entidades sejam capturadas para o interior das células doentes. A
captura celular é altamente exigente e a interação de NPs com a membrana celular,
C.E.de Castro
23
seguida pela internalização e formação de vesículas são os primeiros passos do processo
de endocitose. Neste processo são formadas vesículas de diferentes tamanhos e
ambientes internos chamadas de endossomos, fagossomos ou macropinosomos
dependendo da via de internalização que é essencialmente dependente do tamanho,
morfologia e natureza química da superfície das NPs. Este processo também é
dependente da linhagem celular.21
A endocitose é o processo fundamental utilizada pelas células na captura de
nutrientes, moléculas e macromoléculas. As vias endocíticas podem ser divididas em
fagocitose e pinocitose. O processo de fagocitose envolve a internalização celular de
partículas sólidas como, por exemplo, bactérias, e só ocorre em alguns poucos tipos de
células especiais. A captura através da fagocitose também pode ocorrer em escala
nanométrica, porém, é bem conhecido que esta via está fortemente ligado a opsonização
proteica que por sua vez promove agregação, fazendo desta via endocítica um sistema
de captura inespecífico. Quando alguma partícula interage com os receptores da
superfície celular ocorre um direcionamento da membrana que se distorce em forma de
taça ao redor da partícula gradualmente (Figura 2). Esta distorção dispara o rearranjo da
actina resultando numa extensão da membrana ao redor da partícula com uma espécie
de fecho de bloqueio, terminando com a formação de um fagossomo de forma e
tamanho ditado pela característica do material fagocitado.22
Este processo é amplo e
requer uma grande contribuição da membrana plasmática, envolvendo outras organelas
como endossomos, lisossomos e reticulo endoplasmático.23
Os materiais capturados
pela fagocitose, como envolvem grande volume de membrana, resultam em fagossomos
que ignorem os endossomos iniciais sendo diretamente fusionados com lisossomos para
acelerar o processo de degradação.24,25
Já o processo de pinocitose é dividido em endocitose dependente de clatrina, e
independente de clatrina como mediada por caveolina, flotina, ou outros mecanismos tal
como a macropinocitose.26
A fagocitose e a macropinocitose são processos de captura
de partículas grandes (> 1 µm). Todavia, os processos dependentes de clatrina e
caveolina são os principais processos para internalização celular de nanopartículas
menores (Figura 2).27
No processo de endocitose mediado por clatrina ocorre a
concentração de receptores trans membrana na membrana plasmática formado pelo
conjunto de proteínas citosólicas, sendo que a proteína clatrina desempenha papel
fundamental no processo.28,29
C.E.de Castro
24
O processo de endocitose mediado por clatrina geralmente é dominante na
internalização de nanopartículas submicrométricas (de até 300 nm).30,31
As fendas geradas pelos poços cobertos podem ter caráter exploratório, podendo
aparecer randomicamente na superfície da membrana entrando em colapso a menos que
um evento molecular acometa o poço revestido gerando o brotamento vesicular.32
No
entanto, se houver alguma interação molecular na superfície externa da membrana,
proteínas adaptadoras recrutam no citosol as proteínas clatrina e coordenam a nucleação
da mesma do lado citosólico da membrana onde irá ocorrer a internalização. Este evento
aciona a montagem das unidades de clatrina que formam uma teia de cobertura
poligonal esférica ancorada na membrana no local indicado pelas proteínas adaptadoras,
sendo que em última análise dirige a deformação da membrana no sitio a ela ancorada,
culminando com a formação de um broto endocítico, coberto de clatrina, onde a carga
está em seu interior.
FIGURA 2. Representação esquemática das principais vias de internalização celular de
sólidos e fluidos.
A invaginação da membrana durante a formação da vesícula coberta de clatrina
se dá pela interação de proteínas modeladoras de membrana com a própria membrana.
O trabalho em conjunto dessas proteínas começa a reconhecer os locais para os
diferentes tipos de carga selecionando os pontos, enquanto a rede de clatrina estabiliza a
deformação dos sítios onde está ancorada na membrana, resultando por fim na formação
de um estreitamento da mesma, que é cortada pela intervenção de proteínas especificas
o que leva ao destacamento da membrana e liberação da vesícula coberta no citosol.33,34
Ao passo que o fluído extracelular é aprisionado nos poços de clatrina ou nas
fossas de caveolina, conforme elas vão se invaginando para formar as vesículas
revestidas, qualquer substância dissolvida no fluído extracelular é internalizada por um
C.E.de Castro
25
processo conhecido como endocitose de fase fluida.35
No processo de endocitose
mediado por caveolina, que é a mais importante via endocítica independente de clatrina,
ocorrem invaginações na membrana plasmática que intermediam a absorção de
agregados extracelulares através de ligação específica a receptores.36,37,38
Este
mecanismo é eficiente no processo de internalização celular de nanopartículas com
tamanho ligeiramente menor (50-80 nm) quando comparado ao processo intermediado
por clatrina,39,40
como demonstrado na Figura 2. As caveolinas são proteínas ancoradas
na membrana celular do lado citosólico por sequências hidrofóbicas, sendo que a
caveolina-1 e sua análoga de tecido muscular caveolina-3, são responsáveis por formar
os caveolos na membrana regulando a tensão da mesma.41, 42
Na endocitose mediada por
caveolina, o tráfego de vesículas resulta na fusão vesicular com um compartimento
chamado de caveossomo, organela rica em caveolina-1, e em contraste com os outros
tipos de compartimento endocítico, possui um lúmem de pH neutro. Neste local o
material é selecionado para um endossomo inicial ou para a rede trans do Complexo de
Golgi, e devido a esta peculiaridade está associado à transcitose, onde foi verificado que
diversos componentes plasmáticos e microrganismos usam esta rota para atravessar os
tecidos endoteliais polarizados.43,44
Há outras vias de endocitose independente de clatrina e caveolina, como a
mediada por flotina, que se trata de uma proteína localizada nas frações detergentes
flutuantes da membrana lipídica, são palmitoladas estruturalmente na forma de ganchos
quando ligados a membrana. Essa formação é muito similar a caveolina-1, sugerindo
papel análogo na triagem lipídica, induzindo o agrupamento da membrana e
subsequente internalização, que ocorre como para as anteriores, pelo estreitamento do
gargalo formado no broto endocítico para que ocorra o destacamento vesicular, que é
devido a uma proteína comum da família das GTPases, a dinamina. Reguladora dos
mecanismos de entrada, a dinamina representada pelas esferas verdes no istmo dos
brotos endocíticos na Figura 2 se agrega numa formação helicoidal ao redor do estreito
gargalo fosfolipídico formado pela invaginação da membrana, e corta irreversivelmente
separando a vesícula da membrana plasmática.40
Embora a grande maioria de vias
endocíticas façam uso da dinamina, existem outras que não precisam de seu auxilio e
que também demonstram um sistema de endocitose que captura materiais com tamanho
superior a 200 nm e menores de 2 µm, como a macropinocitose, um processo regulado
pela actina. Entretanto, ao contrário da fagocitose, a macropinocitose não está
relacionada à opsonização proteica, mas com ondulações da membrana onde podem
C.E.de Castro
26
ocorrer protrusões na superfície celular que englobam o material pela ação da
polimerização da actina iniciada por proteínas Rho, também pertencente à família das
GTPases, estimuladas por fatores intrínsecos, como de crescimento.40
Uma vez
capturadas, e atravessando a membrana, há a formação de macropinosomos.45
3.3. INTERAÇÃO NANOPARTÍCULA-MEMBRANA CELULAR
O fenômeno de interação nanopartícula-membrana, primeira etapa da captura
celular, envolve uma série de forças e fenômenos interfaciais. A aderência de partículas
e a imersão nos sítios de adesão requerem interações ligante específicas e/ou não
específicas que contrabalancem as forças de resistência que impedem a absorção de
partículas conforme esquematicamente representado na Figura 3.46,47
O tempo de captura celular (wrapping time) expressa quantitativamente a soma das
forças promotoras como a interação específica receptor-ligante, liberação de energia
livre no local de contato, energia dependente da membrana e dos componentes do
citoesqueleto e forças de motilidade como, por exemplo, as relacionadas à formação da
rede de clatrina (Figura3). O tempo de captura celular também depende de uma série de
parâmetros incluindo tamanho, forma e carga superficial da partícula bem como da
elasticidade da membrana. Para que a captura celular aconteça, interações específicas
(ligante-receptor) ou não específicas (forças hidrofóbicas, eletrostáticas)48
devem
diminuir a energia livre no sítio de adsorção sobrepondo-se às forças restritivas,49
que
incluem a exclusão hidrofóbica de superfície polar pela superfície da membrana e
flutuações térmicas da membrana celular.
Sendo assim, o processo de internalização celular de NPs se mostra bastante eficaz
quando a força de ligação NP-membrana celular é intensa, tal como no caso de ligações
ligante-receptor50
, uma vez que, para realizar a captura mediada por ligante, os
receptores de membrana devem se difundir para o sítio de adesão para formar um
número crítico de interações.
C.E.de Castro
27
FIGURA 3. Processo de captura de nanopartículas na superfície da membrana celular.
As elipses em azul representam clatrina e as esferas vermelhas representam NPs
funcionalizadas (pontos amarelos) que se ligam aos receptores de membrana em forma
de Y. (Figura adaptada Ref. 46).
A difusão de receptores também constitui uma força resistiva, com uma constante
razão ótima para que ocorra a captura.47
Um número limitado de receptores e um
decréscimo no fator de elasticidade de ligação da interação ligante-receptor poderá
também coibir o envolvimento da partícula. Por fim, essas interações cooperativas
devem gerar energia termodinâmica suficiente para vencer o recolhimento elástico da
membrana, outra força resistiva (Figura 3).46
Por outro lado, forças atrativas não específicas podem promover o contato e captura
celular. Estas forças dependem essencialmente da natureza superficial da entidade
nanométrica (carga superficial, hidrofobicidade e rugosidade)49
estando destacadas na
Figura 4.
FIGURA 4. Representação da captura celular e as forças interfaciais envolvidas. As
características intrínsecas das NPs que promovem a ligação com a superfície
(rugosidade, hidrofobicidade, carga catiônica) geralmente levam a forças de ligação não
específicas que promovem a adsorção celular.
C.E.de Castro
28
TK
kAR
B
2min
3.4. PARÂMETROS QUE INFLUENCIAM A INTERNALIZAÇÃO
CELULAR DE NANOPARTÍCULAS
3.4.1. TAMANHO
Como anteriormente citado, o tamanho sem dúvida exerce um efeito substancial
no processo de internalização celular de nanopartículas. Inclusive o mecanismo de
internalização é dependente do tamanho da entidade. O processo de macropinocitose
está associado à captura de partículas de até 2 m ao passo que a fagocitose está
associada a captura de partículas ainda maiores, de até 10 m. Por outro lado,
nanopartículas submicrométricas são internalizadas por mecanismo mediado por
clatrina (10-300 nm) ou caveolina (50-80 nm).
No ponto de vista do processo em si, a interação da superfície curvada das NPs e
a membrana celular deve produzir a deformação necessária para que as NPs possam ser
engolfadas em um processo que depende das forças de adesão e da rigidez da membrana
(Figura 4), e que no final determinam o raio mínimo necessário para que NPs possam
ser efetivamente envolvidas e internalizadas.51
O Raio mínimo depende da área
superficial das NPs, e de processos termodinâmicos, onde as flutuações da membrana
podem facilitar a captura dos nanovetores. O valor é influenciado por fatores que
incluem a força de interação NP-membrana e pode ser estimado utilizando-se a Equação
1:
(1)
onde k é o módulo de flexão da membrana, A é a sua área superficial, é a energia de
ligação, KB é a constante de Boltzmann e T é a temperatura.52
Modelos computacionais e estudos experimentais convergem para a faixa de raio
20-30 nm como tamanho mínimo para captura celular efetiva de NPs.53,54,55
. Este raio
crítico é afetado por diversos fatores. Por exemplo, quanto maior a energia de ligação
entre as superfícies da membrana e das NPs, menor é o raio mínimo. O tamanho, bem
C.E.de Castro
29
como o número máximo de partículas capturadas depende da densidade de ligantes
expressos sobre a superfície das NPs, que interagindo com os receptores contribuem
para um efeito cinético positivo na captura celular (Figura 3). Interações atrativas levam
a formação de agrupamentos reduzindo efetivamente o limiar de energia livre para o
acoplamento, mudando, portanto o corte de raio inferior.56
Da mesma maneira,
interações não específicas tais como forças de van der Waals, estéricas e esletrostáticas
são tão importantes quanto à contribuição das específicas receptor-ligante. Quando estas
forças são de caráter repulsivo, há um aumento do raio mínimo dificultando assim o
processo de endocitose.477
3.4.2. FORMA
Quando se considera a interação com a superfície celular, o efeito da forma pode
ser tão importante quanto o efeito do tamanho. Foi observado, por exemplo, que
nanopartículas de ouro cilíndricas são internalizadas pela linhagem tumoral de células
HeLa de maneira menos eficiente quando comparadas à nanopartículas esféricas.57,58,59
.
O efeito foi explicado pelo maior tempo de captura necessário para nanopartículas
alongadas. À medida que foi aumentada a razão de aspecto, o processo se tornou ainda
menos eficiente.60
Entretanto, os autores também chegaram à conclusão que a natureza
química da superfície domina o fenômeno de captura celular, sendo que a forma tem um
papel secundário.
3.4.3. NATUREZA QUÍMICA DA SUPERFÍCIE
A natureza química e a carga superficial de NPs sem dúvida são os fatores mais
importantes nos processos de interação NP-membrana celular.61
Geralmente,
nanopartículas neutras ou aniônicas são internalizadas de uma maneira
consideravelmente menos eficiente quando comparadas a nanopartículas catiônicas.62,63
Entretanto, estas últimas podem apresentar severos efeitos citotóxicos dependendo da
densidade de carga positiva presente na superfície.64,65
Por outro lado, nanopartículas
aniônicas parecem ser menos citotóxicas, mas devido a forte interação com proteína do
fluxo sanguíneo, são geralmente menos estáveis tendendo a agregação. Atualmente,
existe um esforço mútuo para se vencer um dos grandes desafios desta temática que é a
produção de nanopartículas resistentes à adsorção de proteínas. Sabe-se que a adsorção
C.E.de Castro
30
de proteínas fatalmente leva a captura das entidades pelo sistema fagocitário
mononuclear, as quais são então excretadas rapidamente do fluxo sanguíneo. Este
fenômeno restringe a eficácia terapêutica de sistemas nanoestruturados. A produção de
NPs estabilizadas por cadeias poliméricas de elevado grau de hidratação parece ser uma
estratégia promissora, uma vez que a presença de uma camada de solvatação promove
redução de volume consideravelmente grande repelindo a adsorção de
biomacromoléculas.66
Um dos polímeros mais utilizados neste sentido é o polioxietileno
(PEO). Por outro lado, sabe-se que a presença da camada estabilizante de PEO
minimiza a interação NP-membrana celular o que fatalmente influencia a eficiência de
internalização celular. Da mesma maneira que se quer evitar adsorção de proteínas e a
rápida captura dos nanocarreadores coloidais pelos sistemas de defesa, procuram-se
maneiras de se aumentar a eficiência de internalização celular de sistemas poliméricos
nanoestruturados. Recentemente nosso grupo de pesquisa evidenciou que o parâmetro
chave está, portanto em um balanço da massa molecular (comprimento) da camada
hidrofílica necessária para a estabilização de NPs para que ao mesmo tempo se evite (ou
minimize) adsorção proteica, aumentando assim o tempo de circulação in vivo, sem
contudo afetar consideravelmente a eficiência de internalização celular.67
Finalmente, do ponto de vista da natureza química, a hidrofobicidade também
desempenha fator importante no processo. Quanto mais hidrofóbica a nanopartícula,
mais rapidamente ocorre a internalização, o que vai de acordo com o modelo teórico da
molhabilidade.68,69
As interações NP-membrana celular geralmente promovem ligações
mais fortes entre as moléculas de água e a superfície do material em relação às ligações
formadas entre as próprias moléculas de água. As interações químicas conduzem à
formação da nanobiointerface, ou seja, superfície do material-superfície de membrana
celular.70
A tensão nesta interface sugere que partículas mais hidrofóbicas do que as
membranas biológicas são mais facilmente capturadas pelas células do que as partículas
de superfície menos hidrofóbicas.71
C.E.de Castro
31
4. METODOLOGIA
4.1. MATERAIS UTILIZADOS
A fabricação das nanopartículas poliméricas biodegradáveis teve como ponto de
partida diferentes copolímeros. Foram utilizados sistemas anfifílicos de copolímeros em
bloco contendo um bloco hidrofóbico (PLA, PCL) ligado quimicamente a um bloco
hidrofílico (PEO) além do copoliéster PLGA (não anfifílico). As características
moleculares das cadeias poliméricas utilizadas nas investigações estão detalhadas na
Tabela 1.
TABELA 1. Características moleculares dos copolímeros PEOm-b-PLAn, PEOm-b-
PCLn e PLGA (L:G 50:50). (subscritos fazem referência ao grau de polimerização de
cada bloco).
Polímero Mn (g.mol-1
)a Mw/Mn
b wPEO
c
PEO250-b-PLA153 22000 1.10 0.50
PEO113-b-PLA236 21600 1.20 0.21
PEO45-b-PLA174 14500 1.20 0.14
PEO113-b-PCL118 18500 1.25 0.27
PEO45-b-PCL118 15500 1.40 0.13
PLGA2191 60000 2.00 -
a massa molar numérica média;
b índice de polidispersão,
c fração mássica de PEO
Os copolímeros em bloco foram adquiridos da Polymer Source Inc. e o
copoliéster PLGA foi adquirido da Sigma Aldrich. As estruturas químicas dos
copolímeros estão mostradas na Figura 5.
Os fosfolipídios utilizados na preparação de membrana biomimética foram
adquiridos da Avanti Polar Lipids Inc. (DMPE - 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-
phosphatidiletanolamine-N,N-dimetil) e Sigma Aldrich (DMPC - 1,2-dimiristoil-sn-
glicero-3-phosphatidilcolina). Todos os outros produtos e solventes orgânicos foram
adquiridos da Sigma Aldrich e utilizados como recebidos. A água utilizada passou por
processo de tratamento Milli-Q®.
C.E.de Castro
32
FIGURA 5. Estrutura química dos copolímeros em bloco PEOm-b-PCLn (A), PEOm-b-
PLAn (B) e do copoliéster não anfifílico PLGA (C).
4.2. PREPARAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
Recentemente, o nosso grupo de pesquisa demonstrou que é possível controlar de
maneira precisa o tamanho de nanopartículas poliméricas produzidas através do processo de
nanoprecipitação. Neste caso, copolímeros são dissolvidos em um solvente orgânico
miscível em água sob agitação constante, sendo posteriormente injetados no seio da solução
aquosa permitindo que a fase orgânica se difunda resultando em gotículas de solvente
orgânico cada vez menores e finalmente levando á precipitação dos copolímeros na forma
de nanopartículas.72 Sendo assim, as nanopartículas (NPs) foram produzidas a partir de
soluções poliméricas em estoque preparadas em diferentes solventes (acetona, THF ou
misturas de acetona:THF). Os copolímeros pré-formados foram dissolvidos em solvente
orgânico juntamente com a sonda fluorescente cumarina-6. As nanopartículas foram
preparadas através da difusão da solução polimérica orgânica para dentro do antisolvente
(água Milli-Q®
) com o uso de seringa à taxa de fluxo de 2 mL.min-1
. A velocidade de
agitação da fase aquosa foi mantida fixa para todos os experimentos (350 rpm), sendo que a
natureza do solvente (misturas de acetona:THF) e a natureza do polímero foram as variáveis
de estudo. Soluções poliméricas na concentração final constante (1,0 mg.mL-1
) na razão
solvente: água 0,4 foram preparadas partindo-se de 5,0 mg dos polímeros supracitados.
Estes foram previamente solubilizados em 2,0 mL de solvente orgânico de escolha contendo
0,025 mg de cumarina-6. A solução orgânica foi posteriormente injetada no antisolvente
(5,0 mL). A eliminação do solvente orgânico se deu através do método de diálise a
temperatura ambiente.
(A) (B)
(C)
C.E.de Castro
33
2q
ΓD
2
4π θsen
λ
n=q
4.3. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
4.3.1. ESPALHAMENTO DE LUZ
4.3.1.1. ESPALHAMENTO DE LUZ DINÂMICO (DLS)
As medidas de espalhamento de luz dinâmico (DLS) foram realizadas utilizando-se
o instrumento ALV/CGS-3 consistindo em um laser de HeNe polarizado (22mW)
operando em comprimento de onda = 633nm, um correlacionador digital ALV 7004 e
um par de detectores APD operando em modo pseudo-correlação cruzada. As amostras
foram acondicionadas em cubetas de vidro de 10 mm de diâmetro e mantidas a
temperatura constante de 25 ± 1°C. Funções de correlação temporal foram obtidas na
região angular 30o-150o e foram ajustadas utilizando-se o método de Cumulantes de acordo
com a Equação 2:73
(2)
Onde A é a amplitude da função de correlação e é a taxa média de decaimento, que
em um sistema suficientemente diluído está relacionada à difusão. O parâmetro 2 é
chamado de cumulante de segunda-ordem.
Através do valor de obtido da análise das funções de correlação temporal
pode-se determinar o coeficiente de difusão (D) da partícula por meio da relação com o
vetor de espalhamento (q).
(3)
O módulo do vetor de espalhamento é dado pela relação:
(4)
sendo n o índice de refração do solvente e é o ângulo de espalhamento.
Finalmente, a partir de um valor de D, é possível determinar o raio
hidrodinâmico (RH) do sistema espalhante através da relação de Stokes-Einstein:
....2
- ln)(ln 221 ttΓAtg
C.E.de Castro
34
dtAtg )/exp()(1)(2
D
TKR B
H6
4
2
224π
λN
dc
dnn
=KA
]3
[11
≈22qR
+MR
Kc G
wθ
(5)
onde KB é a constante de Boltzmann, T é a temperatura absoluta e é a viscosidade do
solvente.
Além disso, a análise de Cumulantes gera o parâmetro 2. Este parâmetro foi
utilizado para calcular a distribuição de tamanho das nanopartículas (2/ 2
) os quais são
a medida da largura das distribuições da taxa do decaimento monomodal.
Para confirmar a distribuição monomodal das nanopartículas, as funções de
correlação temporal também foram analisadas utilizando-se o algoritmo CONTIN
(incorporado ao programa ALV Correlator ) o qual utiliza a transformação inversa de
Laplace de acordo com a Equação 6:74
(6)
onde t é o tempo de decaimento da função de correlação e β é um parâmetro
instrumental. A função resultante é uma distribuição de tempos de relaxação geralmente
constituído de picos representando processos dinâmicos individuais.
4.3.1.2. ESPALHAMENTO DE LUZ ESTÁTICO (SLS)
As medidas de espalhamento de luz estático foram realizadas na mesma região
angular (de 30o até 150). A massa molecular (Mw(NPs)) e o raio de giração (RG) das
nanopartículas poliméricas produzidas foram obtidos utilizando a equação parcial de
Zimm:75
(7)
onde a concentração c é dada em mg.mL-1
e K é a constante ótica expressa como:
(8)
C.E.de Castro
35
f(ka)
UE
2
3
padrão
padrão
solventeamostra RI
IIR
Rθ (razão de Rayleigh) é a intensidade de luz espalhada normalizada utilizando-se
tolueno como solvente padrão.
(9)
O valor da razão de Rayleigh (Rpadrão) para o tolueno (padrão) é igual a 1,406 x
10-5
cm-1
a 298 K e = 633 nm. Na Equação 8, n é o índice de refração do solvente,
dn/dc é o incremento do índice de refração da amostra com relação à concentração e NA
é o número de Avogadro.
Sendo assim através do perfil linear do gráfico de Kc/Rvs. q2 (Equação 7)
determina-se o valor de RG da inclinação (coeficiente angular) e a interseção com o eixo
das ordenadas (coeficiente linear) resulta no valor absoluto igual ao recíproco de
Mw(NPs).
4.3.1.3. ESPALHAMENTO DE LUZ ELETROFORÉTICO (ELS)
As análises de ELS foram realizadas utilizando o equipamento Zetasizer Nano ZS
(Malvern Instruments). O potencial zeta () das nanopartículas foi determinado através
das medidas de mobilidade eletroforética (UE) e da conversão dos valores utilizando-se
a equação de Henry:
(10)
onde é a constante dielétrica do solvente e é a viscosidade. O parâmetro f(ka) é a
função de Henry calculada através da aproximação de Smoluchowski f (ka) = 1.5.
4.3.2. MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
As imagens de microscopia de força atômica (AFM) foram obtidas no modo
tapping utilizando-se um microscópio Agilent 5500 AFM/SPM. Os cantilévers
utilizados eram de silício do tipo NCH microfabricados e possuíam uma constante de
mola nominal de 0,2 N/m e frequência de ressonância nominal de 13 kHz. A taxa de
C.E.de Castro
36
varredura utilizada sempre esteve abaixo de 2 Hz para se obter o escaneamento
adequado da morfologia superficial da amostra. As amostras foram preparadas
depositando-se uma gota de cada suspensão de nanopartículas (250 g.mL-1
) sobre
superfícies de mica seguida de secagem a vácuo por 2 horas. As imagens foram
posteriormente analisadas utilizando-se o software WSXM.
4.4. INTERAÇÃO NANOPARTÍCULA-MEMBRANA
4.4.1. PREPARAÇÃO DA MEMBRANA DE BICAMADA HIBRIDA
A membrana de bicamada hibrida (HBM) foi depositada sobre superfície de
ouro contendo grupos tiol conforme esquematizado na Figura 6.
FIGURA 6. Esquema de preparação de uma membrana de bicamada hibrida (HBM)
sobre superfície de ouro utilizando monocamada hidrofóbica de tiol (Figura adaptada).76
A preparação iniciou-se através do contato do prisma de superfície metálica de
ouro com uma solução de octadecanotiol (Figura 6). Foi posteriormente sintetizada uma
monocamada de caráter negativo a partir de lipossomos contendo DMPE, DMPC e CL .
A mistura destes fosfolipídios resulta na formação inicial de lipossomos com carga
superficial negativa devido à presença dos grupos fosfato da cardiolipina. A razão de
mistura utilizada foi de DMPE:DMPC:CL 39:44:17. Ao final da primeira etapa obtém-
se uma suspensão em clorofórmio (10.0 mg.mL-1
) que é posteriormente evaporada para
a formação do filme lipídico. Em seguida são acrescentados 1.0 mL de solução tampão
vesícula lipídica
monocamada de tiol
superfície de ouro
C.E.de Castro
37
Hepes 10 mM pH 7,5 contendo Ca2+
150 mM para facilitar a estabilização da membrana
em formação. A suspensão contendo o sistema vesicular é passada por um extrusor,
utilizando-se uma membrana porosa de 1 µm (Whatman) para a formação de pequenas
vesículas unilamelares. Após a calibração do sistema de ressonância plasmônica de
superfície (SPR) com sacarose, as vesículas foram injetadas com o auxílio de uma
bomba peristáltica de fluxo controlado (20 mL.min-1
), e quando em contato com a
monocamada de tiol, as vesículas se abriram, formando uma bicamada híbrida (Figura
6). Após a formação da camada lipídica foi injetada manualmente uma solução
contendo EDTA para remoção do cálcio utilizado na síntese das vesículas lipídicas.
Foram selecionados 20 pontos da superfície do prisma para serem avaliadas quanto à
presença da membrana fosfolipídica.
O fundamento da técnica de SPR se baseia nas propriedades óticas podendo ser
empregada para estudos de fenômenos de superfície, pelo monitoramento do aferimento
da mudança do índice de refração, devido a interação de uma camada orgânica a uma
superfície metálica por exemplo. O plasmom de superfície refere-se a uma superfície de
onda eletromagnética no limite de um metal e um meio externo o qual é sensível à
adsorção de moléculas à superfície metálica. O comprimento de onda máximo de
absorção no SPR muda o sentido dos comprimentos de onda maiores com o aumento de
índice de refração devido á permissividade do analito de ligação, e acontece também
quando ocorre a dessorção do analito. Os seus sensores são sensíveis às mudanças no
índice de refração e à permissividade próxima a superfície do sensor.77,78
4.4.2. VERIFICAÇÃO DA ADSORÇÃO DE NANOPARTÍCULAS
A adsorção de nanopartículas sobre a membrana de bicamada hibrida produzida
foi verifica utilizando-se a técnica SPR. A solução de Hepes 10 mM pH 7,5 foi utilizada
para formação da linha de base. Um sensor (SPRi Horiba, França) foi utilizado para
medir as mudanças no índice de refração () devido ao processo de adsorção ou
dessorção das nanopartículas. Após a formação da camada lipídica, as suspensões de
nanopartículas foram injetadas em fluxo e mediu-se a reflectância (em ângulo de
incidência específico) em função do tempo.
C.E.de Castro
38
4.5. INTERNALIZAÇÃO CELULAR DE NANOPARTÍCULAS
4.5.1. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL
A determinação semi-quantitativa da internalização celular das nanopartículas
produzidas foi realizado através de medidas de microscopia de fluorescência confocal.
O protocolo de preparação das amostras foi adaptado do descrito por L. Hou e
colaboradores.79
A linhagem de células de glioblastoma U251 foi utilizada nos
experimentos. Para a determinação da captura celular 2 x 104 células U251 foram
plaqueadas em placas de 24 poços com lamínulas de 13 mm de diâmetro 24 horas antes
da incubação com as NPs marcadas com a sonda fluorescente cumarina-6. As células
foram incubadas em meio DMEM com SFB 10%, pen/strep 1%, sendo que o cultivo se
deu a 37ºC e em atmosfera umidificada (5% de CO2). Posteriormente, o meio de cultura
foi trocado por tampão de transporte (Hank’s balanced salt solution, HBSS, pH 7,4) e
pré-incubado à 37ºC por 30 min.
Após este período, para obter uma concentração experimental de 200 µg.mL-1
, o
tampão de transporte foi removido e adicionou-se 100 µL das soluções contendo NPs
marcadas em cada um dos poços e 400 µL de meio DMEM. O tempo de incubação foi
mantido fixo em 2 horas. Na sequência, as células foram lavadas por 5 vezes com PBS
para eliminação das NPs não capturadas ou aderidas às células, que foram
posteriormente fixadas utilizando etanol 70% por 15 minutos. Finalmente, os núcleos
das células foram marcadas com uma gota de corante (20 µl de Hoechst 1:1000).
A determinação semi-quantitativa da captura celular de NPs se deu pela
observação das células no microscópio de fluorescência confocal Zeiss LSM 510-Meta
(Zeiss) levando em consideração as características de excitação e emissão da cumarina-
6 (Ex: 495 nm e Em: 520 nm). As imagens foram obtidas em uma magnitude de
63X, sendo tratadas pelo software Image J.
4.5.2. CITOMETRIA DE FLUXO
Com o objetivo de quantificar a eficiência de internalização celular dos
diferentes sistemas poliméricos nanoestruturados, foram realizadas medidas de
citometria de fluxo. O protocolo de preparação das amostras foi adaptado do descrito
por Yao e colaboradores80
e Łukasiewicz e colaboradores.81
C.E.de Castro
39
Primeiramente 4x104
células de glioblastoma U251 foram plaqueadas em placas
de 48 poços por 24 horas e incubadas em meio DMEM com SFB 10%, pen/strep 1% a
37ºC em atmosfera umidificada (5% CO2). A concentração experimental foi de 200 µg
mL-1
. As células foram incubadas com soluções contendo diferentes NPs por um
período de 2 horas, injetando-se em triplicata 100µL da solução de NPs marcadas com
cumarina-6 nos poços contendo as células. Também foi realizado um grupo controle em
triplicata das células sem contato com NPs. Após o período de incubação, as células
foram lavadas três vezes com PBS com a intenção de se remover NPs adsorvidas à
membrana e não capturadas. Depois, as amostras foram tripsinizadas e recolhidas em
200µL de PBS, seguido pela análise do perfil de internalização utilizando-se o citômetro
de fluxo BD FACS Canto II (BD Biosciences). Foi utilizado o filtro FITC, que atendeu
as especificações do fluoróforo cumarina-6 (Ex: 495nm e Em: 520nm). Para cada
análise foram monitorados 10.000 eventos. Os dados foram tratados utilizando-se o
programa Flowing 2.
4.5.3. ANÁLISES ESTATISTICAS
Os resultados de citometria de fluxo estão apresentados como média ± desvio
padrão, sendo que os dados experimentais foram tratados pelo método estatístico de
múltiplas comparações (ANOVA) de uma via seguido de pós-teste Bonferroni. Um
valor de p menor do que 0,05 (p < 0,05) foi considerado estatisticamente significante.
Para realização das análises foi utilizado-se o programa Graph Prism 6.0.
C.E.de Castro
40
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1. CARACTERIZAÇÃO DAS NANOPARTÍCULAS
5.1.1. ESPALHAMENTO DE LUZ
A natureza do solvente e do polímero foram variáveis de estudo no intuito de se
produzir nanopartículas poliméricas biodegradáveis com distintos parâmetros
estruturais. Os dados de DLS foram utilizados para a determinação do raio
hidrodinâmico (RH) e da distribuição de tamanhos (2/2) dos sistemas poliméricos
nanoestruturados. Na Figura 7 estão mostradas as funções de correlação temporal
monitoradas em diferentes ângulos de espalhamento para nanopartículas de PLGA 1,0
mg.mL-1
contendo 0,5 % m/m de cumarina-6 produzidas a partir de THF (THF = 1,00)
(A) e o respectivo comportamento de vs. q2 para o mesmo sistema (B). Como pode ser
qualitativamente observado, o processo de nanoprecipitação resultou na produção de
NPs com uma única distribuição de tamanhos. O ajuste utilizando o método de
Cumulantes descreve as curvas experimentais de maneira adequada, o que novamente
sugere uma distribuição monomodal uniforme de tamanhos. O índice de polidispersão
(PDI - 2 /2) foi determinado como sendo igual a 0,14, sugerindo uma distribuição
razoavelmente uniforme de tamanhos. Isto também é confirmado pela distribuição de
tempo de relaxação obtida utilizando-se o método CONTIN (Figura 7A - representativa
para ACF monitorada a 90o). Adicionalmente, à medida que o ângulo de observação
aumenta, o decaimento da função de correlação se desloca para tempos menores. A
frequência de relaxação ( = 1/) obtida de cada ACF como função de q2 mostra um
comportamento linear o que é, portanto, representativo de um movimento difusivo. Este
comportamento foi observado para todo o grupo de nanopartículas produzidas. Conclui-
se desta maneira que o raio hidrodinâmico (RH) de todo o conjunto de NPs pode ser
calculado a partir do seu coeficiente de difusão determinado das inclinações de vs. q2
e posteriormente utilizando-se a equação de Stokes-Einstein, uma vez que a dinâmica
em suspensão é governada pelo movimento Browniano. As NPs de PLGA produzidas a
partir de THF foram as que apresentaram maior RH, possivelmente pela ausência de uma
camada de hidratação da coroa, o que aumenta as interações hidrofóbicas entre as
cadeias poliméricas. Os dados de SLS (Figura 7C) também mostram variação do perfil
linear de Kc/R vs. q2. A partir deste dado experimental foi determinado os valores de RG
C.E.de Castro
41
0 1 2 3 4 5 6 70.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
(B)
(
ms
-1)
q2 x 10
10 (cm
-2)
10-3
10-2
10-1
100
101
102
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
50o
70o
90o
110o
130oC
(q
,t)
lag time (ms)
(A)
0 100 200 300 400 500 600 7000
10
20
30
40
50
60
(C)
Kc /
Rx
10
-10 m
ol.g
-1
q2 (m
-2)
-120 -80 -40 0 40 80 120
0
3
6
9
(D)
I x 1
0-4
(a.u
)
(mV)
(coeficiente angular) e Mw(NPs) (coeficiente linear) utilizando-se a equação parcial de
Zimm (Equação 7). Finalmente, o potencial-médio das NPs foi determinado como
sendo igual a -36,7 mV o que muito provavelmente está relacionado à presença de
grupos carboxílicos na superfície das NPs. O tratamento matemático mostrado no início
desta seção, representativamente para NPs de PLGA produzidas a partir de THF, foi
realizado para todo o conjunto de nanopartículas produzidas e os dados são mostrados e
discutidos na sequencia.
FIGURA 7. Funções de correlação temporal (ACFs) monitoradas em diferentes ângulos
e a distribuição de tempos de relaxação determinada a partir da ACF monitorada a 90°
(A), vs. q2 (B), Kc/R vs. q
2 (C) e distribuição de potencial- (D) para NPs de PLGA
produzidas a partir de THF ( THF = 1,00).
Os parâmetros estruturais RG, RH, potencial-ζ, Mw(NPs), PDI e densidade de cada
tipo de nanopartícula produzida foram determinados a partir dos dados provenientes das
diferentes técnicas de espalhamento de luz (DLS, SLS e ELS). Estes parâmetros foram
determinados variando-se a fração volumétrica de THF (THF) desde 0,00 até 1,00,
C.E.de Castro
42
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
0.05
0.10
0.15
0.20(E)
P
DI
THF
0.00 0.25 0.50 0.75 1.0020
30
40
50
60
70
80
90
100
(B)
RH (
nm
)
THF
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00-50
-40
-30
-20
-10
0
10(C)
(m
V)
THF
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
20
40
60
80
100
120
140
160
180 (A)
PLGA
PEO45
-b-PLA174
PEO113
-b-PLA236
PEO250
-b-PLA153
PEO45
-b-PCL118
PEO113
-b-PCL118
RG (
nm
)
THF
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00
107
108
109 (D)
Mw
(NP
s) (
g.m
ol-1
)THF
0.00 0.25 0.50 0.75 1.000.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
(F)
d(
g.c
m-3)
THF
sendo o segundo solvente sempre acetona. A Figura 8 mostra os valores destes
parâmetros para todos os sistemas investigados como função da fração volumétrica de
THF (THF) de acordo com a legenda.
FIGURA 8. Influência de THF nos parâmetros estruturais (RG, RH, potencial-ζ, Mw(NPs),
PDI e densidade estimada) dos diferentes sistemas poliméricos nanoestruturados
produzidos conforme a legenda mostrada em (A).
C.E.de Castro
43
2
águasolvente ) - (
RT
Vágua
águasolvente
Recentemente, o nosso grupo de pesquisa demonstrou que é possível modificar a
dimensão de nanopartículas biodegradáveis utilizando-se misturas de solventes em
diferentes proporções na primeira etapa do processo de nanoprecipitação.72
No presente
trabalho utilizou-se acetona, THF, ou misturas destes dois solventes no processo de
produção de diferentes NPs. Os solventes THF e acetona são muito utilizados neste
aspecto uma vez que possuem alta capacidade de solubilização e são de fácil remoção
seja por diálise ou evaporação a temperatura ambiente. De fato, o processo de
nanoprecipitação produziu em todos os casos distribuições monomodais de partículas
independente do polímero e/ou mistura de solventes utilizados, conforme representado
na Figura 7A, que mostra a eficiência do processo obtido, uma vez que para as maiores
NPs produzidas, as de PLGA (RH ~ 90nm PDI ~ 0,14), o mesmo foi apresentado para as
menores, onde as amostras apresentaram DP ± 3 abaixo 0,0020 (não apresentados).
Conforme pode ser observado, no que se refere a dimensões (RH e RG) somente
as NPs de PLGA mostram um comportamento de variação monotônico, onde se observa
que à medida que a fração volumétrica de THF (THF) aumenta, NPs maiores são
produzidas. Este comportamento já tinha sido observado anteriormente, onde que NPs a
base de copoliester como o PLGA são sensíveis à mudança de solvente orgânico.72
A
explicação mais aceita para este fenômeno está relacionada com a velocidade de
homogeneização meio orgânico-meio aquoso, e este fator determina o tamanho final das
nanopartículas. A homogeneização da solução orgânica no meio aquoso deve ser a mais
rápida possível para evitar correntes de solvente no antisolvente (água). A rápida
mistura leva a uma elevada taxa de nucleação resultando na formação de nanopartículas
menores. Isto pode ser alcançado utilizando-se solventes orgânicos
termodinamicamente compatíveis com água. A alta afinidade solvente-água promove a
alta taxa de difusão do solvente para o seio da fase aquosa e a formação de
nanopartículas de tamanho reduzido. Este efeito foi observado em nossas investigações.
Quantitativamente, a compatibilidade solvente-água pode se expressar pelo parâmetro
de interação (solvente-água) baseado nos parâmetros de solubilidade de Hildebrand como:
(11)
O parâmetro solvente-água descreve a interação entre moléculas de água e as
moléculas do solvente orgânico. Além disso, Vágua é o volume molar da água (calculado
C.E.de Castro
44
3
)(
)( 4
3
HA
NPw
RN
Md
baseado na massa molar e na densidade), R é a constante dos gases, T é a temperatura
absoluta e água e solvente são os parâmetros de solubilidade da água e do solvente
orgânico (água = 47,9 Mpa1/2
; THF = 18,5 Mpa1/2
e acetona = 19,7 Mpa1/2
). Como THF é
menos compatível com água comparado à acetona, à medida que mais THF está
presente na solução orgânica inicial, observa-se uma tendência de aumento do tamanho
das NPs. Estes resultados sugerem que a maior afinidade solvente-água conduz à
formação de NPs menores e confirmam que a miscibilidades solvente-água é o fator de
maior importância no fenômeno de iniciação-difusão e assim na formação de NPs por
nanoprecipitação. O aumento de tamanho está relacionado ao aumento no número de
agregação das NPs de PLGA, o que é resultado da menor velocidade de
homogeneização solvente-água à medida que THF aumenta. Isto é confirmado
verificando os valores de massa molar (Mw(NPs)) das NPs de PLGA produzidas (Figura
8D), que aumenta respeitando a mesma tendência.
Todas as NPs de PLGA produzidas apresentaram valores negativos de
potencial-em torno de -40 mV (Figura 7D). Este comportamento provavelmente está
relacionado à falta da camada de hidratação de PEO e à exposição dos grupos
carboxílicos do PLGA que resultam em uma superfície substancialmente negativa
(Figura 8C). Por outro lado, o índice de polidispersão não parece ser afetado
sistematicamente pela natureza do solvente orgânico, sendo sempre inferior a 0,15
(Figura 8E).
Finalmente, a densidade das NPs de PLGA produzidas apresentaram valores
bem inferiores à densidade conhecida do polímero puro (dPLGA = 1,34 g.mL-1
). A
densidade das NPs foi determinada de acordo com a Equação 12:
(12)
a partir dos dados obtidos das medidas de SLS (Mw(NPs)) e de DLS (RH). Como podem
ser observados (Figura 8 F), os valores estão sempre abaixo de 0,75 g.mL-1
o que sugere
que as NPs de PLGA possuem um elevado grau de hidratação. Parece que há um
aumento da densidade para NPs produzidas a partir de soluções orgânicas enriquecidas
de THF.
As NPs produzidas a partir de PEOm-b-PLAn e PEOm-b-PCLn possuem
característica anfifílica, compreendendo um núcleo hidrofóbico estabilizado por uma
C.E.de Castro
45
coroa hidrofílica de PEO. No que se refere à dimensão das NPs, entretanto, não foi
observado uma tendência clara de aumento de tamanho para as nanopartículas
produzidas a partir dos copolímeros em bloco como função da fração volumétrica de
THF (THF). Um comportamento linear era inicialmente esperado, ou uma variação
monotônica, tendo como base os dados determinados para PLGA. Para PEO45-b-PLA174
observa-se uma tendência linear de aumento tanto de RG quanto RH, mas somente para
elevadas frações volumétricas de THF ( THF 0,75 e 1,00) (Figuras 8A e 8B).
Os dados experimentais mostram, entretanto, que as NPs anfifílicas produzidas
contendo uma coroa estabilizante de PEO mais curta (PEO45) são maiores em toda a
região de mistura de solventes, RH em torno de ~ 50 nm, exceto em acetona pura (THF =
0,00). As maiores NPs produzidas foram portando as baseadas em PLGA, PEO45-b-
PLA174 e PEO45-b-PCL118, sendo que na maioria dos casos a tendência observada foi
PLGA > PEO45-b-PLA174 > PEO45-b-PCL118 para uma mesma THF. Por outro lado, o
sistema produzido a partir do copolímero com o bloco hidrofílico mais longo (PEO250-
b-PLA153) gerou as menores nanopartículas da série em investigação (considerando-se o
tamanho hidrodinâmico - RH ~ 30 nm). As nanopartículas produzidas a partir de PEO113-
b-PLA236 e PEO113-b-PCL118 possuem dimensão um pouco superior às NPs das
produzidas a partir de PEO250-b-PLA153, RH ~ 40nm. Entretanto, de maneira geral, todas
elas possuem dimensão em torno de 30-40 nm, não sendo possível fazer uma
descriminação clara de qualquer tendência para estes dois últimos sistemas. Estes
resultados sugerem que a presença da camada de hidratação de PEO compete com as
forças hidrofóbicas reduzindo o número de agregação dos sistemas nanoestruturados.
Quanto mais longa a cadeia de PEO menor é o número de agregação das NPs.
Conforme pode ser observado na Figura 8D, os menores valores de Mw(NPs) foram
obtidos para PEO250-b-PLA153.
Levando-se em consideração o índice de polidispersão, ao passo que menores
partículas são formadas, observou-se um aumento do parâmetro. Entretanto, mesmo
para PEO250-b-PLA153, somente para THF = 0,00 o valor ultrapassou 0,15 (µ2/Γ
2 =0,17).
Por outro lado o potencial- das NPs produzidas é substancialmente afetado pelo
tamanho da coroa estabilizante de PEO. Ao passo que os maiores valores de potencial-
foram determinados para PLGA, os menores estão relacionados às NPs de PEO250-b-
PLA153. Os valores para estas NPs foram determinados sempre muito próximos a 0,0
mV independente do parâmetro THF. Uma vez que PEO é um polímero aniônico, a
C.E.de Castro
46
estabilização promovida não é de natureza eletrostática. O elevado grau de hidratação
confere estabilização estérica às NPs produzidas. Para as NPs produzidas a partir dos
copolímeros PEO113-b-PLA236, PEO113-b-PCL118, PEO45-b-PLA174 e PEO45-b-PCL118,
não há uma distinção clara entre os valores de potencial-sendo que os valores
negativos se encontram na região entre -17 mV e -27 mV (entre a região reportada para
PLGA e PEO250-b-PLA153).
A densidade das NPs também é um parâmetro que influencia o comportamento
dos sistemas produzidos. Para todos os sistemas produzidos a partir de copolímeros em
bloco, as densidades determinadas foram novamente muito inferiores das densidades
dos polímeros utilizados na sua produção (dPLA = 1,24 g.mL-1
; dPCL = 1,14 ;dPEO = 1,20
g.mL-1
). Adicionalmente, é interessante notar as menores densidades foram monitoradas
para NPs produzidas a partir de PEO250-b-PLA153, o que sugere que estas NPs estão
substancialmente hidratadas, ou seja, muito provavelmente, a camada de PEO promove
a formação de uma espessa camada de solvatação ao redor das NPs.
5.1.2. MICROSCOPIA DE FORÇA ATÔMICA
As análises realizadas utilizando-se técnicas de espalhamento de luz foram
complementados com análises de imagem (AFM). O principal objetivo foi confirmar a
morfologia dos sistemas poliméricos nanoestruturados produzidos. A Figura 9 mostra as
imagens de AFM juntamente com os respectivos histogramas de distribuição de raio
geométrico para NPs de PLGA (A) e PEO113-b-PLA236 sintetizadas a partir de THF =
1,00.
As amostras foram preparadas a partir da secagem das soluções utilizadas nas
medidas de espalhamento de luz sobre superfície de mica. É possível observar para as
amostras representativas mostradas que o tamanho das NPs produzidas é bastante
uniforme. Mais ainda, o tamanho médio dos histogramas mostrados para ambas as NPs
é compatível com a dimensão monitorada via DLS (RH). Para NPs de PLGA, o valor
determinada por AFM é um pouco menor, onde 2R(AFM) = 74 nm e 2RH(DLS) = 93
nm. A diferença é explicada pela desidratação das NPs durante a preparação das
amostras para posterior análise, uma vez que há a evaporação do solvente durante a
secagem. Diferenças são também esperadas uma vez que o raio hidrodinâmico
monitorado por DLS leva em conta uma camada de solvatação do objeto em difusão, e
não se trata simplesmente do raio geométrico das NPs. Por este motivo, geralmente o
C.E.de Castro
47
tamanho monitorada por AFM é menor que o tamanho monitorado por DLS da mesma
amostra. Entretanto, a principal informação retirada desta análise diz respeito à
morfologia dos sistemas nanoestruturados produzidos. Fica claro pelas imagens que
trata-se da produção de objetos esféricos. De fato este resultado foi previamente
sugerido pela combinação dos dados de SLS e DLS e da determinação do fator forma
dado pela razão entre RG e RH ( = RG/RH). As dimensões estática (RG) e dinâmica (RH)
dependem da arquitetura macromolecular e a combinação das duas resulta em uma
informação qualitativa da forma do objeto espalhante. Para esferas rígidas o valor
teórico é igual a 0,775, para novelos poliméricos aleatórios o valor é de 1,73 enquanto
que para bastões o valor geralmente é maior do que 2. Além disso, para objetos
esféricos este valor depende do seu grau de hidratação e compactação, sendo que para
micelas poliméricas o valor gira em torno de 0,8-0,9 devido a fenômenos de solvatação
e para vesículas o valor fica em torno de 1,0. No presente trabalho, os valores estiveram
para a grande maioria das NPs produzidas na região entre 0,8-1,2 (dados não mostrados)
sugerindo a formação de objetos esféricos de diferentes graus de hidratação, sendo que
quando mais distante do valor de 0,775 (valor teórico para esferas rígidas) mais
hidratada deve estar a NP esférica.
Finalmente, salientamos ainda que durante a preparação das amostras, as NPs formadas
a partir de copolímeros em bloco aparentemente sofreram mais efeito de deformação
durante o processo de secagem. Este efeito pode ser notado comparando-se as imagens
obtidas para NPs de PLGA e PEO113-b-PLA236. As nanopartículas possuem morfologia
esférica, entretanto, possivelmente devido ao processo de preparação da amostra e o
elevado grau de desidratação das NPs formadas a partir de copolímeros em bloco, as
imagens obtidas para NPs de PLGA possuem uma qualidade visual superior.
C.E.de Castro
48
FIGURA 9. Imagens obtidas por AFM para NPs de PLGA e PEO113-b-PLA236
produzidas a partir de THF juntamente com os respectivos histogramas de distribuição
de tamanho.
5.2. ADSORÇÃO DE NANOPARTÍCULAS EM MEMBRANA
BIOMIMÉTICA
Análises de adsorção em membrana biomimética foram realizadas com o intuito
de se entender o processo de interação de NPs sobre a membrana biológica. Utilizou-se
para este fim a técnica de SPR. Inicialmente foram produzidos lipossomos que
mimetizam uma membrana lipídica, os quais foram depositados sobre superfície de
ouro. Os lipossomos foram produzidos pela mistura de DMPE, DMPC e CL. A medida
raio (nm)
raio (nm)
(A)
(B)
Nú
mer
o d
e P
artí
cula
s N
úm
ero d
e P
artí
cula
s
C.E.de Castro
49
)( 1ln
2
37.0
SA-nnm
R=d
de potencial-dos lipossomos produzidos mostrou que estes apresentam carga
superficial negativa (- 8,5 mV). Através da técnica de SPR é possível verificar
mudanças de índice de refração () devido a processos de adsorção ou dessorção de
moléculas e agregados sobre a membrana lipídica produzida.82
Durante a formação da
membrana de bicamada híbrida (HBM), o processo de injeção da suspensão contendo
DMPE+DMPC+CL é seguida por um aumento gradual da reflectância que é máxima
após 2 minutos da injeção (Figura 10). O fluxo não foi parado. A formação da
monocamada fosfolipídica após a ruptura sobre a monocamada de tiol é confirmada
pelo aumento da linha de base de reflectância (de 50 para 56 %). Logo após a formação
da nova linha base, que ocorreu 60 minutos após o início do fluxo de água milli-Q,
aguardou-se 30 minutos para a estabilização. O fluxo foi posteriormente modificado
para solução tampão Hepes 10 mM pH 7,5 como “fase móvel” do sistema. Ao se iniciar
o fluxo com a solução tampão, se observa um ligeiro aumento da reflectância visto que
o índice de refração da solução tampão é maior do que da água milli-Q®. Em seguida foi
injetada manualmente uma solução contendo EDTA para remoção do cálcio utilizado na
síntese das vesículas lipídicas.
A diferença entre as linhas de base está relacionada à espessura da monocamada
lipídica formada, que pode ser calculada segundo a equação 13 (adaptada da Ref.76):
(13)
onde d é a espessura da monocamada a ser investigada, λ é o comprimento de onda (635
nm), ΔR é a diferença entre o índice de refração de antes e de depois da injeção das
vesículas, m é o coeficiente angular da curva de calibração da sacarose, nA é o índice de
refração conhecido do adsorvente (fosfolipídios) e nS é o índice de refração da solução
tampão (também conhecido). Logo após a injeção da solução contendo EDTA nota se a
estabilização da bicamada sendo possível se determinar a sua espessura. O valor obtido
foi de 2,0 nm. Levando em consideração que a monocamada de tiol tem
aproximadamente 2,0-2,5 nm, somando-se a espessura obtida da monocamada lipídica
(2,0 mm) chega-se aproximadamente a dimensão de uma membrana celular eucariota
(4-5 nm). A cobertura obtida pela ruptura das vesículas foi de 102% para o ponto de
melhor cobertura e de 80% para o de menor cobertura dentre os 20 avaliados.
C.E.de Castro
50
FIGURA 10. Variação da reflectância em função do tempo durante a formação da
bicamada hibrida em fluxo de água milli-Q® e posterior solução tampão Hepes 10mM
pH 7,5 conforme indicado.
Posteriormente procederam-se os ensaios de interação entre os diferentes tipos
de NPs e a membrana lipídica produzida. Para estes ensaios foram selecionadas 08
diferentes NPs produzidas da série inicial de 30. As NPs foram selecionadas de acordo
com caracterização inicial realizada e com o objetivo de se utilizar NPs com as
características estruturais mais distintas possíveis. A série utilizada está detalhada na
Tabela 2.
TABELA 2. Nanopartículas selecionadas para as medidas de SPR.
Nanopartícula Indicação THF RH (nm) potencial- (mV)
PLGA2191 1 0,00 64,8 -36,7
PEO45-b-PCL118
2 0,50 57,8 -24,3
PEO45-b-PCL118
3 0,00 34,0 -20,7
PEO113-b-PCL118
4 0,00 35,2 -26,3
PEO45-b-PLA174
5 0,50 57,5 -17,5
PEO113-b-PLA236
6 0,50 32,9 -24,8
PEO113-b-PLA236
7 0,00 37,9 -21,7
PEO250-b-PLA153
8 0,50 29,6 -3,7
C.E.de Castro
51
375 400 425 450 475
56
64
72
NaOH
8
2
(B)
4
refle
ctâ
ncia
(%)
tempo (mim)
NaOH
6
150 175 200 325 350
56
64
72
NaOHNaOH
5
3
(A)
1
7
refle
ctâ
ncia
(%)
tempo (mim)
agua
Milli-Q
Os dados qualitativos de SPR estão mostrados na Figura 11. O resultado
interessante desta seção de experimentos, é que somente as nanopartículas poliméricas
contendo núcleo hidrofóbico de PLA adsorveram à superfície da membrana mimética,
como pode ser observado pelo deslocamento da linha de base depois das injeções de 5,
6, 7 e 8 (identificadas em vermelho), e esta adsorção só pode ser removida pela adição
de NaOH 1M. Este resultado sugere que o potencial- parece não ter substancial
influência no processo de adsorção uma vez que exceto para PEO250-b-PLA153, todas as
outras NPs produzidas a partir de sistemas anfifílicos possuem potencial de superfície
similar. Entretanto, o processo de interação parecer ser dominantemente dependente a
natureza do núcleo hidrofóbico. Os resultados também mostram que apesar do
potencial- substancialmente negativo de PEO45-b-PLA174 e PEO113-b-PLA236 (na faixa
de -20 mV) o efeito de repulsão eletrostática NP-membrana mimética parece ter efeito
mínimo no processo de adsorção. Já para o caso de PLGA, que por sua vez possui
potencial- consideravelmente mais negativo (-36,7 mV), a repulsão eletrostática pode
ser uma possível justificativa para a ausência de interação com a membrana mimética.
FIGURA 11. Variação da reflectância em função do tempo durante a injeção de
diferentes nanopartículas poliméricas de acordo com a Tabela 2.
O tempo de adsorção é um parâmetro quantitativo proveniente da medida de
SPR que dá ideia da força de interação NP-membrana mimética. Este parâmetro é
calculado como sendo a diferença de tempo desde a injeção de uma determinada NP,
onde ela interage com a membrana biomimética, adsorvendo a ela, mudando a
reflectância no sensor de SPR (Figura 11), porém como a solução de HEPES é em fluxo
contínuo, essa interação é desfeita e a NP é liberada, num processo de dessorção da
C.E.de Castro
52
membrana até o retorno a um patamar de reflectância constante como estava antes da
interação entre as superfícies. Os dados estão apresentados na Tabela 3.
TABELA 3. Tempo de adsorção de diferentes NPs sobre a superfície da membrana de
bicamada hibrida.
Fica evidente pelos dados da Tabela 3 que o núcleo hidrofóbico desempenha
papel fundamental nos processos de adsorção e dessorção à membrana uma vez que são
observados, para todas as NPs formadas por um núcleo PCL, tempos de adsorção
reduzidos (em torno de 3 minutos) em comparação as NPs formadas por um núcleo de
PLA.
5.3. INVESTIGAÇÕES DA CAPTURA CELULAR DOS
NANOCARREADORES POLIMÉRICOS
5.3.1. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA CONFOCAL
Subsequente à detalhada caracterização estrutural das NPs produzidas e dos
ensaios de interação com membrana biomimética, foi avaliado o perfil e eficiência de
internalização celular das NPs produzidas. Novamente, a ideia foi utilizar NPs onde se
pudesse relacionar o perfil de internalização celular com o detalhamento estrutural e
seus aspectos físico-químicos.
A incubação de NPs contendo a mesma quantidade da sonda fluorescente
cumarina-6 em uma mesma quantidade de células do tipo glioblastoma U251 mostram
Nanopartícula Indicação THF tempo de adsorção (min)
PLGA 1 0,00 3,0
PEO45-b-PCL118
2 0,50 3,5
PEO45-b-PCL118
3 0,00 2,9
PEO113-b-PCL118
4 0,00 3,7
PEO45-b-PLA174
5 0,50 5,3
PEO113-b-PLA236
6 0,50 6,7
PEO113-b-PLA236
7 0,00 6,3
PEO250-b-PLA153
8 0,50 4,4
C.E.de Castro
53
PLGA THF = 0.00
A
PLGA THF = 1.00
B
Cumarina-6
Hoechst Sobreposição
PLGA THF = 1.00 PLGA THF = 1.00
PLGA THF = 0.00 PLGA THF = 0.00
um perfil de internalização dependente principalmente da natureza química das NPs em
questão. Os dados experimentais são mostrados nas Figuras 12 (PLGA) e 13 (sistemas
anfifílicos).
FIGURA 12. Imagens de microscopia de fluorescência confocal para células de
glioblastoma U251 incubadas com nanopartículas de PLGA preparadas a partir de (A)
acetona (THF =0,00) e (B) THF (THF = 1,00) e contendo a mesma quantidade da sonda
hidrofóbica fluorescente cumarina-6, que pode ter a fluorescência verde evidenciada na
coluna 1. A coluna 2 mostra o canal DAPI e se refere a fluorescência azul do meio de
montagem Hoechst marcando o núcleo celular. Na coluna 3 se evidencia a sobreposição
das colunas 1 e 2. O tempo de incubação foi de 2 horas e as imagens são mostradas em
aumento de 63X.
Do ponto de vista de dimensão das NPs, mantendo-se todos os outros parâmetros
similares, a melhor comparação a ser realizada se trata das NPs de PLGA produzidas a
partir de THF = 0,00 e THF = 1,00 (figura 12 A e B, respectivamente). Neste caso, há
um aumento da dimensão RH de aproximadamente 50% desde ~ 60 nm para ~ 90 nm
(Figura 8B). As imagens de microscopia de fluorescência confocal mostradas na Figura
12 sugerem, ainda que de maneira semi-quantitativa, que a intensidade de fluorescência
C.E.de Castro
54
emitida pelo conjunto de células parece ser similar, o que indica que nesta região de
dimensões nanométricas, o tamanho dos sistemas poliméricos nanoestruturados parece
não ter uma substancial influência no processo de internalização celular.
Por outro lado, o comprimento da cadeia estabilizante hidrofílica juntamente
com a natureza química do núcleo hidrofóbico parecem ser fatores de fundamental
importância neste processo. Isto pode ser compreendido comparando-se os dados
experimentais de microscopia de fluorescência confocal dos sistemas anfifílicos (Figura
13). Comparando-se a série PEOm-b-PLAn fica evidente que a intensidade de
fluorescência aumenta na ordem PEO250-b-PLA153 < PEO113-b-PLA236 < PEO45-b-
PLA174. De maneira similar, para a série PEOm-b-PCLn a intensidade de fluorescência
aumenta na ordem PEO113-b-PCL118 < PEO45-b-PCL118.
Outro fator importante no processo a internalização celular parece ser a natureza
do núcleo hidrofóbico, o que fica claro quando se compara as NPs produzidas a partir de
PEO113-b-PLA236 e PEO113-b-PCL118 ou as NPs produzidas a partir de PEO45-b-PCL118 e
PEO45-b-PLA174 (Figura 13). As NPs contendo o núcleo hidrofóbico de PCL parecem
ser internalizadas de maneira mais eficiente quando comparadas às NPs contendo
núcleo de PLA com coroa hidrofílica (PEO) de mesma massa molecular.
Curiosamente, ainda que as NPs de PLGA, que não possuem a coroa de PEO,
sejam internalizadas de maneira similar se comparadas, por exemplo, as NPs de PEO45-
b-PCL118 (Figura 13 E), o seu perfil de adesão e captura parece ser maior quando
comparado aos outros nano vetores. Isto provavelmente está associado à maior interação
com os componentes da membrana celular, promovido por forças hidrofóbicas, mesmo
elas possuindo uma elevada densidade de carga negativa na sua superfície ( ~ -40 mV)
o que vai contra o avaliado nos estudos de SPR, que demonstraram a baixa interação
com a membrana biomimética devido à repulsão eletrostática entre a superfície das NPs
e da membrana fosfolipídica. Isto mostra que a interação entre as superfícies se dá pelo
conjunto de forças envolvidas.
C.E.de Castro
55
Sobreposição Hoechst
Cumarina-6
A
B
C
D
E
PEO250-b-PLA153 PEO250-b-PLA153 PEO250-b-PLA153
PEO113-b-PLA236
PEO113-b-PLA236
PEO113-b-PLA236
PEO45-b-PLA174
PEO45-b-PLA174
PEO45-b-PLA174
PEO45-b-PCL118
PEO45-b-PCL118
PEO45-b-PCL118
PEO113-b-PCL118 PEO113-b-PCL118 PEO113-b-PCL118
FIGURA 13. Imagens de microscopia de fluorescência confocal para células de
glioblastoma U251 incubadas com NPs produzidas a partir de copolímeros em bloco a
partir da mistura 50:50 de THF e acetona (THF =0,50) e contendo a mesma quantidade da
sonda hidrofóbica fluorescente cumarina-6 encapsulada. O tempo de incubação foi de 2
horas e as imagens são mostradas em aumento de 63X.
C.E.de Castro
56
No entanto, o tamanho da coroa hidrofílica parece ser ainda mais importante no
desempenho da captura dos sistemas poliméricos nanoestruturados, como pode ser
observado quando comparadas as NPs de PLGA e PEO250-b-PLA153. Apesar do
potencial- das NPs de PEO250-b-PLA153 estar próximo de 0,0 mV, ao passo que para
NPs de PLGA a valor é substancialmente negativo (~ - 40,0 mV), a eficiência de
internalização celular das NPs de PLGA parece ser maior quando comparada à
internalização das NPs de PEO250-b-PLA153 o que implica um papel importante da coroa
hidrofílica. Em resumo, parece que os parâmetros estruturais principais (RH e potencial-
ζ) apesar de serem importantes na captura celular, tem seu efeito essencialmente
ofuscado pela dimensão de camada de hidratação (massa molecular do bloco de PEO) e
pela natureza química do núcleo hidrofóbico que parecem ser os fatores determinantes
na internalização celular dos sistemas investigados.
O resultado mais intrigante é o fato das NPs contendo o núcleo hidrofóbico de
PCL serem internalizadas de maneira mais eficiente quando comparadas às NPs
contendo núcleo de PLA. Isto porque, recordando as análises de SPR, o processo de
adsorção física parece que ocorre somente para as NPs que possuem núcleo hidrofóbico
de PLA. Estes resultados podem sugerir que algum tipo de interação muito intensa
ocorre de tal maneira que impede a posterior dessorção dificultando o processo de
internalização celular. De qualquer maneira, a maior eficiência de internalização das
NPs a base de PCL pode ser atribuído a maior hidrofobicidade do bloco, o que vai de
encontro com o modelo teórico da molhabilidade, o qual sugere que devido à formação
da nanobiointerface e a tensão existente no local, partículas mais hidrofóbicas do que as
membranas biológicas são mais facilmente capturadas pelas células do que as partículas
de superfície menos hidrofóbica. De qualquer maneira, parece, a princípio, que as NPs
anfifílicas que apresentam adsorção física menos intensa e menor tempo de adsorção
respondem mais eficientemente ao processo de internalização celular. Especula-se que o
fenômeno de adsorção observado para partículas à base de PLA seja essencialmente de
natureza hidrofílica (forças de hidratação), o que explicaria o comportamento
contraditório entre os dados de SPR e microscopia de fluorescência tendo em mente,
novamente, o modelo teórico da molhabilidade. Outro fator importante é que para os
ensaios de SPR, somente a parte lipídica da membrana foi produzida, ou seja, não se
levando em conta proteínas do glicocálice e outras biomoléculas a ela pertencente.
Além do mais, o modelo de membrana utilizado na técnica de SPR, se trata de uma
monocamada fosfolipídica adsorvida rígida, não sendo possível mimetizar as flutuações
C.E.de Castro
57
da membrana, mobilidade do citoesqueleto e a dinâmica molecular de seus componentes
durante a interação, adesão, acoplamento e captura dos nanovetores.
5.3.2. CITOMETRIA DE FLUXO
Dando sequências aos ensaios biológicos após a determinação semi-quantitativa
da internalização celular dos nano vetores, foram realizados ensaios de citometria de
fluxo com o intuito de se quantificar a eficiência da captura celular, tendo em vista os
diferentes aspectos físico-químicos dos sistemas. Uma vez incubadas com as NPs
contendo a mesma quantidade da sonda fluorescente cumarina-6, as células de
glioblastoma U251 apresentaram diferentes dinâmicas de captura celular relacionadas
com as características dos nanocarreadores, sendo que a natureza química de superfície
das mesmas apresentou papel crucial para uma maior eficiência do perfil de
internalização (Figuras 14 e 15) como também demonstrado pelos ensaios de
microscopia de fluorescência confocal (Figuras 12 e 13).
A Figura 14 mostra os histogramas de fluorescência obtidos por medidas de
citometria de fluxo representativamente para nanopartículas poliméricas de PEO250-b-
PLA253 e PEO45-b-PCL118 marcadas com cumarina-6 após incubação de 2 horas em
células de glioblastoma U251. O controle diz respeito à autofluorescência das
respectivas células.
FIGURA 14. Histograma de intensidade de fluorescência para PEO250-b-PLA153 e
PEO45-b-PCL118 marcadas com cumarina-6 após incubação de 2 horas em células de
glioblastoma U251. O controle diz respeito à autofluorescência das respectivas células.
101
102
103
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0 Controle U251
PEO45
-b-PCL118
PEO250
-b-PLA153
Intensidade de Fluorescência
Conta
gem
(u.a
)
C.E.de Castro
58
Estes resultados mostram que a intensidade de fluorescência de células tratadas
com PEO250-b-PLA153 e PEO45-b-PCL118 marcadas com cumarina-6 é, respectivamente,
2 vezes e 4 vezes maior do que a autofluorescência das células. Da mesma forma, a
captura celular de NPs de PEO45-b-PCL118 é 2 vezes maior quando comparada à captura
celular de NPs de PEO250-b-PLA153. Novamente, os resultados mostram que a
internalização celular dependem substancialmente dos aspectos físico-químicos das
nanopartículas poliméricas.
A porcentagem de células positivas, que, portanto demonstra a eficiência de
internalização celular, é significativamente diferentes para diferentes NPs (Figura 15). A
porcentagem de células positivas é de fato, significativamente menor depois do
tratamento de células de glioblastoma U251 com NPs de PEO250-b-PLA153 marcadas
com cumarina-6. A maior porcentagem foi determinada para células de glioblastoma
U251 tratadas com NPs do tipo PEO45-b-PCL118.
FIGURA 15. Análise quantitativa da internalização celular de NPs marcadas com
cumarina-6 capturadas por células de glioblastoma U251 após 2 horas de incubação.
*representa diferença estatisticamente significante comparado a PEO45-b-PCL118, #
representa diferença estatisticamente significante comparado a PEO113-b-PCL118 ou
PEO45-b-PLA174 e § representa diferença estatisticamente significante comparado a
PEO113-b-PLA236. Os resultados estão mostrados como média ± DP (n=3). Foi utilizado
teste estatístico de múltiplas comparações (ANOVA) de uma via seguido de pós-teste
Bonferroni (p < 0,05).
50
25
50
75
100
§
§
§
#
§§
§
#*
**
PEO 11
3-b
-PCL 11
8
PLG
A 219
1
PEO 45
-b-P
CL 11
8
PLG
A 21
91
% C
elu
las P
ositiv
as
PEO 25
0-b
-PLA
153
PEO 11
3-b
-PLA
236
Con
trole
PEO 45
-b-P
LA17
4
* #
C.E.de Castro
59
A eficácia dos nano vetores geralmente é influenciada diretamente pela captura
celular e a sua distribuição, portanto, uma alta afinidade de ligação à superfície de
células tumorais, por exemplo, permanece sendo essencial para alcançar o efeito de
internalização e liberação de um ativo terapêutico. Estudos anteriores têm demonstrado
a importância do desenvolvimento de nanopartículas, suas características funcionais e
físico-químicas e como estas desempenham importante impacto na vetorização
farmacêutica, devido a sua integração com sistemas biológicos83,84,85
. Neste estudo,
onde variamos as características das NPs produzidas, a captura celular e sua eficiência
mostraram-se dependente desses aspectos.
Como mostra a Figura 15, para a série PEOm-b-PLAn, a porcentagem de captura
celular aumenta na ordem PEO250-b-PLA153 < PEO113-b-PLA236 < PEO45-b-PLA174 que
novamente mostra a associação da internalização celular com o impedimento estérico
promovido pela coroa hidrofílica estabilizante. De maneira similar, para a série PEOm-
b-PCLn a porcentagem de células aumenta na ordem PEO113-b-PCL118 < PEO45-b-
PCL118 de maneira estatisticamente significante. A Figura 15 também evidencia que
sistemas formados por coroas hidrofílicas de mesma dimensão, porém com variação do
núcleo, impactam consideravelmente na internalização celular, onde a porcentagem de
células positivas para os nano vetores é maior para NPs contendo núcleo de PCL
(PEO113-b-PCL118 > PEO113-b-PLA236).
A importância de uma coroa de hidratação, além de favorecer a estabilização dos
nanocarreadores, também desempenha importante função na interação com sistemas
biológicos. Os resultados de citometria de fluxo para NPs de PLGA mostram que
independente do tamanho, a porcentagem de células positivas não são estatisticamente
diferentes. Também, não há diferença estatística na porcentagem de células positivas
comparada às NPs de PEO45-b-PCL118. Este fenômeno deve estar associado à ausência
da coroa de hidratação que promove melhor interação e adesão á superfície celular.
Sendo assim, os resultados de citometria de fluxo estão completamente de
acordo com os dados de microscopia de fluorescência confocal mostrados
anteriormente.
C.E.de Castro
60
6. CONCLUSÕES
Os dados experimentais de espalhamento de luz e análise de imagem mostraram
que foi possível obter sistemas poliméricos nanoestruturados esféricos de diferentes
tamanhos e carga superficial utilizando o protocolo de nanoprecipitação. Haja vista a
diferença estrutural dos polímeros utilizados, as nanopartículas produzidas são
estruturalmente diferentes do ponto de vista de tamanho de núcleo hidrofóbico e coroa
hidrofílica. Demonstrou-se que a dimensão dos sistemas aumenta em detrimento da
redução da cadeia hidrofílica de PEO.
A influência dos parâmetros estruturais na captura e internalização celular das
entidades foram avaliadas e os resultados sugerem que a espessura da coroa hidrofílica
de polioxietileno (PEO), que tem o papel fundamental de estabilizar as nanoestruturas
produzidas, é decisiva no processo. Na medida que foram utilizados copolímeros em
bloco de longo bloco hidrofílico, percebeu-se uma redução semi-quantitativa na
internalização celular das entidades. A carga superficial também é de fundamental
importância no processo porém, este parâmetro é ofuscado pela dimensão da coroa,
onde que mesmo para nanopartículas de elevado potencial- (~ -40 mV), que é o caso
de NPs de PLGA, a internalização celular não apresentou diferença estatisticamente
significante em comparação com outros sistemas de coroa hidrofílica reduzida. Este
comportamento sugere que, embora possa ocorrer repulsão eletrostática, as interações
não específicas, como forças hidrofóbicas, favorecem a captura celular desse tipo de
NPs. Por outro lado, NPs apresentando cadeias estabilizantes de PEO mais curtas (Mw ~
2000 g.mol-1
) foram mais eficientemente internalizadas, apesar de seu potencial-
negativo (~ -20 mV). Para NPs com o mesmo tamanho de cadeia estabilizante de PEO,
os dados experimentais sugerem que NPs formadas por um bloco hidrofóbico de
policaprolactona (PCL) são internalizadas de maneira mais eficiente em comparação
com NPs formadas por um bloco hidrofóbico de poli ácido lático (PLA) apesar dos
dados de SPR mostrarem uma adsorção mais intensa à membrana das partículas a base
de PLA. Parecem-nos, assim, que interações, provavelmente de natureza hidrofílica
(forças de hidratação) entre NPs e membrana fosfolipídica, apesar de promoverem forte
adsorção dos sistemas nanoestruturados à superfície celular, de alguma forma
desfavorecem o processo endocítico posterior.
C.E.de Castro
61
7. REFERÊNCAS BIBLIOGRÁFICAS
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