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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
DESENVOLVIMENTO DE qPCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE
SALMONELLA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI EM POLPA DE AÇAÍ
DANILO LEONCIO AGUIAR PEREIRA
Belém-Pará
2018
DANILO LEONCIO AGUIAR PEREIRA
DESENVOLVIMENTO DE qPCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE
SALMONELLA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI EM POLPA DE AÇAÍ
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biológica de Agentes
Infecciosos e Parasitários do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará como requisito para a
obtenção do grau de Doutor em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida
Machado
Belém-Pará
2018
DANILO LEONCIO AGUIAR PEREIRA
DESENVOLVIMENTO DE qPCR MULTIPLEX PARA DETECÇÃO DE
SALMONELLA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI EM POLPA DE AÇAÍ
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade
Federal do Pará, como requisito para a obtenção do grau de Doutor em Biologia
de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado
Laboratório de Virologia ICB/UFPA
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Edilene Oliveira da Silva
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Prof. Dr. Felipe Bonfim Freitas
Instituto Evandro Chagas, SVS, MS
Profa. Dra. Cintya de Oliveira Souza
Instituto Evandro Chagas, SVS, MS
Profa. Dra. Jacqueline Cortinhas Monteiro
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA
Profa. Dra. Rosimar Neris Martins Feitosa
Instituto de Ciências Biológicas, UFPA (Suplente)
Belém, 28 de junho de 2018
À Profa. Dra. Ana Amélia Cavalcante,
que certo dia perto do final de 2007
disse: “Você começa amanhã” e me
ofereceu a primeira oportunidade de
vivenciar a rotina de um Laboratório.
Valeu a pena!
“Hey mãe, por mais que a gente
cresça, há sempre alguma coisa que
a gente não consegue entender...”
(Humberto Gessinger)
Agradecimentos
Aos meus pais, que não podiam me dar uma videogame quando eu tinha 10
anos, não podiam me dar um violão quando eu tinha 15 anos, mas criaram o
ambiente familiar e escolar mais propício possível para algum dia no futuro e ser
e ter o quisesse!
À Luiz Carlos Santana e a melhor equipe do Laboratório de Erros Inatos do
Metabolismos de todos os tempos: Erik, Clebson, Pedro, Cadu, Clebinho,
Nathalia, Patrick e Gustavo, vai ser difícil uma outra geração com tanto talento
no mesmo lugar! E que satisfação ter feito parte desse grupo e poder aprender
uma coisa ou outra com eles.
A Elisabete Santos que me acompanhou pelos melhores momentos e
principalmente quando os momentos não eram tão bons assim!
Ao prof. Dr. Luiz Fernando, que acreditou nesse projeto e na minha capacidade
de executa-lo, espero que venham mais pela frente chefe.
Aos colegas de Labvir tão importantes nas atividades extracurriculares: Mike,
Edilson, Geison, Duda, Karol, Cinthia, Larissa e Leonardo.
Aos pesquisadores do Instituto Evandro chagas (IEC) Dr. Igor Brasil Costa e Dra.
Cintya de Oliveira Souza, sem vocês esse estudo não teria sido desenvolvido,
pelo menos não como foi projetado.
À técnica do laboratório de bacteriologia do IEC, Dolores Dias dos Santos, você
foi 100%.
À técnica do Monitora Laboratórios Elem Maria Brown, por toda ajuda e
orientação no manuseio das culturas.
A Afonso e Santuscha amigos e sócios de desafios, por terem investido neste
projeto e transformado essa ideia em um empreendimento!
6
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE QUADROS E TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS OU SÍMBOLOS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 16
1.1 DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS ................................... 17
1.2 SALMONELLA ....................................................................................... 19
1.2.1 Salmonelose..... .................................................................................... 20
1.2.2 Custos econômicos ............................................................................. 23
1.3 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS EM ALIMENTOS............................................................................................24
1.3.1 Identificação de Salmonella spp. por meio de método tradicional baseado em cultura............... .............................................................. 27
1.3.1.1 Tipificação de Salmonella .................................................................... 28
1.3.2 Identificação de Salmonella por meio de testes rápidos ................ 29
1.3.2.1 Métodos imunológicos ......................................................................... 29
1.3.2.2 Métodos moleculares ........................................................................... 30
1.3.3 Desenvolvimento de métodos alternativos para detecção de Salmonella......... .................................................................................. .32
1.4 DOENÇA DE CHAGAS ......................................................................... 32
1.4.1 Trypanosoma cruzi .............................................................................. 35
1.4.2 Transmissão oral de DC ...................................................................... 38
1.5 AÇAÍ........... ........................................................................................... 46
1.6 OBJETIVOS ........................................................................................... 50
1.6.1 Objetivo geral.... ................................................................................... 50
1.6.2 Objetivos específicos .......................................................................... 50
7
2 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................... 51
2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA A EXTRAÇÃO DE DNA ....... 51
2.1.1 Preparação das cepas de Salmonella e bactérias não alvo para o teste de seletividade...... ...................................................................... 51
2.1.2 Preparação da cepa Esmeraldo de T. cruzi. ...................................... 52
2.2 CONTAMINAÇÃO ARTIFICIAL DA POLPA DE AÇAÍ COM T. CRUZI E SALMONELLA SPP..... .......................................................................... 52
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA............................................................................. 52
2.3.1 Avaliação da concentração e pureza do DNA ................................... 52
2.4 CONTROLE INTERNO DE AMPLIFICAÇÃO (CIA) ............................... 53
2.5 INICIADORES E SONDAS PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS PATÓGENOS ALVOS............................................................................53
2.6 ESTABELECIMENTO DA PRECISÃO E LIMITE DE DETECÇÃO DA qPCR.................... ................................................................................. 54
2.7 AMOSTRAGEM, COLHEITA, CONDICIONAMENTO E TRANSPORTE DAS AMOSTRAS DE AÇAÍ. .................................................................. 55
2.8 PESQUISA DE SALMONELLA SPP. PELO MÉTODO TRADICIONAL BASEADO EM CULTURA....... .............................................................. 55
2.9 PADRONIZAÇÃO DA qPCR multiplex................................................... 56
2.9.1 Avaliação da concordância entre métodos. ...................................... 57
2.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ................................................................... 57
3 RESULTADOS ...................................................................................... 59
3.1 PUREZA E CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA .................. 59
3.2 AVALIAÇÃO DA PRECISÃO DO CONTROLE INTERNO DE AMPLIFICAÇÃO (CIA) ........................................................................... 59
3.3 AVALIAÇÃO DA PRECISÃO DOS CONTROLES ALTO E BAIXO PARA DETECÇÃO DE TRYPANOSOMA CRUZI ............................................ 60
3.4 QUANTIFICAÇÃO E LIMITE DE DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP.62
3.5 PADRONIZAÇÃO DA QPCR MULTIPLEX ............................................ 64
3.5.1 Controle interno de amplificação na qPCR multiplex....................... 64
3.5.2 Quantificação de Salmonella spp. ...................................................... 64
8
3.5.3 Detecção de Trypanosoma cruzi ........................................................ 65
3.5.4 Teste de seletividade da qPCR multiplex .......................................... 66
3.6 DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI EM AMOSTRAS DE CAMPO DE POLPA DE AÇAÍ .................................... 67
3.6.1 Sensibilidade, especificidade, exatidão da qPCR multiplex ............ 68
3.7 CONCORDÂNCIA ENTRE O MÉTODO DE REFERÊNCIA BASEADO Em CULTURA E A QPCR PARA DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP. EM POLPA DE AÇAÍ............... ..................................................................... 69
4 DISCUSSÃO ......................................................................................... 73
5 CONCLUSÕES ..................................................................................... 86
6 REFERÊNCIAS ..................................................................................... 87
9
Lista de figuras
Figura 1- Classificação do gênero Salmonella em espécies, subespécie, sorovares e afecções causadas ...................................................... 20
Figura 2 - Distribuição da doença de chagas no mundo. ................................ 33
Figura 3 - Triatomíneo eliminando fezes durante o repasto sanguíneo. .......... 34
Figura 4 - Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi no homem e em inseto da família Reduviidae. ..................................................................................... 37
Figura 5 – Forma amastigota (A), tripomastigota: seta preta - cinetoplasto; vermelha - núcleo; azul - membrana ondulante; verde – flagelo (B) e epimastigota encontrado em tubo digestivo de inseto da família Reduviidae (C)................................................................................. 37
Figura 6 - Chagoma de inoculação na mão de técnico de laboratório em infecção acidental com T. cruzi (A), sinal de romaña em indivíduo picado por triatomíneo (B). ................................................................................ 38
Figura 7 - Paneiros carregados de açaí antes do transporte e distribuição. .... 41
Figura 8 - Notificações de casos de chagas no Brasil causados por ingestão de alimentos contaminados por T. cruzi entre os anos de 1965 e 2013. ........................................................................................................ 42
Figura 9 - Estudo retrospectivo epidemiológico de notificações de transmissão oral de doença de chagas por estados. ........................................... 43
Figura 10 - Açaizeiro em área de várzea (A). Açaizeiro cultivado em área de manejo (B). ...................................................................................... 47
Figura 11 - Produção do açaí por área plantada no estado do Pará entre os anos de 2003 e 2009................................................................................ 47
Figura 12 - Comercialização da produção do açaí proveniente do estado do Pará em 2010. ......................................................................................... 48
Figura 13 - Evolução das exportações de açaí do Pará (US$) no período de 2002 a 2010. ............................................................................................ 49
Figura 14 - Precisão do controle interno de amplificação realizado em sextuplicata. O controle negativo é representado na curva de cor rosa. ........................................................................................................ 60
Figura 15 - Curva padrão realizada em triplicata para determinação dos controles alto e baixo e limite de detecção de T. cruzi. ................... 61
10
Figura 16 - Controles alto e baixo usados para detecção de Trypanosoma cruzi a partir de DNA extraído de cultura da cepa esmeraldo.............. 62
Figura 17 - Curva padrão em triplicata construída a partir da diluição seriada tendo como ponto de menor Ct igual à 31,5ng/uL de DNA extraído de 1mL de Salmonella typhimurium ATCC 0028 em meio BHI. .. 63
Figura 18 - Controle interno de amplificação na reação de PCR multiplex funcionando juntamente com dois outros conjuntos de oligonucleotídeos usados neste estudo. ..................................... 64
Figura 19 - Curva padrão de Salmonella typhimurium ATCC 0028 construída a partir de DNA extraído de 1mL de polpa de açaí contaminado artificialmente com quantidades equivalentes à 6x106, 6x105, 6x104, 6x103, 6x102 bactérias. ..................................................... 65
Figura 20 - Curva padrão de Salmonella com cinco pontos que variam de quantidade de bactérias equivalente à 6x106à 6x102
. ................. 65
Figura 21 - Controles alto e baixo para detecção de T. cruzi em amostras de DNA extraídas a partir de polpa de açaí artificialmente contaminadas com o protozoário com quantidades equivalentes à 2x105 e 2x101 parasitas/mL de polpa de açaí. ............................ 66
Figura 22 - Amostras de campo de açaí in natura com amplificação tardia (Inconclusivo). ............................................................................. 68
11
Lista de quadros e tabelas
Quadro 1 - Número de casos notificados e confirmados de doença de chagas aguda no estado do Pará de 2002 à 2016. ................................. 44
Quadro 2 - Cepas de Salmonella e bactérias não-alvos usadas no teste de seletividade neste estudo. ........................................................... 51
Quadro 3 - Oligonucleotídeos, regiões e genes alvos usados na qPCR multiplex. .................................................................................................... 54
Quadro 4 – Condições de amplificação da reação da qPCR multiplex. .......... 56
Quadro 5 - Reagentes, volume final, concentrações finais e fabricantes dos reagentes utilizados na reação de qPCR multiplex. .................... 56
Quadro 6 - Grau de pureza e concentração de DNA de amostras de Salmonella spp. T. cruzi e polpa de açaí medidas no espectrofotômetro nanodrop 2000 e quantificadas no Qubit® 2.0 ............................ 59
Quadro 7 - Teste de seletividade da qPCR multiplex usando cepas de Salmonella de diferentes sorovares e sorogrupos e cepas de bactérias não-alvos. .................................................................... 67
Quadro 8 - Avaliação da sensibilidade, especificidade e exatidão da qPCR multiplex para detecção de Salmonella spp. e T. cruzi ............... 69
Quadro 9 - Concordância entre o método de referência e a qPCR para detecção de Salmonella spp. em teste cego. ............................................. 69
Quadro 10 – Amostras de açaí pasteurizado usadas no teste cego para avaliação da sensibilidade, especificidade, exatidão da qPCR para Salmonella spp. e Trypanosoma cruzi e avaliação do grau de concordância entre o método de referência e a qPCR para detecção de Salmonella spp. ...................................................... 70
Tabela 1- Interpretação da intensidade de concordância de acordo com os valores do coeficiente kappa. ........................................................ 58
Tabela 2 - Média e desvio padrão do Ct dos cinco pontos da curva padrão de T. cruzi. .............................................................................................. 61
Tabela 3 - Avaliação da precisão dos controle alto e controle baixo para detecção de T. cruzi...................................................................................... 62
Tabela 4 - Média e desvio padrão do Ct dos sete pontos em triplicata da curva padrão de Salmonella typhimurium ATCC 0028. .......................... 63
12
Lista de abreviaturas, siglas ou símbolos
µL: Microlitro
ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária
APPCC: Análises de Perigos e Pontos Críticos de Controle
ATCC: Coleção americana de culturas
BHI: Infusão de Coração Cérebro
BPLS: Verde Brilhante Vermelho de Fenol de Lactose de Sacarose
CDC: Centro de controle de Doenças
CIA: Controle Interno de Amplificação
CO2: Dióxido de Carbono
CT: Limiar de amplificação
CTAB: Brometo de hexa-decil-trimetil-amônio
DC: Doença de Chagas
DNA: Ácido Desoxirribonucléico
DP: Desvio Padrão
DTA: Doenças Transmitidas por Alimentos
EIEC: Escherichia coli Enteroinvasora
ELISA: Ensaio de imunoadsorção enzimática
EMBRAPA: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
EPEC: Escherichia coli Enteropatogênicas Patogênica
FAO: Organização das Nações Unidas para a Alimentação e Saúde
FDA: Administração de Alimentos e Fármacos
H2S: Gás sulfídrico
HIV: Vírus da imunodeficiência humana
ICSMF: Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos
IEC: Instituto Evandro Chagas
ISO: Organização Internacional para Padronização
kDNA: DNA do cinetoplasto
LAMP: Amplificação Isotérmica Mediada por Loop
LIA: Ágar Lisina Ferro
MAPA: Ministério da agricultura pecuária e abastecimento
13
MIO: Mobilidade Indol Ornitina
mL: Mililitros
mPCR: Reação em cadeia mediada pela polimerase em multiplex
NASBA: Amplificação Baseada na Sequência de Ácidos Nucléicos
ng: Nanogramas
nM: Nanomolar
OMS: Organização Mundial de Saúde
OPAS: Organização Pan-Americana da Saúde
PCR: Reação em Cadeia Mediada pela Polimerase
qPCR: Reação em Cadeia Mediada pela Polimerase Quantitativa
RT-PCR: Reação em Cadeia Mediada pela Polimerase precedida por transcrição reversa
SAGRI: Secretaria de Estado da Agricultura
SDS: Dodecil Sulfato De Sódio
SEDAP: Secretaria de Desenvolvimento Agropecuário e da Pesca
SEICOM: Secretaria de Estado de Indústria, Comércio e Mineração
SINAN: Sistema de Informação de Agravos de Notificação
SPSS: Pacote Estatístico para Ciências Sociais
SS: Ágar Salmonella-Shigella
TSI: Tríplice Açúcar Ferro
USDA: Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
XLD: Ágar de Desoxicolato-Lisina-Xilose
14
RESUMO
Atualmente mais de 200 doenças transmitidas por alimentos são responsáveis por aproximadamente 600 milhões de infecções e intoxicações anualmente no mundo. Alguns patógenos como a Salmonella têm como principal via de infecção alimentos contaminados, enquanto outros podem em condições específicas serem transmitidos por essa via como Trypanosoma cruzi. O tempo de resposta até a confirmação da presença da Salmonella é um gargalo logístico para a indústria alimentícia, e surtos de doença de chagas transmitida pelo consumo de polpa de açaí contaminado é atualmente um problema de saúde pública podendo acarretar sérios prejuízos econômicos. O presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento de uma qPCR multiplex com a inclusão de um controle interno de amplificação para a detecção de Salmonella spp. e Trypanosoma cruzi em polpa de açaí. Um total de 210 amostras de açaí das quais 150 foram amostras de campo e 60 foram amostras de açaí pasteurizado utilizadas em um teste cego onde algumas foram artificialmente contaminadas com Salmonella e Trypanosoma cruzi para verificar a exatidão, precisão, sensibilidade, especificidade e limite de detecção da qPCR além de verificar a concordância entre o método de referência e a qPCR para a detecção de Salmonella. Das 60 amostras do teste cego analisadas nesse estudo a qPCR multiplex apresentou sensibilidade de 98,0%, especificidade de 100% e exatidão de 97% em relação a detecção de Salmonella spp. Para Trypanosoma cruzi a sensibilidade, especificidade e exatidão foram de 100%. A concordância entre o método de referência baseado em cultura e a qPCR multiplex foi de 88,33% e o coeficiente kappa = 0,78. Das 150 amostras de campo analisadas, não foi detectado T. cruzi, sendo seis amostras inconclusivas para a presença de Salmonella spp. O controle interno de amplificação foi inserido com sucesso na qPCR e teve como alvo uma sequência do DNA de Euterpe oleracea. Os parâmetros usados na avaliação da qPCR multiplex desenvolvida neste estudo demonstraram alta sensibilidade, especificidade e exatidão, além de terem uma forte concordância com o método de referência para a detecção de Salmonella spp., além de apresentarem sensibilidade, especificidade e exatidão de 100% para a detecção de Trypanosoma cruzi em polpa de açaí. Adicionalmente, a presença do controle interno de amplificação garante a funcionalidade do teste. Neste estudo foi desenvolvida uma qPCR multiplex para detecção de Salmonella spp. e Trypanosoma cruzi em polpa de açaí. Esta qPCR multiplex pode ser usada como método alternativo para detecção de Salmonella spp., oferecendo um menor tempo de resposta. Adicionalmente o uso do controle interno de amplificação garante a funcionalidade do teste. Esta qPCR multiplex pode tornar mais rápida a pesquisa de Salmonella spp. e agregar valor à cadeia produtiva do açaí diminuindo o risco de surtos de doença de chagas transmitida por açaí contaminado.
Palavras chave: Salmonella spp. Trypanosoma cruzi, qPCR multiplex, açaí.
15
ABSTRACT
Currently more than 200 foodborne diseases are responsible for about 600 million infections and intoxications annually in the world. Some pathogens such as Salmonella has as main route of infection contaminated food, while others may under specific conditions be transmitted by this route as Trypanosoma cruzi. The response time to the confirmation of the presence of Salmonella is a logistical bottleneck for the food industry and outbreaks of chagas disease transmitted by consumption of contaminated pulp of açaí is a public health problem and may cause serious economic loss. The present study aim the development of a multiplex qPCR with the inclusion of an internal amplification control to the detection of Salmonella spp. and Trypanosoma cruzi in açaí pulp. To this were analyzed 150 samples from field and 60 samples used in a blind test of which some were artificially contaminated with Salmonella and Trypanosoma cruzi to verify the accuracy, precision, sensitivity, specificity and limits of qPCR detection in addition to checking the concordance between the reference and qPCR method for the detection of Salmonella. Of the 60 samples of blind test analyzed in this study the multiplex qPCR presented 98.0% sensitivity, specificity of 100%, and an accuracy of 97% for the detection of Salmonella spp. For Trypanosoma cruzi sensitivity, specificity and accuracy were 100 %. The correlation between the reference method based on culture and multiplex qPCR was 88.33% and the coefficient kappa = 0.78. Of the 150 analyzed field samples was not detected T. cruzi, and six samples were inconclusive for the presence of Salmonella spp. the internal amplification control was inserted successfully in qPCR and had targeted a string of DNA of Euterpe oleracea. The parameters used in the evaluation of multiplex qPCR developed in this study demonstrated high sensitivity, specificity and accuracy, and a strong agreement with the reference method for the detection of Salmonella, as well as submit sensitivity, specificity and accuracy of 100% for the detection of Trypanosoma cruzi in Acai pulp. Besides the presence of the internal amplification, control ensures the functionality of the test. In this study was developed a multiplex qPCR for detection of Salmonella spp. and Trypanosoma cruzi in açaí pulp. This multiplex qPCR can be used as alternative method for detection of Salmonella spp. by offering a shorter response time, and is the first test for the detection of Trypanosoma cruzi in pulp of açaí to include an internal amplification control offering greater reliability. This multiplex qPCR can make faster searching of Salmonella spp. and add value to the production chain of açaí by decreasing the risk of outbreaks of chagas disease transmitted by contaminated açaí.
Key words: Salmonella spp. Trypanosoma cruzi, qPCR multiplex, açaí.
16
1 INTRODUÇÃO
Dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), estimam que ocorram
600 milhões de casos de infecções/intoxicações anualmente no mundo
veiculadas por água e alimentos contaminados com, aproximadamente, 420 mil
óbitos por ano, sendo que um terço acometem crianças menores de 5 anos
(OMS, 2017). A contaminação pode ter origem química, porém a maior parte é
causada por microrganismos ou suas toxinas (Kirk et al., 2015). Vários
patógenos são responsáveis por mais de 200 doenças que podem variar de
diarreias ao câncer (Mughini-Gras et al., 2018; Safwat Mohamed et al., 2018).
A transmissão de doenças por meio de alimentos ocorrem pela ingestão
de água contaminada e alimentos crus ou mal cozidos (Kintz et al., 2017). Os
sintomas mais comuns são dores abdominais, náuseas, vômitos, diarreias, dor
de cabeça, febre, mialgia e artralgia (Switaj et al., 2015). O período de incubação
e a gravidade das infecções variam, sendo que, em alguns casos os sintomas
podem ser brandos e a infecção autolimitada não causando maiores prejuízos a
saúde da pessoa afetada, isso porém depende de vários fatores tais como o
patógeno ou toxina envolvidos, a quantidade de alimento ingerido, assim como
a idade e as condições do sistema imunológico do indivíduo afetado (Llanes et
al., 2013).
A ocorrência de surtos epidêmicos causados por agentes infecciosos e/ou
toxinas veiculadas por alimentos contaminados é um problema de saúde pública
que geram custos para o estado e prejuízos econômicos para indústria (Stephen
& Barnett, 2017). Dependendo da gravidade do surto ou do patógeno envolvido,
alguns casos podem levar a embargos e/ou sanções comerciais que podem
afetar todo o setor produtivo de um país (Holznagel et al., 2015). Dessa forma,
órgãos fiscalizadores e a indústria alimentícia tem investido em ferramentas de
gestão de qualidade e análises microbiológicas que avaliam se o alimento está
adequado para o consumo antes da distribuição e comercialização (Fortin,
2013).
Várias ferramentas de gestão de qualidade têm sido desenvolvidas e
estabelecidas para diminuir os riscos de contaminação por microrganismos.
Boas práticas de fabricação, avaliação de riscos microbiológicos, gerenciamento
17
de qualidade (série ISO) e principalmente o sistema análise de perigos e pontos
críticos de controle (APPCC) são importantes ferramentas que visam melhorar a
cadeia produtiva alimentícia (FAO, 2011). Apesar do desenvolvimento e
implementação dessas ferramentas de gestão de qualidade, as análises
microbiológicas são indispensáveis para a avaliação de presença ou ausência
de microrganismos ou toxinas nos alimentos ingeridos pela população (BRASIL,
2001).
Órgãos internacionais como a Comissão Internacional de Especificações
Microbiológicas para Alimentos (ICSMF), CODEX ALIMENTARIUS e no Brasil a
Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e o Ministério da Agricultura
Pecuária e Abastecimento (MAPA) são responsáveis por estabelecer normas e
parâmetros usados pelos laboratórios de controle de qualidade para garantir a
ausência de microrganismos em alimentos. Estes órgãos exercem importantes
funções através de exigências, diretrizes, normas, limites e padrões, e também
são responsáveis pela inspeção, controle, fiscalização e vigilância (ICSMF,
1978; BRASIL, 2001; CODEX ALIMENTARIUS, 2008).
1.1 DOENÇAS TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS
Doenças transmitidas por alimentos (DTA) são aquelas cuja causa é a
ingestão de um alimento contaminado por um agente infeccioso ou sua toxina
(Torso et al., 2015). Mais de 200 tipos de DTA desde envenenamentos causados
por toxinas naturais produzidas por cogumelos, toxinas de algas e peixes, a
alimentos contaminados por produtos químicos prejudiciais como o chumbo,
mercúrio e agrotóxicos são reconhecidas atualmente (Dorne & Fink-Gremmels,
2013). Porém, a maior parte das DTA é causada por microrganismos ou suas
toxinas (Torso et al., 2015).
As DTA podem ser classificadas em infecções, intoxicações ou
toxinfecções (Furuta et al., 2003; Croxen & Finlay, 2010; Remschmidt et al.,
2011). As infecções são causadas pela ingestão de alimentos contendo
microrganismos vivos patogênicos (Fatemeh et al., 2014). As intoxicações
ocorrem quando toxinas produzidas por determinados microrganismos estão
presentes no alimento ingerido (Mehrotra et al., 2000) e as toxinfecções resultam
18
da ingestão de alimentos contendo microrganismos que produzem e liberam
toxinas no organismo (Czerwinski et al., 2015).
A presença do patógeno no alimento, não significa necessariamente a
ocorrência da DTA. O patógeno deve estar em uma quantidade mínima
suficiente para causar uma infecção ou intoxicação, e isto está diretamente
relacionado com a quantidade de alimento consumida e o grau de contaminação
desse alimento (Humphrey et al., 1989). Adicionalmente, grupos vulneráveis
como pessoas com sistema imunológico comprometido, idosos e crianças
menores de cinco anos são fatores relevantes para manifestação da DTA (Gruter
et al., 2000).
Os sistemas de vigilância e ferramentas de gestão de qualidade de
alimentos tem avançado nas últimas décadas, não obstante, houve um aumento
de surtos de DTA nesse mesmo período (Nyachuba, 2010). Vários fatores
podem estar contribuindo para esse fato como o crescimento de grupos
populacionais vulneráveis a exemplo de pessoas infectadas com o Vírus da
imunodeficiência humana (Subramoney, 2015), citomegalovírus (Martinez &
Vera-Roman, 2002), vírus Epstein-Barr (Rigante et al., 2015), fatores
metabólicos como desnutrição, diabetes, uremia, disfunção hepática, pacientes
transplantados e com câncer (Bunning et al., 1997; FDA, 2017).
O aumento crescente da população idosa em todo o mundo também
contribui para uma maior suscetibilidade da ocorrência de infecções a esses
indivíduos (Goulet et al., 2012). Adicionalmente o crescimento populacional e a
exigência de rápida produção e distribuição dos alimentos para o consumo é um
importante fator a ser considerado pois pode acarretar em falhas no controle de
pontos críticos da cadeia produtiva (Nyachuba, 2010).
Embora alguns agentes infecciosos possam, em condições especiais, ser
transmitidos por meio de alimentos (Barreto-de-Albuquerque et al., 2015), existe
um grupo de patógenos que são transmitidos, quase exclusivamente, por meio
do consumo de produtos alimentícios (Marder Mph et al., 2018). Parasitas
multicelulares, protozoários, fungos, bactérias, vírus e príons estão entre os
agentes responsáveis pelas DTA (Balter, 2000; Slifko et al., 2000). Embora esses
patógenos representem perigos específicos e em diferentes graus de gravidade
quando ingeridos juntamente com alimentos, as bactérias são os principais
microrganismos reportados em surtos de DTA (Kim et al., 2018).
19
As bactérias têm uma ampla distribuição no meio ambiente e possuem
grande capacidade de multiplicação em condições adequadas (Franco &
Landgraf, 2008). Podem ser úteis compondo a microbiota normal do homem e
dos animais, na produção de alimentos, como simbióticos na agricultura e na
medicina (Kerwin & Nyholm, 2018; Wang,et al., 2018), não obstante são a
principal causa de DTA (Allard et al., 2018). Staphylococcus aureus, Clostridium
perfringens, Bacillus cereus, Shigella, Campylobacter, Listeria e sobretudo
Escherichia coli e Salmonella são comumente isoladas durante surtos de DTA
(Allard et al., 2018).
1.2 SALMONELLA
O gênero Salmonella é composto por bactérias gram-negativas
pertencentes a família Enterobacteriaceae que possuem forma de bastonetes,
são anaeróbicas facultativas, intracelulares e flageladas em sua maioria (Coburn
et al., 2007). Possuem algumas características bioquímicas que são usadas para
triagem e identificação preliminar durante infecções suspeitas de salmonelose
através de meios seletivos específicos (Sturod et al., 2014). O gênero Salmonella
agrupa duas espécies: Salmonella bongori e Salmonella entérica (Old, 1992;
Brenner et al., 2000b). A Salmonella bongori raramente é isolada em humanos
sendo mais comuns em animais de sangue frio e no ambiente (Fookes et al.,
2011). Por outro lado, estima-se que a Salmonella entérica seja responsável por
99% das salmoneloses em humanos (LaRock et al., 2015).
A espécie S. entérica compreende 6 subespécies: entérica (I), salamae
(II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), indica (VI) como mostrada na
Figura 1 (Old, 1992; Brenner et al., 2000b). Essas subespécies são divididas em
mais de 2500 sorovares que podem ser diferenciados através de estruturas
específicas contidas na superfície da membrana, flagelo e cápsula celular
(Brenner et al., 2000a). A caracterização dos sorovares é realizado usando o
esquema de kauffmann-white onde antígenos somáticos (O), flagelares (H) e
capsulares (Vi) são usados na caracterização antigênica das Salmonellas
(Grimont & Weill, 2008). O conjunto de sorotipos que compartilham antígenos
em comum, podem ser reunidos em sorogrupos (Brenner et al., 2000a).
20
Figura 1- Classificação do gênero Salmonella em espécies, subespécie, sorovares e afecções causadas
Fonte: Adaptado de Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC)
Para um microrganismo iniciar uma infecção ele deve estar presente em
uma quantidade mínima necessária para transpor as barreiras físicas e
imunológicas de um hospedeiro (Stoner et al., 2000). Essa quantidade mínima é
denominada dose infectante e varia entre microrganismos (Leggett et al., 2012).
Salmonelas podem apresentar diferentes doses infectantes, que podem variar
de 103 à 108 dependendo de vários fatores como alimentos ao qual estão
inseridas (BRASIL, 2011), suscetibilidade imunológica do indivíduo infectado
(Moon et al., 2013; Huaman et al., 2015) e do sorovar envolvido (Malheiros et al.,
2007).
1.2.1 Salmonelose
21
O primeiro surto de salmonelose foi descrito na Alemanha, no final do
século XIX envolvendo 59 pessoas, onde uma evoluiu ao óbito
(KARLINSKI, 1889). Atualmente a salmonelose é a DTA mais reportada durante
surtos em todo o mundo (CDC, 2018). A maioria dos sorotipos são patogênicos
ao homem, e os sinais clínicos ocorrem em média entre 12 e 36 horas após o
início da infecção (Scallan et al., 2018). Embora a transmissão possa ocorrer de
pessoa para pessoa em hospitais ou através do contato com animais infectados
em granjas ou fazendas (Wells et al., 2001; Ranjbar et al., 2018), a grande
maioria das infecções por Salmonella ocorre através da ingestão de água ou
alimentos contaminados (Wells et al., 2001; Ranjbar et al., 2018). Uma vez que
o trato intestinal do homem e de animais é o principal reservatório de Salmonella,
a transmissão ocorre quando água não tratada ou alimentos mal cozidos
contaminados com fezes são ingeridos pelo homem (Coburn et al., 2007).
Embora surtos envolvendo Salmonella ocorram em todo o mundo, há uma
maior incidência em países com baixos indicadores socioeconômicos por
reunirem condições que contribuem para a ocorrência desses surtos como
regiões densamente povoadas com condições precárias de saneamento básico
(Murphy et al., 2017). Uma ampla variedade de alimentos podem servir de via
para a infecção por salmonelose, sobretudo aqueles que oferecem nutrientes
adequados à sobrevivência e multiplicação de patógenos quando armazenados
em condições inadequadas como ovos e derivados, carnes bovinas, suínas, de
aves, além de queijos e leite (Coburn et al., 2007). A forma mais eficaz de
prevenção é evitar a ingestão de água não tratada, alimentos sem o cozimento
adequado como carnes mal passadas e leite cru, armazenar os alimentos em
condições de temperatura adequados além de hábitos regulares de higiene
como lavar bem os vegetais consumidos crus e lavar as mãos durante o preparo
das refeições (CDC, 2015).
Ao ser ingerida através de alimentos contaminados, a Salmonella
sobrevive à acidez do estomago e alcança a mucosa intestinal disseminando-se
pela submucosa originando a enterocolite aguda (Jugulete et al., 2013).
Dependendo do sorotipo e do sistema imunológico da pessoa acometida, os
sinais clínicos podem ser leves ou moderados e envolvem febre, dor abdominal,
náuseas, vômitos e diarreia que duram em torno de três dias (Wen et al., 2017).
Por outro lado, indivíduos subnutridos ou imunodeprimidos estão suscetíveis a
22
infecções mais graves e precisam de acompanhamento médico específico (Uche
et al., 2017).
As infecções por Salmonella podem apresentar cursos clínicos diferentes
como gastroenterite, septicemia, febre entérica e portadores crônicos
assintomáticos (Fierer, 2001). A gastroenterite é caracterizada pela inflamação
da mucosa intestinal que ocorre pela invasão desse tecido pela Salmonella ou
outros patógenos (Hefele et al., 2018). O período de incubação é de 8 a 48 horas
após a ingestão do alimento contaminado e os principais sintomas envolvem
febre, dor de cabeça, dores abdominais, náuseas, vômitos, falta de apetite,
diarreia com ou sem presença de sangue (Bruzzese et al., 2018). A intensidade
dos sintomas varia entre indivíduos, mas geralmente é autolimitada em adultos
e raramente evolui para septicemia (Gambino-Shirley et al., 2018). Porém em
grupos de indivíduos vulneráveis como idosos, crianças menores de cinco anos
e indivíduos imunodeprimidos podem ocorrer complicações (Preziosi et al.,
2012). Em alguns casos a infecção pode evoluir para a síndrome de cólon
irritado, que se caracteriza por diarreia branda persistente (Cremon et al., 2014).
A febre entérica ou febre tifoide é usualmente causada pelos sorovares S.
Typhi, S. Paratyphi A e C e S. Sendai embora eventualmente possa ser causada
por outros sorovares (Johnson et al., 2018). Os sinais clínicos envolvem febre
alta, dores de cabeça, mal-estar geral, falta de apetite, retardamento do ritmo
cardíaco, aumento do volume do baço, manchas rosadas no tronco, prisão de
ventre ou diarreia, tosse seca, hepatoesplenomegalia, úlcera, choque séptico,
peritonite, e nos casos mais graves pode evoluir para o óbito (Keestra-Gounder,
2015). Uma porcentagem significante de indivíduos contaminados com
sorovares tifoidais tornam-se portadores crônicos, e representam um problema
de saúde pública pois são fonte de propagação da infecção e irão eliminar as
bactérias através das fezes e urina por períodos de até um ano (Mortimer, 1999;
Ruby et al., 2012).
A septicemia é uma resposta inflamatória sistêmica resultante de um
processo infeccioso. Origina-se quando uma infecção local não é controlada, e
microrganismos alcançam a corrente sanguínea em quantidades elevadas
sendo necessária então uma resposta inflamatória sistêmica do organismo
(Polak et al., 2014). A septicemia por Salmonella inicia-se através de uma
infecção local quando a bactéria penetra a mucosa intestinal e alcança a corrente
23
sanguínea (Preveden et al., 2001). O compartilhamento inicial de sinais clínicos
com gastroenterites comuns, podem dificultar inicialmente o diagnóstico, no
entanto com a evolução do processo infeccioso e o aparecimento de sintomas
mais graves e específicos como evidência de perfuração visceral, oligúria,
edema pulmonar, acidose lática e alterações na coagulação sanguínea indicam
a ocorrência de septicemia (Polak et al., 2014).
A coagulação intravascular disseminada resultado de quadros mais
graves de septicemia impede a distribuição de oxigênio e nutrientes para os
órgãos vitais levando a falência múltipla de órgãos e consequentemente ao óbito
(Eddicks et al. 2016). Entre os sorovares mais importantes relacionados a
septicemia por Salmonella pode-se citar S. Enteritidis, S. Typhimurium, S.
Choleraesuis e S. Dublin (Eddicks et al., 2016; Silva et al., 2017).
1.2.2 Custos econômicos
A alta frequência de salmonelose causada por alimentos contaminados
representa um sério problema socioeconômico em todo o mundo (Kirk et al.,
2015). O controle de salmonelose é de grande interesse para vários segmentos
da cadeia produtiva, sobretudo para os sistemas de saúde pública e produtores
do setor de proteína animal (Arguello et al., 2018). Vários países ao redor do
mundo tem reportados prejuízos milionários na cadeia produtiva por conta de
contaminações de produtos alimentícios e surtos causados por Salmonella
(Ailes, 2013; Wierup & Widell, 2014; Evangelopoulou et al., 2015). Os custos
econômicos estimados da ocorrência de salmonelose só nos Estados Unidos
giram em torno de US$ 4 bilhões anuais (USDA, 2015). Na Holanda, entre 2012
e 2013, foram notificados 21.123 casos de infecção por Salmonella com custos
da ordem de € 7 milhões entre despesas médicas, perda de produtividade e de
produtos alimentícios (Suijkerbuijk et al., 2017).
Em países não desenvolvidos, as estimativas envolvendo prejuízos
econômicos, perda de produtividade e hospitalizações são precários (Fletcher et
al., 2013; Magwedere et al., 2015). Estimativas indicam que mais de 250 mil
casos de salmonelose deixam de ser notificados por ano, a ocorrência de casos
com sinais clínicos leves que deixam de ser notificados nos sistemas de saúde
respondem por parte da subnotificação (Scharff et al., 2016). Por outro lado, a
24
maior parte de casos subnotificados ocorre em países com sistemas de saúde
precários com problemas nos sistemas de vigilância e notificações (Fletcher et
al., 2013; Magwedere et al., 2015).
Sistemas de vigilância eficientes e análises adequadas em produtos
alimentícios, podem diminuir a ocorrência de surtos de Salmonelose e
consequentemente prejuízos econômicos (Scharff et al., 2016). Vários países
tem melhorado ou implementado sistemas de vigilância e principalmente através
de novos métodos mais rápidos e menos laboriosos para atender a nova
necessidade de rapidez com que a produção e distribuição de alimentos exige
na atualidade (Nadon et al., 2017). Sistemas de vigilância baseados em análises
moleculares tem sidos usados para tornar mais eficiente investigações durante
surtos de DTA (Lowther et al., 2017). Nos Estados Unidos a implementação do
sistema de vigilância através do programa PulseNet, evitou prejuízos
econômicos estimados em aproximadamente U$ 40 milhões de dólares entre os
anos de 2007 e 2008 (Scharff et al., 2016).
No Brasil, com o objetivo de reduzir a prevalência de salmonelose e
estabelecer um nível adequado de proteção ao consumidor, recentemente o
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) através da instrução
normativa n° 20, de 21 de outubro de 2016, passou a exigir de estabelecimentos
avícolas comerciais de frangos e perus de corte e nos estabelecimentos de abate
de frangos, galinhas, perus de corte e reprodução, a análise para detecção de
de Salmonella spp., S. typhimurium, S. enteritidis (sorovares de interesse da
saúde pública), S. pullorum e S. gallinarum sorovares de relevância para a saúde
animal (BRASIL, 2016). Essas medidas são importantes para melhorar o
monitoramento de Salmonella em alimentos associados à surtos de salmonelose
e proteger um importante setor econômico nacional contra eventuais embargos
econômicos de países importadores (BRASIL, 2016).
1.3 MÉTODOS DE DETECÇÃO DE MICRORGANISMOS EM ALIMENTOS
Metodologias para amostragem, colheita, acondicionamento, transporte e
análises microbiológicas de amostras de produtos alimentícios devem obedecer
ao disposto por órgãos internacionais como: International Commission on
25
Microbiological Specifications for Foods (I.C.M.S.F.); Codex Alimentarius;
Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods e
Standard Methods for the Examination of Dairy Products entre outros em suas
últimas edições e ou revisões. A Comissão Internacional de Especificações
Microbiológicas para Alimentos (ICSMF), é um dos mais importantes órgãos
responsáveis pelos critérios microbiológicos para avaliação de alimentos. Essa
comissão estabelece um fluxograma bem definido para garantir uma análise
assertiva de produtos alimentícios, que inclui: plano de amostragem, definições
dos microrganismos no alimento a ser avaliado e a metodologia analítica a ser
adotada, além do estabelecimento de padrões, normas e especificações que
definirão a aprovação ou reprovação do produto (ICSMF, 1978).
No âmbito nacional a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
e o Ministério da Agricultura Abastecimento e Pecuária (MAPA) são
responsáveis por estabelecer padrões e limites microbiológicos através de
critérios e interpretações de resultados das análises de alimentos para o
consumo humano, muitas vezes baseados em normativas de órgãos
internacionais (ANVISA, 2001, MAPA, 2016, ICMSF, 1978; FDA, 2007; CODEX
ALIMENTARIUS, 2008). Para identificar se determinado alimento está dentro
das normas estabelecidas, é necessário submeter amostras do alimento a
análises microbiológicas (BRASIL, 2001). Atualmente diferentes métodos tem
sido empregados na detecção de microrganismos em amostras de alimentos e
podem ser classificados em tradicionais e rápidos (Law et al., 2014).
Métodos tradicionais são usados a mais de um século e envolvem várias
etapas até a identificação de gêneros e espécies (Yue et al., 2014). Todas essas
etapas tornam os métodos tradicionais laboriosos, demorados e exigem mão de
obra treinada. As várias etapas que envolvem desde a preparação dos materiais
utilizados até a interpretação dos resultados tornam esses métodos mais
propícios à eventuais falhas (Feder et al., 2001). Por outro lado, os métodos
rápidos surgiram nas últimas décadas e entre as principais vantagens estão a
possibilidade de automação, resultados mais precisos, são menos laboriosos,
necessitam de menos mão de obra e produzem uma quantidade menor de
resíduos (Law et al., 2014).
Os métodos tradicionais baseiam-se no crescimento de microrganismos
em meios específicos e são ainda hoje considerados como referência. A
26
abordagem desses métodos fundamentam-se no cultivo e identificação de
bactérias através de meios não seletivos, seletivos e diferenciadores (Park et al.,
2012). Para se determinar um grupo ou microrganismo específico, é necessário
a realização de etapas específicas essenciais para o sucesso do procedimento.
Essas etapas envolvem um pré-enriquecimento seguido de enriquecimento
seletivo, isolamento e seleção de colônias suspeitas em meios sólidos (Cabrera-
Diaz et al., 2018).
O pré-enriquecimento visa diminuir o estresse causado às células durante
o processamento seja por mudanças de temperatura ou acréscimo de
substâncias químicas que podem causar debilidade porém, sem inativa-las
biologicamente (Richardson et al., 2018). O enriquecimento seletivo baseia-se
na diminuição da microbiota acompanhante através de substâncias que
impedem o crescimento da maioria dos microrganismos e otimizam o
crescimento de um conjunto restrito de bactérias entre as quais estão as que se
deseja identificar (Mooijman, 2018). O isolamento e seleção de colônias
suspeitas é realizada após o plaqueamento dos caldos de enriquecimento em
meios sólidos que permitem o crescimento de colônias com características
morfológicas que indicam a presença dos microrganismos como ágar
MacConkey, xilose-lisina-desoxicolato, Salmonella-Shigella, Eosina azul de
metileno e outros (Maddocks et al., 2002).
Os testes bioquímicos atualmente utilizados nas análises de alimentos
baseiam-se na ocorrência de reações químicas entre enzimas secretadas ou
presentes nos microrganismos e determinadas substâncias químicas ou
moléculas existentes no meio (El-Zanfaly & Kassim, 1983). Essas reações
resultam em eventos específicos que pode ser a formação de gases, a mudança
de cor de um meio ou ainda um processo de coagulação (Aksoysan et al., 1981).
Para a identificação de bactérias da família Enterobacteriaceae como Salmonella
spp., são realizadas provas bioquímicas baseadas na presença de determinadas
enzimas produzidas pelas bactérias, emissão de gases e motilidade.
Fermentação de dextrose, sacarose e lactose (meio TSI), produção de uréase,
desaminação de lisina e formação de H2S (meio LIA), produção de indol e
atividade de ornitina descarboxilase (meio MIO), motilidade e prova do citrato
são algumas das provas realizadas para identificar os gêneros de bactérias
(BRASIL, 2003; ISO 6579-2003).
27
1.3.1 Identificação de Salmonella spp. por meio de método tradicional
baseado em cultura
O pré-enriquecimento realizado em amostras suspeitas de Salmonella é
realizado por meio de água peptonada tamponada na proporção de 1:10 de
amostra e diluente e incubada 36 ± 1ºC por 16 a 20 horas. O enriquecimento
seletivo é realizado em dois meios que podem ser tetrationato, selenito cistina
ou Rappaport Vassiliadis incubados à 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas. Em seguida
realiza-se o isolamento e seleção de colônias em meios sólidos. Os mais comuns
são ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS),
Salmonella-Shigella, Ágar de desoxicolato-lisina-xilose (XLD), Rambach entre
outros (BRASIL, 2003).
A morfologia das colônias observadas nos meios sólidos podem ser
utilizadas como indicativo para a identificação de Salmonella. A ausência de
crescimento já indica a ausência de microrganismos. Por outro lado o
crescimento de colônias com características morfológicas compatíveis com
Salmonella sugerem a presença desse microrganismo ou de um grupo restrito
de microrganismos que compartilham um perfil bioquímico semelhante (Park et
al., 2012).
Apesar da identificação preliminar ou triagem poder ser realizada através
da morfologia da colônia em meios sólidos seletivos, e identificação de
Salmonella depende de características bioquímicas que são intrínsecas a família
Enterobacteriaceae (Ranjbar et al., 2012). Várias provas bioquímicas permitem
avaliar o perfil metabólico de colônias suspeitas e contribuir na identificação do
gênero Salmonella. Verificação da presença de citocromo oxidase; detecção de
pirrolidonil peptidase (PYRase); produção de urease; fermentação da glicose,
sacarose e lactose no meio TSI; detecção de beta-galactosidase;
descarboxilação da lisina; produção de H2S; motilidade e produção de indol são
algumas das mais importantes provas bioquímicas utilizadas em laboratórios
para identificar o perfil bioquímico de colônias suspeitas de Salmonella (BRASIL,
2003).
Além da identificação bioquímica, o reconhecimento de sorovares é muito
importante do ponto de vista médico epidemiológico (Hong et al., 2018). Entre
28
os mais de 2500 sorovares conhecidos, alguns são mais patogênicos e requerem
um maior cuidado durante surtos como os sorovares tifoidais (Organization,
2018). A identificação dos sorovares pode ser realizada através de métodos
fenotípicos ou moleculares (Ferrari et al., 2017). Os métodos fenotípicos
usualmente empregados são sorotipificação, fagotipificação e perfil de
suscetibilidade a antimicrobianos (Kwambana-Adams et al., 2015). Entre os
métodos moleculares o mais importante é a PCR, usada para detectar
sequencias específicas do DNA dos diferentes sorovares (Alzwghaibi et al.,
2018).
1.3.1.1 Tipificação de Salmonella
Entre os métodos fenotípicos, a sorotipificação é um dos mais tradicionais
e baseia-se na ligação específica entre anticorpos e antígenos presentes nas
estruturas celulares: antígenos somáticos (O), antígenos Flagelares (H) e
antígenos capsulares (Vi). Através desde esquema as Salmonellas podem ser
classificadas em sorotipos pelo esquema de Kauffmann-White (Brenner et al.,
2000a; Grimont & Weill, 2008).
A fagotipificação utiliza fagos altamente específicos que infectam somente
determinadas linhagens previamente conhecidas causando lise célular após a
infecção. Com essa técnica é possível diferenciar até certas cepas de um mesmo
sorotipo (Miller et al., 2018). A fagotipificação tem sido uma importante
ferramenta na identificação de clones epidemiologicamente importantes do
ponto de vista da saúde pública como o fagotipo DT 104 encontrado no sorovar
typhimurium que apresenta multirresistência a antimicrobianos (OMS, 2005).
Uma outra técnica fenotípica para tipificação de Salmonella é a
sensibilidade aos antimicrobianos. Essa técnica consiste na utilização de
pequenos discos de papel contendo diferentes antimicrobianos em uma placa
estriada com a cepa teste, após a incubação é realizada a verificação de
crescimento ou inibição ao redor de cada disco (Kwambana-Adams et al., 2015).
Através dessa técnica pode-se identificar a resistência a determinados
antimicrobianos e assim traçar o perfil da cepa (Neuert et al., 2018).
A tipificação de sorovares através da PCR depende da diferença de
sequencias de DNA entre os sorovares (Morita et al., 2006). A maior vantagem
29
desse método é a rapidez, a capacidade de análise em larga escala e pouca
mão de obra já que a maior parte da técnica é automatizada (Zhou et al., 2016).
Vários autores tem descrito diferentes perfis de reações de PCR para
identificação de sorovares, porém um dos pontos limitantes é a falta de
uniformização sobre a utilização de um conjunto consenso de iniciadores entre
os vários laboratórios (Kim et al., 2017; Scopes et al., 2017; Wang, Yang, et al.,
2018).
1.3.2 Identificação de Salmonella por meio de testes rápidos
1.3.2.1 Métodos imunológicos
Entre os métodos rápidos atualmente mais usados na detecção de
patógenos em alimentos estão os imunológicos (Law et al., 2014). Esses
métodos baseiam-se na interação entre anticorpos e antígenos específicos,
(CHO et al., 2014). As técnicas de imunocaptura, imunoimobilização,
coaglutinação, e Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), são alguns
métodos imunológicos usados para detecção de patógenos em alimentos (Law
et al., 2014).
Na imunocaptura os anticorpos ficam acoplados a esferas metálicas
cobertas de policarbonato, após a ligação com antígenos específicos, é aplicada
atração magnética para a separação de antígenos não específicos.
Subsequentemente, o material que não se ligou ao complexo esfera-anticorpo,
é removido e então é retirada a atração magnética e obtêm-se um produto
desejado para submissão a testes do microrganismo de interesse (ISO-
16654:2001; Kobayaschi et al., 2004). Na imunoimobilização, a adição de
anticorpos específicos bloqueia a mobilidade de bactérias cultivadas em meio
semi-sólido formando uma banda de precipitação visível (Laroche et al., 1981).
Por sua vez, a coaglutinação é uma técnica baseada na aglutinação de partículas
de látex sensibilizadas com anticorpos antitoxinas (Chattopadhyay & Rashid,
2003).
O ELISA é umas das técnicas imunológicas mais usada na detecção de
patógenos em alimentos (Liang et al., 2015). Além da detecção de patógenos,
30
essa técnica também pode ser aplicada na detecção de toxinas como a
enterotoxina estafilocócica e toxinas butolínicas (Regnath & Ignatius, 2014). A
possibilidade de automação e a disponibilidade de kits comerciais disponíveis
para vários patógenos e toxinas disponíveis hoje no mercado permitem a
implementação de análises em larga escala tornando o processo mais dinâmico
(Temelli et al., 2012).
1.3.2.2 Métodos moleculares
Em meados da década de 1980, Kary Mullis descreveu a técnica da
reação em cadeia da polimerase (PCR) revolucionando o campo da biologia
molecular (Mullis et al., 1986). Essa técnica baseada na amplificação de
sequencias específicas de ácidos nucleicos, propiciou importantes avanços no
campo da biologia molecular, desde estudos de doenças genéticas, investigação
forense até o diagnóstico de doenças infecciosas (Kaneko et al., 1989; Sommer
et al., 1989; Fregeau et al., 1993). No início da década de 1990, as primeiras
pesquisas utilizando a PCR para a detecção de patógenos em alimentos foram
realizadas, iniciando o desenvolvimento de testes para fins de controle de
qualidade a partir desta técnica (Desenclos et al., 1991; Saito et al., 1992; Makino
et al., 1995).
Com os avanços no conhecimento, várias modificações e variações foram
implementadas à técnica da PCR, o que possibilitou maior flexibilidade de
protocolos, diminuição dos riscos de contaminações cruzadas e do tempo de
resposta. A multiplex PCR (mPCR), reverse transcriptase PCR (RT-PCR) e mais
recentemente a PCR em tempo real ou PCR quantitativa (qPCR) são as mais
importantes (Herwaldt et al., 1994; Vannuffel et al., 1995; Furuta et al., 2003). A
mPCR é capaz de realizar a detecção de dois ou mais alvos simultaneamente
em uma mesma reação (Vannuffel et al., 1995). Por sua vez, na RT-PCR
moléculas de RNA, através da técnica de transcritase reversa são transcritas em
DNA complementar (cDNA) e subsequentemente amplificadas, sendo assim
uma importante ferramenta na detecção de vírus de RNA (Chou & Williams-Hill,
2018). Mais recentemente a qPCR acrescentou elementos fluorescentes durante
a amplificação dos ácidos nucléicos aumentando a sensibilidade, especificidade,
31
diminuindo o número de etapas até o resultado final e consequentemente o
tempo de resposta (Furuta et al., 2003).
A qPCR permite amplificação e quantificação de sequencias específicas
de ácidos nucleicos a partir da detecção de fluorescência emitida de acordo com
o número de cópias produzidas ao final de cada ciclo (Furuta et al., 2003). Assim,
os produtos de PCR podem ser detectados de duas formas: através de corantes
fluorescentes que se ligam a DNA dupla fita, ou sondas com marcações
fluorescentes sequência-específica (Dupouey et al., 2014). No caso dos corantes
fluorescentes intercalantes de dupla fita, o SYBR Green é o mais conhecido, por
outro lado, as sondas com marcações fluorescentes mais usadas são: molecular
beacons e TaqMan (Ryazantsev et al., 2014). As reações através de sondas
TaqMan são altamente específicas uma vez que o conjunto de três
oligonucleotídeos diminuem a possibilidade de reações inespecíficas, e por isso
são indicadas quando se deseja resultados mais confiáveis como detecção de
microrganismos para fins de diagnóstico e controle de qualidade de alimentos
(Quiles et al., 2015).
Todas as variações da PCR têm sido muito utilizadas como ferramentas
para detecção de patógenos em alimentos. No entanto a qPCR pode englobar
todas as outras variações já que pode ser realizada desde uma simples PCR
para a detecção de um único alvo, até uma multiplex e RT-PCR, todas com maior
sensibilidade, especificidade e menor risco de contaminação e tempo de
resposta (Fricker et al., 2007; Cremonesi et al., 2014). De fato, a qPCR possui a
grande vantagem de oferecer resultados de forma quantitativa podendo fornecer
o número de microrganismos presentes na amostra, o que é importante para fins
de controle de qualidade de alimentos (Hahm et al., 2015).
Outras técnicas moleculares baseadas na amplificação de ácidos
nucleicos descritas nas décadas de 1990 e nos anos 2000, tem sido aplicadas
para detecção de patógenos em alimentos (Law et al., 2014). Nucleic acid
sequence-based amplification (NASBA), Loop-Mediated Isothermal Amplification
(LAMP) e DNA Microarray são as mais importantes (Fan et al., 2012; Sugita-
Konishi et al., 2015; Tortajada-Genaro et al., 2015). Essas técnicas possuem
vantagens a serem exploradas, tais como kits comerciais disponíveis, alta
sensibilidade e potencial de implementação de análises em larga escala (Liew et
al., 2014). Apesar das vantagens, essas técnicas também têm suas limitações
32
como o alto custo para implementação em rotina, principalmente quando
encontra-se em ambientes com baixa demanda de amostras (Zhang et al., 2015).
1.3.3 Desenvolvimento de métodos alternativos para detecção de
Salmonella
O desenvolvimento de métodos alternativos para diagnóstico ou controle
de qualidade de alimentos devem ser avaliados através de vários parâmetros
para garantir a confiabilidade do protocolo (Grohmann et al., 2014). Entre os
parâmetros mais importantes podem ser citados a seletividade (inclusividade e
exclusividade), exatidão, precisão, especificidade, sensibilidade e limite de
detecção (Lemos et al). Além disso, é necessário comparar os resultados do
novo método ou protocolo com os resultados observados nos métodos de
referência para avaliar a concordância entre eles (Veterin & Distrito, 2009).
Atualmente um dos métodos alternativos mais descritos para controle de
qualidade de alimentos é a PCR e qPCR (Zhou et al., 2016; Scopes et al., 2017;
Wang, Yang, et al., 2018). Embora vários estudos tenham descritos iniciadores
e sondas para uma ampla gama de microrganismos reportados em surtos de
DTA, a ausência de experimentos que avaliem os parâmetros mínimos para
garantir a confiabilidade dos protocolos e ausência de comparação com o
método de referência é uma barreira para a utilização desses protocolos por
laboratórios (Vannuffel et al., 1995; Fricker et al., 2007; Cremonesi et al., 2014;
Quiles et al., 2015).
1.4 DOENÇA DE CHAGAS
A tripanossomíase americana ou doença de chagas (DC) é uma
antropozoonose causada por um protozoário flagelado da família
Trypanosomatidae (Carod-Artal, 2013). A área de ocorrência da DC abrange a
américa do sul e central (Figura 2) (CDC, 2017). A DC é considerada uma das
mais importante doenças negligenciadas e atualmente estima-se em torno de
oito milhões de pessoas infectadas, a maioria na américa latina (CDC, 2017). O
modo de transmissão, o vetor e o agente infeccioso dessa enfermidade foram
33
descritos por Carlos Justiniano Ribeiro das Chagas no início do século passado
(Chagas, 1909).
Figura 2 - Distribuição da doença de chagas no mundo.
Fonte: Organização Mundial de Saúde (OMS), 2013.
A DC apresenta duas fases: aguda e crônica (Nguyen & Waseem, 2017).
Na fase aguda ocorre a proliferação do parasita na corrente sanguínea e os
sinais clínicos que podem iniciar de uma e duas semanas após a infecção
envolvem febre, fadiga, dores no corpo, dor de cabeça perda do apetite, diarreia
e vômito (CDC, 2013). Em alguns casos os sinais clínicos durante a fase aguda
podem ser leves ou até mesmo assintomáticos impossibilitando o diagnóstico,
dependendo da cepa envolvida na infecção (Gulin et al., 2018), da forma de
transmissão (Barreto-de-Albuquerque et al., 2015) e de outras patologias nos
indivíduos acometidos (Tozetto-Mendoza et al., 2017).
Atualmente os únicos tratamentos disponíveis para DC são o
Benzonidazol e Nifurtimox que são muito eficazes se ministrados durante a fase
aguda da infecção (Rivera et al., 2009). Caso o indivíduo infectado não seja
tratado, a doença evolui para a fase crônica. Nessa fase os tratamentos são
pouco efetivos e embora possa ser assintomática, em 30% à 40% dos infectados
podem ocorrer distúrbios cardíacos, digestivos e no sistema nervoso que podem
34
levar ao óbito (Cordova et al., 2010; Peixoto et al., 2018; Panesso-Gomez et al.,
2018).
A forma clássica de transmissão ocorre por meio de insetos vetores da
família Reduviidae infectados, conhecidos popularmente como “barbeiros” (Lima
et al., 2018). São insetos hematófagos, que defecam durante o repasto
sanguíneo e as fezes contaminadas com agente etiológico podem cair na
corrente sanguínea através da lesão causada pela picada originando a doença
(Figura 3) (Hemmige et al., 2012). As principais espécies de insetos envolvidos
na infecção são Triatoma infestans, Panstrongylus geniculatus, Panstrongylus
lutzi, Panstrongylus megistus, Rhodnius nasutus, Rhodnius neglectus, Rhodnius
robustus, Rhodnius pictipes, Triatoma brasiliensis, Triatoma maculata, Triatoma
pseudomaculata, Triatoma rubrovaria, Triatoma rubrofasciata, Triatoma sordida
e Triatoma vitticeps (Carlos Pinto Dias et al., 2016). No Brasil o vetor mais
importante foi Triatoma infestans devido a sua ampla distribuição nos biomas e
seu habitat peridoméstico, o que potencializava o contato com a espécie humana
(Schofield et al., 2006).
Figura 3 - Triatomíneo eliminando fezes durante o repasto sanguíneo.
Fonte: Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC).
Embora a via clássica de transmissão de DC ainda seja um problema de
saúde pública, nas últimas décadas vários países em regiões endêmicas
35
desenvolveram programas com o objetivo de interromper a transmissão de DC
através da melhoria das condições de habitação e principalmente eliminação dos
principais vetores (Silveira & Vinhaes, 1999). Em meados dos anos 2000, o Brasil
foi o primeiro país na américa latina a receber a certificação internacional pela
interrupção da transmissão da DC pelo Triatoma infestans, o mais importante
vetor da DC no país (OPAS, 2006). Dados de um inquérito de soroprevalência
realizado entre os anos de 2001 à 2008 (Ostermayer et al., 2011) e dados da
vigilância epidemiológica de 2000 à 2013 realizados em amostras de diferentes
regiões do país atestaram a ausência de transmissão domiciliar contínua,
embora transmissões esporádicas ainda ocorram (Ministério de Saúde, 2015).
Essas transmissões estão ligadas à vetores secundários e as transmissões
extradomiciliares (silvestres) que passaram a ter uma maior importância no
contexto da transmissão vetorial de DC no Brasil (Browne et al., 2017).
1.4.1 Trypanosoma cruzi
O agente etiológico da doença de chagas é o Trypanosoma cruzi (Carod-
Artal, 2013). Esse protozoário possui forma alongada (durante seu estágio
infectante), e um cinetoplasto que é uma estrutura funcionalmente semelhante à
mitocôndria que dá suporte energético ao único flagelo responsável pela
motilidade do parasita (Gonçalves et al., 2018). O ciclo de vida pode ser silvestre
ou doméstico e envolve hospedeiros vertebrados e invertebrados. No ciclo
silvestre o protozoário circula entre mamíferos silvestres e insetos vetores da
família Reduviidae, quando populações humanas invadem áreas de ocorrência
do ciclo silvestre sobretudo em condições de moradia precárias como casas de
pau-a-pique com frestas que servem de moradia para os vetores, a transmissão
vetor-humano ocorre e origina o ciclo doméstico (Dias et al., 2008).
O T. cruzi possui uma ampla heterogeneidade fenotípica, bioquímica e
genética (Panunzi & Aguero, 2014; Lima et al., 2014; Messenger et al., 2015).
Embora tenha sido proposto inicialmente que essa heterogeneidade resultou
somente de evoluções clonais, evidências posteriores indicam que trocas
genéticas entre parasitas tenham contribuído para a atual estrutura populacional
do T. cruzi (Stevens et al., 1999; Ramirez et al., 2017). A partir do final da década
de 1970 várias abordagens foram usadas para caracterizar a população desse
36
protozoário, e entre as diferentes designações pode-se citar: zymodemas e
schizodemas (Carneiro et al., 1991), biodemas (Devera et al., 2002), clones
(Bosseno et al., 2000), linhagens (Brisse et al., 2000) e eclades (Chiurillo et al.,
2016). No final do século passado com o aprimoramento de técnicas moleculares
como eletroforese de enzimas multilocus (MLEE), amplificação randômica de
DNA polimórfico (RAPD), sequenciamento de DNA dos mini-exons e da
subunidade ribossômica 24S, foi proposta uma nova divisão em dois grandes
grupos denominados T. cruzi I e T. cruzi II (Momen, 1999).
Mais recentemente com um melhor entendimento da diversidade da
população de T. cruzi e através de análises de genotipagem multilocus dos
grupos denominados T. cruzi I e T. cruzi II foi proposta uma nova nomenclatura
designada Unidades Discretas de Tipificação (UDT) (Zingales et al., 2009).
Nessa nova nomenclatura a população de T. cruzi é classificada em seis grupos
ou UDT: TcI, TcII, TcIII, TcIV, TcV e TCVI e é baseada em marcadores genéticos
e imunológicos comuns entre os integrantes de cada grupo (Brenière et al.,
2016). Essa nomenclatura foi estabelecida em 2009 pela necessidade de facilitar
a comunicação entre os pesquisadores que trabalham com esse protozoário
além de caracterizar do ponto de vista epidemiológico e de patogenicidade
levando em conta marcadores moleculares e imunológicos das diferentes cepas
conhecidas (Zingales et al., 2009).
O T. cruzi assume diferentes formas dependendo do hospedeiro e da sua
localização no organismo (Figura 4). Essas diferenciações morfológicas,
genéticas e bioquímicas estão ligadas com estratégias de sobrevivência nos
hospedeiros (Goncalves et al., 2018). Na corrente sanguínea de um mamífero
infectado, o T. cruzi apresenta-se sob a forma tripomastigota sanguíneo
(Acevedo et al., 2017). Os insetos da família Reduviidae ingerem essas formas
durante o repasto sanguíneo (Anderson & Belnap, 2015).
No intestino do inseto, os parasitas convertem-se em epimastigotas
(figura 5 C) e multiplicam-se antes de migrarem para o reto onde convertem-se
em tripomastigotas metacíclicos, forma infectante que é eliminada nas fezes
durante o repasto sanguíneo (Shaw et al., 2016). Uma vez que as fezes entram
em contato com a lesão causada pela picada, inicia-se a o ciclo de infecção no
hospedeiro vertebrado. Os tripomastigotas caem na corrente sanguínea (figura
5 B) e penetram nas células de tecidos onde convertem-se na forma amastigota
37
(figura 5 A) e multiplicam-se por fissão binária (Nguyen & Waseem, 2017).
Posteriormente as formas amastigotas migram para a corrente sanguínea,
enquanto convertem-se novamente para a forma tripomastigota. Um hospedeiro
vertebrado que contém a forma tripomastigota sanguínea passa a ser um
reservatório da doença e ao ser picado por um inseto vetor o ciclo é reiniciado
(Morales et al., 2017).
Figura 4 - Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi no homem e em inseto da família Reduviidae.
Fonte: Adaptado de Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC)
Figura 5 – Forma amastigota (A), tripomastigota: seta preta - cinetoplasto; vermelha - núcleo; azul - membrana ondulante; verde – flagelo (B) e epimastigota encontrado em tubo digestivo de
inseto da família Reduviidae (C).
Fonte: Atlas Trypanosoma cruzi (UFRGS).
38
Além da transmissão vetorial, outras formas de infecção por DC podem
ocorrer tanto em regiões endêmicas quanto em outras regiões do mundo onde
não há a presença do T. cruzi em reservatórios naturais ou vetores (Araujo et al.,
2017; Zuleta-Duenas et al., 2017; Noya et al., 2017). Essas formas de infecção
podem ocorrer através de transplante de órgãos ou transfusões de sangue de
doadores infectados (Fearon et al., 2013; Kransdorf et al., 2014), infecção
congênita (Noya et al. 2017), acidentes laboratóriais (Hofflin et al., 1987) e
transmissão por via oral (Noya et al. 2017). Essas formas de infecção podem ser
de difícil diagnóstico, sobretudo em regiões não endêmicas (Antinori et al., 2017).
1.4.2 Transmissão oral de DC
Surtos de DC transmitidas por via oral possuem algumas características
específicas que podem ser utilizadas para facilitar o diagnóstico do agente
infeccioso. Normalmente esses surtos acometem pessoas da mesma família ou
nas vizinhanças onde está o alimento que foi fonte da infecção (Pinto et al.,
2001). Os infectados apresentam quadro clínico positivo com a fase aguda da
DC. Além disso, não são observadas lesões e/ou reações cutâneas como o
chagoma de inoculação ou sinal de romaña (Figura 6A) provocadas pela
resposta inflamatória à picada de insetos vetores e entrada do agente infeccioso
naquele ponto (Figura 6B) (de Noya et al., 2015). Combinados, esses eventos
podem indicar fortes indícios de um surto de DC por via oral.
Figura 6 - Chagoma de inoculação na mão de técnico de laboratório em infecção acidental com T. cruzi (A), sinal de romaña em indivíduo picado por triatomíneo (B).
Fonte: (A) Kinoshita-Yanaga et al., (2009), (B) Yanez et al., (2017)
39
Desde a década de 1940 experimentos em modelo animal indicam que o
T. cruzi é capaz de penetrar pela mucosa gastrointestinal e causar infecção (Dias
et al., 1940). Porém apenas em meados da década de 1960 um caso de infecção
de DC foi associado à transmissão oral no distrito de Teutônia, no estado
brasileiro do Rio Grande do Sul (Silva et al., 1968). Nas últimas décadas,
Argentina, Equador, Colômbia, Bolívia, Guiana Francesa, Venezuela além do
Brasil, tem reportado surtos de transmissão oral de DC (da Costa Santiago;
Dutra; Gollob; Andrade, 2014; Blanchet et al., 2014; Silva-Dos-Santos et al.,
2017). No Brasil, esses surtos já foram registrados na Bahia, Ceará, Piauí,
Paraíba, Santa Catarina, São Paulo, Amazonas, Maranhão, Mato Grosso,
Amapá, Pará e Tocantins (Dias et al., 2008; OPAS, 2009). As fontes de
contaminação são diversas podendo envolver consumo de carne de caça mal
cozida, água, palmito, bacaba, suco de goiaba, caldo de cana de açúcar e polpa
de açaí (Ferreira et al., 2001; Pereira et al., 2009; Barbosa-Ferreira et al., 2010;
Toso M et al., 2011).
No Brasil os surtos de DC mais importantes do ponto de vista histórico
e/ou epidemiológico ocorreram em Teutônia em 1965 (Silva et al., 1968), Santa
Catarina em 2005 (Cardoso et al., 2006), e surtos provocados pelo consumo de
polpa de açaí na região amazônica (Vargas et al., 2018). Em Teutônia distrito do
município de estrela (RS), dezessete alunos de uma escola apresentaram ao
mesmo tempo sinais clínicos que envolviam febre, dor de cabeça, astenia. O
diagnóstico foi feito por meio do isolamento do protozoário no sangue dos
infectados e no tecido cardíaco durante a necropsia do infectados que vieram a
óbito (6/17). Não foram encontrados insetos vetores na escola, por outro lado,
análises em amostras de sangue realizadas em marsupiais da espécie Didelphis
marsupialis encontrados nas redondezas da escola incluindo um capturado na
escola, mostraram que esses mamíferos estavam infectados com T. cruzi. Assim
as evidências sugerem que as secreções do animal podem ter entrado em
contato com os alimentos ingeridos pelos indivíduos infectados. Este foi o
primeiro surto de DC associado à transmissão oral no Brasil (Silva et al., 1968).
O surto ocorrido no estado de Santa Catarina apresentou uma
característica incomum aos surtos de transmissão oral de DC. Normalmente
esses surtos são localizados e atingem uma família ou pessoas próximas à fonte
do alimento contaminado (Beltrao et al., 2009). Nesse caso específico o surto
40
espalhou-se por três cidades do estado de Santa Catarina: Navegantes, Penha
e Joinville. Investigações posteriores indicaram que a fonte da infecção foi um
quiosque de venda de caldo de cana localizado as margem da BR-101. O surto
originou-se quando acidentalmente insetos da espécie Triatoma tibiamaculata
portadores do T. cruzi caíram nas moendas de cana e foram ingeridos com o
alimento (Steindel et al., 2008).
Na região amazônica o açaí é o principal alimento associado a surtos de
DC (Pereira et al., 2009; Nobrega et al., 2009; Souza-Lima et al., 2013). Entre os
anos de 1986 e 2000, 50% dos casos de DC foram transmitidos por via oral, e
entre 2000 e 2010 essa porcentagem chegou a 70% dos casos, tornando a
principal via de transmissão de DC, o consumo de açaí contaminado (Benchimol
Barbosa, 2006; Shikanai-Yasuda & Carvalho, 2012). A via de contaminação do
açaí por T. cruzi foi descrita por Seccadio e colaboradores (2013).
De acordo com esse estudo, o inseto triatomíneo é atraído aos paneiros
(Figura 7) por eventos semelhantes aos ocorridos no corpo dos mamíferos que
são a fonte natural de alimentos desses insetos. Análises experimentais
mostraram que 10 paneiros de açaí produzem uma quantidade de calor
equivalente a um homem adulto, adicionalmente a respiração celular consome
oxigênio e libera CO2. Além disso durante o processo de transpiração do fruto,
são exalados odores que podem ser confundidos com o suor de mamíferos e
feromônios de fêmeas, dessa forma, os insetos são atraídos aos paneiros pelo
calor, emissão de CO2, e odores característicos de fontes de alimentos e atração
sexual. Nos paneiros os insetos podem defecar contaminando os frutos, ou ser
processados juntamente a estes durante o processo de despolpamento. A não
higienização e/ou pasteurização desse açaí antes da distribuição e consumo irá
então acarretar os surtos de DC (Seccadio, 2013).
41
Figura 7 - Paneiros carregados de açaí antes do transporte e distribuição.
Fonte: Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA)
Dados de um estudo realizado por Barbosa e colaboradores (2010)
demonstraram a sobrevivência e infectividade do T. cruzi em polpa de açaí. No
experimento foram inoculadas artificialmente formas tripomastigotas em
amostras de polpa de açaí que posteriormente foram submetidas à diferentes
períodos de incubação e temperaturas (temperatura ambiente, refrigerada à 4°C
e congeladas à -20°C). Os resultados mostraram que os parasitas continuaram
viáveis por mais de 24 horas nas amostras congeladas, 48 horas à temperatura
ambiente e quase uma semana nas amostras refrigeradas. Essas resultados de
viabilidade/infectividade foram alcançados através de modelo experimental onde
camundongos foram artificialmente infectados com os tripomastigotas
recuperados e isolados das polpas depois do período de incubação por três
diferentes vias: intraperitoneal, oral e gavagem.
Dados do Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN)
mostram que a ocorrência de surtos de doença de chagas aguda por
transmissão oral tem ocorrido com mais frequência na última década (figura 8)
Embora outras fontes de alimentos sejam capazes de ser via de transmissão oral
de DC, o consumo de polpa de açaí in natura é a atualmente a principal via
(Pereira et al. 2009). Em 2006 dos 115 casos de DC confirmados 94 foram por
42
via oral, ou seja 82% dos casos, a maioria através do consumo do açaí
contaminado (Coura, 2006).
Um estudo retrospectivo realizado por Magalhões-Santos e colaboradores
(2014) mostra que a partir de 2007 as notificações de transmissão oral de DC
intensificaram-se, sobretudo no estado do Pará (figura 9 e quadro 1), com a
principal via de transmissão através da polpa de açaí. Nesse período ocorreram
em torno de 50% dos novos casos de DC do Brasil e 75% dos casos na
Amazônia entre os anos de 2007 e 2013 (Magalhães-Santos, 2014). Essa via de
transmissão tem sido um desafio para a saúde pública na região amazônica uma
vez que a polpa de açaí é historicamente um importante alimento na dieta da
população dessa região, e os surtos são imprevisíveis (Nogueira et al., 2013).
Figura 8 - Notificações de casos de chagas no Brasil causados por ingestão de alimentos contaminados por T. cruzi entre os anos de 1965 e 2013.
Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN)
43
Figura 9 - Estudo retrospectivo epidemiológico de notificações de transmissão oral de doença de chagas por estados.
Fonte: Magalhães-Santos (2014)
44
Quadro 1 - Número de casos notificados e confirmados de doença de chagas aguda no estado do Pará de 2002 à 2016.
* % N/C: porcentagem de notificação confirmadas
Fonte: SINAN (2016)
Dados do sistema de informação sobre mortalidade (2012) evidenciam
que de forma geral a taxa de mortalidade de indivíduos com DC aumenta de
acordo com a faixa etária (Santo, 2008). A maioria desses óbitos ocorre em
indivíduos acima de 60, sendo a taxa de mortalidade de 18,3/100 mil habitantes
em mulheres e 25/100 mil habitantes em homens. Esses dados sugerem que a
45
taxa de mortalidade da DC está associada, na maioria dos casos, por danos aos
sistemas cardíaco, digestivo ou neurológico que podem ocorrer durante a fase
crônica (Mota et al., 2014).
A análise comparativa entre surtos de DC por via oral e à infecção vetorial,
têm evidenciado que a via de transmissão pode ser mais importante do que se
pensava com relação a evolução da infecção (Silva-Dos-Santos et al., 2017).
Barreto e colaboradores (2015) demonstraram experimentalmente que o ponto
de entrada do agente no organismo está diretamente ligado à gravidade da
infecção, ou seja, a via de transmissão pode alterar a intensidade e as
manifestações da doença. De fato, a taxa de mortalidade durante os surtos de
DC por via oral varia de 8% à 35%, enquanto nos casos de transmissão vetorial
a taxa de mortalidade é em torno de 5% durante a fase aguda da infecção (Rassi
et al., 2010).
As taxas de mortalidade mais altas reportadas em surtos de transmissão
oral de DC foram em Santa Catarina envolvendo consumo de caldo de cana de
açúcar contaminado onde 16% dos infectados vieram à óbito (Steindel et al.,
2008; Pereira et al., 2009), na Bahia com 28% de óbitos durante um surto
envolvendo água contaminada (Dias et al., 2008) e em Teutônia onde 35% dos
infectados vieram à óbito (Silva et al., 1968). Esses estudos reforçam os indícios
que a entrada do parasita através de conjuntiva oral ou gastrointestinal pode
causar mais danos do que através da lesão causada pelo inseto na pele.
Atualmente não há um método capaz de detectar a presença do parasita
no açaí. Assim o branqueamento e pasteurização são importantes ferramentas
para evitar os surtos de infecção (Oliveira et al., 2011). Não obstante, o pequeno
comerciante normalmente não faz uso desses processos, sobretudo nas
periferias e nas cidades do interior, o que torna as pessoas que consomem a
polpa de açaí nesses pontos de vendas um grupo vulnerável à transmissão oral
de DC (Nóbrega et al., 2009).
46
1.5 AÇAÍ
O açaizeiro é uma palmeira do gênero Euterpe que conta com 49 espécies
distribuídas na América do Sul e central. Ocorre especialmente na região
amazônica com maior abundancia na Colômbia (19 espécies), Brasil (10
espécies) e Venezuela (9 espécies) (Villachica, 1996). Das espécies que
ocorrem no Brasil a Euterpe oleracea é a mais importante socioeconomicamente
(Dutra et al., 2016; Neri-Numa et al., 2018). Seu desenvolvimento se dá em solos
alagados e várzea podendo atingir altura de até 25 metros e possui caule de 15
a 25 cm de diâmetro. Os frutos são do tipo baga com 1 a 1,5 cm de diâmetro de
cor violácea tornando-se quase negros depois de maduros (Villachica, 1996).
O açaí é uma das frutas mais nutritivas do planeta, rico em proteínas,
lipídios insaturados, vitaminas E, A e complexo B, fibras, potássio, cálcio, fósforo,
magnésio, zinco, ferro e outros minerais (Neida & Elba, 2007; da Silva Santos et
al., 2014; Souza et al., 2017; de Bem et al., 2018). A cor roxa vem das
antocianinas, que são anti-radicais livres (Garzon et al., 2017; Torma et al.,
2017). Vários autores tem realizado estudos relacionados ao potencial
antioxidante, propriedades anticonvulsivantes, efeitos citotóxicos em células
cancerígenas mostrando várias perspectivas para as mais diversas aplicações
desse fruto (Souza-Monteiro et al., 2015; Marques et al., 2017; Alessandra-Perini
et al., 2018). Toda essa riqueza nutricional e versatilidade torna o açaí uma fruta
extremamente atraente do ponto de vista nutricional, científico e comercial (Silva
et al., 2014; Souza-Monteiro et al., 2015).
A maior parte do açaí é obtida da atividade extrativista típica da agricultura
familiar, sendo esta a principal fonte de renda dos agricultores envolvidos. Em
menor escala, o açaí provém de açaizais manejados e cultivados (Figuras 10A
e 10B). Recentemente essa atividade de manejo vem apresentando um
importante crescimento nos últimos anos incluindo novas cultivares em terra
firme proveniente de melhoramento genético por instituições de pesquisa
aumentando assim a produção (SEICOM, 2012).
47
Figura 10 - Açaizeiro em área de várzea (A). Açaizeiro cultivado em área de manejo (B).
Fonte: Secretaria de Estado de Indústria, Comércio e Mineração (SEICOM, 2011)
A cadeia produtiva do açaí no estado do Pará é composta por
aproximadamente 300 mil pessoas (SEDAP, 2015). Só na grande Belém durante
o período de colheita, há em torno de 3.000 pontos de venda (SEDAP, 2015). A
produção apresentou um forte crescimento na última década (figura 11). Em
2012 a produção atingiu 851.829 Toneladas (SAGRI, 2013).
Figura 11 - Produção do açaí por área plantada no estado do Pará entre os anos de 2003 e 2009.
Fonte: Secretária de Estado da Agricultura (SAGRI, 2013)
48
A maior parte da produção ainda é consumida pela população local, no
entanto o açaí é atualmente uma das frutas amazônicas mais conhecidas fora
da região e com grande potencial de conquista de novos mercados (Neri-Numa
et al. 2018). Sua comercialização é crescente tanto no âmbito nacional quanto
internacional uma vez que em torno de 30% da produção já é comercializada
para outras regiões do país principalmente para o sudeste, e 10% é exportada
como mostra a figura 12 (SEICOM, 2011). Os Estados Unidos consomem 77%
de todo açaí que é exportado estabelecendo-se como o maior consumidor.
Alguns países da Ásia, Europa e América do Sul também estão entre os
principais mercados consumidores, com grande potencial de consumo, porém
ainda pouco explorados (SAGRI, 2013).
Figura 12 - Comercialização da produção do açaí proveniente do estado do Pará em 2010.
Fonte: Secretaria de Estado de Indústria, Comércio e Mineração (SEICOM, 2011)
Embora apenas uma pequena parte da produção seja destinada à
exportação, o mercado externo tem representado um papel importante para a
perspectiva econômica do açaí. Entre os anos de 2002 e 2009 o faturamento
com exportação de açaí aumentou de US$1.037,740 para US$ 24.014,995
49
(figura 13). Apesar do significativo aumento no faturamento, os mercados
nacional e internacional ainda possuem um grande potencial para expansão, e
as projeções indicam que a produção irá mais que duplicar na próxima década
(SAGRI, 2011).
Figura 13 - Evolução das exportações de açaí do Pará (US$) no período de 2002 a 2010.
Fonte: Secretária de Estado da Agricultura (SAGRI, 2011)
A comercialização do açaí tende a aumentar à medida que o processo
produtivo incorpore procedimentos que atendam exigências relacionadas à
higiene e controle de qualidade do produto exigidas pelo mercado nacional e
internacional (Cesar et al., 2014). Esses procedimentos têm sido incorporados
na cadeia produtiva nos últimos anos com a entrada no mercado de agroindústria
que utilizam métodos e equipamentos modernos para o processamento e
distribuição do produto, além de uma maior preocupação com a qualidade
microbiológica do açaí (Pereira et al., 2006; Eto et al., 2010).
50
1.6 OBJETIVOS
1.6.1 Objetivo geral
Desenvolver uma qPCR multiplex para detecção simultânea de Trypanosoma
cruzi e Salmonella spp. em polpa de açaí.
1.6.2 Objetivos específicos
Construir e incluir na qPCR um controle interno de amplificação baseado em uma
sequência alvo no genoma de Euterpe oleracea.
Avaliar a seletividade (inclusividade e exclusividade), exatidão, precisão,
sensibilidade, especificidade, e limite de detecção da qPCR multiplex.
Comparar o desempenho da qPCR multiplex para detecção de Salmonella spp.
com o método de referência baseado em cultura em amostras de polpa de açaí
artificialmente contaminadas em um teste cego.
Verificar a presença de Trypanosoma cruzi e Salmonella spp. em amostras de
de açaí provenientes de indústrias localizadas na região nordeste do estado do
Pará.
51
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1 PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS PARA A EXTRAÇÃO DE DNA
2.1.1 Preparação das cepas de Salmonella e bactérias não alvo para o
teste de seletividade.
Este estudo utilizou dezoito cepas de bactérias para o teste de
seletividade das quais sete eram de diferentes sorogrupos e/ou sorovares de
Salmonella spp. (inclusividade) e 12 cepas de bactérias não-alvos
(exclusividade) mostradas no quadro 2. As bactérias foram cultivadas em estufa
à 37°C por 20 horas em meio BHI e após o período de incubação, 1mL do meio
foi aliquotado e congelado a -20°C até o momento da extração de DNA. Essas
bactérias foram escolhidas baseadas em similaridades filogenéticas, por serem
encontradas no mesmo ambiente ou crescer nas mesmas condições dos
patógenos alvos desse estudo.
Quadro 2 - Cepas de Salmonella e bactérias não-alvos usadas no teste de seletividade neste estudo.
Cepas de Salmonella Bactérias não-alvos
Salmonella typhimurium ATCC 0028 Enterobacter aerogenes ATCC 13048
Salmonella sorogrupo B Staphylococcus epidermidis ATCC 0128
Salmonella sorogrupo C1 Proteus mirabilis
Salmonella sorogrupo C2 Citrobacter freundii
Salmonella sorogrupo D Klebsiella pneumoniae
Salmonella pullorum ATCC 9120 Escherichia coli EIEC
Salmonella typhimurium ATCC 14028 Escherichia coli 7
- Escherichia coli EPEC
- Serratia sp.
- Pseudomonas aeruginosa ATCC 0053
- Providencia sp.
- Staphylococcus aureus ATCC 0038
52
2.1.2 Preparação da cepa Esmeraldo de T. cruzi.
A partir de amostras da cepa esmeraldo de T. cruzi cedidas pelo
laboratório de Doença de Chagas do Instituto Evandro Chagas (IEC), foi
separada uma alíquota de 1mL de cultura (previamente contada em câmara de
Newbaeur) com concentração de 2x106 parasitas/mL e mantida à -20°C até o
momento da extração de DNA.
2.2 CONTAMINAÇÃO ARTIFICIAL DA POLPA DE AÇAÍ COM T. CRUZI E
SALMONELLA SPP.
A contaminação artificial do açaí foi realizada inoculando-se volumes de
50µL de cultura de T. cruzi contendo 2x105, 2x104, 2x103 2x102 e 2x101 parasitas
em alíquotas de 950µL de polpa de açaí pasteurizada. A partir de uma alíquota
da cepa ATCC de Salmonella typhimurium 0028 (NewProv, Pinhais, Brasil),
cultivada em caldo BHI à 36±1°C por 20 horas, foi realizada uma diluição seriada
com 7 pontos (6x106, 6x105, 6x104, 6x103 6x102 e 6x101, 6x100 unidades
equivalentes/mL). 50µL de cada diluição foi inoculada em 7 tubos diferentes
contendo 950µL de polpa de açaí pasteurizada.
2.3 EXTRAÇÃO DE DNA
A extração de DNA de Salmonella, cepas bacterianas não-alvos e T. cruzi
foi realizada com o PureLink® Genomic DNA Purification Kit (Invitrogen,
Carlsbad, USA) de acordo com as recomendações do fabricante. O DNA das
amostras de polpa de açaí foi extraído utilizando o Purelink® total plant genomic
DNA kit (Invitrogen, carlsbad, USA) de acordo com as recomendações do
fabricante.
2.3.1 Avaliação da concentração e pureza do DNA
A pureza do DNA extraído a partir das culturas de células e da polpa de
açaí foi avaliada através da medida da densidade óptica usando o
53
espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts,
USA). Para verificar a concentração do DNA extraído das amostras foi usado o
Qubit® 2.0 (Invitrogen, Carlsbad, USA).
2.4 CONTROLE INTERNO DE AMPLIFICAÇÃO (CIA)
Para a construção do CIA foi usado uma sequência da subunidade alpha
(atpA) do gene F1-ATPase de Euterpe oleracea (n° acesso GenBank
AY299769). A partir dessa sequência foram desenhados os iniciadores e a sonda
marcada com fluoróforo VIC usando o software Primer Express® Software
v3.0.1. A similaridade dos oligonucleotídeos com a sequência alvo foi checada
no BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) versão 2.6.0. A precisão do CIA
foi avaliada através do desvio padrão da média dos valores em sextuplicata.
2.5 INICIADORES E SONDAS PARA DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DOS
PATÓGENOS ALVOS
Os iniciadores e sonda para detecção de T. cruzi foram desenhados
usando o software Primer Express® Software v3.0.1, de acordo com as
sequencias de DNA publicadas no GenBank da região repetitiva do DNA satélite
de Trypanosoma cruzi (n° de acesso EU178927). A similaridade dos
oligonucleotídeos com a sequência alvo também foi avaliada no BLAST versão
2.6.0. Os iniciadores e sonda utilizados para detecção de Salmonella spp. foram
descritos por Malorny et al., (2004). Adicionalmente foi realizada uma análise no
software on-line OligoAnalizer 3.1 da Integrated DNA Technologies (IDT) para
avaliar possíveis formações de heterodímeros, homodímeros ou Hairpins entre
todos os oligonucleotídeos utilizados na reação em multiplex. Os
oligonucleotídeos utilizados nesse estudo são mostrados no Quadro 3.
54
Quadro 3 - Oligonucleotídeos, regiões e genes alvos usados na qPCR multiplex.
*Sequencias de oligonucleotídeos sob avaliação de patente.
2.6 ESTABELECIMENTO DA PRECISÃO E LIMITE DE DETECÇÃO DA
qPCR
O limite de detecção foi definido através de diluições seriadas para
definição das quantidades mínimas de DNA capazes de serem detectadas na
qPCR em multiplex. A detecção de T. cruzi foi avaliada baseada em dois
controles: Alto e baixo. Para determinar os valores de Ct desses controles foi
construída uma curva padrão de 5 pontos com concentrações equivalentes à
2x105, 2x104, 2x103, 2x102 e 2x101 parasitas/mL em triplicata. Os valores
extremos da curva padrão foram utilizados como controle alto e baixo, sendo o
controle baixo o limite de detecção. Após a definição dos valores de Ct dos
controles eles foram testados em reações de qPCR nas mesmas condições
durante 6 dias consecutivos para verificar a precisão dos controles.
A quantidade aproximada de Salmonella para a construção da curva
padrão foi definida através da quantificação em Qubit do DNA extraído a partir
da amostra incubada em meio BHI por 20 horas à 36°C. O DNA da amostra foi
extraído e quantificado sendo observado uma concentração de 31,5 ng/µL.
Como já é estabelecido (Malorny et al., 2004) o genoma de uma Salmonella é
equivalente à 5fg de DNA purificado, então a concentração inicial foi de
aproximadamente 6x106/mL. A partir dessa concentração inicial, foi realizada
uma diluição seriada de 7 pontos variando de 6x106 à 6x100 cópias
equivalentes/mL. Amplificações ocorridas após os limites de detecção
estabelecidos foram consideradas como resultado inconclusivo.
55
2.7 AMOSTRAGEM, COLHEITA, CONDICIONAMENTO E TRANSPORTE
DAS AMOSTRAS DE AÇAÍ.
Neste estudo foram utilizadas 150 amostras de campo de polpa de açaí
in natura com um volume de aproximadamente 200mL, cedidas por um
laboratório privado localizado no município de Belém-PA e 60 amostras de açaí
pasteurizado (posteriormente contaminadas artificialmente com os patógenos
analisados no presente estudo) para avaliar a sensibilidade, especificidade e
exatidão da qPCR multiplex, totalizando 210 amostras testadas. As 150
amostras de campo foram originárias de indústrias situadas na região nordeste
do estado do Pará e foram recebidas congeladas e acondicionadas em caixas
térmicas e adequadamente identificadas especificando origem, data, hora e local
da coleta e data do recebimento no laboratório. As 60 amostras de açaí
pasteurizado foram cedidos por uma indústria colaboradora neste estudo. As
análises foram iniciadas quando possível no mesmo dia da chegada das
mesmas ao laboratório e no máximo no dia seguinte. Antes do início das análises
as amostras foram homogeneizadas e separadas alíquotas para a realização de
análises pelo método de referência (pesquisa de Salmonella spp.) baseado em
cultura e a qPCR multiplex.
2.8 PESQUISA DE SALMONELLA SPP. PELO MÉTODO TRADICIONAL
BASEADO EM CULTURA
A preparação e análise das amostras para análise de Salmonella spp. foi
realizada de acordo com o estabelecido pela instrução normativa nº 62, de 26 de
agosto de 2003 do Ministério de Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA).
As 210 amostras usadas neste estudo foram submetidas à análise
microbiológica tradicional e foram realizadas no laboratório privado colaborador
deste estudo.
O pré-enriquecimento foi realizado a partir de 25mL da amostra
adicionada à 225mL de água peptonada tamponada e incubada à 36 ± 1°C por
20 horas. Após esse período de incubação 1mL do meio pré-enriquecido foi
adicionado a 9mL de caldo selenito-cistina e tetrationato para enriquecimento
seletivo. As amostras foram novamente incubadas à 41 ± 0,5°C, sendo
56
tetrationato em banho maria e selenito cistina em estufa. Após 24 horas de
incubação uma alçada dos meios foi estriada em ágar Salmonella-Shigella (SS)
e ágar desoxicolato-lisina-xilose (XLD). As colônias que apresentarem
características morfológicas sugestivas ao gênero Salmonella foram repicadas
em ágar triptona de soja (TSI) e incubadas a 36 ±1ºC por 24 horas, a fim de
verificar a pureza da colônia. Para a confirmação bioquímica em amostras com
crescimento de colônias suspeitas foi realizado a confirmação por provas
bioquímicas no sistema automatizado VITEK® 2 (bioMérieux, Marcy-l'Étoile,
França) utilizando-se cartelas de identificação para gram-negativas (ID-NG) de
acordo com as recomendações do fabricante.
2.9 PADRONIZAÇÃO DA qPCR MULTIPLEX
A padronização da qPCR multiplex foi realizada no equipamento Rotor-
Gene Q (Qiagen, Hilden, Alemanha). O volume final da reação foi de 20 µL. O
perfil da reação e os reagentes usados são mostrados nos quadros 4 e 5.
Quadro 4 – Condições de amplificação da reação da qPCR multiplex.
Quadro 5 - Reagentes, volume final, concentrações finais e fabricantes dos reagentes utilizados na reação de qPCR multiplex.
*Concentrações de reagentes sob avaliação de patente.
57
2.9.1 Avaliação da concordância entre métodos.
Para avaliar a concordância entre o método tradicional baseado em
cultura e a qPCR multiplex, 60 amostras de açaí pasteurizado foram usadas em
um teste cego. Um técnico de um laboratório colaborador recebeu amostras de
açaí e foi orientado a contaminar as amostras com diferentes quantidades dos
patógenos (Salmonella typhimurium ATCC 0028 e T. cruzi cepa esmeraldo) de
forma que o pesquisador responsável pelas análises microbiológicas e de qPCR
multiplex não tivesse acesso a quais amostras estavam contaminadas e nem as
quantidades de cada patógeno. Entre as amostras com resultado presuntivo em
ágar XLD e SS foi realizada a identificação bioquímica no sistema automatizado
VITEK® 2 de acordo com as recomendações do fabricante. Como atualmente
não há um teste disponível para detecção de T. cruzi em polpa de açaí, para
esse patógeno foi avaliada somente a sensibilidade da qPCR nas amostras
artificialmente contaminadas.
2.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
A avaliação da precisão do controle interno de amplificação, curvas
padrão e controles alto e baixo foi medida através do desvio padrão das médias
observadas. A sensibilidade, especificidade e exatidão da qPCR foi realizada
nas 60 amostras do teste cego onde um número desconhecido de amostras de
açaí pasteurizado foram artificialmente contaminadas com Salmonella
typhimurium ATCC 0028 e Trypanosoma cruzi (cepa esmeraldo). As análises
acima citadas foram realizadas no software SPSS versão 19.0 (IBM, Chicago,
EUA). A concordância entre o método tradicional baseado em cultura e a qPCR
multiplex foi realizada através do coeficiente kappa ponderado utilizando o
software GraphPad (https://www.graphpad.com/quickcalcs/kappa2/). A
intensidade de concordância foi mensurada de acordo com o descrito por Landis
JR. & Koch GG (1977) (Tabela 1.)
58
Tabela 1- Interpretação da intensidade de concordância de acordo com os valores do coeficiente kappa.
Valor de Kappa Interpretação
<0,00 Nenhuma concordância
0,0 - 0,19 Concordância fraca
0,20 - 0,39 Concordância suave
0,40 - 0,59 Concordância moderada
0,60 - 079 Concordância substancial
0,80 - 100 Concordância quase perfeita
59
3 RESULTADOS
3.1 PUREZA E CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA
A análise das amostras de DNA extraídas das culturas de T. cruzi,
Salmonella typhimurium (ATCC 0028). demonstrou um grau de pureza ~1.8 que
é o valor considerado ideal para a razão 260/280. A análise das amostras de
açaí revelou uma razão 260/280 em torno de 1.6. A concentração do DNA de T.
cruzi, Salmonella spp. e E. oleracea foram 36 ng/µL, 31,5 ng/µL e 50,7 ng/µL
respectivamente como mostrado no quadro 6.
Quadro 6 - Grau de pureza e concentração de DNA de amostras de Salmonella spp. T. cruzi e polpa de açaí medidas no espectrofotômetro nanodrop 2000 e quantificadas no Qubit® 2.0
Amostra Razão
260/280 Razão
230/260 Concentração
(ng/µL)
Trypanosoma cruzi 1.78 2.09 36,0 ng/µL
S. typhimurium (ATCC 0028) 1.81 2.11 31,5 ng/µL
Euterpe oleracea 1.60 1.78 50,7 ng/µL
3.2 AVALIAÇÃO DA PRECISÃO DO CONTROLE INTERNO DE
AMPLIFICAÇÃO (CIA)
Quando o threshold foi definido para um valor de fluorescência de 0,1 para
o fluoróforo VIC (detectado no canal amarelo), usado na marcação da sonda que
tem como alvo a sequência de DNA de E. oleracea usada como CIA, foi
observada uma excelente precisão em sextuplicata com Ct= 21,38 ± 0,16 (Figura
14).
60
Figura 14 - Precisão do controle interno de amplificação realizado em sextuplicata. O controle negativo é representado na curva de cor rosa.
3.3 AVALIAÇÃO DA PRECISÃO DOS CONTROLES ALTO E BAIXO PARA
DETECÇÃO DE TRYPANOSOMA CRUZI
Para a definição dos controles alto e baixo, inicialmente foi construída uma
curva padrão com 5 pontos realizada em triplicata a partir do DNA extraído da
cultura de T. cruzi da cepa esmeraldo. O ponto de maior concentração da curva
(Ct= 23,75±0,28) foi equivalente à 2x105 parasitas/mL, e o quinto ponto da curva
foi o limite de detecção (Ct=35,10±039) equivalente à 2x10 parasitas/mL.
Quando o threshold foi definido para um valor de fluorescência de 0,04 para a
sonda Cy5 (detectada no canal vermelho) a média e desvio padrão (DP) de todos
os pontos da curva padrão é mostrada na figura 15 e tabela 2. A eficiência da
reação foi de 128%, a correlação R2= 0,991e o Slope= - 2,801.
61
Tabela 2 - Média e desvio padrão do Ct dos cinco pontos da curva padrão de T. cruzi.
N° de parasitas/mL
2x105 2x104 2x103 2x102 2x101
Ct
23,49 25,62 28,79 31,75 35,48
24,05 26,11 29,44 32,24 35,15
23,70 25,98 29,10 31,87 34,69
Média e DP 23,75±0,28 25,90±0,25 29,11±0,32 31,95±0,25 35,10±0,39
Os valores extremos da curva padrão foram usados como controle alto
(Ct= 24,85 ± 0,74) e baixo (Ct= 34,93 ± 1,09) como mostra a figura 16. A tabela
3 mostra pouca variação entre os valores de Ct dos controles alto e baixo
testados durante seis dias consecutivos, evidenciando alta precisão.
Figura 15 - Curva padrão realizada em triplicata para determinação dos controles alto e baixo e limite de detecção de T. cruzi.
62
Figura 16 - Controles alto e baixo usados para detecção de Trypanosoma cruzi a partir de DNA extraído de cultura da cepa esmeraldo.
Tabela 3 - Avaliação da precisão dos controle alto e controle baixo para detecção de T. cruzi.
3.4 QUANTIFICAÇÃO E LIMITE DE DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP.
A curva padrão realizada em triplicata mostrou alta precisão (figura 17 e
tabela 4) e o ponto de maior Ct da curva foi de 31,5fg que é equivalente à
aproximadamente 6 cópias do genoma de Salmonella.
63
Figura 17 - Curva padrão em triplicata construída a partir da diluição seriada tendo como ponto de menor Ct igual à 31,5ng/uL de DNA extraído de 1mL de Salmonella typhimurium ATCC
0028 em meio BHI.
Tabela 4 - Média e desvio padrão do Ct dos sete pontos em triplicata da curva padrão de Salmonella typhimurium ATCC 0028.
N° de cópias
equivalentes 6x106 6x105 6x104 6x103 6x102 6x101 6x100
Ct
14,86 18,36 21,72 24,90 28,29 31,75 34,77
14,77 18,19 21,62 25,01 28,66 31,53 34,86
14,85 18,28 21,61 25,05 28,65 31,69 34,66
Média e DP 14,83±0,05 18,28±0,08 21,65±0,06 24,98±0,07 28,53±0,21 31,65±0,11 34,76±0,10
64
3.5 PADRONIZAÇÃO DA QPCR MULTIPLEX
3.5.1 Controle interno de amplificação na qPCR multiplex
Não foi observada diferença significativa entre a média dos Ct na reação
em single e na reação em multiplex (Ct=20,68±0,57) em relação ao CIA (Figura
18). Esse dado mostra que o CIA não sofreu interferências e/ou perda de
eficiência quando utilizado com os outros oligonucleotídeos da reação.
Figura 18 - Controle interno de amplificação na reação de PCR multiplex funcionando juntamente com dois outros conjuntos de oligonucleotídeos usados neste estudo.
3.5.2 Quantificação de Salmonella spp.
Os dois pontos de menor concentração (equivalente à 6x101 e
6x100cópias/mL) da curva padrão perderam eficiência e/ou não apresentaram
amplificação quando inseridos na PCR multiplex. Dessa forma o limite de
detecção para quantificação de Salmonella spp. na PCR multiplex foi equivalente
à 6x102 cópias/mL (figura 19). A eficiência da reação foi de 90%, a correlação R2
foi 0,998 e o Slope= 3,589 (figura 20) estes dados atestam a confiabilidade da
reação para quantificação de Salmonella spp. em polpa de açaí.
65
Figura 19 - Curva padrão de Salmonella typhimurium ATCC 0028 construída a partir de DNA extraído de 1mL de polpa de açaí contaminado artificialmente com quantidades equivalentes à
6x106, 6x105, 6x104, 6x103, 6x102 bactérias.
Figura 20 - Curva padrão de Salmonella com cinco pontos que variam de quantidade de bactérias equivalente à 6x106à 6x102
.
3.5.3 Detecção de Trypanosoma cruzi
Não houve diferença estatisticamente significante entre os Ct dos
controles alto e baixo usados para determinar a presença ou ausência do T. cruzi
na reação em single e na reação em multiplex (figura 21).
66
Figura 21 - Controles alto e baixo para detecção de T. cruzi em amostras de DNA extraídas a partir de polpa de açaí artificialmente contaminadas com o protozoário com quantidades
equivalentes à 2x105 e 2x101 parasitas/mL de polpa de açaí.
3.5.4 Teste de seletividade da qPCR multiplex
As seis cepas de Salmonella utilizadas no teste de inclusividade foram
detectadas somente no canal verde (FAM) na reação em multiplex com Ct= 14,51
± 0,33, e não houve amplificação das 12 cepas de bactérias não-alvo testadas
para a exclusividade (Quadro 7). No canal vermelho (Cy5) só foram detectadas
o controle alto e baixo de T. cruzi (figura 21) e no canal amarelo somente CIA foi
amplificado (figura 18). Não ocorreu interferência entre as fluorescências nos
canais usados para a detecção dos três fluoróforos utilizados.
67
Quadro 7 - Teste de seletividade da qPCR multiplex usando cepas de Salmonella de diferentes sorovares e sorogrupos e cepas de bactérias não-alvos.
3.6 DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP. E TRYPANOSOMA CRUZI EM
AMOSTRAS DE CAMPO DE POLPA DE AÇAÍ
Das 150 amostras de campo analisadas, em nenhuma foi detectada a
presença do protozoário e 6 foram inconclusivas para Salmonella spp. uma vez
que, apresentaram amplificação tardia, posterior ao limite de detecção
estabelecido no teste (figura 22). O CIA funcionou adequadamente em todas as
68
amostras confirmando a qualidade e consistência na extração de DNA e das
reações de PCR em multiplex.
Figura 22 - Amostras de campo de açaí in natura com amplificação tardia (Inconclusivo).
3.6.1 Sensibilidade, especificidade, exatidão da qPCR multiplex
A sensibilidade, especificidade e exatidão da qPCR para detecção de T.
cruzi em amostras avaliadas no teste cego foi de 100% (Quadro 9). A
sensibilidade, especificidade e exatidão da qPCR para a detecção de Salmonella
spp. foi de 97%, 100% e 98% respectivamente. Os valores observados para
calcular esses parâmetros são mostrados nos quadros 8 e 10, sendo que, 5
amostras apresentaram resultados inconclusivos para a detecção de Salmonella
spp. e foram excluídas das análises acima mencionadas. Os controles alto e
baixo para detecção de T. cruzi funcionaram adequadamente de acordo com os
valores de Ct estabelecidos previamente, e a curva padrão para
detecção/quantificação de Salmonella spp. estava de acordo com os valores
adequados de eficiência, correlação (R2) e Slope em todas as reações.
69
Quadro 8 - Avaliação da sensibilidade, especificidade e exatidão da qPCR multiplex para detecção de Salmonella spp. e T. cruzi
Amostras de açaí qPCR multiplex
Total Detectado Não detectado
Contaminadas 34 1 35
Não Contaminadas 0 20 20
Total 34 21 55
3.7 CONCORDÂNCIA ENTRE O MÉTODO DE REFERÊNCIA BASEADO EM
CULTURA E A qPCR PARA DETECÇÃO DE SALMONELLA SPP. EM
POLPA DE AÇAÍ
As 150 amostras de campo analisadas apresentaram resultado negativo
para Salmonella spp. pelo método tradicional baseado em cultura. Por outro lado,
seis amostras apresentaram amplificação tardia (após o limite de detecção
estabelecido na figura 19) para Salmonella spp. sendo inconclusivas na qPCR.
Das 60 amostras usadas no teste cego 33 apresentaram crescimento em ágar
XLD e SS e foram detectadas na qPCR, uma amostra foi detectada na qPCR e
não apresentou crescimento de colônias, e uma amostra apresentou
crescimento de colônias, mas não foi detectada na qPCR. Adicionalmente 5
amostras apresentaram amplificação tardia sendo inconclusivas na qPCR
(Quadros 9 e 10). O coeficiente kappa foi de 0,78 e o grau de concordância entre
os métodos foi de 88,33%, foi considerado forte segundo valores de
interpretação definidos por Landis JR. e Koch GG (1977) mostrado na tabela 1,
para a comparação entre métodos.
Quadro 9 - Concordância entre o método de referência e a qPCR para detecção de Salmonella spp. em teste cego.
70
Quadro 10 – Amostras de açaí pasteurizado usadas no teste cego para avaliação da sensibilidade, especificidade,
exatidão da qPCR para Salmonella spp. e Trypanosoma cruzi e avaliação do grau de concordância entre o método
de referência e a qPCR para detecção de Salmonella spp.
N° da amostra
Açaí contaminado artificialmente com Salmonella typhimurium ATCC 0028
Açaí contaminado artificialmente com Trypanosoma cruzi
Amostras
contaminadas Método de referência
qPCR multiplex Amostras
contaminadas qPCR multiplex
151 + Positivo Detectado - Não detectado
152 - Negativo Não detectado - Não detectado
153 - Negativo Não detectado + Detectado
154 - Negativo Não detectado + Detectado
155 + Positivo Detectado + Detectado
156 + Positivo Detectado + Detectado
157 - Negativo Não detectado + Detectado
158 - Negativo Não detectado + Detectado
159 + Positivo Detectado - Não detectado
160 + Positivo Detectado - Não detectado
161 - Negativo Não detectado + Detectado
162 + Positivo Detectado + Detectado
163 + Positivo Detectado - Não detectado
164 - Negativo Não detectado + Detectado
165 - Negativo Não detectado + Detectado
166 + Positivo Detectado - Não detectado
167 + Positivo Detectado + Detectado
168 - Negativo Não detectado + Detectado
169 - Negativo Não detectado + Detectado
170 + Positivo Detectado + Detectado
171 - Negativo Não detectado + Detectado
71
172 + Positivo Detectado - Não detectado
173 - Negativo Não detectado + Detectado
174 + Positivo Detectado - Não detectado
175 - Negativo Não detectado + Detectado
176 + Positivo Detectado + Detectado
177 - Negativo Não detectado + Detectado
178 - Negativo Não detectado + Detectado
179 + Positivo Não detectado - Não detectado
180 + Positivo Detectado - Não detectado
181 + Positivo Detectado + Detectado
182 - Negativo Não detectado + Detectado
183 + Positivo Detectado + Detectado
184 + Positivo Detectado - Não detectado
185 + Positivo Detectado - Não detectado
186 - Negativo Não detectado + Detectado
187 + Positivo Detectado + Detectado
188 - Negativo Inconclusivo + Detectado
189 + Positivo Detectado - Não detectado
190 + Negativo Detectado - Não detectado
191 + Positivo Detectado + Detectado
192 - Negativo Inconclusivo + Detectado
193 + Positivo Detectado + Detectado
194 + Positivo Detectado - Não detectado
195 - Negativo Não detectado + Detectado
196 + Positivo Detectado - Não detectado
197 - Negativo Não detectado + Detectado
198 + Positivo Detectado + Detectado
199 - Negativo Inconclusivo + Detectado
200 + Positivo Detectado + Detectado
72
201 + Positivo Detectado - Não detectado
202 + Positivo Detectado + Detectado
203 + Positivo Detectado - Não detectado
204 - Negativo Não detectado + Detectado
205 + Positivo Detectado - Não detectado
206 + Positivo Detectado + Detectado
207 - Negativo Inconclusivo + Detectado
208 + Positivo Detectado + Detectado
209 + Positivo Detectado - Não detectado
210 - Negativo Inconclusivo + Detectado
73
4 DISCUSSÃO
A transmissão oral de DC tornou-se na última década um sério problema
de saúde pública na região amazônica (Coura & Junqueira, 2015). A
imprevisibilidade dos surtos é um grande desafio para a contenção dos mesmos,
uma vez que a contaminação não ocorre de maneira contínua e somente através
de uma cadeia de eventos muito específicos que envolvem a presença do inseto
transmissor contaminado ou suas fezes em meio aos paneiros de açaí e o seu
consumo sem um processo de pasteurização ou branqueamento (Seccadio et
al., 2013). As populações de pequenas cidades e regiões periféricas das grandes
cidades são grupos de risco já que normalmente são nessas regiões que o açaí
costuma ser consumido sem uma maior preocupação com o processo de
higienização (SINAN, 2016). Isto porém não elimina o fato de que a transmissão
possa ocorrer mesmo em regiões centrais das grandes cidades, tudo vai
depender do correto processo de higienização.
Dados do SINAN (2016) demonstram que entre os anos de 2000 e 2016
foram notificados 16,807 casos suspeitos de DC aguda e 2.030 casos
confirmados em um total de 144 municípios do estado do Pará. A média anual
de casos confirmados nesse período foi de 135 casos/ano sendo o ano de 2016
o de maior incidência com a confirmação de 327 casos de DC aguda transmitida
por via oral. Os municípios com maior número de notificações foram Abaetetuba
(25%), Belém (10,2%) e Barcarena (9,6%), no entanto os casos confirmados em
Abaetetuba e Barcarena foram baixos, 8,8% e 7,4% respectivamente. Outros
municípios no entanto, apresentaram altas porcentagens de casos confirmados
como Bagre (83,7%), Anajás (54,9%) e Portel (44,9%).
A transmissão oral de DC pela ingestão da polpa de açaí contaminada é
um problema sazonal. A maior parte das notificações ocorrem no segundo
semestre do ano, especialmente de agosto a dezembro com o ápice ocorrendo
no mês de setembro (SINAN, 2016). O aumento das notificações coincide
precisamente com período em que ocorre o aumento da produção/colheita na
safra do açaí, onde somente na grande Belém o consumo chega a 200.000 litros
por dia (MAPA, 2017).
74
O fato do açaí ter ganhado notoriedade nos últimos anos com grandes
quantidades saindo da região amazônica em direção a várias regiões do país e
do exterior torna possível a transmissão oral de DC em regiões não endêmicas
(sobretudo os Estados Unidos), o que antes só ocorria através de transmissão
congênita ou doadores de sangue ou órgãos infectados. Dessa forma é
importante um melhor monitoramento da qualidade do açaí para a manutenção
do mercado consumidor e a economia da região amazônica. Com base nisso, o
desenvolvimento de um teste que possa detectar o T. cruzi em açaí é importante
para evitar novos surtos tanto locais quanto em regiões não endêmicas.
Atualmente vários testes podem ser realizados para o
diagnóstico/detecção de T. cruzi em pessoas com suspeita de DC (Gilber et al.,
2013; Saavedra et al., 2013; Sabino et al., 2015; Elisei et al., 2018). No exame
parasitológico ou visualização direta em microscópio, amostras de sangue de
pacientes com suspeita de DC aguda são avaliadas à procura do parasita. O
xenodiagnóstico que é um dos métodos mais invasivos e de maior tempo de
resultado, insetos ou ninfas da família Reduviidae são colocadas em contato com
a pele do paciente suspeito para o repasto sanguíneo, e após 40 a 60 dias são
analisados as fezes e o conteúdo intestinal do inseto a procura do parasita em
microscópio (Schenone, 1999).
O diagnóstico sorológico atualmente é um dos mais utilizados e a infecção
é confirmada pela presença de anticorpos anti-Trypanosoma cruzi. Esse teste é
realizado em pacientes suspeitos de DC aguda em regiões endêmicas, em
bancos de sangue para evitar contaminação transfusional e em inquéritos soro-
epidemiológicos (Abras et al., 2016). Vários estudos também têm utilizado a PCR
para a detecção de T. cruzi em amostras de sangue de pacientes suspeitos de
DC, sobretudo na fase aguda com alta parasitemia no sangue (Schijman et al.,
2011; Ramirez et al., 2015; Hernandez et al., 2018). Em pacientes na fase
crônica com baixa parasitemia no sangue esse teste pode apresentar resultados
falso-negativos (Hernandez et al., 2018).
Apesar de atualmente existir uma ampla variedade de exames que
possam ser utilizados para a confirmação de DC em pacientes suspeitos, apenas
a PCR pode ser usada como ferramenta para detectar o T. cruzi em amostras
não humanas.
75
Adicionalmente, a Salmonelose é uma da DTA de maior ocorrência no
mundo, sobretudo em países com baixos índices socioeconômicos e condições
precárias de saneamento básico (Qamar et al., 2015). O método de referência
para a pesquisa de Salmonella spp. atualmente adotado no Brasil é indicado pela
Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003 (MAPA, 2003). Essa
instrução normativa preconiza que a pesquisa de Salmonella spp. deve obedecer
as etapas de pré-enriquecimento, enriquecimento seletivo obrigatoriamente nos
caldos Rappaport Vassiliadis, selenito-cistina ou tetrationato onde
posteriormente uma alçada dos caldos devem ser plaqueados em meios sólidos
específicos (BRASIL, 2003). Após o isolamento e seleção de colônias nos meios
sólidos é necessário a realização de um conjunto de provas bioquímicas nos
meios TSI, LIA ou em testes de kits comerciais para a realização de provas em
equipamentos como o Vitek. Adicionalmente, caso seja de importância médica-
epidemiológica deve-se realizar a sorotipificação para a definição do sorovar
(Andino & Hanning, 2015). Todas essas etapas podem levar de cinco a sete dias
até a confirmação da presença de Salmonella nas amostras analisadas.
Complementariamente ao MAPA, a ANVISA normatiza o regulamento
técnico sobre padrões microbiológicos em alimentos no Brasil (BRASIL, 2001).
Através da resolução-RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001, a ANVISA estabelece
o plano de amostragem, os limites permitidos da presença de microrganismos
em cada tipo de alimento e o número máximo de unidades acima dos limites
estabelecidos aceitáveis. O açaí encontra-se juntamente com: Sucos e refrescos
"in natura", incluindo água de coco, caldo de cana, de açaí e similares, isolados
ou em misturas, em que é obrigatório a pesquisa de coliformes à 45°C e
Salmonella spp. sendo a tolerância para amostra indicativa é de 102 para
coliformes à 45°C e ausência em Salmonella spp. Os agentes causadores da
Salmonelose e sobretudo da doença de chagas podem ser detectados através
da técnica da PCR, uma vez que, não existe um método oficial regulamentado
para a detecção de T. cruzi em polpa de açaí. O sucesso da técnica da PCR vai
depender da metodologia adequada utilizada na extração do DNA a partir das
amostras de polpa de açaí.
Vários estudos tem demonstrado a importância na escolha do método
e/ou protocolo adequado a ser usado na extração de DNA. Essa escolha vai
depender do tipo de amostra, necessidade de rapidez de resultados e
76
concentração/qualidade de DNA desejados (Drabkova, 2014; Semagn, 2014;
Cheng et al., 2014). Adicionalmente com o aprimoramento das técnicas de
biologia molecular, novos reagentes e equipamentos mais robustos para a
realização de PCR tem sido desenvolvidos aumentando a sensibilidade,
especificidade e diminuindo o tempo de reação (Ellington et al., 2016).
Atualmente há vários métodos disponíveis para a extração de DNA a partir
de diferentes tipos de amostras (Oliveira et al., 2014; Psifidi et al., 2015). Esses
métodos podem ser denominados in-house, quando o DNA é extraído a partir de
protocolos que usam solventes orgânicos (Drabkova, 2014), ou métodos
baseados em kits comerciais (Phillips et al., 2012). Os métodos in-house
geralmente são usados em pesquisa por serem de baixo custo e oferecerem
uma alta concentração de DNA. Os mais conhecidos são o Fenol-Clorofórmio
usado na extração de DNA de amostras de sangue e fluidos corporais e
Hexadecil catiônico brometo de trimetil amônio (CTAB) usado na extração de
DNA a partir de amostras vegetais (Springer, 2010; Green & Sambrook, 2018).
Os métodos in-house geralmente são laboriosos não sendo adequados
quando se necessita realizar análises em larga escala, resultados mais rápidos
e reprodutíveis o que dificulta a implementação na rotina dos laboratórios. Além
disso, exigem o manuseio de substancias tóxicas e necessitam de mão de obra
qualificada uma vez que, não é incomum a presença de contaminantes que
inibem da reação de PCR presentes no DNA extraído por falhas na execução do
procedimento (Janabi et al., 2016). Os kits de extração de DNA oferecem um
DNA menos concentrado que os métodos in-house e possuem um custo mais
alto, por outro lado fornecem um DNA com alto grau de pureza além de
protocolos menos laboriosos e mais rápidos que variam entre 60 à 120 min
(Janabi et al., 2016).
Recentemente Ferreira e colaboradores (2016) avaliaram quatro métodos
para a extração de DNA de Trypanosoma cruzi em polpa de açaí. Nesse estudo
foi utilizado dois diferentes protocolos utilizando CTAB, DNAzol e um kit
comercial que fornecia como tampão de lise a proteinase k. Somente um dos
protocolos que utilizou CTAB forneceu DNA em quantidade e qualidade
necessários para PCR. Tanto o DNAzol quanto o kit comercial apresentaram
problemas na amplificação de PCR o que sugere falha na lise celular ou
presença de inibidores.
77
Um dos maiores desafios do presente estudo foi utilizar um método de
extração de DNA que fosse capaz de lisar os 3 tipos de células alvos: Eucariótica
(Trypanosoma cruzi), procariótica (Salmonella) e vegetal (E. oleracea). Cada tipo
de célula possui diferentes barreiras para se chega até o DNA. O Trypanosoma
cruzi é um protozoário unicelular que possue uma membrana celular que pode
ser rompida com o uso da proteinase K presente em vários kits comerciais (Poma
et al., 2012). A Salmonella é uma bactéria gram-negativa que possui
externamente a membrana celular uma parede constituída de peptideoglicanos,
lipoproteína e lipopolissacarídeo (Neuberger et al., 2018) e embora possua uma
barreira a mais que as células eucarióticas, a extração de bactérias gram-
negativas também é realizada com o uso da proteinase k e incubação à 56°C
por 15 à 30 minutos (Poma et al., 2012).
A parede celular vegetal por sua vez é mais complexa e a proteinase k
não é capaz de lisa-la (Drabkova, 2014). O Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) é um
detergente muito utilizado em extrações de DNA a partir de amostras vegetais
por ser capaz de lisar a parede celular vegetal (Ahmed et al., 2009). Dessa forma
o Purelink genomic plant DNA purification kit foi a opção comercial escolhida por
disponibilizar como tampão de lise celular o SDS. Como pode ser visto no quadro
7 o kit foi eficiente para a extração de DNA em amostra de polpa de açaí
fornecendo uma concentração de DNA apropriada a análises por PCR.
Adicionalmente o kit foi capaz de lisar com eficácia a membrana celular de T.
cruzi e a parede celular de Salmonella fornecendo DNA em quantidades
adequadas para a realização da qPCR multiplex. Esse kit fornece um protocolo
de extração de aproximadamente 1 hora e 40 minutos que mostra-se adequado
à implementação na rotina de laboratórios que necessitam realizar análises em
larga escala e obter resultados em menor tempo.
Além da concentração de DNA, a qualidade/pureza também é um fator
importante para o sucesso da PCR (Foley et al., 2011). A presença de
contaminantes/inibidores de reação de PCR podem ser responsáveis por
resultados falsos positivos por impedirem ou diminuírem a eficiência da reação
(Hedman & Radstrom, 2013). Impurezas encontradas no DNA podem ser de
origem química quando resíduos de reagentes usados no processo de extração
como fenol, álcool, sais e outros estão presentes no DNA eluído, ou moléculas
78
orgânicas oriundas da própria amostra como carboidratos, proteínas e lipídios
(Hedman & Radstrom, 2013).
A qualidade/pureza do DNA extraído pode ser mensurada através de
espectrofotômetria (Schiebelhut et al., 2017). Ácidos nucléicos e proteínas tem
absorbância máxima de 260nm e 280nm respectivamente. Dessa forma é
calculada a razão A260/A280 que fornece um parâmetro para a avaliação da
qualidade da amostra. A razão A260/A280 que indica um DNA puro é de ~1.8,
valores inferiores indicam contaminação com proteínas (Desjardins et al., 2009).
Adicionalmente, a razão A230/A260 é usada para verificação de outros
contaminantes como carboidratos, resíduos de fenol, guanidina e glicogênio
(Shim et al., 2010). Esses contaminantes tem uma absorbância de 230nm, dessa
forma, a razão A230/A260 que indica um DNA puro varia de 2.0 à 2.2, valores
inferiores a esses podem indicar a presença de contaminantes com absorbância
de 230nm.
Os resultados do presente estudo mostram que a razão A260/A280 está de
acordo com o valor esperado ~1.8 nas culturas de T. cruzi e Salmonella e nas
amostras de polpa de açaí como foi mostrado no quadro 6, certificando a baixa
quantidade (ou ausência) de proteínas no DNA extraído. Por outro lado, foi
notado uma razão A230/A260 abaixo dos valores estabelecidos para uma amostra
pura. Uma vez que, a extração de DNA foi realizada através de kit comercial
utilizando colunas de sílica (o que descarta a contaminação com fenol) isto
sugere a presença de carboidratos e/ou lipídios, o que frequentemente é
reportado em amostras de DNA oriundas de amostras vegetais (Takakura &
Nishio, 2012).
Após a avaliação da concentração e qualidade de DNA, é muito
importante estabelecer os controles a serem utilizados durante a reação de uma
PCR (Buckwalter et al., 2014). A utilização de controles negativo e positivo é
essencial para garantir a confiabilidade da reação. O controle negativo garante
que os materiais e regentes utilizados estão livre de contaminação evitando
resultados falto-positivos, e o controle positivo comprova que os iniciadores,
reagentes e as condições de temperatura no termociclador estão ajustados para
o êxito da reação evitando assim resultados falso-negativos.
Recentemente dois estudos propuseram a detecção de T. cruzi em polpa
de açaí (de Souza Godoi et al., 2017; Mattos et al., 2017). Esses estudos
79
utilizaram como método de extração de DNA o CTAB e fenol-clorofórmio, dois
métodos que são laboriosos e dificultam a implantação para análises em larga
escala em rotinas de laboratórios. Adicionalmente apesar de utilizarem controles
negativo e positivo nas reações, esses estudos não incluíram um controle interno
de amplificação, o que impede a checagem do sucesso da extração de DNA
exigido no desenvolvimento de novos protocolos de PCR. Além disso é
necessário avaliar se o método de Fenol-Clorofórmio é capaz de lisar a parede
celular para a possível inclusão de um CIA em testes futuros utilizando esse
protocolo.
O controle interno de amplificação (CIA) é uma importante ferramenta
para implementação de um protocolo para detecção de microrganismos por
PCR. Geralmente o CIA é construído a partir de uma sequência alvo que está
presente nas amostras a serem analisadas e portanto deverá ser amplificado em
todas as reações juntamente com cada amostra (Bjornsdottir-Butler et al., 2011).
A utilização de um CIA é muito importante para a confiabilidade da reação uma
vez que, a correta amplificação desse controle indica que todas as etapas desde
a coleta e armazenamento da amostra, processo de extração/purificação de
DNA e execução da PCR foram realizadas de forma correta, além de atestar a
viabilidade das amostras, o funcionamento adequado do termociclador e a
funcionalidade dos reagentes utilizados (McIver et al., 2014).
O CIA desenvolvido para a qPCR do presente estudo demonstrou um
desempenho adequado medido através do desvio padrão das médias observado
em sextuplicata demonstrando alta precisão em todas as reações realizadas,
tanto em single, quanto nas reações em multiplex. Adicionalmente, através de
uma investigação das sequencias depositadas do GenBank, notou-se que os
oligonucleotídeos desenhados para amplificação do CIA da qPCR do presente
estudo poderia ser utilizado para detecção de T. cruzi também em amostras de
cana de açúcar (Saccharum officinarum, n° de acesso: LC107874.1)
demonstrando assim a versatilidade dessa qPCR. Além disso é possível verificar
em testes futuros a possibilidade do uso dessa qPCR multiplex em bacaba,
babaçu, goiaba e outros alimentos de origem vegetal que são reportados em
surtos de transmissão oral de DC uma vez que, não foi possível encontrar
sequencias compatíveis com o CIA aqui descrito depositadas no GenBank
80
devido à disponibilidade de poucas ou nenhuma sequência correspondente ao
alvo do CIA nessas espécies.
Um dos grandes desafios para o desenvolvimento de uma PCR para
detecção de T. cruzi é o estabelecimento de um par de iniciadores, concentração
de reagentes e condições de reação padronizados entre os diferentes
laboratórios. Atualmente vários autores têm descrito diferentes iniciadores para
a detecção de T. cruzi a partir de diferentes sequências/regiões do DNA do
parasita (Schijman et al., 2011; Sabino et al., 2015; Ramirez et al., 2015).
Duas regiões do genoma do T. cruzi tem sido muito utilizadas como alvo:
os mini-circulos presentes no cinetoplasto (kDNA) (Sturm et al., 1989) e a região
repetitiva do DNA satélite (Kirchhoff et al., 1996). A região do kDNA
conhecidamente possui origens de replicação de DNA compartilhadas por outros
membros da família Trypanosomatidae (Leishmania sp., T. brucei brucei, T.
brucei rhodesiense, T. brucei gambiense, e T. congolense) e isto pode diminuir
a especificidade da qPCR (Moser et al., 1989), dessa forma optou-se nesse
estudo em não utiliza-la como alvo para a construção dos iniciadores.
Em 1989, Moser e colaboradores descreveram um par de iniciadores e
sequenciaram uma região de 188pb em uma região repetitiva altamente
conservada de 195pb. Testes realizados em cepas de T. cruzi de várias regiões
na América (Estado do Texas, sudeste brasileiro, patagônia) demonstraram
sucesso na amplificação do material genético do T. cruzi e pouca variabilidade
dentro dessa sequência tornando-a adequada para o desenho de iniciadores
para reações de PCR ou qPCR. Adicionalmente, essa região possui entre 80.000
e 100.000 cópias o que aumenta substancialmente a sensibilidade da qPCR.
Uma reação de qPCR possui vários indicadores do sucesso e da
confiabilidade da reação. Esses indicadores são fatores críticos para o sucesso
de uma reação e entre eles estão a eficiência, o coeficiente de correlação (R2) e
o Slope (Zhong et al., 2016). Esses indicadores possuem valores mínimos e
máximos que oferecem um parâmetro da confiabilidade. Alguns estudos avaliam
que uma eficiência confiável deve ser entre 90% à 110%, valores acima ou
abaixo desses valores indicam interferência na qPCR seja de contaminantes ou
outros fatores como diluições incorretas de iniciadores/sonda ou ainda erros de
pipetagem (Broeders et al., 2014; ROGERS-BROADWAY & KARTERIS, 2015).
O R2 é um importante indicador da correlação em uma reação de quantificação,
81
quando se deseja saber a quantidade de DNA, patógenos ou cópias
equivalentes. Esse valor deve ser o mais próximo de 1 e valores abaixo de 0.980
tendem a ser descartados (Broeders et al., 2014). O Slope é o “caimento” dos
valores da curva padrão. Os valores ideais estão entre -3.3 e -3.8. O valor do
Slope está diretamente relacionado ao coeficiente R2 e a eficiência da reação
(Broeders et al., 2014).
A curva padrão construída para detecção de T. cruzi contou com cinco
pontos sendo a maior concentração equivalente à 105 parasitas/mL porque
reações realizadas com concentrações acima dessa não apresentaram
diferenças entre os Cts, sendo todos amplificados muito próximos. Embora o R2
esteja dentro de parâmetros aceitáveis para uma qPCR a eficiência de 128%
demonstra um desequilíbrio na reação durante a amplificação. Adicionalmente o
Slope foi de -2.8 e também ficou fora dos valores adequados. Esses dados
podem sugerir que o desequilíbrio nesses indicadores estejam ligados ao fato
dos oligonucleotídeos para T. cruzi terem como alvo uma região repetitiva o que
pode estar aumentando a eficiência da reação e desequilibrando o Slope da
curva padrão uma vez que, tanto o CIA quanto a curva padrão de Salmonella
estavam dentro dos valores esperados para uma qPCR confiável.
Dessa forma optou-se por não usar uma curva padrão para a
quantificação de T. cruzi nessa qPCR. Ao invés disso foram utilizados os dois
pontos extremos da curva padrão e a qPCR foi construída baseada em um
controle alto e um controle baixo. Como já explicado, o controle alto representa
uma concentração equivalente à 2x105 parasitas e o controle baixo 2x10
parasitas que foi o limite de detecção da qPCR. A avaliação da precisão dos
controles alto e baixo durante seis dias consecutivos atestam a precisão e
confiabilidade dos mesmos para a detecção de T. cruzi.
Todas as etapas envolvidas no desenvolvimento de um protocolo devem
ser avaliadas para garantir a robustez e confiabilidade dos resultados (Lemos et
al). A sensibilidade, especificidade, exatidão, precisão e limite de detecção são
importantes parâmetros que devem ser avaliados no desenvolvimento de novas
técnicas ou protocolos para fins de diagnóstico (Marino et al., 2017). É possível
mensurar esses parâmetros comparando-se os resultados do novo método ou
protocolo com métodos de referência ou com amostras conhecidamente
positivas e/ou negativas (Zhi et al., 2010).
82
A sensibilidade é a probabilidade de um teste identificar corretamente
amostras contaminadas com um analíto ou patógeno. No presente estudo a
sensibilidade para Salmonella spp. foi de 97% no teste cego, onde somente uma
amostra que havia sido contaminada artificialmente apresentou resultado não
detectado na qPCR. Como a mesma amostra foi identificada corretamente
através do método de referência, e o CIA funcionou adequadamente nessa
amostra eliminando a possibilidade de erro de pipetagem, é possível que possa
ter ocorrido algum problema com a sonda de Salmonella nessa reação
específica, ou a quantidade de bactérias estava abaixo do limite de detecção do
teste. A sensibilidade para T. cruzi foi de 100%, uma vez que todas as amostras
contaminadas artificialmente foram detectadas na qPCR multiplex.
A especificidade é a probabilidade de identificar corretamente as amostras
que não possuem o analíto ou patógeno. A especificidade tanto para a
Salmonella spp. quanto para T. cruzi foi de 100% já que, em nenhuma das
amostras não contaminadas no teste cego foi identificada amplificação na qPCR.
Complementariamente a sensibilidade e a especificidade, é possível mensurar a
exatidão de um teste, que é a capacidade de identificar corretamente as
amostras que contém um analíto e as que não contém o analíto em um conjunto
amostral comparando-se os resultados com um método de referência ou padrão
ouro (Zhi et al., 2010). A exatidão da qPCR multiplex foi de 98%, uma vez que
uma amostra identificada corretamente pelo método de referência não foi
detectada na qPCR e uma amostra detectada na qPCR apresentou resultado
negativo no método de referência. Como não há um método de referência
atualmente para detecção de T. cruzi em açaí, a exatidão foi mensurada através
dos resultados detectado e não detectado nas amostras artificialmente
contaminadas e não contaminadas no teste cego.
A precisão de um método é medida quando as análises são repetidas sob
as mesma condições com pouca variação nos resultados, seja em replicatas em
uma mesma reação, em testes realizados em dias diferentes ou ainda através
de testes de proficiência inter-laboratoriais (McClure & Lee, 2014). A precisão da
qPCR no presente estudo foi avaliada para o CIA, a curva padrão de Salmonella
spp. e controles alto e baixo para detecção de T. cruzi. Os valor dos DP dos Cts
para o CIA foi de 0,16 medido em sextuplicata e o maior DP observado na curva
padrão de Salmonella foi de 0,21 na concentração 6x102 demonstrando alta
83
precisão em ambos os casos. Os controles alto e baixo apresentaram DP de
0,74 e 1,09 respectivamente. É notável que a menor concentração demonstrou
maior variação dos Ct o que pode estar ligado a menor quantidade de DNA inicial
na reação ou ao fato do alvo ser uma região repetitiva. No entanto, mesmo um
DP mais alto para o controle baixo não afetou a confiabilidade ou o limite de
detecção da reação que foi padronizada para 45 ciclos com uma ampla margem
do Ct do controle baixo.
O limite de detecção indica qual a menor quantidade de um analíto é
possível ser detectado em um teste. No presente estudo o limite de detecção
está relacionado a menor quantidade de DNA capaz de ser amplificado na qPCR
para Salmonella spp. e T. cruzi. O limite de detecção de Salmonella spp. na
reação em multiplex foi de 6x102 cópias equivalentes, diferente de quando foi
realizado o teste em single (onde o limite de detecção foi equivalente à 6 cópias
equivalentes) com DNA oriundo da cultura pura. Uma vez que o CIA demonstrou
que o DNA extraído do açaí não havia impurezas que estivesse afetando a
reação, isto sugere uma interferência entre os oligonucleotídeos na qPCR
multiplex o que pode ter diminuído a eficiência dos oligonucleotídeos que tinham
como alvo Salmonella aumentando o limite de detecção. No caso do T. cruzi não
houve diferença entre o limite de detecção na reação em single e na multiplex.
Vários fatores estão envolvidos no início de uma infecção como a
presença de co-morbidades, carência nutricional, idade e outros fatores que
influenciam o sistema imunológico (Cristina & Vanetti, 2004). Adicionalmente, a
dose infectante é um importante fator a ser levado em conta para o início de uma
infecção (Song et al., 2015). Diferentes patógenos necessitam estar em uma
quantidade mínima necessária para iniciar uma infecção (Leggett et al., 2012),
no caso do T. cruzi por motivos éticos esse dado não é conhecido e portanto,
não pode ser mensurado uma quantidade mínima de parasitas necessários para
iniciar a infecção. No entanto, em um estudo realizado por Fairbain & Burtt (1946)
demonstram que a dose infectante em humanos de Trypanosoma rhodesiensi
que causam a Tripanosomíase africana é de 300 a 450 tripomastigotas
metacíclicos. Dessa forma a proximidade filogenética entre as duas espécies
podem oferecer um ponto de partida para se ter uma ideia da dose infectante de
T. cruzi. Ao se assumir uma dose infectante de T. cruzi semelhante ao T.
84
rhodesiense, a qPCR desenvolvida no presente estudo pode oferecer um limiar
seguro de detecção do parasita.
A possibilidade de detecção de Salmonella através de qPCR tem tornado
mais rápido o tempo de resposta das análises (Fang et al., 2018). Vários estudos
tem desenvolvido protocolos para a detecção de Salmonella spp. e de sorovares
específicos como Salmonella typhimurium, enteritidis, typhi entre outros. Estes
estudos também têm feito análises comparativas com os métodos de referência
atestando a validade dos resultados obtidos (Malorny et al., 2004).
No presente estudo foram utilizados os iniciadores e sonda descritos por
Malorny e colaboradores (2004), onde o autor valida a qPCR ao comparar os
resultados com o preconizado pela ISO 6579:2003. Adicionalmente, a qPCR
desenvolvida foi submetida a análises interlaboratoriais em diferentes matrizes
alimentícias como leite cru, carne moída, peixe e frango para avaliação da
precisão das análises. Os oligonucleotídeos utilizados nesse estudo passaram
por um rigoroso teste de seletividade que contou com 110 diferentes sorovares
de Salmonella e 87 bactérias não-alvo, demonstrando inclusividade e
exclusividade de 100%. Dessa forma o teste de seletividade realizado no
presente estudo tinha como objetivo avaliar se os oligonucleotídeos para T. cruzi
e E. oleracea (CIA) não estavam apresentando amplificação inespecíficas com
os sorovares de Salmonella e bactérias não alvos.
Não há na literatura muitos estudos reportando a presença de Salmonella
em açaí. Souza e colaboradores (1999) não encontraram Salmonella em
amostras de açaí coletadas na cidade de Macapá, embora tenham encontrado
coliformes à 35°C e à 45°C, bolores, leveduras e Staphylococcus aureus. Por
outro lado Cohen e colaboradores (2011) reportaram a presença de Salmonella
em amostras de açaí oriundas da cidade de Belém-PA. Embora o relato de
ocorrência de surtos de Salmonelose através do açaí não seja comum, a
detecção de Salmonella na qPCR multiplex desenvolvida nesse estudo é
importante do ponto de vista comercial uma vez que a análise de presença ou
ausência em açaí é exigida pela RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001 da
ANVISA.
Em comparação com os valores sugeridos para dose infectante de T.
cruzi, a Salmonella possui uma dose infectante mais alta, onde é necessária a
ingestão de uma quantidade entre 105 à 108 bactérias para iniciar uma infecção
85
(BRASIL 2011). Em pacientes imunocomprometidos no entanto, doses
infectantes menores que 103 têm sido observadas (BRASIL, 2011). Ainda assim
a qPCR desenvolvida neste estudo é capaz de oferecer um limiar seguro de
detecção para Salmonella spp.
Embora não seja comum notificações de Salmonelose através da
ingestão de açaí contaminado, em 6 das 150 amostras de campo foi observado
sinal de amplificação de Salmonella spp., no entanto essa amplificação ocorreu
posterior ao limite de detecção previamente estabelecido. O método de
referência realizado nessa amostra não apresentou crescimento de colônias em
ágar XLD e SS. Curiosamente as seis amostras foram originárias de um mesmo
lote de uma das indústrias que cederam amostras para este estudo o que exige
que uma análise mais minuciosa seja realizada. É possível que essas
amplificações possam ser a detecção de quantidades muito pequenas de
Salmonella que não cresceram nos meios de cultura, ou ainda células viáveis
mas não cultiváveis. Dessa forma a amplificação ocorrida após o limite é
considerada inconclusiva e em uma rotina laboratorial é indicado a repetição da
extração de DNA e da qPCR.
86
5 CONCLUSÕES
No presente estudo foi desenvolvida uma qPCR multiplex para a detecção
de Salmonella spp. e Trypanosoma cruzi em polpa de açaí.
Este método pode ser utilizado como método alternativo para a detecção
de Salmonella spp. Em polpa de açaí oferecendo menor tempo de resposta e
tornando mais dinâmica a cadeia produtiva.
Adicionalmente pode diminuir o risco de surtos de doença de chagas
transmitida por açaí contaminado com Trypanosoma cruzi agregando valor ao
produto
O controle interno de amplificação foi construído e inserido com sucesso
oferecendo confiabilidade à qPCR multiplex. O Uso desse controle garante a
funcionalidade do teste em todas as etapas da execução.
Todos os patógenos utilizados no teste de seletividade foram identificados
corretamente.
A sensibilidade, especificidade e exatidão para a detecção de Salmonella
spp. foram altas demonstrando a confiabilidade do teste.
A detecção de Trypanosoma cruzi demonstrou 100% sensibilidade,
especificidade e exatidão demonstrando a confiabilidade do teste.
A qPCR multiplex forneceu um baixo limite de detecção tanto para
Salmonella spp. quanto para Trypanosoma cruzi.
Houve forte concordância entre a qPCR multiplex e o método referência
para a detecção de Salmonella spp. o que o credencia para ser utilizado como
método alternativo.
As sequencias de nucleotídeos dos iniciadores e sondas utilizados para a
detecção de Trypanosoma cruzi e controle interno de amplificação, além das
respectivas concentração dos mesmos combinados na qPCR estão sendo
mantidos em sigilo até aprovação de patente a ser submetida no instituto
nacional de propriedade industrial (INPI)
87
6 REFERÊNCIAS
ABRAS A, GALLEGO M, LLOVET T. Serological Diagnosis of Chronic Chagas Disease: Is It Time for a Change? J Clin Microbiol : 1566–1572, 2016.
ACEVEDO GR, LONGHI SA, BUNYING A. Methodological approach to the ex vivo expansion and detection of T. cruzi-specific T cells from chronic Chagas disease patients. PLoS One : e0178380, 2017.
AHMED I, ISLAM M, ARSHAD W, MANNAN A, AHMAD W, MIRZA B. High-quality plant DNA extraction for PCR: an easy approach. J Appl Genet : 105–107, 2009.
AILES E. Economic and Health Impacts Associated with a Salmonella Typhimurium Drinking Water Outbreak−Alamosa, CO, 2008. 2013.
AKSOYSAN N, BERKMAN E, MERCANGOZ F, SAGANAK I. [S. typhimurium strains which are H2S negative in TSI medium]. Mikrobiyol Bul : 45–48, 1981.
ALESSANDRA-PERINI J, PERINI JA, RODRIGUES-BAPTISTA KC. Euterpe oleracea extract inhibits tumorigenesis effect of the chemical carcinogen DMBA in breast experimental cancer. BMC Complement Altern Med : 116, 2018.
ALLARD MW, BELL R, FERREIRA CM. Genomics of foodborne pathogens for microbial food safety. Curr Opin Biotechnol : 224–229, 2018.
ALZWGHAIBI AB, YAHYARAEYAT R, FASAEI BN, LANGEROUDI AG, SALEHI TZ. Rapid molecular identification and differentiation of common Salmonella serovars isolated from poultry, domestic animals and foodstuff using multiplex PCR assay. Arch Microbiol. 2018.
ANDERSON C, BELNAP C. The Kiss of Death: A Rare Case of Anaphylaxis to the Bite of the ‘Red Margined Kissing Bug’. Hawai’i J Med public Heal a J Asia Pacific Med Public Heal : 33–35, 2015.
ANDINO A, HANNING I. Salmonella enterica: survival, colonization, and virulence differences among serovars. ScientificWorldJournal : 520179, 2015.
ANDRADE D V. Acute Chagas Disease: New Global Challenges for an Old Neglected Disease. 2014.
ANTINORI S, GALIMBERTI L, BIANCO R, GRANDE R, GALLI M, CORBELLINO M. Chagas disease in Europe: A review for the internist in the globalized world. Eur J Intern Med : 6–15, 2017.
ARAUJO PF, ALMEIDA AB, PIMENTEL CF. Sexual transmission of American
88
trypanosomiasis in humans: a new potential pandemic route for Chagas parasites. Mem Inst Oswaldo Cruz : 437–446, 2017.
ARGUELLO H, MANZANILLA EG, LYNCH H. Surveillance Data Highlights Feed Form, Biosecurity, and Disease Control as Significant Factors Associated with Salmonella Infection on Farrow-to-Finish Pig Farms. Front Microbiol : 187, 2018.
BALTER M. SPONGIFORM DISEASE: Experts Downplay New vCJD Fears. Science : 1663b–6b, 2000.
BARBOSA-FERREIRA JM, GUERRA JA DE O, SANTANA FILHO FS DE, MAGALHAES BML, COELHO LIARC, BARBOSA M DAS GV. [Cardiac involvement in Acute Chagas’ Disease cases in the Amazon region]. Arq Bras Cardiol : 147–149, 2010.
BARRETO-DE-ALBUQUERQUE J, SILVA-DOS-SANTOS D, PÉREZ AR. Trypanosoma cruzi infection through the oral route promotes a severe infection in mice: New disease form from an old infection? PLoS Negl Trop Dis : 1–21, 2010.
BELTRAO H DE BM, CERRONI M DE P, FREITAS DRC DE. Investigation of two outbreaks of suspected oral transmission of acute Chagas disease in the Amazon region, Para State, Brazil, in 2007. Trop Doct : 231–232, 2009
DE BEM GF, DA COSTA CA, DA SILVA CRISTINO CORDEIRO V. Euterpe oleracea Mart. (acai) seed extract associated with exercise training reduces hepatic steatosis in type 2 diabetic male rats. J Nutr Biochem : 70–81, 2018.
BENCHIMOL BARBOSA PR. The oral transmission of Chagas’ disease: An acute form of infection responsible for regional outbreaks. Int J Cardiol : 132–133, 2006.
BJORNSDOTTIR-BUTLER K, JONES JL, BENNER R, BURKHARDT W 3rd. Development of a real-time PCR assay with an internal amplification control for detection of Gram-negative histamine-producing bacteria in fish. Food Microbiol : 356–363, 2011.
BLANCHET D, BRENIERE SF, SCHIJMAN AG. First report of a family outbreak of Chagas disease in French Guiana and posttreatment follow-up. Infect Genet Evol : 245–250.
BOSSENO MF, YACSIK N, VARGAS F, BRENIERE SF. Selection of Trypanosoma cruzi clonal genotypes (clonet 20 and 39) isolated from Bolivian triatomines following subculture in liquid medium. Mem Inst Oswaldo Cruz : 601–607, 2000.
BRASIL. Agencia Nacional de Vigilancia Sanitária (ANVISA). Resolução-rdc nº 12, de 02 de janeiro de 2001. Disponível em: <http://portal.anvisa.gov.br/documents/33880/2568070/RDC_12_2001.pdf/15ffddf6-3767-4527-bfac-740a0400829b> Acesso em: 18/01/2018.
89
BRASIL. Ministério da Saúde (MS). Manual de diagnóstico laboratorial de Salmonella spp. Disponível em:< http://portalarquivos2.saude.gov.br/images/pdf/2014/dezembro/15/manual-diagnostico-salmonella-spp-web.pdf>. Acesso em: 20/01/2018.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Instrução Normativa SDA - 62, de 26/08/2003. Disponível em: <https://www.defesa.agricultura.sp.gov.br/legislacoes/instrucao-normativa-sda-62-de-26-08-2003,665.html>. Acesso em: 20/01/2018.
BRASIL. Secretaria de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Nota Técnica Doença de Chagas Aguda por transmissão oral. 2007. Disponível em: <htp://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=27898>. Acesso em: 18/04/2018.
BRASIL. Sistema de Informação de Agravos de Notificação – SINAN NET. Doença de Chagas Aguda: casos confirmados 2016. Disponível em: <htp://dtr2004.saude.gov.br/sinanweb/tabnet/ dh?sinannet/chagas/bases/chagasbrnet.def >. Acesso em: 18/04/2018.
BRENIÈRE SF, WALECKX E, BARNABÉ C. Over Six Thousand Trypanosoma cruzi Strains Classified into Discrete Typing Units (DTUs): Attempt at an Inventory. PLoS Negl Trop Dis : 1–19, 206.
BRENNER FW, VILLAR RG, ANGULO FJ, TAUXE R, SWAMINATHAN B. Salmonella Nomenclature. J Clin Microbiol : 2465–2467, 2000.
BRENNER FW, VILLAR RG, ANGULO FJ, TAUXE R, SWAMINATHAN B. Salmonella Nomenclature. J Clin Microbiol : 2465–2467, 2000.
BRISSE S, DUJARDIN JC, TIBAYRENC M. Identification of six Trypanosoma cruzi lineages by sequence-characterised amplified region markers. Mol Biochem Parasitol : 95–105, 2000.
BROEDERS S, HUBER I, GROHMANN L. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods. Trends Food Sci Technol : 115–126, 2014.
BROWNE AJ, GUERRA CA, ALVES RV. The contemporary distribution of Trypanosoma cruzi infection in humans, alternative hosts and vectors. Sci data : 170050, 2017.
BRUZZESE E, GIANNATTASIO A, GUARINO A. Antibiotic treatment of acute gastroenteritis in children. F1000Research : 193, 2018.
BUCKWALTER SP, SLOAN LM, CUNNINGHAM SA. Inhibition controls for qualitative real-time PCR assays: are they necessary for all specimen matrices? J Clin Microbiol : 2139–2143, 2014.
BUNNING VK, LINDSAY JA, ARCHER DL. Chronic health effects of microbial foodborne disease. World Health Stat Q : 51–56, 1997.
90
CABRERA-DIAZ E, MARTINEZ-CHAVEZ L, SANCHEZ-CAMARENA J. Simultaneous and individual quantitative estimation of Salmonella, Shigella and Listeria monocytogenes on inoculated Roma tomatoes (Lycopersicon esculentum var. Pyriforme) and Serrano peppers (Capsicum annuum) using an MPN technique. Food Microbiol : 282–287, 2018.
CARDOSO AVN, LESCANO SAZ, AMATO NETO V, GAKIYA E, SANTOS S V. Survival of Trypanosoma cruzi in sugar cane used to prepare juice. Rev Inst Med Trop Sao Paulo : 287–289, 2006.
CARLOS PINTO DIAS J, NOVAES RAMOS A, DIAS GONTIJO E. II Consenso Brasileiro em Doença de Chagas, 2015. Epidemiol e Serviços Saúde : 1–10, 2016.
CARNEIRO M, ROMANHA AJ, CHIARI E. Biological characterization of Trypanosoma cruzi strains from different zymodemes and schizodemes. Mem Inst Oswaldo Cruz : 387–393, 1991.
CAROD-ARTAL FJ (2013). American trypanosomiasis. Handb Clin Neurol : 103–123, 2013.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (2013). American Trypanosomiasis: Disease and symtoms. Disponivel em:< https://www.cdc.gov/parasites/chagas/disease.html>. Acesso em: 26/01/2018.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (2017). American Trypanosomiasis: General informations. Disponivel em:< https://www.cdc.gov/parasites/chagas/gen_info/index.html>. Acesso em: 27/01/2018.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (2015). Salmonelose prevention. Disponivel em: < https://www.cdc.gov/salmonella/general/ prevention.html>. Acesso em: 08/02/2018.
CENTER FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION (2018). Reports of Salmonella Outbreak Investigations from 2018. Disponivel em: < https://www.cdc.gov/salmonella/outbreaks-2018.html>. Acesso em: 08/02/2018.
CESAR LT, DE FREITAS CABRAL M, MAIA GA. Effects of clarification on physicochemical characteristics, antioxidant capacity and quality attributes of acai (Euterpe oleracea Mart.) juice. J Food Sci Technol : 3293–3300, 2014.
CHAGAS C. Nova tripanozomiaze humana: estudos sobre a morfolojia e o ciclo evolutivo do Schizotrypanum cruzi n. gen., n. sp., ajente etiolojico de nova entidade morbida do homem. Mem Inst Oswaldo Cruz : 159–218, 1909.
CHATTOPADHYAY UK, RASHID M. Rapid screening of chicken intestinal contents for Campylobacter jejuni using coagglutination. Vet Rec : 654–655, 2003.
91
CHENG X, CHEN X, SU X. DNA extraction protocol for biological ingredient analysis of Liuwei Dihuang Wan. Genomics Proteomics Bioinformatics : 137–143, 2014.
CHIURILLO MA, CORTEZ DR, LIMA FM. The diversity and expansion of the trans-sialidase gene family is a common feature in Trypanosoma cruzi clade members. Infect Genet Evol : 266–274, 2016.
CHO I-H, MAUER L, IRUDAYARAJ J. In-situ fluorescent immunomagnetic multiplex detection of foodborne pathogens in very low numbers. Biosens Bioelectron : 143–148, 2014.
CHOU KX, WILLIAMS-HILL DM. Improved TaqMan real-time assays for detecting hepatitis A virus. J Virol Methods : 46–50, 2018.
COBURN B, GRASSL GA, FINLAY BB. Salmonella, the host and disease: a brief review. Immunol Cell Biol : 112–118, 2007.
CORDOVA E, MAIOLO E, CORTI M, ORDUNA T. Neurological manifestations of Chagas’ disease. Neurol Res : 238–244, 2010.
COURA JR. [Transmission of chagasic infection by oral route in the natural history of Chagas disease]. Rev Soc Bras Med Trop : 113–117, 2006.
COURA JR, JUNQUEIRA AC V. Surveillance, health promotion and control of Chagas disease in the Amazon Region--Medical attention in the Brazilian Amazon Region: a proposal. Mem Inst Oswaldo Cruz : 825–830, 2015.
COHEN, Kelly de Oliveira et al.Contaminantes microbiológicos em polpas de açaí comercializadas na cidade de Belém-PA. Revista Brasileira de Tecnologia Agroindustrial, Paraná, v.05, n. 02, p. 524-530, 2011.
CREMON C, STANGHELLINI V, PALLOTTI F. Salmonella gastroenteritis during childhood is a risk factor for irritable bowel syndrome in adulthood. Gastroenterology : 69–77, 2014.
CREMONESI P, PISANI LF, LECCHI C. Development of 23 individual TaqMan(R) real-time PCR assays for identifying common foodborne pathogens using a single set of amplification conditions. Food Microbiol : 35–40, 2014.
CRISTINA M, VANETTI D. Detecção de Listeria , Salmonella e Klebsiella em serviço de alimentação hospitalar Detection of Listeria , Salmonella and Klebsiella in a hospital food service. : 319–326, 2004.
CROXEN M A, FINLAY BB. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nat Rev Microbiol : 26–38, 2010.
CZERWINSKI M, CZARKOWSKI MP, KONDEJ B. Foodborne botulism in Poland in 2013. Przegl Epidemiol : 243–245, 2015.
92
Codex alimentarius. Procedural manual, Eighteenth edition. World health organization (WHO), Rome, 2008.
DESENCLOS JC, KLONTZ KC, WILDER MH, NAINAN O V, MARGOLIS HS, GUNN RA. A multistate outbreak of hepatitis A caused by the consumption of raw oysters. Am J Public Health : 1268–1272, 1991.
DESJARDINS P, HANSEN JB, ALLEN M. Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer. J Vis Exp, 2009.
DEVERA R, ILLARRAMENDI X, MONTOYA-ARAÚJO R. Biodemas de cepas do Trypanosoma cruzi isoladas de humanos de três áreas endêmicas de Minas Gerais Biodemes of Trypanosoma cruzi strains isolated from humans from three endemic areas in Minas Gerais State. Rev Soc Bras Med Trop : 323–330, 2002.
DIAS JCP Aspectos socio-culturales y economicos relativos al vector de la enfermedad de Chagas, 2008.
DIAS JP, BASTOS C, ARAUJO E. Acute Chagas disease outbreak associated with oral transmission. Rev Soc Bras Med Trop : 296–300, 2008.
DORNE JLCM, FINK-GREMMELS J. Human and animal health risk assessments of chemicals in the food chain: comparative aspects and future perspectives. Toxicol Appl Pharmacol : 187–195, 2013.
DRABKOVA LZ (2014). DNA extraction from herbarium specimens. Methods Mol Biol : 69–84, 2014.
DUPOUEY J, NINOVE L, FERRIER V. Molecular detection of human rhinoviruses in respiratory samples: a comparison of Taqman probe-, SYBR green I- and BOXTO-based real-time PCR assays. Virol J : 31, 2014.
DUTRA RC, CAMPOS MM, SANTOS ARS, CALIXTO JB. Medicinal plants in Brazil: Pharmacological studies, drug discovery, challenges and perspectives. Pharmacol Res : 4–29, 2016.
E SOUZA BSF, CARVALHO HO, FERREIRA IM. Effect of the treatment with Euterpe oleracea Mart. oil in rats with Triton-induced dyslipidemia. Biomed Pharmacother : 542–547, 2017.
EDDICKS M, HAUSLEITNER R, EDDICKS L. [Detection of Salmonella Choleraesuis var. Kunzendorf in a fattening pig with septicaemic salmonellosis. A case report]. Tierarztl Prax Ausg G Grosstiere Nutztiere : 381–387, 2016.
EL-ZANFALY HT, KASSIM EA. Effects of storage temperature, light and time on stability of triple sugar iron agar and its productivity for Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Folia Microbiol (Praha) : 446–451, 1983.
ELISEI RMT, MATOS CS, CARVALHO AMRS. Immunogenomic screening
93
approach to identify new antigens for the serological diagnosis of chronic Chagas’ disease. Appl Microbiol Biotechnol. 2018.
ELLINGTON MJ, FINDLAY J, HOPKINS KL. Multicentre evaluation of a real-time PCR assay to detect genes encoding clinically relevant carbapenemases in cultured bacteria. Int J Antimicrob Agents : 151–154, 2016.
ETO DK, KANO AM, BORGES MTMR, BRUGNARO C, CECCATO-ANTONINI SR, VERRUMA-BERNARDI MR. Qualidade microbiológica e físico-química da polpa e mix de açaí armazenada sob congelamento. Rev Inst Adolfo Lutz : 304–310, 2010.
EVANGELOPOULOU G, KRITAS S, CHRISTODOULOPOULOS G, BURRIEL AR. The commercial impact of pig Salmonella sppp. infections in border-free markets during an economic recession. Vet World : 257–272, 2015.
FAIRBAIN, H. & BURTT, E. (1946). Ann. trop. Med. Parasiz., 40, 270. (1948). Trop. Dis. Bull., 15, 1.
FAN H, LONG B, WU X, BAI Y. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Cronobacter sakazakii. Foodborne Pathog Dis : 1111–1118, 2012.
FANG J, WU Y, QU D. Propidium monoazide real-time loop-mediated isothermal amplification for specific visualization of viable Salmonella in food. Lett Appl Microbiol. 2018.
FATEMEH D, REZA ZM, MOHAMMAD A. Rapid detection of coliforms in drinking water of Arak city using multiplex PCR method in comparison with the standard method of culture (Most Probably Number). Asian Pac J Trop Biomed : 404–409, 2014.
FEARON MA, SCALIA V, HUANG M, DINES I, NDAO M, LAGACE-WIENS P. A case of vertical transmission of Chagas disease contracted via blood transfusion in Canada. Can J Infect Dis Med Microbiol = J Can des Mal Infect la Microbiol medicale : 32–34, 2013.
FEDER I, NIETFELD JC, GALLAND J. Comparison of cultivation and PCR-hybridization for detection of Salmonella in porcine fecal and water samples. J Clin Microbiol : 2477–2484, 2001.
FERRARI RG, PANZENHAGEN PHN, CONTE-JUNIOR CA. Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking. Front Microbiol : 2587, 2017.
FERREIRA CS, MARTINHO PC, AMATO NETO V, CRUZ RR. Pasteurization of human milk to prevent transmission of Chagas disease. Rev Inst Med Trop Sao Paulo : 161–162, 2001.
FIERER J. Extra-intestinal Salmonella infections: the significance of spv genes. Clin Infect Dis : 519–520, 2001.
94
FLETCHER SM, LEWIS-FULLER E, WILLIAMS H. Magnitude, Distribution, and Estimated Level of Underreporting of Acute Gastroenteritis in Jamaica. J Health Popul Nutr : S69-80, 2013.
FOLEY C, O’FARRELLY C, MEADE KG. Technical note: Comparative analyses of the quality and yield of genomic DNA from invasive and noninvasive, automated and manual extraction methods. J Dairy Sci : 3159–3165, 2011.
FOOKES M, SCHROEDER GN, LANGRIDGE GC. Salmonella bongori provides insights into the evolution of the Salmonellae. PLoS Pathog : e1002191, 2011.
FORTIN ND. Chapter 35 - HACCP and Other Regulatory Approaches to Prevention of Foodborne Diseases A2 - Morris, J. Glenn. In: Potter MEBT-FI and I (Fourth E, ed. Food Science and Technology. Academic Press: San Diego, pp. 497–510, 2013.
FOOD AND AGRICULTURE ORGANIZATION OF THE UNITED NATIONS -
FAO [2011]. Live animals. Disponível em: Acesso em: 26/4/2010.
FRANCO & LANDGRAF. Microbiologia dos alimentos. São Paulo, atheneu. 2008. 182p.
FREGEAU CJ, FOURNEY RM. DNA typing with fluorescently tagged short tandem repeats: a sensitive and accurate approach to human identification. Biotechniques : 100–119, 1993.
FRICKER M, MESSELHAUSSER U, BUSCH U, SCHERER S, EHLING-SCHULZ M. Diagnostic real-time PCR assays for the detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl Environ Microbiol : 1892–1898, 2007.
FURUTA T, AKIYAMA M, KATO Y, NISHIO O. [A food poisoning outbreak caused by purple Washington clam contaminated with norovirus (Norwalk-like virus) and hepatitis A virus]. Kansenshogaku Zasshi : 89–94, 2003.
GAMBINO-SHIRLEY KJ, TESFAI A, SCHWENSOHN CA. Multistate Outbreak of Salmonella Virchow Infections Linked to a Powdered Meal Replacement Product - United States, 2015-2016. Clin Infect Dis. 2018.
GARZON GA, NARVAEZ-CUENCA C-E, VINCKEN J-P, GRUPPEN H. Polyphenolic composition and antioxidant activity of acai (Euterpe oleracea Mart.) from Colombia. Food Chem : 364–372, 2018.
GILBER SR, ALBAN SM, GOBOR L, BESCROVAINE J DE O, MYIAZAKI MI, THOMAZ-SOCCOL V. Comparison of conventional serology and PCR methods for the routine diagnosis of Trypanosoma cruzi infection. Rev Soc Bras Med Trop : 310–315, 2013.
GONÇALVES CS, ÁVILA AR, DE SOUZA W, CRISTINA M, MOTTA M,
95
PEREIRA CAVALCANTI D. Revisiting the Trypanosoma cruzi metacyclogenesis: morphological and ultrastructural analyses during cell differentiation. Parasit Vectors : 83, 2018.
GONCALVES CS, AVILA AR, DE SOUZA W, MOTTA MCM, CAVALCANTI DP. Revisiting the Trypanosoma cruzi metacyclogenesis: morphological and ultrastructural analyses during cell differentiation. Parasit Vectors : 83, 2018.
GOULET V, HEBERT M, HEDBERG C. Incidence of listeriosis and related mortality among groups at risk of acquiring listeriosis. Clin Infect Dis : 652–660, 2012.
GREEN MR, SAMBROOK J. Isolation of DNA from Mouse Tails without Extraction by Organic Solvents. Cold Spring Harb Protoc. 2018.
GRIMONT P, WEILL F-X. Antigenic formulae of the Salmonella servovars. WHO Collab Cent Ref Res Salmonella: 1–167, 2008.
GROHMANN L, BERBEN G, TAVERNIERS I, MAZZARA M, ROOSENS N, MORISSET D. Guidelines for validation of qualitative real-time PCR methods *. Trends Food Sci Technol : 115–126, 2008.
GRUTER E, ROMERO J, GRUSSNER R, BINSWANGER U. [Extra-intestinal salmonella infections in kidney transplant patients]. Schweiz Med Wochenschr : 186–189, 2000.
GULIN JEN, BISIO M, ROCCO DM, ALTCHEH J, SOLANA ME, GARCIA-BOURNISSEN F. Molecular and biological characterization of a highly pathogenic Trypanosoma cruzi strain isolated from a patient with congenital infection. Exp Parasitol : 50–58, 2018.
HAHM B-K, KIM H, SINGH AK, BHUNIA AK. Pathogen enrichment device (PED) enables one-step growth, enrichment and separation of pathogen from food matrices for detection using bioanalytical platforms. J Microbiol Methods : 64–73, 2015.
HEDMAN J, RADSTROM P. Overcoming inhibition in real-time diagnostic PCR. Methods Mol Biol : 17–48, 2013.
HEFELE M, STOLZER I, RUDER B. Intestinal epithelial Caspase-8 signaling is essential to prevent necroptosis during Salmonella Typhimurium induced enteritis. Mucosal Immunol. 2018.
HEMMIGE V, TANOWITZ H, SETHI A. Trypanosoma cruzi infection: a review with emphasis on cutaneous manifestations. Int J Dermatol : 501–508, 2012.
HERNANDEZ C, TEHERAN A, FLOREZ C, RAMIREZ JD. Comparison of parasite loads in serum and blood samples from patients in acute and chronic phases of Chagas disease. Parasitology: 1–7, 2018
96
HOFFLIN JM, SADLER RH, ARAUJO FG, PAGE WE, REMINGTON JS. Laboratory-acquired Chagas disease. Trans R Soc Trop Med Hyg : 437–440, 1987.
HOLZNAGEL E, YUTZY B, KRUIP C, BIERKE P, SCHULZ-SCHAEFFER W, LOWER J. Foodborne-Transmitted Prions From the Brain of Cows With Bovine Spongiform Encephalopathy Ascend in Afferent Neurons to the Simian Central Nervous System and Spread to Tonsils and Spleen at a Late Stage of the Incubation Period. J Infect Dis : 1459–1468, 2015.
HONG Y-P, WANG Y-W, HUANG I-H. Genetic Relationships among Multidrug-Resistant Salmonella enterica Serovar Typhimurium Strains from Humans and Animals. Antimicrob Agents Chemother. 2018.
HUAMAN MA, FISKE CT, JONES TF. Tuberculosis and the risk of infection with other intracellular bacteria: a population-based study. Epidemiol Infect : 951–959, 2015.
HUMPHREY TJ, GREENWOOD M, GILBERT RJ, ROWE B, CHAPMAN PA. The survival of salmonellas in shell eggs cooked under simulated domestic conditions. Epidemiol Infect : 35–45, 1989.
ICMSF (INTERNATIONAL COMMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATIONS FOR FOODS). Microrganismos de los alimentos. 1. Técnicas de análisis microbiológico. Zaragoza: Acribia. 1978.
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARLIZATION (ISO). Microbiology of food and animal feeding stuffs -- Horizontal method for the detection of Salmonella sppp. Disponivel em: < https://www.iso.org/standard/29315.html>. Acesso em: 20/02/2018.
JANABI AHD, KERKHOF LJ, MCGUINNESS LR, BIDDLE AS, MCKEEVER KH. Comparison of a modified phenol/chloroform and commercial-kit methods for extracting DNA from horse fecal material. J Microbiol Methods : 14–19, 2016
JOHNSON R, RAVENHALL M, PICKARD D, DOUGAN G, BYRNE A, FRANKEL G. Comparison of Salmonella enterica Serovars Typhi and Typhimurium Reveals Typhoidal Serovar-Specific Responses to Bile. Infect Immun. 2018.
JUGULETE G, LUMINOS M, DRĂGĂNESCU A. Salmonella sppp acute enterocolitis - an overview of antibiotic therapy and chemosensitivity patterns among children. BMC Infect Dis : P37, 2013.
KANEKO S, FEINSTONE SM, MILLER RH. Rapid and sensitive method for the detection of serum hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction technique. J Clin Microbiol : 1930–1933, 1989.
KERWIN AH, NYHOLM S V. Reproductive System Symbiotic Bacteria Are
97
Conserved between Two Distinct Populations of Euprymna scolopes from Oahu, Hawaii. mSphere, 2018.
KIM T-H, HWANG HJ, KIM JH. Development of a Novel, Rapid Multiplex Polymerase Chain Reaction Assay for the Detection and Differentiation of Salmonella enterica Serovars Enteritidis and Typhimurium Using Ultra-Fast Convection Polymerase Chain Reaction. Foodborne Pathog Dis : 580–586, 2017.
KIM SH, KIM HY, KIM SY. Atypical hemolytic uremic syndrome and eculizumab therapy in children. Korean J Pediatr : 37–42, 2018.
KINTZ E, BRAINARD J, HOOPER L, HUNTER P. Transmission pathways for sporadic Shiga-toxin producing E. coli infections: A systematic review and meta-analysis. Int J Hyg Environ Health : 57–67, 2017.
KIRCHHOFF L V, VOTAVA JR, OCHS DE, MOSER DR. Comparison of PCR and microscopic methods for detecting Trypanosoma cruzi. J Clin Microbiol : 1171–1175, 1996.
KIRK MD, PIRES SM, BLACK RE. World Health Organization Estimates of the Global and Regional Disease Burden of 22 Foodborne Bacterial, Protozoal, and Viral Diseases, 2010: A Data Synthesis. PLoS Med : e1001921, 2015.
KRANSDORF EP, ZAKOWSKI PC, KOBASHIGAWA JA. Chagas disease in solid organ and heart transplantation. Curr Opin Infect Dis : 418–424, 2014.
KWAMBANA-ADAMS B, DARBOE S, NABWERA H. Salmonella Infections in The Gambia, 2005-2015. Clin Infect Dis :354-62, 2015.
LAROCHE RN, DESAI V, FRIEDMAN B, SWAMINATHAN B. Field evaluation of the membrane filter-disc immunoimmobilization technique in the detection of salmonellae in egg products. Poult Sci : 2265–2269, 1981.
LAROCK DL, CHAUDHARY A, MILLER SI. Salmonellae interactions with host processes. Nat Rev Microbiol : 191–205, 2015.
LANDIS JR. E KOCH GG. The measurement of observer agreement for categorial data. Biometrics. 159-74, 1977.
LAW JW-F, AB MUTALIB N-S, CHAN K-G, LEE L-H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front Microbiol : 770, 2014.
LEGGETT HC, CORNWALLIS CK, WEST SA. Mechanisms of pathogenesis, infective dose and virulence in human parasites. PLoS Pathog : e1002512, 2012.
LEMOS AA DE, MARIN VA, AS R, ORIGEM D DE, DOA A Validação de métodos alternativos qualitativos na detecção de patógenos alimentares Validation of qualitative alternative methods in the detection of food-born pathogens. : 1073–1083, 2012.
98
LIANG M, ZHANG T, LIU X. Development of an indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay based on the multiepitope peptide for the synchronous detection of staphylococcal enterotoxin A and G proteins in milk. J Food Prot : 362–369, 2015.
LIEW PS, TEH CSJ, LAU YL, THONG KL. A real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Shigella species. Trop Biomed : 709–720, 2014.
LIMA MS, CARNEIRO AB, SOUTO-PADRON T, JURBERG J, SILVA-NETO MAC, ATELLA GC. Triatoma infestans relies on salivary lysophosphatidylcholine to enhance Trypanosoma cruzi transmission. Acta Trop : 68–72, 2018.
LIMA VS, JANSEN AM, MESSENGER LA, MILES MA, LLEWELLYN MS. Wild Trypanosoma cruzi I genetic diversity in Brazil suggests admixture and disturbance in parasite populations from the Atlantic Forest region. Parasit Vectors : 263, 2014.
LLANES R, VELAZQUEZ B, REYES Z, SOMARRIBA L. Co-infection with Cyclospora cayetanensis and Salmonella typhi in a patient with HIV infection and chronic diarrhoea. Pathog Glob Health : 38–39, 2013.
LOWTHER JA, BOSCH A, BUTOT S. Validation of ISO method 15216 part 1 - Quantification of hepatitis A virus and norovirus in food matrices. Int J Food Microbiol. 2017.
MADDOCKS S, OLMA T, CHEN S. Comparison of CHROMagar Salmonella medium and xylose-lysine-desoxycholate and Salmonella-Shigella agars for isolation of Salmonella strains from stool samples. J Clin Microbiol : 2999–3003, 2002.
MAGALHÃES-SANTOS ÍF. ARTIGO DE REVISÃO Transmissão oral da Doença de Chagas : breve revisão. Rev Ciências Médicas e Biológicas : 226–235, 2014.
MAGWEDERE K, SONGABE T, DZIVA F. Challenges of Sanitary Compliance Related to Trade in Products of Animal Origin in Southern Africa. Ital J Food Saf. 2015.
MAKINO S, OKADA Y, MARUYAMA T. A new method for direct detection of Listeria monocytogenes from foods by PCR. Appl Environ Microbiol : 3745–3747, 1995.
MALHEIROS S, MINÉIA C, PAULA DDE, TONDO EC. Cinética de crescimento de Salmonella Enteritidis envolvida em surtos alimentares no RS : uma comparação com linhagens de outros sorovares. Program : 751–755, 2007.
MARDER MPH EP, GRIFFIN PM, CIESLAK PR. Preliminary Incidence and Trends of Infections with Pathogens Transmitted Commonly Through Food - Foodborne Diseases Active Surveillance Network, 10 U.S. Sites, 2006-2017. MMWR Morb Mortal Wkly Rep : 324–328, 2018.
99
MARINO AMF, PERCIPALLE M, GIUNTA RP. Development and validation of a real-time PCR assay for the detection of Toxoplasma gondii DNA in animal and meat samples. J Vet Diagn Invest : 203–207, 2017.
MARQUES ES, TSUBOY MSF, CARVALHO JCT. First cytotoxic, genotoxic, and antigenotoxic assessment of Euterpe oleracea fruit oil (acai) in cultured human cells. Genet Mol Res. 2017.
MARTINEZ M, VERA-ROMAN JM. Cytomegalovirus and perforation complication a Salmonella colitis in an immunocompetent patient. Rev Esp Enferm Dig : 164–165, 2002.
MATTOS EC DE, MEIRA-STREJEVITCH C DA S, MARCIANO MAM, FACCINI CC, LOURENCO AM, PEREIRA-CHIOCCOLA VL. Molecular detection of Trypanosoma cruzi in acai pulp and sugarcane juice. Acta Trop : 311–315, 2017.
MALORNY, B. et al. Diagnostic Real-Time PCR for Detection of Salmonella in Food. Applied and Environmental Microbiology, v. 70, n. 12, p. 7046–7052, 2004.
MCCLURE FD, LEE JK. Use of prediction methods to assess laboratory bias and mean values associated with an interlaboratory study for method validation and/or proficiency testing. J AOAC Int : 624–629, 2014.
MCIVER CJ, BELL SM, ER N. Development of an internal amplification control system for a real-time PCR assay for detection of Neisseria meningitidis in CSF and EDTA blood. Pathology : 344–347, 2014.
MEHROTRA M, WANG G, JOHNSON WM. Multiplex PCR for detection of genes for Staphylococcus aureus enterotoxins, exfoliative toxins, toxic shock syndrome toxin 1, and methicillin resistance. J Clin Microbiol : 1032–1035, 2000.
MESSENGER LA, MILES MA, BERN C. Between a bug and a hard place: Trypanosoma cruzi genetic diversity and the clinical outcomes of Chagas disease. Expert Rev Anti Infect Ther : 995–1029, 2015.
MILLER T, BROCKMANN S, SPACKOVA M. Recurring outbreaks caused by the same Salmonella Infantis clone in a German rehabilitation oncology clinic over at least 2002 to 2009. J Hosp Infect, 2018.
MINISTÉRIO DE SAÚDE. Boletim Epidemiológico. Chagas aguda no Brasil: série histórica de 2000 a 2013. Secr Vigilância em saúde : 1–9, 2015.
MOMEN H. Taxonomy of Trypanosoma cruzi: a commentary on characterization and nomenclature. Mem Inst Oswaldo Cruz : 181–184, 1999.
MOOIJMAN KA. The new ISO 6579-1: A real horizontal standard for detection of Salmonella, at last! Food Microbiol : 2–7, 2018.
MOON TD, SILVA WP, BUENE M. Bacteremia as a cause of fever in ambulatory,
100
HIV-infected Mozambican adults: results and policy implications from a prospective observational study. PLoS One : e83591, 2013.
MORALES EA, MAYOR P, BOWLER M. Prevalence of Trypanosoma cruzi and Other Trypanosomatids in Frequently-Hunted Wild Mammals from the Peruvian Amazon. Am J Trop Med Hyg : 1482–1485, 2017.
MORITA M, ITO K, HIROSE K. Development of a real-time PCR assay for detection of gyrA mutations associated with reduced susceptibility to ciprofloxacin in Salmonella enterica serovar typhi and paratyphi A. Microbiol Immunol : 707–711, 2006.
MOSER DR, KIRCHHOFF L V, DONELSON JE. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J Clin Microbiol : 1477–1482, 1989.
MOTA JC DA, CAMPOS MR, SCHRAMM JM DE A, COSTA M DE F DOS S. Estimativa de taxa de mortalidade e taxa de incidência de sequelas cardíacas e digestivas por doença de Chagas no Brasil, 2008. Epidemiol e Serviços Saúde : 711–720, 2014.
MUGHINI-GRAS L, SCHAAPVELD M, KRAMERS J. Increased colon cancer risk after severe Salmonella infection. PLoS One : e0189721, 2018.
MULLIS K, FALOONA F, SCHARF S, SAIKI R, HORN G, ERLICH H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol : 263–273, 1986.
MURPHY JL, KAHLER AM, NANSUBUGA I. Environmental Survey of Drinking Water Sources in Kampala, Uganda, during a Typhoid Fever Outbreak. Appl Environ Microbiol . 2017.
NADON C, VAN WALLE I, GERNER-SMIDT P. PulseNet International: Vision for the implementation of whole genome sequencing (WGS) for global food-borne disease surveillance. Euro Surveill Bull Eur sur les Mal Transm = Eur Commun Dis Bull. 2017.
NEIDA S, ELBA S. Characterization of the acai or manaca (Euterpe oleracea Mart.): a fruit of the Amazon. Arch Latinoam Nutr : 94–98, 2007.
NERI-NUMA IA, SORIANO SANCHO RA, PEREIRA APA, PASTORE GM. Small Brazilian wild fruits: Nutrients, bioactive compounds, health-promotion properties and commercial interest. Food Res Int : 345–360, 2018.
NEUBERGER A, DU D, LUISI BF. Structure and mechanism of bacterial tripartite efflux pumps. Res Microbiol, 2018.
NEUERT S, NAIR S, DAY MR. Prediction of Phenotypic Antimicrobial Resistance Profiles From Whole Genome Sequences of Non-typhoidal Salmonella enterica. Front Microbiol : 592, 2018.
NGUYEN T, WASEEM M. Chagas Disease (American Trypanosomiasis). In:
101
Treasure Island (FL), p. 23-27, 2017.
NOBREGA AA, GARCIA MH, TATTO E. Oral transmission of Chagas disease by consumption of acai palm fruit, Brazil. Emerg Infect Dis : 653–655, 2009.
NÓBREGA AA, GARCIA MH, TATTO E. Oral transmission of chagas disease by consumption of A??a?? palm fruit, Brazil. Emerg Infect Dis : 653–655, 2009.
NOGUEIRA AKM, DE SANTANA AC, GARCIA WS. A dinâmica do mercado de açaí fruto no Estado do Pará: De 1994 a 2009. Rev Ceres : 324–331, 2013.
DE NOYA BA, DÍAZ-BELLO Z, COLMENARES C. Update on oral Chagas disease outbreaks in Venezuela: epidemiological, clinical and diagnostic approaches. Mem Inst Oswaldo Cruz : 377–386, 2015.
NOYA BA DE, PEREZ-CHACON G, DIAZ-BELLO Z. Description of an oral Chagas disease outbreak in Venezuela, including a vertically transmitted case. Mem Inst Oswaldo Cruz : 569–571, 2017.
NYACHUBA DG. Foodborne illness: is it on the rise? Nutr Rev : 257–269, 2010.
OLD DC. Nomenclature of Salmonella. J Med Microbiol : 361–363, 1992.
OLIVEIRA CF DE, PAIM TG DA S, REITER KC, RIEGER A, D’AZEVEDO PA. Evaluation of four different DNA extraction methods in coagulase-negative staphylococci clinical isolates. Rev Inst Med Trop Sao Paulo : 29–33, 2014.
OLIVEIRA PAAC DE, SILVA IG DA, SOUZA ML DE, FURTADO CM, SILVA RF DA. In natura açaí beverage: quality, pasteurization and acidification. Ciência e Tecnol Aliment : 502–507, 2011.
ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DE SAÚDE (OPAS). Certificação da interrupção de Doença de Chagas pelo Triatoma infestans no Brasil. Disponível em: <https://www.paho.org/bra/index.php?option=com_content& view=article&id=2878:opas-oms-apoia-o-processo-de-certificacao-da-interrupcao-da-transmissao-da-doenca-de-chagas-por-vetores-secundarios-no-brasil&Itemid=463>. Acesso em: 27/02/2018.
ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA DE SAÚDE (OPAS). Vigilância, prevenção controle e manejo clínica da doença de chagas. Disponível em: < https://www.paho.org/bra/index.php?option=com_docman&view=list&slug=doenca-chagas-976&Itemid=965>. Acesso em: 06/03/2018.
OSTERMAYER AL, PASSOS ADC, SILVEIRA AC, FERREIRA AW, MACEDO V, PRATA AR. The national survey of seroprevalence for evaluation of the control of Chagas disease in Brazil (2001-2008). Rev Soc Bras Med Trop : 108–21, 2011.
PANESSO-GOMEZ S, PAVIA P, RODRIGUEZ-MANTILLA IE. Trypanosoma cruzi Detection in Colombian Patients with a Diagnosis of Esophageal Achalasia. Am J Trop Med Hyg, 2018.
102
PANUNZI LG, AGUERO F. A genome-wide analysis of genetic diversity in Trypanosoma cruzi intergenic regions. PLoS Negl Trop Dis, 28-39, 2014.
PARK S-H, RYU S, KANG D-H. Development of an improved selective and differential medium for isolation of Salmonella sppp. J Clin Microbiol : 3222–3226, 2014.
PEIXOTO G DE L, MARTINELLI FILHO M, SIQUEIRA SF DE. Predictors of death in chronic Chagas cardiomyopathy patients with pacemaker. Int J Cardiol : 260–265, 2018.
PEREIRA JMATK, OLIVEIRA KAM, SOARES NFF, GONÇALVES MPJC, PINTO CLO, FONTES EAF. Avaliação da qualidade físico-química, microbiológica e microscópica de polpas de frutas congeladas comercializadas na cidade de Viçosa-MG. Aliment e Nutr : 437–442, 2006.
PEREIRA KS, SCHMIDT FL, GUARALDO AMA, FRANCO RMB, DIAS VL, PASSOS LAC. Chagas’ disease as a foodborne illness. J Food Prot : 441–446, 2009.
PHILLIPS K, MCCALLUM N, WELCH L. A comparison of methods for forensic DNA extraction: Chelex-100(R) and the QIAGEN DNA Investigator Kit (manual and automated). Forensic Sci Int Genet : 282–285, 2012.
PINTO AY, HARADA GS, VD V. Cardiac attacks in patients with acute Chagas disease in a family micro-outbreak, in Abaetetuba, Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop : 413–419, 2001.
POLAK P, JURANKOVA J, HUSA P. Pathophysiology and pathogenesis of Salmonella sepsis. Klin Mikrobiol Infekc Lek : 11–14, 2014.
POMA HR, DAVIES C, GUTIERREZ CACCIABUE D, MORA MC, BASOMBRIO MA, RAJAL VB. [Comparison of nucleic acid extraction efficiency using different commercial kits and qPCR. Effect of inhibitors]. Rev Argent Microbiol : 144–149, 2012.
PREVEDEN T, KNEZEVIC K, BRKIC S, JELESIC Z. [Salmonella bacteremia]. Med Pregl : 367–370, 2001.
PREZIOSI MJ, KANDEL SM, GUINEY DG, BROWNE SH. Microbiological analysis of nontyphoidal Salmonella strains causing distinct syndromes of bacteremia or enteritis in HIV/AIDS patients in San Diego, California. J Clin Microbiol : 3598–3603, 2012.
PSIFIDI A, DOVAS CI, BRAMIS G. Comparison of eleven methods for genomic DNA extraction suitable for large-scale whole-genome genotyping and long-term DNA banking using blood samples. PLoS One, 2015.
QAMAR FN, AZMATULLAH A, BHUTTA ZA. Challenges in measuring complications and death due to invasive Salmonella infections. Vaccine : C16-20, 2015.
103
QUILES MG, MENEZES LC, BAUAB K DE C. Diagnosis of bacteremia in pediatric oncologic patients by in-house real-time PCR. BMC Infect Dis : 283, 2015.
RAMIREZ JC, CURA CI, DA CRUZ MOREIRA O. Analytical Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for Quantification of Trypanosoma cruzi DNA in Blood Samples from Chagas Disease Patients. J Mol Diagn : 605–615, 2015.
RAMIREZ JC, TORRES C, CURTO M DE LA, SCHIJMAN AG. New insights into Trypanosoma cruzi evolution, genotyping and molecular diagnostics from satellite DNA sequence analysis. PLoS Negl Trop Dis, 2017.
RANJBAR MALIDAREH N, FIROUZI S, RANJBAR MALIDAREH N, HABIBI H. In vitro and in vivo susceptibility of Salmonella sppp. isolated from broiler chickens. Comp Clin Path : 1065–1068, 2012.
RANJBAR R, RAHMATI H, SHOKOOHIZADEH L. Detection of common clones of Salmonella enterica serotype Infantis from human sources in Tehran hospitals. Gastroenterol Hepatol from bed to bench : 54–59, 2018.
RASSI AJ, RASSI A, MARIN-NETO JA. Chagas disease. Lancet (London, England) : 1388–1402, 2010.
REGNATH T, IGNATIUS R. Accurate detection of Campylobacter spp. antigens by immunochromatography and enzyme immunoassay in routine microbiological laboratory. Eur J Microbiol Immunol (Bp) : 156–158, 2014.
REMSCHMIDT C, WILKING H, DELERÉ Y. new england journal. : 1763–1770, 2011.
RICHARDSON KE, COX NA, COSBY DE, BERRANG ME. Impact of desiccation and heat exposure stress on Salmonella tolerance to acidic conditions. J Environ Sci Health B : 141–144, 2018.
RIGANTE D, BOSCO A, ESPOSITO S. The Etiology of Juvenile Idiopathic Arthritis. Clin Rev Allergy Immunol : 253–261, 2015.
RIVERA G, BOCANEGRA-GARCIA V, ORDAZ-PICHARDO C, NOGUEDA-TORRES B, MONGE A. New therapeutic targets for drug design against Trypanosoma cruzi, advances and perspectives. Curr Med Chem : 3286–3293, 2009.
ROGERS-BROADWAY K-R, KARTERIS E. Amplification efficiency and thermal stability of qPCR instrumentation: Current landscape and future perspectives. Exp Ther Med : 1261–1264, 2015.
RYAZANTSEV DY, KVACH M V, TSYBULSKY DA. Design of molecular beacons: 3’ couple quenchers improve fluorogenic properties of a probe in real-time PCR assay. Analyst : 2867–2872, 2014.
SAAVEDRA M, ZULANTAY I, APT W, MARTINEZ G, ROJAS A, RODRIGUEZ J.
104
Chronic Chagas disease: PCR-xenodiagnosis without previous microscopic observation is a useful tool to detect viable Trypanosoma cruzi. Biol Res : 295–298, 2013.
SABINO EC, RIBEIRO AL, LEE T. Detection of Trypanosoma cruzi DNA in blood by PCR is associated with Chagas cardiomyopathy and disease severity. Eur J Heart Fail : 416–423, 2015.
SAFWAT MOHAMED D, FAROUK AHMED E, MOHAMED MAHMOUD A, ABD EL-BAKY RM, John J. Isolation and evaluation of cocktail phages for the control of multidrug-resistant Escherichia coli serotype O104: H4 and E. coli O157: H7 isolates causing diarrhea. FEMS Microbiol Lett, 2018.
SAITO M, MATSUMOTO M, FUNABASHI M. Detection of Clostridium perfringens enterotoxin gene by the polymerase chain reaction amplification procedure. Int J Food Microbiol : 47–55, 1992.
SANTO AH. Tendência da mortalidade relacionada à paracoccidioidomicose, Estado de São Paulo, Brasil, 1985 a 2005: estudo usando causas múltiplas de morte. Rev Panam Salud Pública : 313–324, 2008.
SCALLAN E, GRIFFIN PM, MCLEAN HQ, MAHON BE. Hospitalisations due to bacterial gastroenteritis: A comparison of surveillance and hospital discharge data. Epidemiol Infect: 1–7, 2018.
SCHARFF RL, BESSER J, SHARP DJ, JONES TF, PETER G-S, HEDBERG CW. An Economic Evaluation of PulseNet: A Network for Foodborne Disease Surveillance. Am J Prev Med : S66-73, 2016.
SCHENONE H. Xenodiagnosis. : 289–294, 1999.
SCHIEBELHUT LM, ABBOUD SS, GOMEZ DAGLIO LE, SWIFT HF, DAWSON MN. A comparison of DNA extraction methods for high-throughput DNA analyses. Mol Ecol Resour : 721–729, 2017.
SCHIJMAN AG, BISIO M, ORELLANA L. International study to evaluate PCR methods for detection of Trypanosoma cruzi DNA in blood samples from Chagas disease patients. PLoS Negl Trop Dis, 2011.
SCHOFIELD CJ, JANNIN J, SALVATELLA R. The future of Chagas disease control. Trends Parasitol : 583–588, 2016.
SCOPES E, SCREEN J, EVANS K. Evaluation of the Thermo Scientific RapidFinder Salmonella sppecies, Typhimurium, and Enteritidis Multiplex PCR Kit. J AOAC Int, 2017.
SECCADIO LL. Fatores De Possível Influência Comportamental Em Triatomíneos Durante a Pós-Colheita De Frutos Em Triatomíneos Durante a Pós-Colheita De Frutos, 2013.
SEMAGN K. Leaf tissue sampling and DNA extraction protocols. Methods Mol Biol : 53–67, 2014.
105
SECRETARIA DE ESTADO DE DESENVOLVIMENTO AGROPECUÁRIO E DA PESCA (SEDAP). Programa de Desenvolvimento da Cadeia Produtiva do Açaí (PRÓ-AÇAÍ). Disponível em:< http://www.sedap.pa.gov.br/search/node/a%C3%A7a%C3%AD>. Acesso em: 28/03/2018.
SECRETARIA DE ESTADO DE INDÚSTRIA, COMÉRCIO E MINERAÇÃO
(SEICOM). Exportações de Polpa de Açaí do Estado do Pará: Situação Atual e Perspectivas. Disponível em:<
https://www.researchgate.net/publication/319465735_Exportacoes_de_Polpa_de_Acai_do_Estado_do_Para_Situacao_Atual_e_Perspectivas>. Acesso em: 30/04/2018.
SECRETARIA DE ESTADO DA AGRICULTURA (SAGRI). Extrativismo e Silvicultura. Disponível em:< <www.sagri.pa.gov.br>. Acesso em 13/04/2018.
SHAW AK, KALEM MC, ZIMMER SL. Mitochondrial Gene Expression Is Responsive to Starvation Stress and Developmental Transition in Trypanosoma cruzi. mSphere, 2016.
SHIKANAI-YASUDA MA, CARVALHO NB. Oral transmission of Chagas disease. Clin Infect Dis : 845–852, 2012.
SHIM S-M, KIM J-H, JUNG S-E. Multilaboratory assessment of variations in spectrophotometry-based DNA quantity and purity indexes. Biopreserv Biobank : 187–192, 2010.
SILVA-DOS-SANTOS D, BARRETO-DE-ALBUQUERQUE J, GUERRA B. Unraveling Chagas disease transmission through the oral route: Gateways to Trypanosoma cruzi infection and target tissues. PLoS Negl Trop Dis, 2017.
SILVA C, BETANCOR L, GARCIA C. Characterization of Salmonella enterica isolates causing bacteremia in Lima, Peru, using multiple typing methods. PLoS One, 2017.
DA SILVA SANTOS V, DE ALMEIDA TEIXEIRA GH, BARBOSA FJ. Acai (Euterpe oleracea Mart.): a tropical fruit with high levels of essential minerals-especially manganese-and its contribution as a source of natural mineral supplementation. J Toxicol Environ Health A : 80–89, 2014.
SILVA DF, VIDAL FCB, SANTOS D. Cytotoxic effects of Euterpe oleracea Mart. in malignant cell lines. BMC Complement Altern Med : 175, 2014.
SILVEIRA A, VINHAES M. Elimination of vector-borne transmission of Chagas disease. Mem Inst Oswaldo Cruz : 405–411, 1999.
SLIFKO TR, SMITH H V, ROSE JB. Emerging parasite zoonoses associated with water and food. Int J Parasitol : 1379–1393, 2000.
106
SOMMER SS, CASSADY JD, SOBELL JL, BOTTEMA CD. A novel method for detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers of phenylketonuria. Mayo Clin Proc : 1361–1372, 1989.
SONG Y, WANG X, ZHANG H. Repeated Low-Dose Influenza Virus Infection Causes Severe Disease in Mice: a Model for Vaccine Evaluation. J Virol : 7841–7851, 2015.
SOUZA-LIMA R DE C DE, BARBOSA M DAS GV, COURA JR. Outbreak of acute Chagas disease associated with oral transmission in the Rio Negro region, Brazilian Amazon. Rev Soc Bras Med Trop : 510–514, 2013.
SOUZA-MONTEIRO JR, HAMOY M, SANTANA-COELHO D. Anticonvulsant properties of Euterpe oleracea in mice. Neurochem Int. 2015.
DE SOUZA GODOI PA, PIECHNIK CA, DE OLIVEIRA AC. qPCR for the detection of foodborne Trypanosoma cruzi. Parasitol Int : 563–566, 2017.
SPRINGER NM. Isolation of plant DNA for PCR and genotyping using organic extraction and CTAB. Cold Spring Harb Protoc , 2010.
STEINDEL M, KRAMER PACHECO L, SCHOLL D. Characterization of Trypanosoma cruzi isolated from humans, vectors, and animal reservoirs following an outbreak of acute human Chagas disease in Santa Catarina State, Brazil. Diagn Microbiol Infect Dis : 25–32, 2008.
STEPHEN DM, BARNETT AG. Using Microsimulation to Estimate the Future Health and Economic Costs of Salmonellosis under Climate Change in Central Queensland, Australia. Environ Health Perspect , 2017.
STEVENS JR, NOYES HA, DOVER GA, GIBSON WC. The ancient and divergent origins of the human pathogenic Trypanosomas, Trypanosoma brucei and T. cruzi. Parasitology : 107–116, 1999.
STONER MC, FORSYTHE R, MILLS AS, IVATURY RR, BRODERICK TJ. Intestinal perforation secondary to Salmonella typhi: case report and review of the literature. Am Surg : 219–222, 2000.
STURM NR, DEGRAVE W, MOREL C, SIMPSON L. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas’ disease. Mol Biochem Parasitol : 205–214, 1989.
STUROD K, DAHLE UR, BERG ES, STEINBAKK M, WESTER AL. Evaluation of the ability of four ESBL-screening media to detect ESBL-producing Salmonella and Shigella. BMC Microbiol : 217, 2014.
SUBRAMONEY EL. Non-typhoidal Salmonella infections in HIV-positive adults. S Afr Med J : 805–807, 2015.
SUGITA-KONISHI Y, FUKUDA Y, MORI K. New validated rapid screening
107
methods for identifying Kudoa septempunctata in olive flounder (Paralichthys olivaceus). Jpn J Infect Dis : 145–147, 2015.
SUIJKERBUIJK AWM, BOUWKNEGT M, MANGEN M-JJ, (2017). The economic burden of a Salmonella Thompson outbreak caused by smoked salmon in the Netherlands, 2012-2013. Eur J Public Health : 325–330.
SWITAJ TL, WINTER KJ, CHRISTENSEN SR. Diagnosis and Management of Foodborne Illness. Am Fam Physician : 358–365, 2015.
TAKAKURA K-I, NISHIO T. Safer DNA extraction from plant tissues using sucrose buffer and glass fiber filter. J Plant Res : 805–807, 2012.
TEMELLI S, EYIGOR A, CARLI KT. Salmonella detection in poultry meat and meat products by the Vitek immunodiagnostic assay system easy Salmonella method, a LightCycler polymerase chain reaction system, and the International Organization for Standardization method 6579. Poult Sci : 724–731, 2012.
TORMA P DO CMR, BRASIL AVS, CARVALHO AV. Hydroethanolic extracts from different genotypes of acai (Euterpe oleracea) presented antioxidant potential and protected human neuron-like cells (SH-SY5Y). Food Chem : 94–104, 2017.
TORSO LM, VOORHEES RE, FOREST SA. Escherichia coli O157:H7 Outbreak Associated with Restaurant Beef Grinding. J Food Prot : 1272–1279, 2015.
TORTAJADA-GENARO LA, RODRIGO A, HEVIA E, MENA S, NINOLES R, MAQUIEIRA A. Microarray on digital versatile disc for identification and genotyping of Salmonella and Campylobacter in meat products. Anal Bioanal Chem, 2015.
TOSO M A, VIAL U F, GALANTI N. [Oral transmission of Chagas’ disease]. Rev Med Chil : 258–266, 2011.
TOZETTO-MENDOZA TR, VASCONCELOS D DE M, IBRAHIM KY. Role of T. cruzi exposure in the pattern of T cell cytokines among chronically infected HIV and Chagas disease patients. Clinics (Sao Paulo) : 652–660, 2017.
UCHE IV, MACLENNAN CA, SAUL A. A Systematic Review of the Incidence, Risk Factors and Case Fatality Rates of Invasive Nontyphoidal Salmonella (iNTS) Disease in Africa (1966 to 2014). PLoS Negl Trop Dis , 2017.
UNITED STATES DEPARTMENT OF AGRICULTURE (2015) . Cost estimates of foodborne illnesses. Disponível em:< https://www.ers.usda.gov/data-products/cost-estimates-of-foodborne-illnesses/>. Acesso em: 23/01/2018.
VANNUFFEL P, GIGI J, EZZEDINE H. Specific detection of methicillin-resistant Staphylococcus species by multiplex PCR. J Clin Microbiol : 2864–2867, 1995.
VARGAS A, MALTA JMAS, COSTA VM DA. [Investigation of an outbreak of
108
acute Chagas disease outside the Amazon Region, in Rio Grande do Norte State, Brazil, 2016]. Cad Saude Publica , 2018.
VETERIN M, DISTRITO U. Comparação entre método bioquímico e reação em cadeia de polimerase para identificação de. : 319–325, 2009.
WANG Q, LIU J, ZHU H. Genetic and Molecular Mechanisms Underlying Symbiotic Specificity in Legume-Rhizobium Interactions. Front Plant Sci : 313, 2018.
WANG M, YANG J, GAI Z. Comparison between digital PCR and real-time PCR in detection of Salmonella typhimurium in milk. Int J Food Microbiol : 251–256, 2018.
WELLS SJ, FEDORKA-CRAY PJ, DARGATZ DA, FERRIS K, GREEN. Fecal shedding of Salmonella sppp. by dairy cows on farm and at cull cow markets. J Food Prot : 3–11, 2001.
WEN SC, BEST E, NOURSE C. Non-typhoidal Salmonella infections in children: Review of literature and recommendations for management. J Paediatr Child Health : 936–941, 2017.
WIERUP M, WIDELL S. Estimation of costs for control of Salmonella in high-risk feed materials and compound feed. Infect Ecol Epidemiol , 2014.
WORLD HEALTH ORGANIZATION (2005) . Salmonella non-typhoidal. Disponivel em: < http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/salmonella-(non-typhoidal)>. Acesso em: 15/03/2018.
WORLD HEALTH ORGANIZATION . Typhoid vaccines: WHO position paper, March 2018 - Recommendations. Vaccine. 2018.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Foodborne diseases estimates. Disponivel em: <http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2015/foodborne-disease-estimates/en/>. Acesso em: 10/12/2017.
YAMAGUCHI KK DE L, PEREIRA LFR, LAMARAO CV, LIMA ES, DA VEIGA-JUNIOR VF. Amazon acai: chemistry and biological activities: a review. Food Chem : 137–151, 2015.
YUE H, ZHANG B, ZHU X, ZHANG H, TANG C. Comparison of culture methods for isolation of salmonella in yak fecal samples. Indian J Microbiol : 223–226, 2014.
ZHANG H, ZHANG Y, LIN Y. Ultrasensitive detection and rapid identification of multiple foodborne pathogens with the naked eyes. Biosens Bioelectron : 186–193, 2015.
ZHI Y, MAYHEW A, SENG N, TAKLE GB. Validation of a PCR method for the detection of mycoplasmas according to European Pharmacopoeia section 2.6.7. Biologicals : 232–237, 2010.
109
Zhong CQ, He N, Hua MQ, Wei XD, Ma DX, Ji CY. [The establishment and application of internal quality control system for real-time quantitative PCR detection of BCR-ABL (P210) transcript levels]. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi : 800–806, 2016.
ZHOU L, JONES C, GIBANI MM. Development and Evaluation of a Blood Culture PCR Assay for Rapid Detection of Salmonella Paratyphi A in Clinical Samples. PLoS One : e0150576, 2016.
ZINGALES B, ANDRADE SG, CAMPBELL DA, CHIARI E, FERNANDES O, GUHL F. A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific no- menclature: second revision meeting recommends TcI to Tc. 104: 1051–1054, 2009.
ZULETA-DUENAS LP, LOPEZ-QUIROGA AJ, TORRES-TORRES F, CASTANEDA-PORRAS O. [Possible oral transmission of Chagas disease among hydrocarbons sector workers in Casanare, Colombia, 2014]. Biomedica : 218–232, 2017.