UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE - UFRN

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA E PARSITOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA

Marcelo Henrique Matias da Silva

PERFIL DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA INATA DE PACIENTES

INFECTADOS PELO VÍRUS ZIKA

Natal/RN

Março/2018

MARCELO HENRIQUE MATIAS DA SILVA

PERFIL DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA INATA DE PACIENTES

INFECTADOS PELO VÍRUS ZIKA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária da Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de mestre em Biologia Parasitária.

.

Orientador: Professor Dr. José Veríssimo Fernandes

Co-orientador: Professor Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes

Natal/RN

março de 2018

MARCELO HENRIQUE MATIAS DA SILVA

PERFIL DE RESPOSTA IMUNOLÓGICA INATA DE PACIENTES

INFECTADOS PELO VÍRUS ZIKA

Dissertação de Mestrado do Curso de Pós-

Graduação em Biologia Parasitária, para

obtenção do Título de Mestre em Biologia

Parasitária na área de Ciências Biológicas III.

Orientador: Professor Dr. José Veríssimo Fernandes

Co-orientador: Professor Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes

Natal

Março/2018

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

Silva, Marcelo Henrique Matias da. Perfil de resposta imunológica inata de

pacientes infectados pelo vírus Zika / Marcelo Henrique Matias da Silva. - Natal,

2018. 56 f.: il.Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, Centro de Biociências. (Programa de Pós-Graduação em Biologia

Parasitária.) Orientador: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes. Coorientador: Prof.

Dr. Paulo Marcos da Matta Guedes. 1. Vírus Zika - Dissertação. 2. Receptores de

reconhecimento de padrões - Dissertação. 3. Imunidade inata - Dissertação. I.

Fernandes, José Veríssimo. II. Guedes, Paulo Marcos da Matta. III. Universidade

Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSE-CB CDU 578.833.1

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes

Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN

Prof. Dr. Josélio Maria Galvão De Araujo

Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN

Prof. Dra. Manuela Sales Lima Nascimento

Instituto Internacional de Neurociências Edmond e Lily Safra – IIN-ELS

AGRADECIMENTOS

Á minha Esposa, por sempre acreditar em minha capacidade e sempre estar ao meu lado nos momentos difíceis. Você é meu presente que Deus concedeu. Aos meus familiares, especialmente minha mãe Luzia Matias pela minha educação, por me mostrar na vida o certo e o errado. Aos familiares de minha esposa por serem espelho para mim. Ao meu orientador, Professor Dr. José Veríssimo Fernandes, por ter me aceitado como aluno e transmitido sua experiência desde a graduação. É exemplo para muitos professores no Centro de Biociências. . Ao Professor Dr. Paulo Guedes, que desde a graduação contribui com minha formação, com sua forma única de ministrar aula, sua contribuição para o andamento dos experimentos foi vital. Ao Professor Dr. Josélio Maria Galvão, colaborador deste trabalho, pela minha aceitação no LADIC, participação direta em minha formação, com seu exemplo de serenidade. A minha colega de experimentos Raiza Nara, sem a colaboração dela, não seria possível o andamento dos experimentos, que possamos sempre fazer uma parceria. Aos colegas do laboratório pelo Auxílio e descontração nos momentos de trabalho, Hannaly Wana, Denis Dantas, Brenda Alves, Nathalie de Sena por ter cedido parte de seu tempo ao auxiliar na execução dos experimentos e na análise estatística. Aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, pelos ensinamentos e dedicação Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, que sempre auxiliam na resolução dos problemas, mesmo à distância. À turma de Biologia Parasitária, por deixar as aulas mais descontraídas e mais leves. Obrigado pelos momentos felizes!

Aos amigos da graduação que continuam presentes compartilhando das mesmas

experiências e frustrações e que deixam nossa vida mais leve durante as horas de

lazer.

À DEUS, por não me abandonar e por ter construído em mim a sapiência.

RESUMO

Os receptores da imunidade inata, principalmente receptores do tipo toll (TLRs) e

receptores do tipo Rig (RLRs) são moléculas importantes para o reconhecimento

inicial do vírus Zika e modulação de resposta imunológica protetora com produção

de IFN do tipo 1. Epidemias recentes pelo vírus Zika apresentaram como principais

consequências o aumento do número de casos da síndrome de Guillain-Barré e o

surgimento da síndrome congênita do vírus Zika que pode resultar em microcefalia e

outros danos neurológicos. Os mecanismos imunológicos que conferem proteção ou

patologia durante a infecção por esse vírus ainda não foram elucidados. Dessa

forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil da resposta imunológica inata

em pacientes durante a infecção aguda pelo vírus Zika. Para isso, foi quantificada a

expressão de RNA mensageiro (RNAm) dos TLRs (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9), do

RLR MDA-5 (Melanoma Differentiation-Associated protein 5), das moléculas

adaptadoras TRIF (Toll/IL-1 Receptor Domain-Containing Adaptor-Inducing IFN-β) e

Myd88 (Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88) e das citocinas (IL-6, IL-

12, IFN-α, TNF-α, IFN-β, IFN-γ). Células mononucleares do sangue periférico

(PBMC) de 30 pacientes com sintomas da infecção aguda pelo vírus Zika com

diagnóstico confirmado por RT-PCR em tempo real (qRT-PCR) e de nove indivíduos

saudáveis não infectados foram utilizadas para quantificação do perfil de resposta

imunológica. Pacientes com infecção aguda pelo vírus Zika apresentaram elevada

expressão de TLR3, IFN-α, IFN-β e IFN-γ, quando comparado aos controles

saudáveis. Ademais, houve correlação positiva entre a expressão de TLR3 em

relação a IFN-α e IFN-β. Por outro lado, pacientes infectados pelo vírus zika

apresentaram redução na expressão de TLR8, Myd88 e TNF-α. Foi observada

expressão semelhante de TLR7, TLR9, MDA-5, TRIF, IL-6 e IL-12 entre o grupo de

pacientes infectados pelo vírus zika e indivíduos do grupo controle. Nossos

resultados indicam que a infecção aguda (até 5 dias após o aparecimento dos

sintomas) pelo vírus Zika induz a produção de IFN-γ, IFN-α e IFN-β, principalmente

por via dependente de TLR3. Por outro lado, os pacientes infectados pelo vírus zika

apresentaram uma redução da expressão de TLR8, Myd88 e TNF-α, moléculas

também envolvidas na imunidade antiviral.

Palavras-Chave: Vírus Zika; receptores de reconhecimento de padrões; Imunidade

inata.

ABSTRACT

The receptors of the innate immunity, mainly Toll like receptors (TLRs) and RIG like

receptors (RLRs) are important molecules for the initial recognition of Zika virus and

modulation of protective immune response with production of type 1 IFN. Recent Zika

virus epidemics presented the main consequences the increase in the number of

cases of Guillain-Barré syndrome and the emergence of congenital Zika syndrome,

which may result in microcephaly and other neurological damage. Immunological

mechanisms that confer protection or pathology during infection by this virus have

not yet been elucidated. Thus, the aim of the present study was to evaluate the

profile of the innate immune response in patients during acute Zika virus infection.

For this, the expression of messenger RNA (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9), RLR MDA-5

(Melanoma Differentiation-Associated protein 5), TRIF adapter molecules (Toll / IL-1

Receptor (IFN-γ) and cytokines (IL-6, IL-12, IFN-α, TNF-α, IFN-γ and IFN-γ).

Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from 30 patients with symptoms of acute

Zika virus infection with diagnosis confirmed by real-time RT-PCR (qRT-PCR) and

nine uninfected healthy individuals were used to quantify the immune response

profile. Patients with acute Zika virus infection had high expression of TLR3, IFN-α,

IFN-β and IFN-γ when compared to healthy controls. In addition, there was a positive

correlation between TLR3 expression in relation to IFN-α and IFN-β. On the other

hand, patients infected by zika virus showed reduced expression of TLR8, Myd88

and TNF-α. Similar expression of TLR7, TLR9, MDA-5, TRIF, IL-6 and IL-12 was

observed between the group of patients infected with zika virus and control subjects.

Our results indicate that acute infection (up to 5 days after the onset of symptoms) by

the Zika virus induces the production of IFN-γ, IFN-α and IFN-β, mainly via TLR3-

dependent pathway. However, patients infected by the zika virus showed a reduction

in the expression of TLR8, Myd88 and TNF-α, molecules also involved in antiviral

immunity.

Keywords: Zika virus; receptor recognition patterns Innate immunity.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. A) Organização genômica, e B) estrutura do virion do vírus Zika

(ZIKV)................................................................ ........... ................................. 14

Figura 2. Esquema da patogênese do ZIKV..................................................

Erro! Indicador não definido.

Figura 3. Esquema da via de sinalização dos PRRs e produtos formados.....

Erro! Indicador não definido.

Figura 5. Pacientes infectados pelo vírus zika apresentam elevada expressão de

RNAm de TLR3 e reduzida expressão de TLR8 e Myd88..............................

Erro! Indicador não definido.

Figura 6. Pacientes infectados pelo vírus zika apresentam elevada expressão de

RNAm de IFN-α, IFN-β e IFN-γ e reduzida expressão de TNF-α...................

Erro! Indicador não definido.

Figura 7. A elevada expressão de TLR3 em pacientes infectados com o vírus zika é

correlacionada com a alta expressão de IL-12, IFN-α, IFN-β.........................

Erro! Indicador não definido.

Figura 8. A elevada expressão de TLR9 em pacientes infectados com o vírus zika é

correlacionada com a alta expressão de IL-6, IL-12, IFN-α, IFN-β e IFN-γ.....

42

Figura 9. A elevada expressão de MDA-5 em pacientes infectados com o vírus zika

é correlacionada com a alta expressão de IL-6, IL-12, IFN-α e IFN-β...............

43

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Relação dos Oligunucleotídeos utilizados na transcrição reversa seguida

da relação em cadeia pela polimerase em tempo real (RT-qPCR) para detecção do

vírus Zika (Y=T ou C, R =A ou G).........................................................................

34

Tabela 2. Relação dos reagentes utilizados na transcrição reversa seguida pela

reação em cadeia pela polimerase em tempo real (RT-qPCR).................... 34

Tabela 3. Sequência dos iniciadores específicos utilizados nas reações de PCR em

tempo real..................................................................................................... 36

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AP1 - “Activator protein 1” – Proteína ativadora 1

ASC - “Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD” – Proteína semelhante à partícula associada a apoptose contendo um CARD BIRs - “Baculovirus inhibitor-of-apoptosis repeats” – Repetições de inibidores de bacilovírus CARD - “Caspase recruitment domain” – Domínio recrutador de caspase CD - “Cluster of differentiation” – Grupamento de diferenciação cDNA - “Complementary deoxyribonucleic acid” – Ácido desoxirribonucleico

complementar.

CLRs – “C-type lectin receptors” – Receptores de lectinas do tipo C

CT – “Cycle threshold” – Limiar de ciclo

DAMPs - “Damage-associated molecular patterns” – Padrões moleculares

associados a dano.

DCs – “Dendritic cells” – Células dendriticas.

DENV – “Dengue vírus” – vírus Dengue

IFITM – “Interferon-induced transmembrane” – Transmembrana induzida por

interferon.

IFNAR – “interferon-α/β receptor” – Receptor de interferon- α/β

IRF - “Interferon regulatory factor” – Fator regulador de interferon

ISGs – “Interferon-stimulated genes” – Genes estimuladores de intetferon.

MDA5 – “Melanoma differentiation associated gene 5” – Gene 5 associado à diferenciação de melanoma. MITA – “Mediator of IRF3 activation” – mediador da ativação IRF3.

Myd88 - “Myeloid differentiation primary-response-gene-88” – Gene de resposta

primária da diferenciação mielóide 88

NLR - “NOD-like receptor” – Receptor do tipo NOD

NOD - “Nucleotide-binding oligomerization domain” – Domínio de oligomerização de ligação de nucleotídeos. ORF – “Open reading frame” - Janela de leitura aberta

PAMPs - “Pathogen-associated molecular patterns” – Padrões moleculares associados a patógenos. PRRs - “Pattern recognition receptors” – Receptores de reconhecimento de Padrões. RIG - “Retinoic acid-inducible gene I” – gene I induzido por ácido retinóico

RLR - “RIG-I-like receptor” – Receptor do tipo RIG

RT-qPCR - “Quantitative reverse transcription PCR” – PCR quantitativo com transcrição reversa.

sfRNAs – “Subgenomic flavivirus Ribonucleic acid” – Ácido ribonucleico de flavivirus

subgenômico.

ssRNA – “Positive-sense single-stranded Ribonucleic acid viruses” – Vírus de ácido

ribonucleico de cadeia simples de sentido positivo.

STAT – “Signal transducer and activator of transcription” – Transdutor de sinal e

ativador de transcrição.

TLR - “Toll-like receptor” – Receptor do tipo Toll

TRIF - “Toll/IL-1 receptor domain-containing adaptor protein inducing IFN beta” –

Domínio TIR contendo adaptador indutor de IFN-β.

ZIKV – “Zika vírus” – vírus Zika.

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................................ 13

1.1 Aspectos Gerais do Vírus Zika ..................................................................................... 13

1.2 Histórico e Epidemiologia da infecção pelo vírus Zika .......................................... 14

1.3 Interação vírus hospedeiro humano ........................................................................... 16

1.4 Manifestações clinicas na infecção pelo vírus zika ................................................ 19

1.5 Resposta Imunológica contra ZIKV ............................................................................. 21

1.6 Receptores da Imunidade Inata .................................................................................... 24

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 30

2.1 Objetivo geral .................................................................................................................... 30

2.2 Objetivos específicos ...................................................................................................... 30

3. MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 31

3.1 Delineamento experimental ........................................................................................... 31

3.2 Amostras ............................................................................................................................... 32

3.3 Extração do RNA viral ........................................................................................................ 32

3.5 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em tempo real

(RT-qPCR) para detecção do Vírus Zika................................................................................. 33

3.7 PCR em Tempo real (RT-qPCR) para quantificação de marcadores da

imunidade inata ............................................................................................................................ 35

3.8 Análises estatísticas ............................................................................................................. 37

4. RESULTADOS ........................................................................................................................... 38

5. DISCUSSÃO ............................................................................................................................... 44

6. CONCLUSÃO ............................................................................................................................. 49

REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 50

13

1. INTRODUÇÃO

1.1 Aspectos Gerais do Vírus Zika

O Vírus Zika (ZIKV) pertence a família Flaviviridae, gênero Flavivirus. Possui a

mesma organização genômica de todos outros Flavivirus incluindo vírus da Dengue

(DENV), vírus do Nilo Ocidental (WNV), vírus da febre amarela (YFV) e Vírus da

Encefalite Japonesa (JEV). (LEDERMANN et al., 2014).

Atualmente, os isolados de ZIKV podem ser agrupados em duas ou três

linhagens principais. Essas linhagens correspondem à linhagem Africana, a

linhagem Asiática (que inclui as cepas Americanas) e uma linhagem negligenciada

que circula na África (designada Africano II) que constituiria um grupo irmão tanto

para a linhagem Africana (que deveria ser renomeado para Africano I) como para a

linhagens Asiática, previamente identificadas (FAYE et al., 2014; GONG, GAO e

HAN, 2016; LI et al., 2017b; WANG et al., 2016a).

A sequência dos sitios de clivagem das proteínas do ZIKV segue os padrões

estabelecidos para outros vírus transmitidos por mosquitos (KUNO e CHANG, 2007).

As três proteínas estruturais são necessárias para a montagem de novas partículas

virais infecciosas, enquanto que as proteínas não estruturais atuam na replicação do

genoma (SONG et al., 2016). A proteína C do capsídeo envolve o genoma para

formar o nucleocapsídeo que por sua vez é envolvido pelo envelope viral formando a

partir da membrana do retículo endoplasmático da célula hospedeira na qual foram

inseridas as proteínas prM e a glicoproteína E, para formar os vírions. A

glicoproteína E é a estrutura de ligação do vírus aos receptores da célula num

processo denominado adsorção e em seguida promove a fusão entre o envelope

viral e a membrana da vesícula formada a partir de membrana plasmática com a

liberação dos vírus no interior da célula. Por isso, a glicoproteína E se constitui o

principal alvo para a indução de anticorpos neutralizantes (DAI et al., 2016;

STETTLER et al., 2016; WANG et al., 2016b; ZHANG et al., 2017). As sete proteínas

não estruturais (NS) (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5) estão envolvidas

em uma variedade de funções que vão da replicação de RNA viral, morfogênese de

14

partículas virais, indução de rearranjos de membrana e desenvolvimento de

partículas virais para a modulação da resposta imunológica do hospedeiro (MARTÍN-

ACEBES e SAIZ, 2012). (Figura 2).

Seu genoma é de ácido ribonucleico (RNA) de cadeia simples de polaridade

positiva, contendo 10.794 bases de comprimento, e não possui cauda poli-A (KUNO

e CHANG, 2007; LEDERMANN et al., 2014).

Figura 1. A) Organização genômica, e B) estrutura do virion do vírus Zika (ZIKV).

Fonte: adaptado de Saiz et al., 2017.

1.2 Histórico e Epidemiologia da infecção pelo vírus Zika

O Vírus Zika (ZIKV) é um flavivirus isolado inicialmente de macacos

Rhesus na África em 1947 na floresta Zika em Uganda e é responsável, nos

dias atuais, por uma arbovirose emergente no mundo (DICK, KITCHEN e

HADDOW, 1952; IKEJEZIE et al., 2017). Antes restrito aos continentes

africano e asiático, o ZIKV surgiu nas Ilhas Yap no Oceano Pacífico em 2007

(HAYES, 2009), depois no arquipélago da Polinésia Francesa em 2013

(KUCHARSKI et al. 2016), na Ilha de Páscoa, Chile em 2014 (TOGNARELLI

et al., 2016) e no Nordeste do Brasil em 2015 (ZANLUCA et al., 2015),

espalhando-se rapidamente para outras as regiões do país (CALVET et al. ,

2016) e depois para as Américas, atingindo 48 países e territórios (IKEJEZIE

15

et al., 2017). Somente no continente Americano foram relatados mais de

532.000 casos suspeitos de infecção pelo vírus Zika, dos quais 175.063

confirmados laboratorialmente. Além disso, 22 países e territórios relataram

2.439 casos de síndrome congênita associada ao Zika e cinco países

relataram casos de transmissão sexual deste vírus (IKEJEZIE et al., 2017;

“PAHO WHO | Regional Zika Epidemiological Update (Americas) August 25,

2017”, [s.d.])

No Brasil em 2016 foram registrados 216.207 casos prováveis de febre pelo

vírus Zika no país (Figura 2), sendo confirmados laboratorialmente 8 óbitos por vírus

Zika no Rio de Janeiro, Espírito Santo, Maranhão e Paraíba. Até outubro de 2017

foram registrados 15.586 casos prováveis de febre pelo vírus Zika no país, com taxa

de incidência de 7,6 casos/100 mil hab., e destes, 6.679 (42,9%) foram confirmados.

(BRASIL, 2017). Autores levantaram a hipótese que no Brasil, região Nordeste, onde

foi identificada uma dispersão muito rápida do ZIKV, estaria mais vulnerável a

disseminação do vírus, devido à baixa cobertura de vacina contra febre amarela,

pois supõe-se que os anticorpos induzidos pela vacina poderia oferecer uma

proteção cruzada contra outros flavivirus, incluindo o vírus zika (DE GÓES

CAVALCANTI et al., 2016). Por outro lado, outros autores demonstraram em modelo

animal, que anticorpos contra outros flavivirus como dengue e vírus do Nilo

Ocidental facilitam a entrada do vírus zika em monócitos e macrófagos por meio de

endocitose mediada por receptor de Fcγ de IgG, resultando no aumento da carga

viral e morbidade da doença (BARDINA et al., 2017). Fenômeno semelhante poderia

ocorrer em relação aos anticorpos induzidos pela vacina contra a febre amarela.

Neste caso a ausência de vacinação contra essa doença, ao contrário do proposto

poderia tornar a população não vacinada menos vulnerável a infecção pelo vírus

zika.

16

Figura 2. Área endêmica de transmissão do vírus Dengue em cinza e áreas tracejadas de

transmissão do vírus Zika ao longo de dois anos no território brasileiro.

Fonte: Adaptado de Lowe et al., 2018.

1.3 Interação vírus hospedeiro humano

ZIKV é um vírus transmitido por mosquitos (Figura 3). ZIKV foi isolado de

muitas espécies de mosquito do gênero Aedes, mas apenas um subconjunto destes

(incluindo Ae. Aegypti, Ae. Albopictus, Ae. Hensilii e Ae. Polynesiensis) são vetores

competentes para transmissão (DIAGNE et al., 2015; DIALLO et al., 2014; DICK,

1952; GRARD et al., 2014; HADDOW et al., 1964; HAYES, 2009; LEDERMANN et

al., 2014; LI et al., 2012; MARCHETTE, GARCIA e RUDNICK, 1969; MCCRAE e

KIRYA, 1982). Aedes aegypti é considerado o principal vetor de introdução do ZIKV

durante o surto atual na América Latina e no Caribe, provavelmente devido à

abundância urbana e natureza antropofílica deste mosquito (POWELL et al., 2013).

Os macacos são presumidos para servir como reservatórios para o ZIKV, embora a

espécie primária não tenha sido identificada (MCCRAE e KIRYA, 1982; HAYES,

2009). Não está claro se o ZIKV se tornará endêmico nos macacos do Novo Mundo

Fronteiras Estaduais

Área de transmissão permanente do Dengue

Difusão do Zika

17

e estabelecerá um ciclo de transmissão silvestre na América Latina análogo ao

observado com a febre amarela ou será mantido exclusivamente através de ciclos

de transmissão urbana sem ciclo silvestre no Novo Mundo, de forma semelhante ao

DENV (HANLEY et al., 2013). Os seres humanos estão entre os principais

hospedeiros para o ZIKV, e os ciclos urbanos de transmissão entre humanos e

mosquitos sustentam e causam epidemias.

O curso típico da infecção por ZIKV é ilustrado (fundo verde), com potenciais efeitos graves

que requerem investigação adicional indicada (fundo azul). DENV, vírus da dengue; ADE,

aumento dependente de anticorpos.

Fonte:Lazear e Diamond, 2016.

Figura 2. Esquema da patogênese do ZIKV.

Queratinócito

Células dendriticas

Febre, Erupção,

Cutânea, Mialgia

e Conjuntivite

Imunidade protetora

Perguntas sem

resposta

Transmissão transplacentária?

Microcefalia e outros

defeitos de nascença?

Transmissão sexual?

Persistente em tecidos

imuno-previlegiados?

ADE por anticorpos do

DENV?

Doença do ZIKV mais

severa?

ADE por anticorpos do

ZIKV?

Doença do DENV mais

severa?

Interferências com as

respostas da vacina do

DENV?

Síndrome de

Guillain-Barré?

Infecção do vírus

Zika

18

A biossíntese do ZIKV começa com a adsorção das partículas virais à

superfície da membrana plasmática de células susceptíveis, através de um processo

que envolve fatores de adesão e receptores de entrada (FERNÁNDEZ-SANLÉS et

al., 2017). Os fatores de adesão mantem as partículas virais em contato com a

membrana da célula, o que permite a interação destas com os receptores de entrada

o que possibilita a internalização dos vírus. A expressão diferencial desses

receptores determina o tropismo do vírus pela célula (HAMEL et al., 2015; REY;

STIASNY e HEINZ, 2017). Entre os fatores de adesão e receptores de entrada

envolvidos na infecção de células como fibroblastos, queratinócitos e células

dendríticas imaturas, estão a lecitina C, também conhecida como DC-SIGN e

moléculas da família TIM e TAM. Essas últimas são glicoproteínas transmembrana

que se ligam a resíduos de fosfatidilserina presentes no envelope viral (PERERA-

LECOIN et al., 2013).

Quando as partículas virais se ligam aos receptores de entrada, presentes na

membrana plasmática da célula, ativam proteínas intracelulares do tipo clatrinas as

quais se ligam a parte interna da membrana, promovendo uma invaginação que se

rompe, formando uma vesícula endossômica, contendo as partículas virais no seu

interior. A medida que essas vesículas se aproximam do núcleo o ambiente vai se

tornando mais ácido, atingindo o pH ideal para as alterações conformacionais da

glicoproteína E, o que possibilita a exposição do seu domínio de fusão, o qual

promove a fusão entre o envelope viral e a membrana do endossomo, liberando os

nucleocapsídeos virais no citosol (HEINZ e STIASNY, 2017; SMIT et al., 2011). Em

seguida ocorre a quebra do capsídeo e o RNA genômico é traduzido na poliproteína

nos ribossomos da membrana do retículo endoplasmático (RE). Após o

processamento as proteínas não estruturais permitem a síntese de uma fita

completa de RNA de polaridade negativa que serve como molde para a síntese de

novas cópias do genoma viral (LINDENBACH, THIEL & RICE, 2007). Ao mesmo

tempo em que ocorre a replicação do RNA viral na luz do RE as proteínas prM e são

direcionadas para a membrana desta organela onde são inseridas. Enquanto isso,

múltiplas cópias da proteína C se reúnem para montar os capsídeos, envolvendo as

cópias do RNA genômico recém-sintetizadas para formar os nucleocapsídeos, os

quais brotam da membrana do reticulo endoplasmático na qual estão inseridas

proteína prM e E, para formar o envelope viral. As partículas virais que brotam da

19

membrana do RE, são ainda imaturas e apresenta a superfície espiculada, onde as

proteínas E e prM se arranjam em 60 heterotrímeros (REY; STIASNY & HEINZ,

2017). Os vírions imaturos e ainda não infeciosos, são transportados através do

Golgi onde ocorre a clivagem da proteína percursora, prM em sua forma definitiva M,

pela ação de proteases semelhantes a furina. A proteína E recebe a glicosilação nos

resíduos de aminoácido Asn67 e Asn153 para assegurar o dobramento adequado a

proteína. Após esses eventos o vírions tornam se maduros e são liberados da célula

por exocitose (MOSSENTA et al., 2017; PIERSON e GRAHAM, 2016).

1.4 Manifestações clinicas na infecção pelo vírus zika

A maioria dos pacientes sintomáticos infectados pelo ZIKV apresentam

doença branda e autolimitada, com duração próxima a uma semana (LUZ, SANTOS

e VIEIRA, 2015). Na infecção por ZIKV, os principais sintomas são febre, cefaleia e

exantema maculopapular pruriginoso. Em alguns casos, não pouco frequentes, a

infecção se manifesta sem febre (MUSSO, CAO-LORMEAU e GUBLER, 2015). A

apresentação clínica da infecção por ZIKV é inespecífica e por essa razão, pode ser

confundida com outras doenças febris, principalmente dengue e febre Chikungunya

(LUZ, SANTOS e VIEIRA, 2015). Em alguns grupos, a febre pelo ZIKV apresenta

certas peculiaridades. Nas crianças, o quadro cutâneo pode ser atípico,

caracterizado, por lesões maculares com tendência à confluência, lesões

vesiculares, e até mesmo tendência à recorrência sob determinados fatores

precipitantes, como o estresse. Em imunosuprimidos, é possível a ocorrência de

quadros com complicações viscerais graves, prolongados ou fatais, como acontece

com outras infecções virais nesse segmento da população (ZANLUCA et al., 2015).

Embora a doença tenda a evoluir de forma favorável, há relatos de

complicações neurológicas tardias, provavelmente imunomediadas, como a

síndrome de Guillain-Barré (SGB), relatada tanto nos surtos ocorridos na Polinésia

Francesa como nas epidemias recentes no Rio Grande do Norte e Bahia, Brasil.

Portanto, os clínicos devem estar atentos para quadros de fraqueza nos membros

20

inferiores, observados em pacientes com quadro sugestivo de ZIKV (LUZ, SANTOS

e VIEIRA, 2015). Ainda, há a implicação da infecção pelo ZIKV em gestantes na

ocorrência de microcefalia em recém-nascidos. Esta hipótese foi levantada após a

detecção do aumento inesperado no número de casos de microcefalia, inicialmente

em Pernambuco e posteriormente em outros estados da região Nordeste do Brasil, a

partir de outubro de 2015 (BRASIL, 2016).

Em novembro de 2015, o Ministério da Saúde confirmou a relação entre a

infecção pelo vírus Zika e a ocorrência de microcefalia. A presença do vírus foi

identificada por pesquisadores do Instituto Evandro Chagas (IEC) em amostras de

sangue e tecidos de um recém-nascido do Ceará que apresentava microcefalia e

outras malformações congênitas (BRASIL., 2016).

Estudos em primatas não humanos e outros modelos animais têm apoiado a

hipótese da ligação causal entre a infecção congênita pelo ZIKV e o

desenvolvimento de anormalidades fetais (ADAMS WALDORF et al., 2016;

CUGOLA et al., 2016; MINER et al., 2016). A infecção materna pelo ZIKV em

camundongos resulta em restrição do crescimento intrauterino, insuficiência

placentária, transmissão viral in útero, aumento da morte celular no cérebro do feto

(CUGOLA et al., 2016; MINER et al., 2016). No entanto, ainda não está claro se as

anormalidades fetais são causadas pelo dano placentário, efeitos diretos da

replicação viral no cérebro fetal, ou uma combinação dos dois mecanismos.

Atualmente não existem terapias ou vacinas específicas aprovadas para uso em

seres humanos para combater ou prevenir a infecção por ZIKV, embora vários

compostos farmacológicos promissores e vacinas estejam atualmente em

desenvolvimento (DURBIN e WILDER-SMITH, 2017; MCARTHUR, 2017).

Quanto as infecções do SNC por arbovírus já se sabe que devido a afinidade

dos vírus da família Flaviviridae pelas células neuronais, podem ocorrer casos em

que ele provoque a morte dessas células diretamente, ou por meio da ativação das

respostas imunológicas dos hospedeiros infectados (BRITO e DONATO, 2017).

Célula Neuroprogenitora (NPC) ou Células-tronco neurais (NSCs) são capazes de se

diferenciar em muitos tipos de células neuronais que formam as camadas do

cérebro, dependendo de estímulos específicos (NAMBA e HUTTNER, 2017).

Considerando um cérebro em desenvolvimento, especialmente no primeiro trimestre

de gestação, as NPCs são provavelmente a maioria das células do SNC (NAMBA e

21

HUTTNER, 2017). Em estudo para verificar o neurotropismo da primeira cepa ZIKV

isolada (MR766), observou-se que vírus infectou NPC e neurônios imaturos,

resultando em replicação viral e causando apoptose em células infectadas (TANG et

al., 2016; GARCEZ et al., 2016).

O potencial neurotrópico da cepa brasileira do ZIKV, associada à

microcefalia em recém-nascidos, foi investigada pela primeira vez in vitro e revelou-

se altamente neurotrópica e agressiva, causando a morte celular por apoptose

(CUGOLA et al., 2016). Duas outras cepas desse vírus, IbH30656 e H/PF/ 2013

foram também associadas com redução do crescimento e neurogênese das células-

tronco neurais humanas (fNSCs) in vitro (LIANG et al., 2016; TSAI et al., 2009).

Alguns sustentam a ideia de que, apesar de outras cepas do ZIKV estarem

associadas à deficiência neuronal, é possível que a cepa circulante no Brasil e

outros países da América do Sul, seja mais neurotrópica e possa causar maior

impacto no processo de neurogênese, resultando em fenótipos observados em

recém-nascidos afetados (BRASIL et al., 2016; LI et al., 2017a; LIANG et al., 2016).

1.5 Resposta Imunológica contra ZIKV

Os mecanismos de resposta imunológica frente a infecção pelo vírus zika

pacientes são ainda pouco estudados até o momento, alguns trabalhos relatam a

participação de anticorpos, quimiocinas, citocinas e linfócitos T na patogênese da

infecção pelo vírus em humanos. Os parâmetros imunológicos avaliados até o

momento em pacientes infectados pelo vírus zika são relacionados a imunidade

adaptativa, entretanto, não existem estudos analisando a participação de receptores

da imunidade inata durante a infecção pelo vírus zika em humanos.

(TAPPE et al., 2016)Tappe e colaboradores (2016); analisaram o perfil de

citocinas no soro, com auxílio de ELISA, de seis pacientes durante a fase aguda da

infecção (até 10 dias após sintomas) e no período de convalescência (10 a 62 dias

após sintomas) pelo vírus zika. Foi observado aumento na produção de IL1B, IL-2,

IL-4, IL-6, IL-9, IL-10, IL-13 e IL-17 durante a fase aguda da infecção em indivíduos

infectados por Zika, quando comparado a indivíduos saudáveis. Durante a fase de

convalescência pacientes infectados por Zika apresentaram maior produção de IL-

1β, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-13 no soro, quando comparado a indivíduos saudáveis.

22

Pacientes controles não infectados, e aqueles infectados por Zika nas fases aguda e

de convalescência apresentaram níveis semelhantes de IFN-γ e TNF-α no soro.

Estes autores demonstraram a participação de citocinas dos perfis Th1, Th2, Th9,

Th17 e linfócitos T reguladores (TREG) durante a infecção pelo vírus zika em

pacientes.

Lai et al., (2017); avaliaram o perfil de resposta imunológica

(imunofenotipagem linfócito T CD 4 e CD8), carga viral e manifestações clinicas

foram caracterizados em cinco viajantes norte-americanos que estavam em áreas

endêmicas do ZIKV, entre eles duas pacientes gestantes. Os pacientes

apresentaram fadiga, náuseas, diarreia, dores articulares, conjuntivite, dor de

cabeça. Três dias após o início dos sintomas todos apresentaram aumento do

número de monócitos pró-inflamatórios, com diminuição transitória de células

dendriticas miolóides. Houve ativação de linfócitos T CD4+, com produção de

citocinas antivirais nos quatro pacientes, em contraste, ativação massiva de linfócitos

T CD8+ em apenas 2/4 dos pacientes avaliados.

Estudo realizado em Campinas-SP, Brasil, com 95 pacientes na fase aguda

da infecção (3 dias após sintomas) pelo vírus Zika, demonstrou que 11,6% dos

pacientes apresentaram complicações neurológicas e 88,4% apresentaram doença

leve de erupção cutânea e febre. Pacientes infectados pelo vírus zika apresentaram

maior produção das citocinas IL-4, IL-6, IL-7, IL8, IL-10, IL-18, TNF-α, IFN-γ e das

quimiocinas CXCL-10, CXCL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL11 quando comparado a

indivíduos controles saudáveis. Pacientes com complicações neurológicas

apresentaram aumento na produção de RNAm de TNF-α, IFN-γ, IL-18, IL-10 e

CXCL10 no soro, quando comparado ao grupo controle não infectado. Ainda,

pacientes infectados com vírus zika que apresentaram complicações neurológicas

apresentaram menor expressão de IL-10, quando comparado a pacientes infectados

por Zika que não apresentaram manifestações neurológicas. Estes autores ainda

demonstraram aumento na expressão de CCL2, CCL10, TNF-α e IL-22 em mães

que gestavam fetos com malformações. Notavelmente, bebês com deformidades

congênitas do sistema nervoso central apresentaram maiores níveis de IL-18 e

CXCL10, quando comparado a gestantes que possuem fetos normais (KAM et al.,

2017).

23

Em outro estudo Foo et al., (2017); infectaram monócitos obtidos de pacientes

saudáveis com cepas do ZIKV das linhagens africana (MR766) ou asiática

(H/PF/2013) e analisaram por qRT-PCR citocinas e genes moduladores comumente

associados à infecção viral aguda. Foi observado que os monócitos infectados com

o vírus de origem africana apresentaram maior expressão de genes ligados a

produção de interferon do tipo 1 (IFN-α, IFN-β, STAT1, STAT2, IRF7, IRF9, NF-κB)

macrófagos inflamatórios M1 (CXCL-10, CD80, IL12, IL18, IDO, iNOS, SOCS1,

CCR7) e menor expressão de genes ligados a macrófagos anti-inflamatórios M2 (IL-

10, CCL2, Arg-1, VEGF, YKL-40, CD163, CD23), quando comparado a monócitos

infectados com o vírus de origem asiática. Os autores ainda demonstraram que a

infecção de monócitos obtidos de pacientes gestantes saudáveis com a linhagem

africana do vírus zika induziu elevada produção de IFN-β quando comparado a

essas mesmas células infectadas com a cepa do vírus de origem asiática. Foi

observado também que as células obtidas de gestantes produzem menor

quantidade de IFN-β, quando comparado a células de indivíduos não gestantes.

Foi demonstrado em modelo animal que a deficiência do IFN de tipo I como

do tipo II, podem promover a replicação viral e disseminação para o SNC (ALIOTA et

al., 2016; KATO et al., 2006; ROSSI et al., 2016). Foi demonstrado que proteínas

não estruturais do ZIKV (NS1, NS4A e NS5) podem inibir a indução de IFN do tipo I,

inibindo a sinalização via IRF3 e ativação de NF-kB, embora o mecanismo preciso

ainda não esteja claro (KUMAR et al., 2016). Em outro estudo, os autores sugeriram

que NS1 e NS4B do ZIKV interagem com TBK1 e impedem a ativação de IRF3 (WU

et al., 2017).

Abdalla et al., (2018); estudou o caso de um paciente com fibrilação atrial por

Zika, comparado a um paciente infectado pelo vírus zika, mas sem fibrilação atrial e

um indivíduo controle saudável. O paciente com fibrilação atrial apresentou níveis

elevados de quimiocinas (CXCL8, CCL11, CCL2, CXCL10), citocinas (IL-1β, IL-6,

TNF-α, IFN-γ, IL-17, IL-1B, IL-4, IL-9) quando comparado com pacientes saudáveis.

Ademais, o paciente com fibrilação atrial apresentou maior produção de CCL5, IL-

1β, TNF-α, IFN-γ, IL-9, G-CSF e GM-CSF, quando comparado a pacientes

infectados pelo ZIKV sem fibrilação atrial.

24

Até o momento, poucos estudos avaliaram a participação da resposta

imunológica em pacientes infectados pelo vírus zika. Como demonstrado acima,

estes estudos investigaram principalmente a produção de citocinas e quimiocinas em

pacientes durante a fase aguda e convalescente da infecção, bem como em células

provenientes de pacientes não infectados e posteriormente infectadas in vitro. Ainda

não temos estudos descrevendo a participação de receptores da imunidade inata

durante a infecção em pacientes, estes receptores são importantes para iniciar a

resposta antiviral e a ativação de determinados receptores podem modular a

imunidade adaptativa.

1.6 Receptores da Imunidade Inata

A imunidade inata detecta patógenos utilizando moléculas denominadas

receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Os PRRs são expressos em

macrófagos, células dendríticas (DCs) e neutrófilos principalmente e reconhecem os

padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs) que são padrões

moleculares conservados e compartilhados por grandes grupos de micro-organismos

(KUMAGAI e AKIRA, 2010). Os PRRs são classificados em quatro grupos diferentes

com base em sua localização celular e função e incluem proteínas

transmembranares, como receptores semelhantes a toll (TLRs), Receptores de

lectina tipo C (CLRs), proteínas citoplasmáticas tais como NOD (nucleotídeos de

domínio de oligomerização) ou NLRs e ácido retinóico gene induzível I (RIG I) ou

como receptores semelhantes a RIG (RLRs). Os TLR, por exemplo, reconhecem

uma variedade de componentes microbianos, como bactérias lipoproteínas

específicas, glicolípidios proteínas e ácidos nucleicos. Os ligantes do PPR,

medeiam as cascatas de sinalização da imunidade inata e resposta inflamatória em

monócitos e células dendríticas. Posteriormente, citocinas e quimiocinas são

produzidas, e os leucócitos se tornam mobilizados e ativados. Estudos recentes

indicam que PRRs não são apenas envolvidos em reconhecer patógenos, mas

também em reconhecer moléculas endógenas liberadas por células danificadas,

denominados como padrões moleculares associados a dano (DAMPs) que incluem

ácidos nucleicos, ácido úrico, e colesterol (ROCK, LAI e KONO, 2011). Clinicamente,

25

o reconhecimento desses ligantes endógenos pelo PRRs é associado a uma

variedade de doenças crônicas autoimunes e inflamatória.

Os receptores tipo Toll (TLRs) são uma classe de receptores de

reconhecimento de padrões que reconhecem padrões moleculares associados a

patógenos bacterianos, virais ou parasitários (PAMPs), desempenhando um papel

fundamental nas respostas imunológicas inatas (BRUBAKER et al., 2015; TAKEDA e

AKIRA, 2003). Esta família inclui receptores de membrana plasmática identificados

em camundongos e seres humanos: TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 e TLR10

(BRUBAKER et al., 2015; LEIFER e MEDVEDEV, 2016) receptores endossômicos

de detecção de ácido nucleico também identificados em camundongos e seres

humanos: TLR3, TLR7, TLR8 e TLR9 e receptores endossomais específicos de

camundongos: TLR11, TLR12 e TLR13 (EWALD e BARTON, 2011; WANG, CHAI e

WANG, 2016). Os membros da família TLR foram bem analisados como mediadores

da imunidade inata, além de estarem intimamente ligados à autoimunidade (PELKA

et al., 2016; TAKEDA e AKIRA, 2004) e também reconhecem padrões moleculares

associados ao perigo (DAMPs) no espaço extracelular e ativa vias de sinalização

através de fatores de transcrição que regulam a expressão de citocinas pró-

inflamatórias e quimiocinas para eliminar patógenos invasores. No entanto, além

disso, para lipopolisacarídeos (LPS) e outros produtos microbianos, os TLRs

também podem ser ativados por sinais endógenos de lesões teciduais, incluindo

detritos de células apoptóticas e necróticas, oligossacarídeos, proteínas de choque

térmico e fragmentos de ácido nucleico (WADA e MAKINO, 2016). Os TLR

aparecem agora em posição crítica na patogênese de uma variedade de condições

inflamatórias, como lesão de isquemia-reperfusão (LEEMANS et al., 2005),

aterogênese (DEN DEKKER et al., 2010), e doenças imunomediadas (FRIC et al.,

2013). Dos TLRs endossomais, TLR3 reconhece o dsRNA e o TLR9 reconhece o

dsDNA. Alternativamente, o TLR7 e o TLR8 intimamente relacionados respondem

pelo reconhecimento de ácido ribonucleico de cadeia simples rico em purina

(ssRNA) para induzir uma resposta imunológica a patógenos que são reconhecidos

no endosoma (HEMMI et al., 2002; MANCUSO et al., 2009). Assim, a localização

desses TLRs no endossoma é um requisito para a detecção de ácidos nucleicos

virais e bacterianos que são endocitados. O controle das vias de tráfico desses TLRs

para o endosoma é um processo regimentado que envolve várias etapas. Na

26

literatura, há uma maior ênfase na regulação da localização dos TLR9, enquanto o

conhecimento dos mecanismos que controlam a localização TLR7 é principalmente

deduzido dos estudos TLR9 (BAO e LIU, 2013; CHUANG e ULEVITCH, 2000).

A família de indutores do gene do ácido rentinóico I (RIG-I), como os

receptores semelhantes (RLRs), consiste no membro epônimo RIG-I, bem como o

antígeno de diferenciação de melanoma 5 (MDA5). RIG-I preferencialmente

reconhece moléculas curtas de dsRNA, enquanto MDA5 tem preferência por

moléculas de dsRNA mais longas (KATO et al., 2008). Os RLRs estão localizados no

citoplasma de quase todas as células do corpo e distingue o RNA do hospedeiro e

do patógeno, reconhecendo estruturas únicas encontradas no RNA viral (LOO,

GALE e JR., 2011). RIG-I e MDA5 contêm domínios N-terminais de ativação e

recrutamento de caspáses (CARDs) que atuam como domínios de sinalização, um

domínio central de RNA semelhante a helicases DExD/H que facilita a hidrolise de

ATP e ligação ao RNA e um domínio C-terminal (CTD) que auxilia no

reconhecimento do RNA ligante e especificidade da ligação (BRUNS e HORVATH,

2012).

Apesar das diferentes especificidades de ligação para RNA viral, ambos RIG-

I e MDA5 dependem da mesma cascata de sinalização para desencadear a

expressão de IFN de tipo I, ISGs e citocinas pró-inflamatórias(YONEYAMA et al.,

2005). Os domínios amino-terminais CARDs dos RLRs interagem com outro

localizado na posição N-terminal da proteína adaptadora central, a proteína

mitocondrial de sinalização antiviral (MAVS) (VAZQUEZ e HORNER, 2015). Após a

sua ligação ao ligante, RIG-I e MDA5 sofrem mudanças de conformação e

modificações pós-tradução, incluindo desfosforilação e ubiquitinação, permitindo sua

interação com MAVS (GACK et al., 2007; WIES et al., 2013). MAVS recruta

membros da família do fator associado ao receptor TNF (TRAF), E3 ubiquitina

ligases e esses MAVS ubiquinados promovem o recrutamento do modulador

essencial de NF-kappaβ (NEMO), que ele mesmo recruta o inibidor de proteína

quinasses serina / treonina de kappa-β quinase épsilon (IKKε) e TINK-binding

quinasse 1 (TBK1). IKK e TBK1 fosforilam e ativam os fatores reguladores de

interferon 3 e 7, (IRF-3) e IRF-7, bem como o fator nuclear kappa-B (NFκβ), através

da fosforilação e degradação de inibidor de kappa-β (Iκβ). Após a translocação

nuclear, o IRF-3 promove a transcrição dos genes codificadores de interferon do tipo

27

I e ativa diretamente a transcrição gene efetor antiviral (BROWNELL et al., 2014;

DAFFIS et al., 2007; WANG et al., 2010).

Figura 3. Esquema da via de sinalização dos PRRs e produtos formados.

28

Fonte: Adaptado de Trinchieri e Sher, 2007.

Em infecção de cultura de fibroblastos in vitro, foi observada ativação de

receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), tais como TLR3, RIG-1 e MDA-5

sensibilizados por PAMPs virais, impulsionando a sinalização na ativação de fatores

de transcrição como o IRF-7 que por sua vez estimula a produção de interferon do

tipo I (HAMEL et al., 2015). A figura 5 apresenta o modelo proposto de

reconhecimento do vírus Zika por receptores de reconhecimento de padrões. Hamel

e colaboradores (2015); destaca que não foi observada a ativação do TLR7 e que

apesar da ativação do TLR3, a expressão gênica do IRF3 permaneceu inalterada

durante o curso da infecção nos fibroblastos.

A doença causada pelo vírus zika é emergente nas américas, e ainda não há

uma vacina protetora, nem tratamento especifico. A associação da infecção materna

pelo vírus zika com transmissão vertical, resultando em anormalidades congênitas

incluindo a microcefalia e outras complicações como a síndrome de Guillain-Barré,

tornou esse vírus uma emergência em saúde pública. Não há estudos em seres

Figura 3. Esquema da via de sinalização dos PRRs e produtos formados

β-glucano Lipoproteínas Proteínas IL-1, IL-1β

Dectina-1 Membrana plasmática

Citoplasma

IFN tipo 1

IFN tipo 1

Citocinas pró-inflamatórias

Vários ligantes Peptídeos

Endossomo

29

humanos que avaliem a expressão de receptores da imunidade inata em pacientes

portadores de infecção pelo vírus Zika. Assim, este trabalho visa avaliar a resposta

imunológica inata apresentada por pacientes com infecção aguda pelo vírus Zika no

sentido de contribuir para a geração de conhecimentos sobre o papel dos

mediadores da resposta imunológica inata na proteção ou patogênese da doença.

30

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar o perfil da resposta imunológica inata de pacientes infectados pelo

vírus Zika.

2.2 Objetivos específicos

Avaliar a expressão de RNAm de receptores da imunidade inata por qRT-

PCR e citocinas em células mononucleares do sangue periférico de pacientes

durante a infecção aguda pelo vírus Zika

Correlacionar a expressão dos receptores de reconhecimento de padrões

(PRRs) às citocinas.

31

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Delineamento experimental

32

3.2 Amostras

Pacientes com suspeita da infecção pelo ZIKV atendidos em centros de

saúde e hospitais da rede pública e privada do Rio Grande do Norte foram

submetidos à punção venosa (sistema a vácuo) de sangue periférico 15 ml, em tubo

contendo o anticoagulante EDTA (Vacutainer®, BD Biosciences, USA) para

obtenção do soro e/ou sangue total. A coleta foi realizada em até cinco dias após o

início dos sintomas. Essas amostras foram enviadas, juntamente com suas

respectivas fichas de notificação compulsória, ao Laboratório Central Doutor Almino

Fernandes (LACEN/RN) e, posteriormente, encaminhadas ao Laboratório de

Biologia Molecular de Doenças Infecciosas e do Câncer (LADIC) e LAVIR-IMT

(Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical), localizados na

Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN). O presente estudo foi

aprovado pelo comitê de ética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN) de acordo com o protocolo CAAE: 51057015.5.0000.5537. Todos os

participantes da pesquisa estavam cientes e assinaram o termo de livre

consentimento e esclarecimento conforme a resolução 196/96-CNS/MS.

3.3 Extração do RNA viral

As amostras obtidas acima foram submetidas ao processo de extração de

RNA, utilizando Kit QIAGEN (Viral RNA Mini Kit Qiagen RNA Extraction) específico

para extração de RNA total, seguindo as recomendações do fabricante. Inicialmente

foram pipetados 560 µL de tampão AVL (tampão de lise) preparado com RNA

(carrier/transportador) em tubos de micro centrífuga com capacidade de 1,5 ml;

foram adicionados 140 µL das amostras (PBMC + Trizol) e o produto

homogeneizado por pulso-vortex (Vortex Model QL-901, Biomixer) 15 segundos.

Após, incubados a temperatura ambiente por 10 min, seguido de breve

centrifugação (6000 x g/ 15 segs.) e adicionados mais 560µL de etanol (96-100%),

novamente o produto foi homogeneizado por meio de pulso vórtex 15 segs., seguido

de breve centrifugação (6000 x g/ 15 segs.). Do total 630µL do produto obtido foram

passados para uma coluna QIAamp Mini (Kit QIAGEN) centrifugados a 6000 x

33

g/1min (esse passo foi repetido), foram adicionados 500µL de tampão (Buffer AW1)

a coluna, e centrifugado a 6000 x g/1min. O tubo coletor foi descartado, substituído

por novo tubo coletor de micro centrífuga com capacidade de 1,5 ml e acoplado a

coluna, adicionados mais 500µL de tampão (Buffer AW2) centrifugado a 20 000 x

g/3min, novamente o tubo coletor foi descartado e a coluna acoplada a um micro

tubo de polipropileno com capacidade de 1,5mL (Sigma), por fim, foram adicionados

60µL tampão (Buffer AVE), a amostra foi incubada por 1 min a temperatura ambiente

e então centrifugada a 6000 x g/1min, a coluna descartada. Dado todo o

procedimento e as amostras extraídas foram acondicionadas em freezer -80°C até o

momento de serem utilizadas para obtenção do cDNA.

3.5 Transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase em

tempo real (RT-qPCR) para detecção do Vírus Zika

Os RNAs obtidos na etapa anterior, a extração do RNA viral, foram

submetidos a reação a em cadeia da polimerase com transcrição reversa em tempo

real (RT-qPCR) em uma única etapa e utilizando iniciadores consensuais e sondas

marcadas com fluoróforos (WHO, 2009). A fluorescência gerada no momento da

amplificação permite a quantificação viral e é proporcional à quantidade de produtos

amplificados (STORCH, 2007).

Para a detecção do ZIKV nas amostras, foram utilizados os iniciadores

consensuais forward e reverse (Zika_qRT_F e Zika_qRT_R) a 200 nM

complementares as sequências dos genes que codificam a proteína não estrutural

NS5 e a sonda (Zika_qRT_P) a 125nM que é complementar à nucleotídeos

conservados existentes nas cepas de ZIKV da Malásia, África e Micronésia (FAYE et

al., 2013). (Tabela 1).

A mistura de reagentes para a reação da RT-qPCR foi realizada para cada

amostra estudada da seguinte forma: em uma placa da AppliedBiosystems®

contendo 96 poços, foram adicionados 2,5μL do TaqMan FAST 1-Step Master Mix

(2x) (AppliedBiosystems, Foster City, Usa), 0,2μL do primer Zika_qRT_F (Invitrogen,

USA), 0,2μL do primer Zika_qRT_R (Invitrogen, USA), 0,2μL da sonda

Zika_qRT_PAppliedBiosystems® e 1,9μL de água livre de nucleases (Promega,

34

Madison, USA). Após a preparação desses 5 μL de mistura para a reação, foram

alíquotados 5 μL do RNA previamente extraído (Tabela 2).

Tabela 1. Relação dos Oligunucleotídeos utilizados na transcrição reversa seguida da relação em cadeia pela polimerase em tempo real (RT-qPCR) para detecção do vírus Zika (Y=T ou C, R =A ou

G).

Fonte: Faye et al., 2013

A placa foi imediatamente levada ao Aparelho 7500 fast Real-Time PCR

System (AppliedBiosystems®) e submetida aos seguintes parâmetros de

termociclagem: 1 ciclo para ativação enzimática da transcriptase reversa (50ºC por 5

minutos), 1 ciclo para a inativação enzimática e desnaturação inicial (95ºC por 20

segundos), 40 ciclos de desnaturação (95ºC por 15 segundos), anelamento (60ºC

por 1 minuto), extensão (60ºC por 1 minuto) e um período de extensão final (60ºC

por 1 minuto).

Tabela 2. Relação dos reagentes utilizados na transcrição reversa seguida pela reação em cadeia pela polimerase em tempo real (RT-qPCR).

3.6 Síntese de cDNA

Em um segundo momento as amostras de RNA foram submetidas ao

procedimento de síntese de cDNA, utilizando o kit HIGT CAPACITY cDNA

REVERSE TRANSCRIPTION (Applied Biosystems, USA) e termociclador

convencional (MJ Research PTC-150 MiniCycler), seguindo o protocolo

Tipo de Oligonucleotídeo (sentido)

6 da sequência (5’ – 3’) Posição no Genoma

Primer Zika_qRT_F TGA-CTC-AGG-ATT-TAA-AAA-CTG-GAA

GCC-ACA-TTG-TGA-ACT-TTG-GG

Primer Zika_qRT_R TGG-GTC-TGG-GAA-CAT-TTC-TCT-TC TGA-GAT-TTA-AAC-ATT-CCT-CTT-CGC

Sonda Zika_qRT_P TTT-ACC-TGG-ATG-GAA-ACC-AGC-TA TCA-AGG-CTG-AGA-AGC-TGT-AAG-CTA

Reagentes Mistura para RT-qPCR (volume utilizado por reação)

Taqman FAST1 – STEP Master Mix (2) 2,5 µL

Primer Zika_qRT_F 0,2 µL Primer Zika_qRT_R 0,2 µL Sonda Zika_qRT_P 0,2 µL Água livre de nucleases 1,9 µL

35

recomendado pelo fabricante para a síntese do cDNA a partir da fita de RNA total.

Os ciclos da reação foram de 10min a 25° C, 120min a 37°C, 5min a 85°C e ∞ a 4°C.

A preparação do mix foi realizada em microtubos de polipropileno com capacidade

para 0,5mL (Sigma), adicionando 2µL da solução tampão, 0,8µL de dNTPs na

concentração de 100µM (Bio Basic Inc., USA), 1µL da enzima (MultiScribe™

Reverse Transcriptase), 2µL dos iniciadores, 1µL do inibidor de RNAse, 3µL de água

Mili-Q (Nuclease free) e 2µL da amostra de RNA. Os cDNA obtidos a partir de cada

amostra foram acondicionados a uma temperatura de (–20°C) até a realização das

análises para quantificação da expressão do RNAm dos receptores, moléculas

adaptadoras e suas citocinas por qPCR em tempo real.

3.7 PCR em Tempo real (RT-qPCR) para quantificação de marcadores da

imunidade inata

A análise da expressão quantitativa de genes de receptores da imunidade

inata, suas moléculas adaptadoras e citocinas foram realizadas por meio de reações

de PCR em tempo real, utilizando o sistema SYBR Green® em termociclador 7500

Fast Real time (Applied Biosystems, Warrington, USA). As reações foram realizadas

em placas de 96 poços (MicroAmp®, Applied Biosystems, USA) e, para cada gene

alvo foi preparado um Master mix composto pelos iniciadores direto e reverso, FAST

SYBR® Green (Applied Biosystems, USA) e água Mili-Q estéril para PCR. Foram

utilizados iniciadores específicos para receptores do tipo Toll (TLR3, TLR7, TLR8,

TLR9 e MDA-5), moléculas adaptadoras (TRIF e Myd88), e para as citocinas (IL-6,

IL-12, TNF-α, IFN-α, IFN-β e IFN-γ) descritos na (tabela 3), desenhado com auxílio

de software apropriado (Primer Express, Applied Biosystems, USA). O cDNA (2,5

ng/reação) sintetizados a partir do RNA mensageiro e oligonucleotídeos específicos

(2µg/reação), foram utilizados juntamente com os tampões da reação contendo 5μL

de Sybr® green, 0,7μL de cada iniciador (direto e reverso), 1,6 μL de água e 2μL do

cDNA. As condições das reações foram 2 min a 50ºC, 10min a 95ºC, e 40 ciclos de

15s a 95ºC e 1min a 56ºC. Um ciclo final de 20min com temperatura crescente de 60

a 95ºC foi empregado para a obtenção de uma curva de dissociação dos produtos

da reação, utilizada para a análise da especificidade de amplificação. As condições

da PCR para cada iniciador utilizado foram padronizadas de acordo com a

36

concentração, temperatura de anelamento, ausência de formação de dímeros

(determinada pela curva de dissociação do produto gerado pela qPCR), eficiência de

amplificação dos genes alvos e gene constitutivo. A determinação dos níveis de

expressão dos genes alvo é realizada por meio da normalização das amostras

quanto à expressão constitutiva de β-actina. Após a normalização dos resultados

baseados na expressão do gene constitutivo, foi verificada a análise da expressão

dos receptores, moléculas adaptadoras, citocinas estudadas com o cálculo baseado

na fórmula utilizando o programa Microsoft Excel (2007)

O equipamento utilizado para execução das reações e fornecimento dos

resultados foi o 7500 Software V 2.0.5, 7500 Fast Real time (Applied Biosystems,

USA). O nível de expressão de cada gene foi determinado pelo método de

quantidade relativa (Rq). Inicialmente foi formada uma curva padrão relativa para

cada gene utilizando-se cinco pontos obtidos por diluição seriada de uma amostra

de cDNA com elevada concentração de genes alvos e constitutivo. Para cada

paciente foi obtida a Rq de cada gene pelo valor de CT (cycle threshold) e a

equação da reta obtida para cada um dos genes alvos. Os mesmos foram

normalizados utilizando a Rq do controle endógeno (β-actina) e a expressão foi

comparada entre os grupos avaliados.

Tabela 3. Sequência dos iniciadores específicos utilizados nas reações de PCR em tempo real.

Iniciadores Sequência do Primer (5’ – 3’)

Temp. de Anelamento

Referências

β-actina Hu (direto) TGACTCAGGATTTAAAAACTGGAA 56,1 Pereira, 2014 β-actina Hu (reverso) GCCACATTGTGAACTTTGGG TLR3 Hu (direto) TGGGTTCTGGGAACATTTCTCTTC 58,8 Pereira, 2014 TLR3 Hu (reverso) TGAGATTTAAACATTCCTCTTCGC TLR7 Hu (direto) TTTACCTGGATGGAAACCAGCTA 59,3 Pereira, 2014 TLR7 Hu (reverso) TCAAGGCTGAGAAGCTGTAAGCT TLR8 Hu (direto) TTATGTGTTCCAGGAACTCAGAGAA 59 Pereira, 2014 TLR8 Hu (reverso TAATACCCAAGTTGATGATCGATAAGTTTG TLR9 Hu (direto) CCACCCTGGAAGAGCTAAACC 60,8 Pereira, 2014 TLR9 Hu (reverso) GCCGTCCATGAATAGGAAGC Myd88 Hu (direto) CAAGTACAAGGCAATGAAGAAAG 56,9 Pereira, 2014 Myd88 Hu (reverso) AAGGCGAGTCCAGAACCA TRIF Hu (direto) ATTTCAGGTGCCCGGGCGTG 59,9 Pereira, 2014 TRIF Hu (reverso) TTTGCCGCTCTGCCTCCAC MDA5 Hu (direto) GCAGAGGTGAAGGAGCAGA 52,5 Este trabalho MDA-5 Hu (reverso) AAACGATGGAGAGGGCAAG IFN-α Hu (direto) GAAGAATCTCTCCTTTCTCCTGCC 60,9 Pereira, 2014 IFN-α Hu (reverso) ATGGAGGACAGAGATGGCTTG IFN-β Hu (direto) TGCCTCAAGGACAGGATGAAC 60,9 Este trabalho IFN-β Hu (reverso) GCGTCCTCCTTCTGGAACTG IFN-γ Hu (direto) ATGCAGAGCCAAATTGTCTCC 58,9 Abrantes, 2016 IFN-γ Hu (reverso) GGCAGGACAACCATTACTGG IL-6 Hu (direto) CAAATTCGGTACATCCTCGA 56 Pereira, 2014 IL-6 Hu (reverso) TGCTGCTTTCACACATGTTACT IL-12 Hu (direto) CACTCCCAAAACCTGCTGAG 59 Pereira, 2014 IL-12 Hu (reverso) TCTCTTCAGAAGTGCAAGGGTA

37

TNF-α Hu (direto) TNF-α Hu (reverso)

TTCTGGCTCAAAAAGAGAATTG TGGTGGTCTTGTTGCTTAAAG

55 Abrantes, 2016

Fonte: adaptado de Abrantes, 2016;Pereira, 2014.

3.8 Análises estatísticas

As análises estatísticas foram realizadas através do software PRISM® 7.0

(GraphPad, San Diego, CA, USA) versão para Windows. Inicialmente foram feitos os

testes de Agostino-Pearson, ShapiroWilk e Kolmogorov-Smirnov para verificação da

distribuição normal dos dados. Posteriormente, para as análises dos níveis de

expressão das citocinas, receptores e moléculas adaptadoras envolvidos, para os

grupos infectados e controle, utilizamos o teste de Mann-Whitney. Para realizar as

correlações entre as expressões de todos os parâmetros analisados utilizamos a

regressão linear e o teste não paramétrico de Spearman. Em todos os casos, as

diferenças foram consideradas estatisticamente significantes quando o valor de p foi

menor ou igual a 0,05 (p ≤0,05).

38

4. RESULTADOS

A análise da expressão de RNAm para os receptores da imunidade inata

demonstrou que pacientes infectados pelo vírus zika em fase aguda apresentaram

maior expressão de TLR3 (Fig 4A) e menor expressão de RNAm de TLR8 (Fig 4C) e

Myd88 (Fig 4F), quando comparado com os indivíduos saudáveis. Entretanto,

pacientes infectados pelo vírus Zika e indivíduos saudáveis apresentaram níveis de

expressão semelhantes de RNAm de TLR7, TLR8, TLR9, MDA-5 e TRIF (Figs 4B,

4D, 4E, 4G).

Expressão do RNA mensageiro de TLR3 (A), TLR7 (B) e TLR8 (C), TLR9 (D), TRIF (E), Myd88 (F), MDA5 (G) foi determinada por PCR em tempo real (qRT-PCR) em células monucleares do sangue periférico de pacientes com infecção aguda pelo vírus zika (até 5 dias após infecção) (n=30) e indivíduos controles saudáveis (n=9). Os níveis de expressão de RNAm foram normalizados com auxílio da expressão de RNAm da β-actina. Os resultados estão expressos em média ± desvio

Figura 4. Pacientes infectados pelo vírus zika apresentam elevada expressão de RNAm de TLR3 e reduzida expressão de TLR8 e Myd88.

39

padrão. *p < 0.05.

Pacientes infectados pelo vírus zika e indivíduos saudáveis possuem

expressão semelhante de RNAm de IL-6 (Fig 5A) e IL-12 (Fig 5B). Entretanto,

pacientes infectados pelo vírus zika apresentaram reduzida expressão de RNAm de

TNF-α (Fig 5C) e aumentada expressão de IFN-α (Fig 5D), IFN-β (Fig 5E) e IFN-γ

(Fig 5F), quando comparado a indivíduos saudáveis.

Figura 5. Pacientes infectados pelo vírus zika apresentam elevada expressão de RNAm de IFN-α, IFN-β e IFN-γ e reduzida expressão de TNF-α.

40

Expressão do RNA mensageiro de IL-6 (A), IL-12 (B), TNF-α (C), IFN-α (D), IFN-β (E) e IFN-γ (F) foi determinada por PCR em tempo real (qRT-PCR) em células monucleares do sangue periférico de pacientes com infecção aguda pelo vírus zika (até 5 dias após infecção) (n=30) e indivíduos controles saudáveis (n=9). Os níveis de expressão de RNAm foram normalizados com auxílio da expressão de RNAm da β-actina. Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. *p < 0.05.

Para determinar o possível envolvimento de receptores da imunidade inata na

produção de mediadores imunológicos dessa resposta foi realizada a análise de

correlação entre os níveis de expressão de RNAm dos diferentes receptores da

imunidade inata avaliados em função da expressão de RNAm das citocinas em

pacientes infectados pelo vírus zika. Inicialmente, foi verificado que há correlação

positiva entre a expressão de TLR3 e a expressão de RNAm de IL-12 (Fig 6B), IFN-

Figura 6. A elevada expressão de TLR3 em pacientes infectados com o vírus zika é correlacionada com a alta expressão de IL-12, IFN-α, IFN-β.

41

α (Fig 6C) e IFN-β (Fig 6D). Este aspecto indica que TLR3 pode ser receptor

importante na indução de interferon do tipo 1. Não foi observada correlação

significativa entre a expressão de TLR3 com as citocinas IL-6 (Fig 6A) e IFN-γ (Fig

6E).

A expressão do RNA mensageiro, de TLR3 (A) foi correlacionada a expressão do RNAm das citocinas IL-12 (B), IFN-α (C), IFN-β (D) e IFN-γ (E). A expressão gênica foi determinada por PCR em tempo real (qRT-PCR) em células monucleares do sangue periférico de pacientes com infecção aguda pelo vírus zika (até 5 dias após infecção) (n=30) e indivíduos controles saudáveis (n=9). Os níveis de expressão de RNAm foram normalizados com auxílio da expressão de RNAm da β-actina. Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. *p < 0.05.

Posteriormente, foi verificada correlação positiva entre a expressão de TLR-9

e a expressão de RNAm de IL-6 (Fig 7A), IL-12 (Fig 7B), IFN-α (Fig 7C) e IFN- γ (Fig

7E). Não foi observada correlação significativa entre a expressão de TLR9 e IFN-β

(Fig. 7D).

42

Figura 7. A elevada expressão de TLR9 em pacientes infectados com o vírus zika é correlacionada

com a alta expressão de IL-6, IL-12, IFN-α, IFN-β e IFN-γ.

A expressão do RNA mensageiro, de TLR9 (A) foi correlacionada a expressão do RNAm das citocinas IL-12 (B), IFN-α (C), IFN-β (D) e IFN-γ (E). A expressão gênica foi determinada por PCR em tempo real (qRT-PCR) em células monucleares do sangue periférico de pacientes com infecção aguda pelo vírus zika (até 5 dias após infecção) (n=30) e indivíduos controles saudáveis (n=9). Os níveis de expressão de RNAm foram normalizados com auxílio da expressão de RNAm da β-actina. Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. *p < 0.05 ***P0,0001; ****P<0,0001.

43

A análise de correlação entre a expressão de RNAm de MDA-5 e o perfil de

citocinas demonstrou correlação positiva entre a expressão deste receptor e a

expressão de RNAm de IL-6 (Fig 8A), IL-12 (Fig 8B), IFN-α (Fig 8C) e IFN-β (Fig

8D).

A expressão do RNA mensageiro, de MDA-5 (A) foi correlacionada a expressão do RNAm das citocinas IFN-α (A), IFN-β (B), IL-6 (C) e IL-12 (D). A expressão gênica foi determinada por PCR em tempo real (qRT-PCR) em células monucleares do sangue periférico de pacientes com infecção aguda pelo vírus zika (até 5 dias após infecção) (n=30) e indivíduos controles saudáveis (n=9). Os níveis de expressão de RNAm foram normalizados com auxílio da expressão de RNAm da β-actina. Os resultados estão expressos em média ± desvio padrão. *p < 0.05, **P< 0,01.

Figura 8. A elevada expressão de MDA-5 em pacientes infectados com o vírus zika é correlacionada com a alta expressão de IL-6, IL-12, IFN-α e IFN-β.

44

5. DISCUSSÃO

No presente estudo foi observada a expressão do RNAm dos

receptores da imunidade inata (TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 e MDA-5),

moléculas adaptadoras (Myd88 e TRIF) e citocinas (IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-α,

IFN-β e IFN-γ) em pacientes com infecção aguda pelo vírus zika. Nossos

resultados indicam que a infecção aguda (até 5 dias após o aparecimento dos

sintomas) pelo vírus Zika induz a produção de IFN-γ, IFN-α e IFN-β,

principalmente por via dependente de TLR3. Por outro lado, os pacientes

infectados pelo vírus zika apresentaram reduzida expressão de TLR8, Myd88

e TNF-α, moléculas também envolvidas na imunidade antiviral. Este estudo é

pioneiro na avaliação da participação de receptores da imunidade inata em

humanos durante a infecção aguda pelo vírus zika.

Inicialmente, a análise da expressão de receptores da imunidade inata,

demonstrou que pacientes com infecção aguda pelo vírus Zika apresentaram

elevada expressão de TLR3, e reduzida expressão de TLR8, quando

comparado aos controles saudáveis. Foi demonstrado por Hamel et al. (2015)

que a infecção de fibroblastos da pele in vitro com o vírus zika induz aumento

na expressão de TLR3, mas não de TLR7. Estes autores ainda destacam que a

expressão gênica do IRF3 permaneceu inalterada durante o curso da infecção

nos fibroblastos, embora a expressão de TLR7 tenha sido reduzida, indicando

que possivelmente TLR3 contribuiu para ativação de IRF7 e produção de

interferon do tipo 1. De acordo com Morris et al. (2017); a expressão de TLR3

contribui para a imunidade antiviral induzindo a produção de interferons do tipo

I e outras citocinas pro-inflamatórias. Entretanto, a alta produção de interferons

do tipo I e citocinas pro-inflamatórias foi também detectada no soro e líquido

amniótico de crianças que tiveram transmissão congênita do vírus (MORRIS et

al., 2017). Por outro lado, estudo utilizando camundongos nocautes de TLR3

infectados com outro Flavivirus, o vírus do Nilo Ocidental (WNV), apresentaram

discreta diferença na carga viral comparado a animais selvagens (DAFFIS et

al., 2008). Estudos conduzidos por Alagarasu et al., (2015); associaram

45

polimorfismo em receptores do tipo toll 3, (TLR) 7 e 8 e TIRAP a apresentação

clínica do tipo de Dengue. Revelaram que uma menor frequência de TLR3 alelo

rs3775291 T estava mais relacionado a Dengue hemorrágica, enquanto que a

frequência de TLR8 haplotipo C-A, foi melhor associada com febre dengue.

No presente estudo, foi observada expressão semelhante de RNAm

de TLR7 no grupo de pacientes infectados com o vírus zika e em indivíduos

saudáveis. O TLR7 reconhece vírus de RNA, como o vírus zika. Foi

demonstrado na infecção experimental com o vírus do Nilo Ocidental (WNV) -

outro Flavivirus que camundongos nocautes de TLR7 produzem menores

níveis de interferon do tipo 1 (WELTE et al., 2009). Curiosamente foi

constatado inibição na expressão de RNAm de TLR8 no grupo de indivíduos

infectados pelo vírus zika, quando comparado com indivíduos saudáveis. Este

dado sugere que pacientes infectados pelo vírus zika apresentam inibição da

expressão de TLR8, receptor importante para produção de interferon do tipo

1. A inibição da expressão TLR8 e a não expressão de TLR7, ambos

envolvidos no reconhecimento de vírus com genoma de RNA de fita simples,

bem como de sua molécula adaptadora Myd88, durante a infecção pelo vírus

zika sugere que esta condição poderia ser um mecanismo de escape do vírus

utilizado para se evadir da resposta imunológica inata.

A expressão do TLR9 foi semelhante entre o grupo de pacientes

infectados pelo vírus zika e o grupo de indivíduos saudáveis. Embora no

grupo de pacientes infectados pelo vírus zika, a média de expressão de

RNAm de TLR9 foi aproximadamente 7x maior que em indivíduos saudáveis.

TLR9 reconhece o dsDNA, é possível que durante o processo de replicação

viral fragmentos de DNA de fita dupla ou DNA de células destruídas sejam

reconhecidas e ativem o receptor TLR9 (BRUBAKER et al., 2015; TAKEDA e

AKIRA, 2003).

A expressão de MDA-5 foi semelhante em pacientes infectados pelo

vírus zika e indivíduos saudáveis. Embora a expressão do RNAm do receptor

citosólico MDA-5 tenha sido semelhante nos indivíduos saudáveis e

infectados pelo vírus, houve correlação positiva com a expressão dos

interferons do tipo I, (IFN-α e IFN-β), bem como com as citocinas pró-

46

inflamatórias IL-6 e IL-12. Estes resultados sugerem que MDA-5 desempenhe

função no reconhecimento e proteção contra o vírus zika. Hamel et al., (2015)

demonstraram aumento na expressão de RNAm de MDA-5 em cultura de

fibroblastos humanos infectados in vitro pelo vírus Zika, havendo também

aumento de IFN-α e IFN-β.

A análise do perfil de citocinas apresentando pelos pacientes deste

estudo, durante a infecção aguda pelo vírus zika demonstrou elevada

expressão de IFN-γ, IFN-α e IFN-β, e reduzida expressão de TNF-α. Ademais,

a elevada expressão de TLR3 em pacientes infectados com o vírus zika é

correlacionada com a alta expressão de IL-12, IFN-α, IFN-β. Foo et al. (2017)

infectaram monócitos obtidos de pacientes saudáveis com cepas das

linhagens africana (MR766) ou asiática (H/PF/2013) do vírus zika e

demonstraram que os monócitos infectados com o vírus de origem africana

apresentaram maior expressão de genes de interferon do tipo 1 (IFN-α, IFN-

β), quando comparado a monócitos infectados com o vírus de origem asiática.

Os autores ainda demonstraram que a infecção de monócitos obtidos de

pacientes gestantes saudáveis com a linhagem africana do vírus zika induziu

elevada produção de IFN-β, quando comparado as mesmas células

infectadas com vírus de origem asiática. A produção de interferons do tipo I

em pacientes infectados está relacionada com proteção contra a infecção,

mas também pode estar relacionada a patogênese, como acontece na

transmissão congênita e na síndrome de Guillain-Barré.

Chaudhary et al. (2017) mostraram que a via de sinalização STAT1 –

STAT2 – IRF9 que conduz a produção de interferon do tipo 1 pode ser inibida

pela proteína NS5 do vírus zika, induzindo a degradação de STAT2. Outros

estudos também mostraram tanto in vitro como in vivo a importância da

proteína NS5 no antagonismo a produção de IFN do tipo I em diferentes

flavivirus (LAURENT-ROLLE et al., 2010, 2014; LUBICK et al., 2015).

Também foi relatado que proteínas não estruturais do ZIKV interferem na

etapa de sinalização de interferon do tipo I e produção de IFN-β via RIG-I (XIA

et al., 2018)

47

Houve aumento significativo da expressão do IFN-γ nos pacientes

infectados pelo vírus zika em relação ao grupo de indivíduos saudáveis. Esse

resultado é coerente com os obtidos por Chaudhary et al., (2017). Esses

autores mostram que a proteína NS5 do vírus Zika induz seletivamente a

expressão da atividade de interferons do tipo II, promovendo a formação de

complexos de proteínas STAT1–STAT1, que ativam genes controladores da

atividade de IFN-γ. Além disso, Elong Ngono et al. (2017); mostraram que a

infecção pelo vírus zika mostrou um perfil de resposta Th1 para linfócitos T

CD4 com produção de IFN-γ, TNF-α e IL-2.

Os níveis de expressão de IL-6 e IL-12 foram semelhantes nos

pacientes sintomáticos infectados pelo vírus zika e indivíduos saudáveis.

Nossos resultados com relação a IL-6 são concordantes como os achados de

Bowen et al. (2017) obtidos em estudo realizado em células dentríticas e

monócitos infectadas com o vírus zika, isolado em Porto Rico que é

filogeneticamente relacionada aos isolados durante o surto no Brasil 2015-

2016. (FARIA et al., 2016; LANCIOTTI et al., 2016). Segundo os autores

acima referidos, essa cepa do vírus não foi capaz de induzir expressão de

níveis relevantes de IL-6 e IL-12. Ainda, estudo realizado por Foo et al. (2017)

utilizando soros de mulheres grávidas infectadas pelo vírus zika, não foi

encontrada diferença nas concentrações de IL-12 entre as mulheres

infectadas e saudáveis.

O nível de expressão de RNAm da citocina TNF-α foi menor nos

pacientes infectados pelo vírus zika, quando comparados com os indivíduos

saudáveis. Este resultado é coerente com aqueles obtidos em um estudo em

modelo animal infectado pelo vírus zika realizado por Kumar et al., (2017); no

qual foi observado diminuição dos níveis de TNF-α a partir do 5º dia de

infecção. Tappe et al. (2016); avaliaram os níveis de citocinas e quimiocinas

de pacientes infectados com o vírus zika em diferentes estágios da infecção e

descreveram níveis muito reduzidos de TNF-α. Esses autores levantaram a

hipótese de que isso seria devido a persistência de níveis elevados de

expressão de IL-10 e IL-13, desde a fase aguda até a convalescência. Por

outro lado, em caso atípico de infecção pelo vírus zika onde um paciente sem

histórico de doenças cardiovasculares apresentou sintomas típicos de

48

fibrilação atrial e níveis elevados de quimiocinas, IL-6, TNF-α, IFN-γ entre

outras citocinas quando comparados com amostras de indivíduos saudáveis.

Observaram ainda, níveis maiores de TNF-α, IFN-γ e quimiocinas, quando

comparados com pacientes infectados por ZIKV com manifestações clinicas

típicas (ABDALLA et al., 2018). Desta forma, o nível diferencial de expressão

de citocinas parece influenciar a história natural da infecção pelo vírus zika

podendo conduzir a quadros clínicos que variam de casos assintomáticos à

casos com sintomatologia neurológica grave.

O presente estudo é pioneiro na avaliação da participação de receptores

da imunidade inata durante a infecção pelo vírus zika em humanos. Estes

receptores são responsáveis pela resposta protetora inicial contra o vírus, além

de modular o perfil de resposta imunológica adaptativa. Nossos resultados

demonstram que durante a infecção aguda pelo vírus zika os pacientes

analisados mostraram forte expressão de RNAm de TLR3 correlacionada com

a elevada expressão de IFN-α e IFN-β, principais moléculas da imunidade inata

com atividade antiviral. Por outro lado, pacientes com infecção aguda pelo vírus

zika apresentaram inibição da expressão de TLR8 e Myd88, moléculas também

envolvidas na imunidade antiviral, o que pode ser um mecanismo de evasão do

sistema imunológico pelo vírus, como descrito para outros flavivirus. O melhor

conhecimento dos mecanismos imunológicos que conferem proteção ou

patologia durante a infecção pelo vírus Zika em humanos pode ser uma

ferramenta valiosa para redução da morbimortalidade associada a infecção,

que possui como consequências mais graves a síndrome de Guillain-Barré e a

síndrome congênita do vírus Zika que pode resultar em microcefalia e outros

danos neurológicos.

49

6. CONCLUSÃO

Nossos resultados indicam que a infecção aguda (até 5 dias de doença)

pelo vírus Zika em humanos induz a expressão de RNAm para IFN-γ, IFN-α e

IFN-β, principalmente por via de TLR3. Por outro lado, pacientes infectados

pelo vírus zika apresentaram inibição da expressão de RNAm para TLR8,

Myd88 e TNF-α, moléculas também envolvidas na imunidade antiviral.

50

REFERÊNCIAS

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