uso de marcadores ssr para … 71 genotipos de papa pertenecientes al germo-plasma del programa de...

INVESTIGACIÓN

USO DE MARCADORES SSR PARA IDENTIFICACIÓNDE GERMOPLASMA DE PAPA EN EL PROGRAMA

DE MEJORAMIENTO DE INIA DE CHILE

Use of SSR markers to identify potato germplasm in the INIA Chilebreeding program

Mónica Mathias R.1 , Boris Sagredo D.2 * , Julio Kalazich B.2

AGRICULTURA TÉCNICA (CHILE) 67(1):3-15 (ENERO-MARZO 2007)

A B S T R A C T

Molecular markers based on Simple Sequence Repeats(SSR) are a very efficient tool for potato (Solanum

tuberosum L.) genotype identification and can be veryuseful for germplasm conservation and management.With the purpose of incorporate this technology intothe potato breeding program of the National Instituteof Agricultural Research (INIA) Chile, a set of 26 SSRmarkers was evaluated on a sample of 71 potato ge-notypes. Each marker was characterized for numberand combinations of alleles, scoring quality, polymor-phic information content (PIC) and discriminationpower (D). From the total, only 21 SSR markersshowed up scoreable products and the allele numberranged between 2 and 17. The observed allelic com-binations among the different potato genotypes ran-ged from 2 to 47; however, unique genotypes detec-ted by each SSR marker ranged from 0 to 38. Theobserved (Do) and expected (Dj) discriminatory powerranged from 0.23 to 0.98 and from 0.43 to 0.92, res-pectively. The seven SSR markers which showed thehighest Do scores were STM1009 (0.98), STM1020(0.97), STM0031 (0.97), STM2013 (0.96), STM1008(0.94), STM1052 (0.93) and STM0019 (0.91). TheSTM1009, STM1020 and STM1008 markers aremulti-loci SSR, where each one amplifies more thanone locus of the potato genome. The utilization of themulti-loci type of marker, or combinations of severalSSR markers in either PCR-multiplex or pseudo-mul-tiplex reactions, are good options to increase the speedand reduce the cost of SSR markers application.

Key words: Solanum tuberosum, microsatellite, DNA-fingerprint.

1 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Carillanca, Casilla 58-D, Temuco, Chile.2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Remehue, Casilla 24-D, Osorno, Chile. E-mail: [email protected] *Autor para correspondencia. Recibido: 15 de marzo de 2006. Aceptado: 18 de julio de 2006.

R E S U M E N

Los marcadores moleculares basados en SecuenciasSimples Repetidas (SSR) constituyen una herramien-ta altamente eficaz para la identificación de genoti-pos de papa (Solanum tuberosum L.) y pueden ser degran utilidad en la conservación y manejo de germo-plasma. Con el propósito de incorporar esta tecnolo-gía al Programa de Mejoramiento de Papa del Institu-to de Investigaciones Agropecuarias (INIA) de Chile,se evaluó un grupo de 26 marcadores SSR sobre unamuestra de 71 genotipos de papa. Cada marcador secaracterizó según su número de alelos y sus respecti-vas combinaciones, calidad de lectura, contenido deinformación polimórfica (PIC) y poder discriminato-rio (D). Del total sólo 21 marcadores SSR mostraronproductos legibles con un número de alelos que varióentre 2 y 17. Las combinaciones alélicas observadasvariaron desde 2 a 47; sin embargo, los genotiposúnicos detectados por cada marcador fueron desde 0a 38. El poder discriminatorio observado (Do) y es-perado (Dj) estuvo entre 0,23 a 0,98 y entre 0,43 a0,92, respectivamente. Los siete marcadores que pre-sentaron mayor Do fueron STM1009 (0,98), STM1020(0,97), STM0031 (0,97), STM2013 (0,96), STM1008(0,94), STM1052 (0,93) y STM0019 (0,91). Los mar-cadores STM1009, STM1020 y STM1008 correspon-den a SSR multi-loci, donde cada uno amplifica másde un locus desde distintas regiones del genoma de lapapa. La utilización de este tipo de marcadoresmulti-loci, o de combinaciones de varios SSR enreacciones de PCR-múltiplex o pseudos-múltiplex sonuna buena alternativa para aumentar rapidez y dismi-nuir costo en la aplicación de marcadores SSR.

Palabras clave: Solanum tuberosum, microsatélites,huella digital de ADN.

4 AGRICULTURA TÉCNICA - VOL. 67 - No 1 - 2007

INTRODUCCIÓN

Los programas de mejoramiento genético de papa(Solanum tuberosum L.) necesitan conservar y ma-nejar colecciones de germoplasma, conformadaspor numerosos genotipos que son utilizados comoprogenitores. La mayoría de estos genotipos sonportadores de genes valiosos, que a través de cru-zamientos son transferidos a los futuros nuevoscultivares.

Actualmente el germoplasma de papa del Progra-ma de Mejoramiento Genético de Papa del Institu-to de Investigaciones Agropecuarias (INIA), delCentro Regional de Investigación Remehue (CRI),está constituido por aproximadamente 500 genoti-pos que son mantenidos bajo condiciones de culti-vo in vitro y en campo. El tamaño de esta colec-ción está en constante crecimiento y regularmentese integran nuevos genotipos, los cuales provienende las selecciones avanzadas del mismo programay de introducciones de materiales de otros progra-mas y regiones.

La mantención del germoplasma de INIA bajo con-diciones de cultivo in vitro requiere que cada ge-notipo sea repicado a lo menos dos a tres veces alaño, siendo indispensable contar con un sistema deetiquetado e identificación confiable que evite con-fusiones, que podrían generar mezclas que puedenllevar a pérdidas de materiales valiosos. En condi-ciones de campo también se pueden producir estetipo de confusiones, especialmente en un progra-ma de mejoramiento donde se realizan cientos decruzamientos que generan más de 50.000 genoti-pos nuevos cada temporada.

En el caso de los cultivares descritos oficialmen-te, éstos podrían ser identificados a través de des-criptores morfo-agronómicos como los descritospor la Unión Internacional para la Protección delas Obtenciones Vegetales (UPOV, 2001). Sinembargo, esta metodología requiere de al menosuna temporada completa de cultivo, y puede serafectada por el medio ambiente, por lo que en ca-sos de confusión sea más conveniente readquirirel cultivar desde una fuente confiable. Más dra-mático es el caso de los clones que se liberan comogermoplasma, que normalmente no son caracteri-zados suficientemente, y sus descriptores morfo-agronómicos suelen ser limitados para su correctaidentificación.

La identificación molecular basada en pruebas deADN-fingerprint utilizando marcadores de micro-satélites (SSRs) ha sido descrita como una podero-sa herramienta de identificación de clones y culti-vares de papa que podría facilitar enormemente laconservación y manejo del germoplasma de papa(Perazzo et al., 2001; Ghislain et al., 2001a; b). ElLaboratorio de Biología Molecular Aplicada delCentro Internacional de la Papa (CIP), ha utilizadoeste tipo de marcadores para evaluar el nivel deerror en sus sistemas de etiquetado dentro de gran-des colecciones de germoplasma que superan las5.000 accesiones (Perazzo et al., 2001). La incor-poración de este tipo de herramientas a nuestro pro-grama de mejoramiento de papa facilitará el mane-jo de colecciones, tanto in vitro como en campo, yserá de gran apoyo a las actividades de intercam-bio de germoplasma con los distintos centros y pro-gramas dedicados a esta actividad.

Los marcadores moleculares corresponden a regio-nes del ADN que muestran polimorfismo o varia-ción entre diferentes individuos dentro de una es-pecie (Liu, 1998). El análisis de ADN presentamúltiples ventajas, por entregar información gené-tica precisa, permitir el análisis simultáneo de ungran número de muestras y es independiente delmedio ambiente. Por otro lado, el ADN puede serextraído a partir de cantidades ínfimas de tejido decualquier órgano somático y estado de desarrollode la planta, permitiendo la obtención de resulta-dos en un corto plazo.

En Chile, el uso de técnicas moleculares para iden-tificación de plantas es aún incipiente, observán-dose un mayor desarrollo en el área vitivinícola(Narvaez, 1998; Narvaez et al., 2001). Sin embar-go, existen algunos trabajos de caracterizaciónmolecular realizados en arroz (Hinrichsen et al.,1996), trigo (Zerené et al., 2000), frutillas (Bece-rra et al., 2001), accesiones silvestres de papa (Rie-gel et al., 2004) y material genético forestal (Pare-des et al., 2004).

Se han descrito diversos tipos de marcadores deADN útiles para la identificación de genotipos ycultivares de papa tales como RFLP, AFLP, RAPDy SSR (Ortiz et al., 2000). Sin embargo, los másutilizados y aceptados han sido los SSRs (SingleSequence Repeat) o microsatélites (Schneider yDouches, 1997; Ashkenazi et al., 2001; Ghislain et

al., 2001b; 2004; Norero et al., 2003). Los SSRs

5M. MATHIAS R. et al.- USO DE MARCADORES SSR PARA IDENTIFICACIÓN DE GERMOPLASMA ...

presentan mayor simplicidad tecnológica en rela-ción a RFLP y AFLP, y no requieren alta concen-tración y calidad de ADN. Por otro lado, los SSRsal contrario de los marcadores RAPD, presentan altareproducibilidad entre laboratorios y son de basegenética codominante, y generalmente permitendetectar todos los alelos posibles de un locus (Or-tiz et al., 2000).

Los microsatélites se encuentran ampliamente dis-tribuidos en los genomas de organismos eucario-tas, y a nivel molecular corresponden a secuenciasde 1 a 5 nucleótidos repetidas en tándem, en dondeel número de repeticiones revela diferencias gené-ticas entre individuos (Kruglyak et al., 1998). Engeneral, el grado de polimorfismo revelado aumentacon la longitud total del SSR, y aunque un micro-satélite no es específico de un locus, las regionesflanqueantes sí lo son, por lo que un par de partido-res para estas regiones amplificará un microsatéli-te concreto (Ortiz et al., 2000).

El ADN conteniendo secuencias tipo microsatéli-tes puede ser amplificado usando la Reacción enCadena de la Polimerasa (PCR), con partidores queflanquean el motivo repetitivo y pueden ser fácil-mente resueltos por electroforesis (Liu, 1998). Lospatrones de fragmentos de ADN observados por tin-ción con sales de plata corresponden a una huelladigital, o fingerprint, genético distintivo de cadacultivar. Existen otros sistemas alternativos de vi-sualización de los fragmentos de ADN que se ba-san en el uso de isótopos radiactivos o fluoróforos(Sambrook y Russell, 2001). En papa la tecnologíaSSR ha sido desarrollada usando ADN de cultiva-res modernos (Ghislain et al., 2004). La primerageneración de SSR fue obtenida a partir de la iden-tificación de motivos repetitivos en secuencias degenes (Veilleux et al., 1995; Kawchuck et al., 1996;Provan et al., 1996; Schneider y Douches, 1997).El segundo grupo de SSRs surgió del análisis delibrerías genómicas enriquecidas con motivos re-petitivos (Milbourne et al., 1998). Más reciente-mente, se ha reportado la búsqueda de motivos re-petitivos dentro de las bases de datos de EST (Ex-pressed Sequence Tag) y librerías de cDNA prove-nientes de papa, donde el 5% de ellos contienenSSR (Ghislain et al., 2004, Feingold et al., 2005).

En este artículo se presentan los resultados de laevaluación de 26 marcadores SSR sobre un grupode 71 genotipos de papa pertenecientes al germo-

plasma del Programa de Mejoramiento de INIA,Chile. Además, se proponen alternativas para re-ducir costos y tiempo de análisis, que incluyenmodificaciones a los procesos de extracción deADN y la utilización de marcadores SSR en reac-ciones de multi-loci, múltiplex y pseudos-múltiplex.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetalSe estudió un grupo de 71 genotipos de papa co-rrespondientes a 35 cultivares comerciales, 12 clo-nes avanzados del Programa de Mejoramiento deINIA, Chile, nueve clones originarios del progra-ma de mejoramiento de la Universidad de Cornell,EE.UU., y 15 clones provenientes del Centro Inter-nacional de la Papa (CIP), Lima, Perú. Este mate-rial es mantenido in vitro y en campo, en el CentroRegional de Investigación Remehue del INIA,Osorno, Chile.

Extracción de ADNEl ADN de cada genotipo se obtuvo a partir de ho-jas frescas provenientes de plántulas mantenidas invitro o de plantas crecidas en invernadero, utilizan-do la metodología descrita por Fulton et al. (1995).Además, con el objetivo de introducir un métodode extracción de ADN más sencillo y rápido que elanterior, se evaluó el protocolo descrito por Paris yCarter (2000) con leves modificaciones, lo que con-sistió en la molienda de un disco de hoja en NaOH250 mM y posteriormente, la transferencia del so-brenadante en seis volúmenes de solución concen-trada de TE (Tris-HCl 80 mM pH 7,5 y EDTA 1M). El ADN contenido en esta solución resultantese utilizó directamente como templado en las reac-ciones de PCR.

Loci SSRs y condiciones de amplificación porPCRSe utilizó un grupo de 26 marcadores microsatélitesdescritos por Milbourne et al. (1998) (Cuadros 1 y2). Todos los marcadores SSRs se evaluaron indi-vidualmente, excepto el par STM3012/STPoAc58que se evaluó sólo como un múltiplex, que consisteen realizar una reacción de PCR simultánea para másde un SSR. Además, algunos marcadores se anali-zaron como pseudos-múltiplex (STM1052/STM2013 y STM1016/STM1104/STGBSS), queconsiste en mezclar los productos PCR de SSRs quepresentan productos de diferente tamaño (Ghislain


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.et al., 2004). En todos los casos la mezcla de PCRconsistió en 20 µL de volumen final con aproxima-damente 10-20 ng de ADN templado, 1X de bufferPCR (Tris 20 mM, KCl 50 mM, pH 8,4), 1,2 a 2,0mM de MgCl

2, 0,125 mM de cada dNTP, 5 µM de

cada partidor y 1 U de enzima Taq polimerasa. Elprograma de PCR consistió en un ciclo de desnatu-ración a 94ºC por 3 min; 40 ciclos con desnatura-ción a 94ºC por 30 s, alineamiento de 50 a 60ºCpor 1 min dependiendo del partidor, y elongación a72ºC por 1 min; finalmente un ciclo de extensión a72ºC por 5 min (Milbourne et al., 1998). Los frag-mentos amplificados por PCR se separaron en ge-les de secuenciación de poliacrilamida al 6% (20:1acrilamida:bisacrilamida) con 7 M urea. La elec-troforesis se realizó a 1.700 Volts por 2 h y final-mente las bandas se visualizaron a través de tin-ción con sales de plata (Promega, 2004).

Lectura de alelos de SSRCada alelo de SSR correspondiente a una bandaamplificada se registró con “1” ó “0”, según supresencia o ausencia, respectivamente, para cadagenotipo, y se ingresó en una matriz de datos. Lasbandas tenues de apariencia diferente a la del pa-trón dominante se consideraron como artefactos dela PCR y no se incluyeron en el análisis. Cada SSRse caracterizó según la nitidez de sus bandas, an-cho o amplitud de sus alelos y presencia de som-bras, definiéndose un índice de calidad de lecturapara cada marcador SSR de acuerdo a la metodo-logía consensuada en el Taller de análisis SSR enpapa y desarrollo de bases de datos, realizado enel Centro Internacional de la Papa (CIP, 2004)(Cuadros 3 y 4). El tamaño de los alelos se deter-minó por comparación de movilidad en el gel conel marcador de tamaño molecular Gene Ruler™ 50pb DNA Ladder (MBI Fermentas, Ontario, Cana-dá). Cada uno de los geles teñidos con sales de platase escaneó y almacenó en una base de datos digitalquedando disponible para posteriores análisis ypara quien lo solicite al autor de correspondencia.

Determinación del poder discriminatorio de losSSRsPara cada marcador se estimó el poder discrimina-torio esperado (Dj) y observado (Do). El valor deDj se estimó utilizando la metodología de Tessieret al. (1999). Considerando que C es la probabili-dad de confusión, la probabilidad de que dos indi-viduos elegidos al azar tengan diferentes patronescorresponde a D = 1 - C. En un set de N individuos


es posible sortear N(N-1)/2 pares diferentes y si eli-ésimo patrón que entrega el partidor j-ésimo, pre-senta una frecuencia p

i dentro de este grupo de ge-

notipos, la probabilidad de confusión ci es:

ci = p

i (N p

i - 1)/ (N - 1)

El valor Cj corresponde a la sumatoria de c

i de to-

dos los patrones I generados por el partidor. De estaforma el poder discriminatorio del partidor j-ésimoes igual a:

Dj =1 - C

j

Como N tiende al infinito el límite de Dj, igual aD

L, provee una estimación del poder discriminato-

rio de cada uno de los partidores j.

Lim(Dj) = D

L =1 - ∑ p

i2

Ésta corresponde a una extensión del Contenidode Información Polimórfica (PIC) (Anderson et

al., 1993) disponible desde las frecuencias de losdiferentes patrones de bandas generados por unpartidor.

El poder discriminatorio observado se estimó comoDo = 1- Co, donde Co corresponde al porcentaje dela suma de pares de grupos de genotipos que pre-sentaron un patrón de alelos SSR idénticos. Estevalor se obtuvo de la siguiente manera: i) para cadamarcador SSR se identificaron los grupos de geno-tipos idénticos, ii) luego separadamente se calculóel número de pares posibles que se forman dentrode cada grupo de genotipos idénticos, lo que co-rresponde al número de pares de genotipos que pue-den ser confundidos entre sí, y iii) el porcentaje dela sumatoria total de todos estos pares de genoti-pos representa la probabilidad de confusión obser-vada (Co). Esta tarea se facilitó a través del uso dedendrogramas, que se obtuvieron por análisis dedistancias genéticas (simple matching coefficient)y agrupamiento (UPGMA), utilizando el softwareNTSYSpc versión 2.02c (Sneath y Sokal, 1973).

Combinaciones óptimas de SSRPara establecer las mejores combinaciones de mar-cadores SSRs, que permitan diferenciar el germo-plasma evaluado, se utilizó la metodología de Tes-sier et al. (1999). Se elaboró una lista de marcado-res ordenándolos según su PIC en forma decrecien-te. Luego, al marcador de mayor PIC se combinóel marcador inmediatamente menor, y así sucesi-vamente. Entonces, se estimó la capacidad discri-minatoria acumulada esperada (Dk) de las distin-tas combinaciones de marcadores y su correspon-diente número total de pares de genotipos no dife-renciados Xk. Los respectivos valores observados

Cuadro 3. Parámetros de calidad de lectura de bandas de ADN de marcadores SSRs.Table 3. Parameters of scoring quality of DNA band of SSRs markers.

Cuadro 4. Estimación del índice de calidad de lecturade SSRs según sus parámetros de banda de ADN.

Table 4. Estimation of SSRs scoring quality indexaccording their DNA band parameters.


(Do y Xo) de las diferentes combinaciones de mar-cadores SSR, se obtuvieron por análisis de dendro-gramas con una metodología similar a la utilizadapara los marcadores individuales, descrita anterior-mente.

Combinaciones alélicasPara una especie autotetraploide como S. tubero-

sum el número máximo de combinaciones alélicasposibles (Aj) para cada marcador SSR, se dedujode la ecuación general de la teoría combinatoria paraagrupaciones tipo combinación, completamente alazar y con posibilidades de repetición.

n ( m + n - 1 )!CR

m =

m + n-1 =

n!(m-1)! = Aj

n

Donde m corresponde al número total de elemen-tos disponibles y n representa al número de elemen-tos por grupo que se forman. Así en el caso de unapoblación de individuos tetraploides, m correspon-de al número total de alelos por locus o loci conta-bilizados en la población analizada y n al númeromáximo de alelos que se podría encontrar en un soloindividuo de esta misma población. El valor de nvariará en múltiplos de cuatro n = 4, n = 8, n = 12,n = 16,... y n = 4l para 1, 2, 3, 4,…y l loci, respec-tivamente, de acuerdo al número de loci considera-do en el análisis, ya sea productos SSR de una re-acción PCR de simple locus (l = 1), multi-loci

(l > 1), múltiplex (l > 1), pseudos-múltiplex (l > 1).Por lo tanto, el número máximo de combinacionesalélicas posibles (Aj) para 1, 2 y 3 loci de acuerdoal tipo de marcador utilizado en este estudio secalculó de acuerdo a las siguientes ecuaciones:

(m + 3)! (m + 7)!Aj = para 1 locus; Aj = para 2 loci;

4!(m-1)! 8! (m-1)!

(m + 11)!

Aj = para 3 loci

12!(m-1)!

El número de combinaciones alélicas observadas(Ao) y el número de genotipos únicos se determinómediante recuento de ramas totales y/o únicas endendrogramas generados por análisis de similitud,según se describió anteriormente.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En este trabajo se reportan los resultados de la eva-luación de 26 marcadores SSR, sobre un grupo de71 clones y cultivares de papa de diferente origen.Los marcadores SSR utilizados corresponden a par-

te del grupo descrito por Milbourne et al. (1998) ypara su selección se consideró una buena distribu-ción entre los grupos de ligamiento de la papa. Al-gunos de estos SSRs han sido recomendados para laidentificación de cultivares de papa (Ghislain et al.,2004). Además, en este grupo se incluyeron marca-dores SSR multi-loci que amplifican productos apartir de más de un locus y que fueron mapeados endistintos cromosomas (Milbourne et al., 1998). Encuanto al germoplasma de papa utilizado, a partir dela colección de más de 500 genotipos que se manejaen el programa de mejoramiento genético de papade INIA-Chile, se eligió un grupo que representa porun lado la máxima diversidad en cuanto a su origen,y por otro constituye el grupo de progenitores másfrecuentemente utilizados en los cruzamientos quese realizan anualmente en las actividades de mejo-ramiento, incluyendo materiales chilenos, sudame-ricanos, norteamericanos y europeos.

En una primera etapa de evaluación se consideróexclusivamente la calidad visible de los marcado-res SSR y se descartaron del análisis todos aque-llos marcadores que, bajo nuestras condiciones ex-perimentales de laboratorio, resultaron en produc-tos imposibles de escrutar. Los marcadores elimi-nados correspondieron a STM1050, STM0040,STM0030, STM0037 y STWAX-2, siendo los últi-mos tres SSRs utilizados con éxito en otros labora-torios (Gishlain et al., 2004). Esta diferencia pue-de explicarse por los diferentes tipos de germoplas-ma evaluados, problemas técnicos como degrada-ción de partidores, o simplemente por las condi-ciones distintas de trabajo entre laboratorios.

Los 21 marcadores restantes que generaron produc-tos escrutables, se caracterizaron según la calidad.Para ello se consideró la nitidez, la presencia desombras que confunden la lectura, bandas tartamu-das o presencia de fragmentos-artefactos de simi-lar tamaño que dificultan el reconocimiento del ale-lo; finalmente la mayor amplitud de alelo, medidacomo la separación en mm entre las dos hebras des-naturadas de un mismo alelo fue considerada comoun factor negativo, ya que genera el traslapamientoentre alelos diferentes (Cuadro 3). Así se constru-yó una escala de puntajes asignados a cada carac-terística, de forma que los valores promedios fluc-túan entre 1 y 3, siendo los SSRs de mayor calidadlos de tipo 1 (Cuadro 4). En la Figura 1 se mues-tran los marcadores SSR STM1053, STM0031 ySTM1009 que obtuvieron índices de calidad de lec-

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tura de 1, 2 y 3, respectivamente. En este trabajo,la mayoría de los marcadores presentaron una bue-na calidad salvo los marcadores STM1106 (3),STM1009 (3), STM0031 (2) y STM1017 (2) loscuales, bajo las condiciones de laboratorio utiliza-das, presentaron baja nitidez además de bandas tar-tamudas y presencia de sombras, lo que dificultó lalectura de alelos (Cuadro 1).

Poder discriminatorio de los SSRComo se observa en el Cuadro 1, cada marcadorfue evaluado según el valor del contenido de infor-mación polimórfica (PIC). Este parámetro es fre-cuentemente utilizado para medir la capacidad dis-criminatoria de marcadores SSRs; sin embargo, suvalor puede variar para un mismo SSR, dependien-do de las características del germoplasma estudia-do (Morales, 2002). El PIC calculado para un mar-cador puede variar entre 0 y 1, indicando un mayornivel de polimorfismo o variación cuando el valores más cercano a 1. Paralelamente, la estimacióndel poder discriminatorio esperado (Dj) de cadaSSR, al igual que el valor de PIC se basa en lasfrecuencias alélicas y por lo tanto, corresponden avalores prácticamente idénticos (Tessier et al.,1999), lo cual se observó en los resultados obteni-dos (Cuadro 1).

Los valores Dj para el total de marcadores (Cuadro1) estuvieron dentro del rango de 0,92 y 0,43, don-de los siete marcadores de mayor poder discrimi-nante fueron STM1009 (0,92), STM0031 (0,90),STM1020 (0,86), STM3023 y STM2013 (0,84),STM1008 y STM2022 (0,82). En este grupo están

incluidos los marcadores SSR multi-loci STM1009,STM1020 y STM1008. En este caso, el valor Djequivale a la información combinada de los alelosde sus respectivos loci. En general, los niveles depolimorfismo detectados para la mayoría de losmarcadores fueron similares a los descritos porGhislain et al. (2001a; b; 2004), quienes han eva-luado cultivares de papa provenientes de India ySud América, y una colección de cerca de mil acce-siones de S. tuberosum, respectivamente. Esta últi-ma colección estaba constituida por ocho grupostaxonómicos diferentes de Stenotomum, Phureja,Ajanhuiri, Chaucha, Juzepczukii, Andigenum, Chi-lotanum, Curtilobum (Ghislain et al., 2004).

Por otro lado, al comparar los valores del poder dediscriminación observado (Do) y sus respectivosvalores esperados (Dj) se aprecia que en la mayo-ría de los casos el valor observado es mayor al es-perado (Figura 2). Probablemente esta diferenciatendería a disminuir a medida que se aumente elnúmero de genotipos de papa en el análisis. Sin em-bargo, como se observa en la Figura 2, la tendenciala rompen los marcadores STM3023, STM2022,STM1053 y STM2030, donde Do resultó menor queDj. Sólo un caso, STM1058, presentó valores idén-ticos para ambos parámetros. Esto indica que lacapacidad discriminatoria de un marcador no sólodepende de las frecuencias alélicas, sino tambiénde la forma en que están combinados los alelos enlos genotipos de papa evaluados, pudiendo dosmarcadores con igual valor de PIC y Dj, presentarpoderes discriminatorios observados (Do) muy di-ferentes. Los siete marcadores que presentaron un

Figura 1. Perfiles de ADN para tres SSRs que presentan diferentes calidades de lectura de banda: (A) STM1053con calidad de lectura de 1; (B) STM0031 con calidad de lectura de 2; y (C) STM1009 con calidad de lectura de 3.

Figure 1. DNA profiles for three SSRs showing different band quality scoring: (A) STM1053 with scoring quality1; (B) STM0031 with scoring quality 2; and (C) STM1009 with scoring quality 3.


mayor valor Do fueron STM1009 (0,98), STM1020 ySTM0031 (0,97), STM2013 (0,96), STM1008 (0,94),STM1052 (0,93) y STM0019 (0,91) (Cuadro 1).

Respecto al número de combinaciones alélicas ob-servadas (Ao), en todos los casos se presentaronvalores inferiores al máximo de combinacionesposibles (Aj) en individuos tetraploides. Para unmarcador SSR de simple locus, sobre cinco alelosel número máximo de genotipos posibles sobrepa-sa el tamaño de la población analizada, por lo tantoen estos casos se esperan valores observados me-nores. Sin embargo, para un número de alelos ≤ 5se obtienen valores de Aj de ≤ 70, pero las respec-tivas combinaciones observadas Ao fueron siem-pre menores. Todo esto indica que existen combi-naciones alélicas que se repiten, posiblemente porla selección a que han sido sometidos estos mate-riales antes de convertirse en cultivares o germo-plasma avanzado. Es destacable la situación delmarcador STM3023, en el cual con siete alelos y210 posibilidades de combinaciones alélicas dife-rentes sólo se encontraron cinco combinaciones(Cuadro 1).

Combinaciones óptimas de SSRs para identifi-cación de genotipos

En general todos los métodos de identificación con-fiables recomiendan incluir el mayor número posi-

ble de parámetros descriptores, lo cual también esválido en el uso de marcadores moleculares. Sinembargo, para disminuir costos y aumentar la efi-ciencia total del análisis, es necesario determinarun número mínimo de marcadores para los cualesel riesgo de confundir germoplasma sea muy bajo(Narvaez et al., 2001).

Con el objetivo de definir un grupo de marcadoresaltamente informativos que permita diferenciar latotalidad del germoplasma utilizado, los marca-dores incluidos en este análisis se ordenaron porvalor de Do decreciente y se combinaron segúnse indica en el Cuadro 5. Para cada combinaciónde marcadores se determinó el número esperadoy observado de pares de genotipos que puedenser confundidos, Xk y Xo, respectivamente, parauna población de tamaño n = 71. El valor espe-rado Xk se hace igual a cero al utilizar cinco omás l oc i (STM1009/STM0031/STM3023/STM2013/STM1020). Sin embargo, los valoresobservados Xo muestran que al utilizar tres omás loci (STM1009/STM0031/STM3023) esposible distinguir la totalidad del germoplasma(Cuadro 5). Lo mismo ocurre con la combina-ción STM1020/STM2013/STM1052, aunque es-tos marcadores presentaron menores valores dePIC, mostraron mayor facilidad de lectura si soncomparados con los perfi les obtenidos conSTM1009 y STM0031.

Figura 2. Comparación de poderes discriminatorios observado (Do) y esperado (Dj) de SSRs.Figure 2. Comparison of observed (Do) and expected (Dj) SSRs discriminatory powers.

SSR: simple sequence repeat.


Reducción de costos en el análisis de marcado-res SSRDentro de los desafíos que deben enfrentar losmarcadores moleculares para poder ser aplicadosen forma rutinaria en identificación de germoplas-ma, se encuentra reducir los costos de análisis. És-tos pueden ser reducidos considerablemente opti-mizando métodos alternativos rápidos de extracciónde ADN y utilizando PCR en condición de multi-loci, múltiplex y pseudos-múltiplex.

Desde el punto de vista de la extracción de ADN,sin considerar la mano de obra, los costos puedenser reducidos sobre un 90% utilizando procedimien-tos alternativos como el método de lisis alcalinadescrito por Paris y Carter (2000). Aplicando esteprotocolo rápido, en el presente estudio, el ADNde una muestra pudo ser extraído en menos de 1min y con un costo de $44 (US$0.08) por muestra.Es importante destacar que la calidad de este ADNcomo templado para reacciones PCR fue evaluadobajo las condiciones de trabajo del laboratorio deINIA-Remehue, obteniéndose resultados similaresa los métodos convencionales, aunque los produc-tos de SSR presentaron una menor intensidad (Sa-gredo et al., 2004). Además, estas muestras de ADNextraído con el método rápido se mostraron esta-bles después de haber sido congeladas y descon-geladas después de 3 meses. Sin embargo, un pe-queño porcentaje de las muestras (aprox. 1%) nun-ca generaron productos de amplificación, lo cualaparentemente se debe a la presencia de contami-nantes que inhiben la reacción de PCR.

Otra posibilidad para aumentar la eficiencia delanálisis con marcadores SSRs, es utilizar marcado-

res multi-loci, los cuales con un solo par de parti-dores amplifican productos de ADN de más de unaregión del genoma (Cuadro 1). Los SSR multilo-cus utilizados correspondieron a STM0040 (Cr. IIIy VII), STM1008 (Cr. II, IV y IX), STM1050 (Cr.III, IV, VI y VII), STM1009 (Cr. VII y XI) ySTM1020 (Cr. III y V) (Milbourne et al., 1998).No obstante, en este estudio sólo fue seleccionadoSTM1020 por el nivel de nitidez observado en losgeles. En general, los SSRs multi-loci permitieronobservar mayor número de alelos por genotipo, loque resultó en un mayor poder discriminatorio ob-servado (Cuadro 1). La gran limitación de este tipode marcadores SSR multi-loci es su escaso númerodescrito en papa.

La alternativa de realizar una reacción de PCR si-multánea para más de un SSR, llamado PCR-múl-tiplex, permite reducir los costos y tiempos a lamitad, tanto en la PCR como en la electroforesis.Sin embargo, debe existir compatibilidad de tama-ño de productos PCR y de las temperaturas de apa-reamiento de partidores durante la PCR. En estecaso, la mejor posibilidad correspondió a la com-binación STPoAc58/STM3012, con la cual fue po-sible reconocer sólo un 18% del germoplasma es-tudiado (Cuadro 2).

El uso de pseudos-múltiplex, que consiste en mez-clar los productos PCR de SSRs que presentan pro-ductos de diferente tamaño, es una alternativa bas-tante recurrida en los análisis de marcadores SSR(Ghislain et al., 2004). En este caso, la reducciónde costos se produce sólo en la etapa de la electro-foresis. Sin embargo, es la mejor posibilidad parautilizar las mejores combinaciones de marcadores

Cuadro 5. Poder discriminatorio acumulado de las combinaciones de marcadores SSR más informativas.Table 5. Accumulative discriminatory power of the most informative SSR markers combinations.


SSR de mayor poder discriminatorio. En el presen-te análisis se logró reconocer un 78% del germo-plasma con la combinación STM2013/STM1052 y42% con STM1016/STM1104/STGBSS (Cuadro 2y Figura 3).

Dentro del grupo de 71 genotipos analizados, 15corresponden a cultivares del Registro de Varie-dades descritas oficialmente por el Servicio Agrí-cola y Ganadero (SAG), de Chile, y correspon-den a los cultivares Atlantic, Asterix, Cardinal,Desirée, Granola, Karu-INIA, Kennebec, Ona-INIA, Oscar, Pukará-INIA, Ranger Russet, Ro-mano, Rosara, Shepody y Yagana-INIA. Éstas sepueden distinguir totalmente con los partidoresSTM1020, STM2013 y STM1052 (Mathias et al.,2004). Recientemente, seis de los mejores SSRsque se caracterizaron en este estudio se evaluaronpara identificación varietal en grupo de 80 geno-

tipos que corresponden a todos los cultivares depapa de la Lista de Variedades Descritas Oficial-mente del SAG del año 2004, pudiéndose diferen-ciar e identificar el 100% de las variedades anali-zadas (Manuscrito en preparación). Estos resulta-dos y los obtenidos en otros laboratorios (Noreroet al., 2003; Coombs et al., 2004) de identifica-ción de cultivares mediante marcadores SSR, de-muestran que ésta es una herramienta que puedeimpactar positivamente la comercialización desemilla certificada, tanto en los programas decertificación como para la protección de los de-rechos del obtentor.

CONCLUSIONES

Los resultados de la evaluación de marcadores mi-crosatélites como herramienta de identificación degenotipos de papa, permitió seleccionar un grupo

Figura 3. Perfiles de ADN para un grupo de variedades y materiales avanzados de papa utilizando SSRs encondición de pseudos múltiplex (STM1016/STM1104/STGBSS).

Figure 3. DNA profile for a group of potato varieties and advanced materials using pseudo multiplex SSRs(STM1016/STM1104/STGBSS).


de marcadores SSR altamente informativos parafacilitar la conservación y manejo del germoplas-ma de papa del programa de mejoramiento genéti-co de papa de INIA-Remehue.

Se recomienda para identificación de genotipos depapa, el uso de los marcadores STM1020, STM2013y STM1052, por su alta capacidad de discrimina-ción, facilidad de lectura e interpretación y por laposibilidad de ser utilizados en condición de pseu-dos-múltiplex.

El desarrollo de protocolos que utilicen marcado-res multi-loci, PCR-múltiplex y/o PCR pseudos-múltiplex, junto con la aplicación de métodos deextracción de ADN más simples y rápidos, aumen-tan la factibilidad de uso de este tipo de tecnología

para la conservación y manejo de germoplasma depapa, ya que disminuyen ostensiblemente el tiem-po y costo de los análisis.

En comparación con los marcadores morfo-agro-nómicos, los marcadores SSR presentan grandesventajas para la identificación de cultivares depapa, y su utilización podría fortalecer los siste-mas de producción y comercialización de semillade papa.

RECONOCIMIENTO

Este trabajo fue desarrollado gracias el apoyo fi-nanciero de la Fundación para la Innovación Agra-ria, Proyecto FIA-BIOT-01-A-015.

LITERATURA CITADA

Anderson, J.A., G.A. Churchill, J.E. Autroque, S.D.Tanksley, and M.E. Swells. 1993. Optimizing selec-tion for plant linkage map. Genome 36:181-186.

Ashkenazi, V., E. Chani, U. Lavi, D. Levy, J. Hillel, andE. Veilleux. 2001. Development of microsatellitemarkers in potato and their use in phylogenetic andfingerprinting analyses. Genome 44:50-62.

Becerra, V.M., A. Paredes, A. Romero, y L. Lavin. 2001.Diversidad bioquímica y molecular en frutillas chile-nas (Fragaria chiloensis L. Duch.) y su implicanciaen el mejoramiento de la especie. Agric. Téc. (Chile)61:413-428.

CIP. 2004. Taller de análisis SSR en papa y desarrollo debases de datos. 25-29 de octubre 2004. Lima, Perú.Annual Report 2004. Centro Internacional de la Papa(CIP), Lima, Perú.

Coombs, J.J, L.M. Frank, and D. S. Douches. 2004. Anapplied fingerprinting system for cultivated potatousing simple sequence repeats. Am. J. Potato Res.81:243-250.

Fulton, T.M., J. Chunwongse, and S.D. Tanksley. 1995.Microprep protocol for extraction of DNA from to-mato and other herbaceous plants. Plant Mol. Biol.Report 13:207-209.

Ghislain, M., F. Rodriguez, J. Núñez, P. Naik, Z. Hua-mán, and M. Bonierbale. 2001a. Comparison of ge-netic diversity of potato varieties from India and SouthAmerica. Poster presented at Plant and Animal Ge-nome, San Diego, California, USA. January 13-17.Available at http://www.cipotato.org Accessed 27September 2004.

Ghislain, M., F. Rodriguez, F. Villamon, J. Núñez, R.Waugh, and M. Bonierbale. 2001b. Establishment ofmicrosatellite assays for potato genetic identification.p. 167-174. In International Potato Center (CIP),Scientist and farmer: Partners in research for the 21stcentury. Program Report, 1999-2000. Lima, Peru.

Ghislain, M., D.M. Spooner, F. Rodriguez, F. Villamón,J. Núñez, C. Vásquez, et al. 2004. Selection of highlyinformative and user-friendly microsatellites (SSRs)for genotyping of cultivated potato. Theor. Appl. Ge-net. 108:881-890.

Hinrichsen, P., C. Amigo, R. Alvarado, y C. Muñoz. 1996.Identificación de variedades chilenas de arroz (Ory-

za sativa L.). Evaluación del uso de perfiles protei-cos y de fragmentos polimórficos de ADN amplifica-dos al azar (RAPD). Agric. Téc. (Chile) 56:1-10.

Kawchuck, L.M., D.R. Lynch, J. Thomas, B. Penner, D.Sillito, and F. Kulcsar. 1996. Characterization of So-

lanum tuberosum simple sequence repeats and appli-cation to potato cultivar identification. Am. Potato J.73:325-335.

Kruglyak, S., R.T. Durrett, M.D. Schug, and C.F. Aqua-dro. 1998. Equilibrium distributions of microsatelliterepeat length resulting from a balance between slip-page events and points mutations. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95:10774-10778.

Liu, B.H. 1998. Statistical genomics: linkage, mappingand QTL analysis. 611 p. CRC Press, Boca Raton,Florida, USA.


Mathias, M., B. Sagredo, y J. Kalazich. 2004. Identifica-ción de cultivares de papa a través de marcadores SSRen Chile. p. 92. XXI Congreso de la Asociación Lati-noamericana de la Papa (ALAP), Valdivia, Chile. 7-12 marzo de 2004. Asociación Latinoamericana de laPapa, Valdivia, Chile.

Milbourne, D., R.C. Meyer, A.J. Collins, L.D. Ramsay,C. Gebhardt, and R. Waugh. 1998. Isolation, charac-terization and mapping of simple sequence repeatsloci in potato. Molecular Genetics 259:233-245.

Morales, L. 2002. Caracterización genotípica de plantasde maíz (Zea mays) utilizando secuencias microsaté-lites distribuidas uniformemente sobre el genoma.Tesis Licenciado en Ciencias Biológicas. 34 p. Uni-versidad de Belgrano, Facultad de Ciencias Exactasy Naturales, Buenos Aires, Argentina.

Narvaez, C. 1998. Uso de marcadores moleculares parala identificación de variedades de vid (RAPD, AFLP,SSR). 59 p. Tesis Bioquímico. Universidad de Chile,Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, San-tiago, Chile.

Narvaez, C., H. Castro, J. Valenzuela, y P. Hinrichsen.2001. Patrones genéticos de los cultivares de videsde vinificación más comúnmente usados en Chilebasados en marcadores de microsatélites. Agric. Téc.(Chile) 61:249-261.

Norero, N., M. Huarte, y S. Feingold. 2003. Potente he-rramienta para la identificación de cultivares de papa.Presentado como poster al V Simposio de RecursosGenéticos para América Latina y el Caribe, Mar delPlata, 10 a 14 noviembre 2003. Disponible en http://www.inta.gov.ar Leído el 15 de octubre de 2004.

Ortiz, J.M., I. Aguinagalde, y J.P. Martín. 2000. Identifi-cación varietal. p. 515-560. In F. Nuez y J. M. Carri-llo (eds.). Los marcadores genéticos en la mejora ve-getal. Editorial de la UVP, Valencia, España.

Paredes, M., V. Becerra, R. Avilés, C. Rojo, C. Balocchi,J. Zapata, y F. Dropelmann. 2004. Desarrollo e im-plementación de herramientas moleculares para lacaracterización de material genético forestal, proyectoFDI-CORFO, 2001-2004. Disponible en http://www.inia.cl Leído el 20 de julio de 2004.

Paris, M., and M. Carter. 2000. Cereal DNA: A rapid High-Throughput extraction method for marker assistedselection. Plant Mol. Biol. Reptr. 18:357-360.

Perazzo, G., A. Panta, F. Rodriguez, R. Gomez, J. Tole-do, Z. Huaman, et al. 2001. Clonal true to type verifi-cation of potato accessions retrieved from in vitro

conservation and cryopreservation. p. 175-183. In

Scientist and farmer: Partners in research for the 21stcentury. Program Report, 1999-2000. InternationalPotato Center (CIP), Lima (Peru).

Promega. 2004. Technical manual: Silver sequence DNAsequencing system. Instructions for use of productsQ4130 and Q4131. Available at http://www.promega.com Accessed 12 January 2004.

Provan, J., W. Powell, and R. Waugh. 1996. Microsate-llite analysis of relationships within cultivated potato(Solanum tuberosum). Theor. Appl. Genet. 92:1078-1084.

Riegel, R., R. Pérez, M. Mathias, y A. Contreras. 2004.Diversidad y relaciones genéticas en papas nativassilvestres y cultivadas en Chile. p. 54. XXI Congresode la Asociación Latinoamericana de la Papa (ALAP),Valdivia, Chile. 7-12 de marzo 2004. Asociación La-tinoamericana de la Papa, Valdivia, Chile.

SAG. 2005. Servicio Agrícola y Ganadero: certificaciónde semillas agrícolas. Disponible en http://www.sag.clLeído el 20 de abril de 2004.

Sagredo, B., M. Mathias, y J. Kalazich. 2004. Identifica-ción varietal de papa mediante marcadores SSR enmúltiplex y pseudos-múltiplex. p. 161. 55º CongresoAgronómico de Chile y 5º Congreso de la SociedadChilena de Fruticultura, Valdivia, Chile. 19-22 denoviembre 2004. Sociedad Agronómica de Chile ySociedad Chilena de Fruticultura, Valdivia, Chile.

Sambrook, J., and D. Russell. 2001. Molecular cloning:A laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor La-boratory Press, New York, USA.

Schneider, K., and D. Douches. 1997. Assessment of PCR-based sequence repeats to fingerprint North Ameri-can potato cultivars. Am. Potato J. 74:149-160.

Sneath, P.H.A., and R.R. Sokal. 1973. Numerical taxo-nomy. 573 p. Freeman, San Francisco, California,USA.

Tessier, C., J. David, P. This, J.M. Boursiquot, and A.Charrier. 1999. Optimization of the choice of mole-cular markers for varietal identification in Vitis vini-

fera L. Theor. Appl. Genet. 98:171-177.UPOV. 2001. International Union for the Protection of

New Varieties of Plants-UPOV. Available at http://www.upov.int/en/about/upov_system.htm Accessed6 May 2004.

Veilleux., R.E., L.Y. Shen, and M.M. Paz. 1995. Analy-sis of the genetic composition of anther derived pota-to by randomly amplified polymorphic DNA and sim-ple sequence repeats. Genome 38:1153-1162.

Zerené, M., D. Granger, D. Prehn, y P. Hinrichsen. 2000.Secuencias de microsatélites asociadas a genes deproteínas de reserva en variedades chilenas de trigoharinero: descripción y posible uso como marcado-res moleculares. Agric. Téc. (Chile) 60:14-31.

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