virologia guia de tp

8/7/2019 Virologia Guia de TP

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I--ZUJ

G U I A DE

TRABAJOS

PRAcT ICOS

Nov. 2006: corte de 10Av. San Marl in en rechozo a 10ocrecr loclon de 10conero de vetennorlo Q 10 CoNfeAU

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GUIA DE TRABA.JOS PRACTICOSD~:

VIROLOGIA

AREA DE VIROLOGIA

FCV,UBA2000

Marcelo GonzalezPablo MurciaLuis JaureguiGustavo Delhon

Pdgina

Esterilidad y desinfeccion " iInactivacion de virus ." 3Bioseguridad 0< 4Cultivo de tejidos " 8Aislamiento primario viral., 20Instrucciones para TP: aislamiento 23Cuantificacion de virus 25Ejercicios 28lnstrucciones para TP: Titulacion 28Microscopia electronica 29La reaccion de polim erasa en cadena (PCR) .36



ESTERILIDAD Y DESINFECCI()N. BIOSEGURIDAD EN ELLABORATORIO DE VIROLOGIA.

ESTEllJLIDi\ny nEsINFECCI()N

Introduccibn

En el trabajo con microorganismos cs fundamental asegurarnos que los materiales autilizar no contengan otros germenes que puedan interferir con los que n030tr05 usaremos;tambien, una vez concluido el trabajo es importante eliminar toda posible contaminacion delmedioambiente y las personas. La eliminacion de los microorganismos puede conseguirse pormedics fisicos y quimicos, Nos referimos a esterilizacion como el ernpleo de medics fisicos 0quimicos para eliminar la !91~lti~taq de los microorganisrnos viables en un materialdeterminado, mientras que con desinfeccion nos referimo s al ernpleo de agentes quimicosgerrnicidas con la finalidad de destruir la infectividad potencial de un material determinado (1 0que no irnplica necesariamente 1a eliminacion de todos los microorganismos viables),Hablamos de asepsia a1 refenrnos a todas aquellas maniobras tendientes a evitar la llegada demicroorganismos (limpieza de mesadas, uso de guantes y barbijo, guardapolvo, etc ...); y nosreferimos a antisepsia como al conjunto de procedimientos que tienen por objeto destruir 0

eliminar los agentes contaminantes, Las sustancias que destruyen gerrnenes se denominangermicides, y dentro de estas, las que destruyen virus son viricidas. En algunos medics decultivo celulares se utilizan antibioticos para evitar la proliferacion de bacterias.

Prcparacion dd material a csterilizar

EI material a esterilizar debe ser acondicionado adecuadamente para no obstaculizar elprocedimiento y evitar la posterior contaminacion,

Los elementos a esterilizar deben estar perfectamente lavados, enjuagados (20enjuagues con agua corriente, 10 con agua destilada y 5 con agua bidestilada) y secos.

Las prendas de vestir se podran envolver en doble papel madera 0 acondicionar entambores de acero inoxidable para autoclave. Las botellas, vacias 0 con soluciones, llevaran ,sus tapas desenroscadas a medias para permitir el ingreso del vapor en su interior; a losfrascos sin tapa y las probetas se les obturara laboca con papel aluminio y luego con papelmadera. Las pipetas podran envolverse en forma individual con papel madera 0 ubicarse enpipeteros de aluminio, Los tubos de centrffuga y las pipetas pasteur se disponen enpaquetes de papel madera. Los filtros para medios de cultivo se esterilizan ya arrnados, consus bocas cubiertas con papel clealuminio y envueltos en doble papel madera.

Todos los materiales deben llevar escrita la fecha de esterilizacion en el envoltorio.MModos de esterilizaci6n

Como mencionamos anteriormente los metodos de esterilizacion se pueden dividir enfisicos y quimicos, aunque estos ultimos suelen clasificarse como desinfectantes.

Metodos Fisicos ...:. Calor.

Este es el metodo de eleccion para esterilizar todos los materiales que no sonafectados por el. La mayoria de las bacterias patcgenas son destruidas en pecos minutos a 50-70°C Y muchas de las esporas 1 0 son a lOOae, pero para la esterilizacion es necesaria una

temperatura mayor, que puede alcanzarse por dos metodos: calor seco en estufas deesterilizacion, 0 calor humedo en autoclave. El autoclaveactua como una granolla a presionque alcanza, en su interior una presion de 1 atmosfera por encima de la atmosferica, llegando

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la temperatura a 121°C, si se mantiene durante 15 :J 20 minutes se produce la destruccion detodos los microorganismos y sus formas vcgetativas. La estufa de esterilizacion , en carnbio,debe mantener una temperatura de 160'{: por 2 horas para tenet' el mismo resultado, y esmasperjudicial para el material a esterilizar. El vapor de agua a J 21 tiene un poder depenetracion mayor que el aire caliente a 160°C~ Otros metodos que utilizan el calor son: fa

pasteurizacion, fa ebullicion y fa incineracion. El mecanisme de accion d el c alo r como agentede esterilizacion se basa en la desnaturalizacion de proteinas, que se incrementa con el vaporde agua ya que los puentes de hidrogeno de ellas son destruidos con mas facilidad si puedenSCl: reemplazados con molecules de agua.~:~Frio,

La congelacion sc puede utilizar para destruir algunos microorganismos,sobretodo si sc realiza en forma repetida, pcro la mayoria de los virus son resistentes. 1J friosuele utilizarse como metodo de conservacion de virus y bacterias en freezer (-20 6 ···gtY')0 ennitrogeno liquido (-180°C) .e:. Radiacion,

Las radiaciones de longitud de onda corta son eficaces para la esterilizacion demateriales que no soportan el calor extrerno. La luz tTV de 270 nm es arnpliamente utilizadapara esterilizar superficies y amhientes, fundamentalmente. Tambien se utilizan otrasradiaciones como rayos X y rayos gamma en menor proporcion. La accion de lasradiaciones ionizantes sc basa en las lesiones que producen en el ADN de losmicroorganismos, que impiden su replicacion .•:. Filt radon.

Este metodo se utiliza para esterilizar soluciones que no toleran altastemperatures (Ej: medios de cultivo), Para ello se utilizan filtros de diferentes materiales(porcelana, cristal conglomerado. nitrocelulosa), y diametro de poro variable. Para medios decultivo, el uso defiltros de diametro de poro de 0.2 urn es el mas usado para excluir lasbacterias.

Desinfedantes

Los desinfectantes son sustancias que tienen una rapida accron gerrnicida a bajaconcentracion, La potencia de desinfeccion depende de la concentracion y la temperatura,adernas del pH. Se agrupan aqui los agentes quimicos mas comunmente utilizados paradesinfeccion.

Metodos Quimicos .•:. Halogenos"

I] yodo se une las proteinas en forma irreversible y aetna como agenteoxidante, La tintura de yodo es una solucion alcoholica, bactericida de accion rapida, Alcornbinarse con detergentes forma los llamados yodoforos utiles para el lavado y desinfeccionde superficies cutaneas. EI cloro se utiliza fundamentalmcnte en forma de hipoclorito desodio (agua lavandina) para la limpieza de superficies, pisos, etc.". Se inactiva en presenciade materia organica, y por ello las superficies a tratar deben estar limpias,..:~ Agentes alquilantes,

Estes agentes actuan sobre proteinas y acidos nucleicos. EI formaklehido 0

formul puede utilizarse en solucion acuosa al 4% 0 en forma de gas, Las reacciones quimicasque produce son parcial mente reversibles. PI oxide de etileno es un gas que constituye elmetoda mas adecuado para la desinfeccion gaseosa de superficies secas. Tiene como

desventaja su toxicidad para el hombre. Se utiliza para la csterilizacion de objetos sensibles alcalor. Las reacciones quimicas que produce son irreversibles.

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.:. Agentes tensioactivos.Tambien llamados detergentes sinteticos, producen alteraciones en la

membrana celular de los gerrnenes y las envolturas virales, dando lugar a la liberacion demetabolites y a un aumento de Ia susceptibilidad al medio externo. Los mas actives son losdetergentes cationicos y, dentro de estos, los amonios cuaternarios (cloruro de benzalconio,cloruro de lapirio). Estos compuestos son arnpliarnente utilizados para L aantisepsia cutanea .•:. Alcoholes .E1mas utilizado es e1 etanol por su capacidad de desnaturalizar las proteinas de la membranabacteriana. La concentracion a la cual su actividad germicida es maxima, es al 70% en agua,

Tabla 1: Datos de interes para algunos desinfectantes usuales,

Agente Tiempo de eontacto Corrosive Inactivado por Irritante de las Toxleospara virus Iiptdieos materia organica mucosas

Amonios 10 minutos Si S' S{1

cuaternariosHipocloritos 10 minutes S1 Sf S{Yodoforos 10 minutes S ' Sf Sf Si, 1

Alcohol 10 minutos Sf Si 81 S fetilico ,

Forrnol 10 minutos S f S{

Inactivacion de virus

a) Definicion.

Cuando hablamos de virus no podemos emplear el termino muerte ya que las particulasvirales son incapaces de autoabastecerse energeticamente. Por ella utilizamos el terminoinactivacion que equivale a la muerte en los organismos vivos; y se refiere a la perdidapermanente de infectividad.

b) Usos,La inactivacion puede realizarse para esterilizar un material 0 para otros procesos en los

cuales sea necesario preservar determinados componentes virales (antigenos para larealizacion de vacunas, etc ... ) Por ella es importante determinar el grado de inactivacion aobtener y sus consecuencias sobre los distintos cornponentes del virion. La capacidad deinactivacion de un agente fisico 0 quimico esta en relacion con la dosis (tiempo X

concentracion 0 intensidad), y las condiciones en que es usado (temperatura, plI, tiempo,etc ..).

c) Agentes.Los agentes inactivantes pueden clasificarse de acuerdo a su mecanismo de accion en:

nucleotropicos, proteotropicos, lipotropicos y universales.6 :.Nueleetropicos: actuan sobre los acidos nucleicos. Ej: luz UV de 260 run de longitud de

onda, formol, acido nitroso, hidroxilamina, elementos radiactivos incorporados al acido

nuc1eico (p32, H3 ).~:. Proteotropicos: actuan sobre las proteinas. Ej: luz UV de 235 nm de'lorig. de onda, calor,

enzirnas proteoliticas, pH ligeramente acido, detergentes,

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*:~Lipotropicos; actuan sobre los lipidos, principalmente en VlJUS con envoltura: Ej:enzimas lipoliticas, detergentes.

~:.. Universales: son agentes no selectivos. Ej: rayos X, sustancias alquilantes, accionfotodinamica.

Propiedades de algunos agentes inactivantes,@ Calor, Su €leci6n se produce, fundamentalrnente pOl' desnaturalizacion de las proteinas de

la capside. La sensibilidad de los virus al calor es variable..LllZ UV (260 nm). La accion principal es sobre los acidos nucleicos, induciendo

mutaciones. Estas lesiones pueden ser reparadas por rnecauismos enzimaticos celulares.Adernas, los rayos UV son absorbidos por muchas sustancias bin logicas pew noatraviesan medios opacos, Todo clio les rcsta utilidad, salvo en el caso de superficieslibres.

tt Formol. Actua reaccionando con los grupos amino de las proteinas y con los acidosnucleicos de simple cadena, cuando es utilizado al 03%,

6> Oxido de etileno, Es un agente alquilante, como cl acido nitro so y la hidroxilamina.

Ejerce Btl accion sobre cualquier tipo de virus, actuando sobre los acidos nucleicos y

tambien sobre las proteinas.e Eter. Disuelve los llpidos y, por 1 0 tanto actua sobre los virus envueltos, a una

concentracion del 3 al 10%. No tiene efecto sobre virus no envueltos.• Enzimas. Proteasas (tripsina, pronasa) y/o lipasas (fosfolipasa A, C). Algunos virus

resistentes a las proteasas se hacen sensibles luego de la exposici6n a lipasas, Ciertosenterovirus son resistentes ala accion de las enzimas.

e Radiaciones ionizantes. Rayos X, rayos gamma, etc .. ejercen su accion sobre los acidosnucleicos.

BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE VIROLOGIA

Introduccion

La Bioseguridad comprende todas aquellas norrnas, metodologias y

procedimientos tendientes a evitar la adquisicion de infecciones, en eI laboratorio, por partede los sores humanos que alli trabajan; 0 en la comunidad donde este se encuentra. Este temasuele ser pasado por alto en rnuchos casos y es alli cuando el error humano, las practicasincorrectas de laboratorio y el emplco inapropiado del material, provocan la mayor parte delos accidentes infecciosos que se producen en el laboratorio.

POI' ello es fundamental que un servicio de laboratorio aplique un plan de

seguridad, y que todo el personal este informado de su existcncia y conozca las razones porlas que debe pro ceder de la manera indicada. Tan importante como lograr su efectivaimplementacion es conseguir Lacontinuidad en su utilizacion.

Vias de contagiQ

Trabajar con virus patogenos para el ser humane conlleva el riesgo de adquiririnfecciones de laboratorio. Numerosas situaciones vividas por el personal de salud 1 0 exponenal contagio de distintos agentes patogenos. Enumeraremos a continuacion, algunas de las viasde contagio mas frecuentes que pueden ocurrir en el laboratorio:• Autoinoculacion accidental debida a puncion 0 cortes con agujas, pipetas, bisturies u otros

elementos punzantes.

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* Exposicion de la piel 0 mucosas a fluidos biologicos contaminados; especialmente cuandoIn pcrrneabilidad de las mismas se encuentra alterada por heridas, escoriaciones, eczemas,herpes, conjuntivitis 0 quemaduras.

4; Inhalacion de aerosoles producidos al agitar muestras, a] destapar tubes, al expulsar laultima gota de una pipeta, durante In centritugacion, especialmcnte cuando se usan tubosabiertos 0 con mayor volurnen del aconsejado por el fabricante en una centrifuga deAngulo fijo 0 cuando esta es frenada ahruptamente para ganar tiernpo.

• Salpicaduras en los ojos.• Aspiracion bucal pm falta de proteccion al "pipetear' muestras infecciosas.

Grupos de riesgo

Tanto los virus como otros agentes infecciosos pueden clasificarse en cuatrogrupos dependiendo del peligro que significan para los trabajadores del laboratorio. Deacuerdo al peligro que entraiian los microorganismos infectantes se clasifican en grupos de

riesgo 0 nivel de contaminacion 1, II, III Y IV .•!* Grupa de riesgo 0 Nivel de contaminacion I (escaso 0 nulo riesgo individual y

comunitario)

r~\1i.~~E~..:..(.).'.E.g~.1 .!. . • . ._ .i ~ I11(.~s .:_ .q~~~~ ..i._.fi..~il.!rl ..C .:ttt_~_ p_r( . ?Y._ ( . ){ l~l_~.._.~_~l.!f~.~l-me_d...ac..i ( . ' :Sal!\I.n~'!r~_o.._..s 0 ~.1.1l~1<1 .I.e .:~ _ . .- - . . - . .I.~,:j:_'!iru~q~lc at~ 0~ :1__~~g;~t~}~.s_,_~~lcte~i?J~1~~)S2~!~_~ .__.__________.. ....__.~ .._.. ._._ _._j$ :.Grupo de riesge 0 Nivel de contaminacien II (riesgo individual moderado, riesgo

comunitario bajo)Agente patogeno que puede provo car enferrnedades a humanos 0 animales, perc que tienepocas probabilidades de entrafiar un riesgo grave para el personal de laboratorio, 1acomunidad, el ganado 0 el medio ambiente. La exposicion dentro del laboratorio puedeprovocar una infeccion grave, pero se dispone de medidas adecuadas para el tratamiento y la

prevencion, por clio el riesgo de propagacion es limitado.E]: Adenovirus, Coronavirus, Hepatitis A-G, Influenza A-c' Rabia, Rotavirus, etc".:. Grupo de riesgo 0 Nivel de contaminaclon In (riesgo individual elevado, nesgo

comunitario bajo)Agente patogeno que puede provocar enfcrrnedades graves a humanos 0 animales, pero quehabitualmente no se propaga entre individuos (baja contagiosidad), Se dispone de medidaseficaces de tratamiento y de prevencion.Ej: Hantavirus, Virus Junin, Encef. Eq. Venezolana, Fiebre Amarilla, Louping Ill, etc ....:. Grupo de riesgo 0 Nivel de contaminacion IV (elevado riesgo individual y cornunitario)Agente patogeno que suele provocar enferrnedades graves en las personas 0 en los animates yque puede propagarse facilmente entre individuos, directs 0 indirectamente (altacontagiosidad). No suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y de prevencion,Ej: virus Ebola, HlV, virus de la peste pore ina, etc.

Tipos de laboratorio

Los laboratories pueden dividirse segun sus caracteristicas de disefio,construccion y medics de contencion, en tres tipos:..:. Laboratorio basico: comprende laboratories que trabajan con agentes de los niveles de

contaminacion I y II...:.. Laboratorio de contencion: esta instalado para trabajar con agentes del nivel III ...:.. Laboratorio de contencion maxima: esta concebido para trabajar con agentes

infecciosos del nivel IV.

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Los laboratories de contencion maxima tienen un mantenimiento muy costosoy existen solo en algunos paises,

Para patogenos transmitidos por via sanguinea, las precauciones de laboratoriodebieron ser dirigidas a] cuidado de la salud bajo el termino "Precauciones Universales". yestas deben ser observadas para todos los trabajos que se relacionan con el contacto de sangre

y fluidos corporales potencialmente infecciosos, sumach) a esto el nivel de bioscguridadapropiado del. laboratorio.

Un aspecto a tener en cuenta es que los riesgos atribuibles 1 1 ciertos agentesbiologicos varian segun los paises, que cualquicr medida de seguridad propuesta debeadaptarse a los recursos disponibles y que las necesidades del personal de laboratorio variansegun la formacion de ese personal y el trabajo al que este asignado,

§istemas de scgu ridad

CABINAS DE SEGURIDAD BIoriKHCAUno de los equipos de seguridad 1 1 1 < 1 8irnportante que posee un Iaboratorio de

virologia. es la cabina de seguridad biologica (.'88); este equipo perrnite el trabajo conagentes infecciosos impidiendo que escapen al medioambiente y tambien evitando sucontaminacion con agentes ambientalcsDe esta rnanera protege al material de investigacion,al operador y al ambiente. Tambien se denominan cabinas de flujo laminar, este puede serhorizontal 0 vertical. Podernos clasificar a las CSB en Clase 1, H YIlLCSH Clase I: Estos equipos proveen proteccion al operador ya que el flujo de aire penetra por

el frente yes filtrado antes de salir al exterior. Poseen frente abierto, ventilacion por presionnegativa y aire filtrado pOl' filtro HEPA (H igh Efficiencv Particulated Air).Este filtro detieneel paso del 99,97% de las particulas mayores a 0,3 urn. El inconveniente es que no proveeproteccion al producto, que puede contaminarse con agentes del medioarnbiente.eBB Clase II: Estes equipos proveen proteccion al operador y al producto, ya que el aire queentra pm el frente es filtrado antes de ingresar al area de trabajo. Este disefio tambien proveeproteccion contra contarninacion cruzada dentro de la cabina cuando se trabaja con variasmuestras, Poseen un dispositive de flujo laminar vertical, con aire recirculado y filtrado porfiltro lIEPA. Algunas poseen alarrnas opticas y acusticas, Perrniten cl trabajo con agentes delos grupos de ricsgo de nivel I, 2 y 3.CSB Clase UI:Estos equipos proveen la maxima seguridad para cl trabajo con agentesinfecciosos, Poseen un cierre herrnetico y la manipulacion de las muestras se realiza mediantela utilizacion de brazos de goma donde el operador introduce los suyos. Se puede utilizar paratabajar con agentes del grupo de riesgo de nivel 4, 0 tambien de nivel 3 cuando la muestra sepresenta en un aerosol con alto riesgo de dispersion.

Estes equipos deben poseer superficies de facil limpieza y resistentes a losdesinfectantes, es conveniente tambien que posean una fuente de luz UV para esterilizar susuperficie cuando no estan en uso,

Tabla 2. Sumario de niveles de seguridad recornendados para agentes infeccio sos.

"-"""---_ ---" . . . . . . . .~-. --_ .. _---

Nivel de Tipo de Laboratorio Practicas Equipo de seguridadContam, Recomendadas (Barreras Primarias)

,- "

Laboratorio Basico (Ej: P:ME No requeridot ensefianza basica) (autoclave es

recorne ndable )

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_WWWW_N --W _________ ~ __ ~

Laboratorio Basico cl esa y PME con u s a de eSB y eSB, DPP, usa de2 DPP (Ej: hospital primario) DPP. Acceso limitado. guantes y antiparras si

Manual d~_.~iosegurida~..:.._._ es necesario.- 1------- ----, -----

Laboratorio de Contencion Acceso limitado. -ademas

3 (Ej: Diagnostico especial) Descontam. de desechos. Mascaras confiltro deDescontam. de ropa. aire si es necesario.

Laboratorio de Contencion -ademas: -ademas4 maxima (Ej: Unidades Cambio de fopa y ducha Trajes con presion

patogenas peligrosas) en la entrada. posit iva.Salida para 1 21eliminacion Filtros de aire.especial de residuos.

P1v1E:Practicas Microbiologicas EstandareSB: Cabina de Seguridad Biologica.

DPP: Dispositivos de Proteccion Personal.(Extraido de "Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories" Richmond, JW)

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La diversidad de actividades desarrolladas en un laborarorio. hace necesanodelirnitar Areas de trabajo con distinto nivel de riesgo de infeccion. Estas se adecuaran al tipode material con que se trabaje, las tecnicas que se realicen y las muestras que se procesen.

L Areas de bajo riesgo: Sedan aquellas en las que el personal no esta mayorrnenteexpuesto. Ej: adrninistracion, archive, etc

2. .Areas de mediano riesgo: Representadas por la zona de recepcion de rnuestras. lavado dematerial, atencion de pacientes, etc..

3. Areas de alto riesgo: Dentro de este grupo estanan las zonas de extraccion de rnuestras,proccsamiento y control.

Estas areas seran determinadas por el inspector de bioseguridad y el comite, deacuerdo al espacio disponible y la conveniencia de lugar en cada caso.

Seguridad en la tom:! y remisiol1 de mucstl'as

Normas de seguridad a tener en cuenta pam la toma de muestras infecciosas:

EO El operador que obtiene la muestra debe tencr las manes lavadas, protegidas con guantes,cabellos recogidos y usar ropa protectora si es necesario.

e Las agujas, lancetas y jeringas scrim descartables y se desecharan en recipientes adecuados.Recordar que el mayor numero de accidentes por punciones se produce al querer retirar lasagujas de las jeringas 0 al intentar taparlas con su capuchon plastico.

EO Para la obtencion de las muestras se debe contar con recipientes adecuados, Los tubas 0

frascos de vidrio deben ser de pared gruesa, con cierre herrnetico a rosca 0 tapon de g0111a.Se deben encintar los tapones para transportar adistancia.

• Todo material de obtencion debe ser rotulado ANTES de la extraccion 0 recoleccion de lasmuestras,

e El operador se debera lavar las manos luego de quitarse los guantes al finalizar Ia toma demuestras y proceder a desinfectar las superficies de trabajo y el recipiente de obtencion (encaso de que haya habido derrames) con agua lavandina a15%.

Normas de seguridad a tener en cuenta para la remision de muestras infeeciosas:

e Todas las muestras seran rotuladas con los datos de origen (paciente, laboratorio, hospital,etc .. ), tipo de muestra (suero, liquidos de puncion, tejidos, cultivos, cadaver, etc .. ), mediode conservacion (para virologla: glicerina, fifo), diagnostico presuntivo y destino,

@ Toda persona que efectue el transporte de materiales biologicos dentro 0 fuera de lainstitucion debera conocer debera conocer los riesgos que ello implica.

IIJi En caso de derivar muestras fuera de la institucion se deberan tomar los recaudosnecesarios para proteger a la comunidad: La muestra herrneticamente cerrada se colocaraen bolsa de nylon con suficiente algodon como para absorber todo el liquido en caso derotura y derrame. Esta se introducira en un recipiente rigido e impermeable (se puedenutilizar sache de suero vacios). Y se agregara un sache refrigerante en caso de que lamuestra asi 1 0 requiera.

@ Si la muestra debe ser enviada por correo 0 por transporte contratado, se debera curnplircon las normas internacionales existentes para tal efecto.

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Bibliogra(~

Balows, A. et ali Manual of Clinical Microbiology. 5 th American Society Ior Microbiology,Washington DC. 1993,Carter, GlL: Fundarnenros de Bacteriologia y Micologia Veterinaria. Ed. Acribia. Zaragoza.1989

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CyUivo de teiidos

Desde su introduccion en 1949. los cultivos de tejidos (C:1") imptimieron un avarice sinprecedentes en el conocimiento de la biologia de los viJUS animales.Dcsde el punto de vistapractico, los CT solucionaron el problema de Ia propagacion y cuantificacion de virus,

haciendolo independiente de 121inoculacion de anirnales. Actualmente, pueden SCI cultivadascelulas de anirnales, plantas e insectos, a escalas domesticas 0 industriales. permitiendo elcrecimiento de distintos tipos de virus .. ya sea para invcstigacion basica. diagnostico 0

produccion de vacunas. De heche, las tecnicas de CT se han erigido en un campo deespecialidad de desarrollo independiente, con aplicaciones en diversas areas de 1a Biologia.Muchos tipos celulares que no era posible cultivar en el pasado hoy son cultivadosrutinariamente. permitiendo examinar nuevas relaciones virus-celula, Estos avances sedebieron en gran parte al desarrollo paralelo de sofisticados medios de cultrvo y aldescubrirniento y purificacion de factores de crecimiento especificos de tipo celular. Asimisrno, se avanzo en la preservacion por congelamiento de las celulas, abaratando el costo desu produccion y manutencion,

Se deduce de 1 0 arriba expuesto que todo laboratorio de Virologia debe contar con unaseccion de cultivo de tejidos. La coordinacion entre esta seccion y aquella donde se rnanipulavirus debe ser celosamente controlada para evitar Ia infeccion accidental de los cult ivos 1 0cual estropearta cualquier interpretacion de los resultados.

Todo laboratorio de CT debe contar minimamente con: 1) fuente de agua de primeracalidad para la preparacion de medics de cultivo y el lavado del material de vidrio.Idealrnente, se debe contar con un deionizador capaz de producir agua con una conductividadno rnenor a 18 Mn/cm. 2) fuente de frio para Ia preservacion de stock de celulas (tanque de Nlfquido) y de suero (freezer de80C y20C), 3) estufa de CO 2 para el crecimiento celular,independiente de aquellas ernpleadas para propagar virus 4) flujo laminar exclusive paramantenimiento y pasaje de celulas, 5) autoclave para esterilizar el material de vidrio, 6) salade lavado de material, 7) filtros para la esterilizacion de medios de cultivo, 8) dispositivos deseguridad para el descarte de rnedios, material descartable, celulas y tejidos, EI buenfuncionarniento de un laboratorio de Virologia depende directamente del manejo de la secciondedicada a C'L

El medio extracelular consiste de la temperatura ambicnte, atmosfera, matriz y sustratode soporte, asi como de factores que participan de la interacion cclula-celula 0 celula-sustrato.En los ultimos 20 alios se ha trabajado mtensamente en la definicion de los requerimientoscelulares: se ha optirnizado los ingredientes y sus concentraciones, necesarios para lograr unmedic ideal de crecimiento; asi como estandarizaron los ranges de p11 y las necesidades deC02. La identificacion y sintesis de factores de crecimienro 0 adhesion perrnitieron Iacreacion de sistemas celulares libres de suero (serum-free media). Finalmente, el estudio delas interacciones celula-rnatriz, el uso de co-cultivos incluyendo el uso de celulasalimentadoras (feeder layers), 0 cultivos en mernbranas porosas sobre ambas caras, hanprovisto el conocirniento minimo para entender las interdependencias virus-celula.Desarrollados inicialrnente de forma ernpirica, los medics de cultivo (MC:) actuales tienen unacomposicion definida que per mite crecer las celulas con alta repetibilidad. Se disponeactualmente de catalogos comerciales con una vasta lista de medias que difieren en Sll

composicion de acuerdo al tipo celular empleado. As! par ejemplo, originalmente el medio

Glasgow-MEM fue formulado para celulas BHK-21; Ham 1'-12 fue disenado para clonarcelulas eHO; Medium 199, creado para soportar el crecimiento de fibroblastos de ernbrionde

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polio; 0 Te 100 fue desarrollado para crecer lineas celulares derivadas de insectos.Basicamente, los Me deben proveer de todos los nutrientes necesarios para el mantenimicnto':/ crecirniento celular Aunquc Ja diversidad de medics es grande, todos deben incluir: 1)fuente de C para la sintesis macromolecular y metabolismo (arninoacidos esenciales, azucares,

etc),vitaminas y trazas minerales, 2) un buffer capaz de controlar el pfl del medio, J) unindicador de pI!, generalmente una sustancia cuyo color cambia de acuerdo al pl-l, 4) unaforrnulacion tal que respete la osmolaridad fisiologica de las celulas, sobretodo a traves de Iacomposicion ionica, 5) una fuente de factores de crecimiento (generalmente suero sanguineo) ..De todos los elementos rnencionados, el suero es el menos predecible en cuanto a sucornposicion, pm 1 0 que muchos laboratories 1 0 reemplazan por factores de crecimiento y/odifercnciacion cuando el trabajo requiere 1adefinicion completa del medio.

Los medics definidos general mente vienen en polvo y se reconstituyen con agua deprirnera calidad. Se considera agua de calidad a Ja obtenida por deionizador, pDf destilacion uosmosis reversa, con nivcles de pirogeno por debajo 0.125 Ell (testeado por ensayo LAL),

con conductividad no menor a 18 MDIcm. Usualmente es necesario agregar at medio algunaminoacido limitante (por 1 0 general, glutamina), ademas de alguna sustancia buffer OT-COl',HEPES, TRIS)" Debemos recordar que parte del sistema buffer de los medics de cultivo esproporcionado por CO 2 liberado por el metabolisrno celular 0 bien por la estufa gaseada,Como varios de sus cornponentes son inact ivados pOl' las altas temperaturas, los medics seesterilizan mediante filtracion con mernbranas de 0.2 ~H11 de diametro de poro. Debe tenersesiempre en cuenta que la filtracion suck incremcntar entre 0.1 a (U el pll final post-filtracion.En muchos laboratories de cultivo, se emplea antibioticos de manera profilactica para evitarcontaminaciones de los cuitivos. Dichos antibioticos se incorporan a los medios previo a sufiltracion, y a una concentracion preestablecida. Un parrafo especial quisieramos incluirrespecto al uso profilactico de los antibioticos. Nunca dehe sustituirse una buena prdctica

aseptica de manipulacion de celulas, con un manto de antibioticos protectores. Serecomicnda el empleo de antibioticos cuando se realizan cultivos derivados de necropsias,biopsias, o de muestras clinicas para aislamiento virologjco. Los antibioticos mascornunmente ernpleados son Penici lina (10 5 UI/L) + Estreptornicina (100 mg/L), Gentamicina(50 mg/L), Anfotericina B (2.5 mg/L), Ampicilina (100 mg/L) 0 Ciprofloxacina 00 mg/L).Conviene asegurarse de la esterilidad del media sembrando medics para bacterias con elmedio filtrado. Una vez preparados los medics, se recomienda usarlos dentro de las 4-6semanas, pues la calidad del crccimiento celular depende de su "frescura". P O Tejemplo, laglutamina es uno de los elementos mas inestables, attn a 4°C, debiendose agregar nueva cada4 semanas. EI pH durante el almacenaje no deberia viral' por encima de 7.6 (con Rojo Fenol,se alcanza un color purpura >7.7), ya que esto induce la precipitacion de ciertos componentes,incluidos los fosfatos (claves para mantener el sistema buffer). Los medios no soportan ciclosde congelamiento y /descongelamiento, e incluso la exposicion a la luz puede original'problemas con oxidacion de vitaminas y cofactores.

Una vez que las celulas toman contacto con el medio de cultivo, 1 0 comienzan amodificar. En muchos cases, dicha modificacion es favorable para el metabolismo celular.Como los nutrientes invariablemente se agotan, el media debe reernplazarse periodicamentecon media fresco.

Muchos tipos celulares .requieren medios especiales. La variacion es tal que un medioque promueve Ia division en untipo celular, puede promover la diferenciacion (e incluso laapoptosis) en otro. Por todo ello, es recomenclable conocer las caracteristicas de cada tipocelular, Cuando se adquieren lineas celulares comerciales (ver abajo) es imperioso seguir las

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instrucciones para su rnantenimiento (tipo de medio, forma de pasaje, etc). Si no se respetanestas insrrucciones, las celulas comienzan a ser seleccionadas por las condiciones impuestaspO I el operador. Los cambios acumulados luego de un numero de pasajes pueden SCi 1 0suficienternente significativos como para modificar la linea original, haciendo cierto tipo deexperimentos irrepetibles.

Esencialmente, la mayoria de los medics de cultivo estan cornpletamente definidos,excepto por un cornponente: el suero. 1,05 sueros son una compleja solucion de albuminas,globulinas, prornotores del crecimiento e inhibidores del crecimiento. La cantidad y calidadde dichos cornponentes varia eon la edad, nutricion y salud de los animales dadores. Por estasrazones, y considerando que las llneas celulares requieren suero de una alta calidad paracrecer. el suero fetal 0 neonatal bovine son los: mas emplcados.

Practicarnente a todos los medics se Ies adiciona un porcentaje de suero (entre el 5 y

10%). Generalmente se cmplea suero fetal bovino 0 suero equine. La calidad del suero es uno

de los factores mas importantes en el exito de los CT. L,05 proveedores de sueros debencertificar la ausencia de endotoxinas (niveles «L2ngimL) 0 hernoglobina « 20 mg/iOO ml.) y

la sanidad y pais de origen de los animales dado res (para garantizar la ausencia de virusautoctonos y exoticos, asi como micoplasmas). Los distintos lotes de suero pueden variarsignificativamente en su capacidad para sostener el crecimiento celular, porto cual seaconseja probar distintos totes hasta encontrar cl mils apto para el sistema celular ernpleado.Para evaluar distintos totes o marcas de suero, se recornicndan las pruebas de eficiencia declonaje, eficiencia de plaqueo y la promocion de crecimiento.

Algunos laboratories producen su propio suero wando disponen de animates sanos,En estos casos sue len usarse novillos de un afio de edad a los cuales se les cxtrae sangremensualmente. La sangre se colecta en frascos Mariette, se espera que coagule y 5C centrifugaa 4C para separar el SUCfO. Este suero es lucgo tratado con polictilenglicol y filtrado para sueste rili zac ion .

Dado que el uso de suero irnplica incluir un elemento no completamente definido almedio de cultivo, y considerando el costo y las restricciones que el comercio de productos deorigen animal imponen al investigador, un gran enfasis se ha puesto en el desarrollo desistemas libres de suero (serum-free systems). EI rol del suero en los medics de cultivo esmultiple, siendo una Fuente de encrgia, aminoacidos, cofactores, vitarninas, horrnonas,promotores del crecimiento, factores de anclaje, incluso actuando como estabilizante ydetoxificante del ambiente de cultivo, amen de actuar como butler. Cada uno de estos rolespuede s cr de mayor 0 menor importancia dependiendo del tipo celular que nos interese. Unaalternativa para promover el crecimiento celular es rcemplazar cl suero con un set deprornotores especificos dependientes del tipo celular, hormonas, proteinas transportadoras yproteinas de anclaje, Asi por ejemplo, para lineas celulares derivadas de epitelios, el agregadode EGF (Epidermal Growth Factor) suple en gran medida el rol del suero como factor decrecimiento; 1 0 mismo sucede con NOF para neuronas. Otra alternativa es adaptar 1a lineacelular a menores concentraciones de SUCH) de manera gradual, hasta llegar a niveles mlnimoso nulos de suero en el sistema. Esta aproximacion cs tremendamente variable al tipo celular,pero muy exitosa por ejemplo para la adaptacion de mielomas a cultivos libres de suero.Finalmente, existen sustitutos cornerciales del suero que pueden ser agregados al cultivo,Ejemplos de estos complejos productos son HLI (sigma), CPSRl-5 (Sigma), Nutridoma(Boehringer), NuSerum (Collabotive Research).

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l.a mayoria de las celulas utilizadas para CT son celulas adherentes: requieren unasuperficie tal que les permita adherirse con relativa firmeza. La adhesion para esras celulas esun rcquerimiento para subsistir, aquellas

que tallanen

adherirse,mueren. IJI vidrio

(borosilicate) 0 cl plastico (poliestireno tratado con plasma gaseoso] son generalmente aptospara las celulas adherentes. Los de plastico son descartables, solo adrniten un uso, en tanto losde vidrio pueden ser reusados luego de un largo procedimiento de lavados y autoclavado,Existe una gran variedad de formatos de rec ipientes para crecer celulas: bote llas, rollers,"flasks", capsulas de Petri, placas de pocillos (0 "wells"), portaobjetos con camara, etc (fig.1). La eleccion de cada tipo depende de la naturaleza del trabajo: rollers para la produccionmasiva, flasks para trabajo rutinario, placas para cuantificacion de la infecciosidad, etc. Cadarecipiente posee una superficie de crecimiento diferente, ya modo ilustrativo se presenta estaescala.1. Flask: 25-150 cm2

2. Roller: 1.500 em'3. Roller modificados: espiral internePlacas internas

4. Tubos de vidrio empacados (glass tubing):5. Placas apiladas: 250,ClOOcnl6. Esferas de vidrio: 10.000 cnhL7. Microcarrier: 20.000 cnilL8. Microcarrier poroso: 100.000 cm 2/L

8.500 em'6.300 cm 2

340.000 em'

Los microcarriers son cuentas esfericas que son usadas para incrementar la superficiede crecirniento efectiva en un cultivo celular. Debido al gran incremento en la superficie

cultivable, los microcarriers scm cultivados en una suspension batida, y comunmenteperfundida con media fresco de manera continua para alcanzar altas densidades celulares. Detodas rnaneras, el sistema aim s610 sirve para celulas dependientes de anclaje, Las cuentaspueden estar hechas de una variedad de materiales, como ser dextran, vidrio 0 plasticomodificado. Como ventajas, podemos citar un import ante aumento en la superficie cultivabley una produccion biologica incrementada, Las principales desventajas son: las celulas puedeser dificiles de remover de las cuentas, la fuerza de agitacion puede dafiar celulas fragiles y serequiere perfusion 0 cambio frecuente del medio.

Si bien todos los sistemas de cultivos son considerados in vitro, el sistema que masrecuerda a algo in vivo es el uso de rnembranas porosas para anclaje de celulas, De este modo,las celulas pueden recibir nutrientes y sefiales intercelulares de ambos lados de la membrana,

y la capa celular presenta asi una superficie basal y apical, Una variedad de funcionesbiologicas pueden ser ahora estudiadas. como ser el transporte activo, diferenciacion celular, yco-cultivo de diferentes tipos celulares. El sistema es sencillo, y esta constituido por un anillocon una membrana adherido que puede colocarse dentro de una placa 0 multiwell. Lamembrana puede construirsc con poliestcr, esteres de celulosa 0 policarbonatos, y debetenerse muy en cuenta el tarnano y densidad de los pores. Sus ventajas son: los nutrientes sonaccesibles de ambos lados, cl transporte celular puede ser polar y es io similar a lacornpartimentalizacion in vivo Lamentablemente su costa es aun alto, y las membranas estandisponibles s610 en tamanos chicos,

Algunos tipos celulares no se adhieren bien a las superficies convencionales y

requieren superficies mas elaboradas. POl' ejemplo, las neuronas y otras celulas altamentediferenciadas requiererique el recipiente este cubierto par algun sustrato que aumente la

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adhesividad. El colageno, la laminina, la polilisina, etc son algunos de los sustratos queaumentan Ia adhesividad.

Finalmente, existen celulas no adhesivas que crecen naturalmente en suspension,como el caso de los linfocitos y ciertas lineas transformadas.

roller

Flaskscapsutas de petri

porta-objeto C<'Jncarnaras

placa multlwell

B.

.,

medto de

%s.~~~_-. - C~I~~~capa contluyante d e- celulas

sustrato plasfico

Figu.!IU: Recipientes utilizados en CT.

Mantenimie:nto de los CT

La gran mayoria de los CI' se incuban en estufas gaseadas con CO 2, EI porcentajc deCO 2 en la atmosfera de la cstufa es usualmcnte del 5%. Con esc porcentaje el pll del medio semantiene dentro de los rangos fisiologicos

C~7.2). La temperatura se mantiene a 37 C, aunque

CT derivados de especies euya temperatura fisiologica es mayor (e.g. aves) requieren mayortemperatura.

Tipos de eultivos celulares

Los cultivos mas populates utilizados en Virologta son: 1) cultivos primarios, 2)cultivos de linea.

Eigura 2. Monocapas confluyentes de celulas observadas en fresco. A) Fibroblastos humanos primaries. Noteseel aspecto fusiforme de las celulas, B) Linea epitelial HeLa. Las celulas Hel.a son celulas transformadas quetienden a crecer unas encima de otras luego de la confluencia.

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Un tipo menos popular y mas arcaico de cultivo son los explantos celulares. Porultimo, no siendo un tipo de cultivo relacionado directamente con la virologia, los hibridornas,constituyen una herramienta valiosisima en el estudio de virus a traves de las interaccionescon Ac rnonoclonaies. A continuacion trataremos muy superficialmente cada tipo de cultivo

celular.Los cultivos primarios (CP) se obtienen de tejidos de animales sanos. Por ejernplo, el

herpesvirus bovino 1 se propaga bien en cultivos de celulas provenientes de rifiori fetalbovine. [AIS tecnicas para la produccion de CP depende del tejido u organo a partir del cual seobtienen las celulas, pero en general se siguen los siguientes pasos (todo el material empleadodebe ser esterill): I} obtencion quirurgica aseptica del organo 0 tejido, 2) desmenuzado contijera en pequetios trows, 3) incubacion de los trocitos con una enzima que digiera el cementointercelular (tripsina, colagenasa, pronasa, etc), 4) inactivacion de la enzima por lavado 0 poragregado de inhibidores, 5) disgregacion rnecanica de los fragrnentos tisulares para laliberacion de las celulas individuales. Las celulas son resuspendidas con medio de cultivo consuero y contadas en una camara cuenta-globulos, Finalmente se siembra un volumen

apropiado de la suspension en el rccipiente adccuado, se agrega un volumen de medic, y secoloca el reeipiente en la estufa gaseada.

Cuando se siembra un recipiente, las celulas sc adhieren a Ia superficie del recipiente ycomienzan a dividirse, con una periodicidad (tiempo generacional) que depende del tipocelular. A medida que las celulas se dividcn, mas y mas superficie es ocupada por celulas,hasta que eventualmente toda la superficie del sustrato esta cubierta. En este memento,decimo s que las celulas alcanzaron confluencia (fig. 2). Las celulas confluyentes contactanunas con otras. El contacto intercelular funciona como un inhibidor del ciclo celulariinhibicion pot contactos y, por lo tanto, las celulas dejan de dividirse. En estas condicioneslas celulas pueden rnantenerse por elias o meses si se reernplaza el medio por uno frescopcriodicamente, Lo usual es que cuando las celulas confluyen, el operario realiza un pasaje.

El pasaje consiste en despegar las celulas (generalmente con una solucion de tripsina),resuspcnderlas en medio de cultivo y sembrarlas en nuevos recipientes, Dependicndo del tipode celulas, el contenido celular de un recipiente se pasa a 3 0 4 recipientes donde se volverana rcpetir los eventos descriptos anteriorrnente (adhesion, division y confluencia). Cuando seIra/a de ('1', el numero de pasajes es limitado ya que la frecuencia de division es cada vezmenor. Eventualmente, todas las celulas dejan de dividirse y entran en un estado quiescenteseguido de muerte celular (crisis). EI numero de pasajes adrnitidos antes de entrar en crisisdepende de la especie animal, de I periodo de desarrollo del tejido primario (fetal 0 adulto), ydel tipo de tejido, pero como referencia digamos que oscila entre 5 a 20. La entrada enquiescencia es inevitable en C~p ya que esta geneticamente determinada, y ningunamanipulacion del medio podra evitarla. Par 1 0 tanto, la utilidad de los CP viene limitada poreste fenorneno.

A pesar de este inconveniente practice, los Cl' tienen sus ventajas para trabajar convirus. Las celulas primarias derivan directamente de los tejidos del animal y pOI 1 0 tanto nohan acumulado lesiones geneticas y presentan en su estructura nativa la mayoria de losreceptores de superficie que permite la adsorcion viral. Para cierto tipo de trabajos (geneticade Virus), esta diferencia es fundamental. Por otro lado, muchos virus (como el herpesmencio nado en cultivos de rihon) crecen a titulos mas altos en CP que en lineas celulares,

Algunos trabajos en Viro logia requieren poblaciones homogeneas de celulas, en 1 0posible con un solo tipo celular, Los CP raramente ofrecen esta caracteristica ya que pordefinicion son poblaciones heterogeneas de celulas constituidas par tipos celularesfibroblasticos 0 epiteliales, incluso con diferentes tasas de replicacion,

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Los cultivos de linea derivan de C P o Con una baja frecuencia, unas pocas celulas delCP sufren lesiones geneticas que les otorgan una ventaja de crecimiento sobre el resto de lapoblacion. Estas celulas cornienzan entonces a predominar en el cultivo, Cuando estaslesiones bloquean 0 eluden los mecanismos naturales que llcvan a las celulas a volverscquiescentcs, decimos que Ia cclula se ha inmortalizado. La inmortalizacion es una

caracteristica de las celulas de linea que le s permite tolerar inurnerables pasajes antes desucumbir. Las celulas inmortales se diferencian de las celulas transformadas en que lasprirneras aun son sensibles a In inhibicion por contacro mientras que las segundas, indiferenresa este control, siguen dividiendose y creciendo en forma estratificada (fig. 2B). Se piensa quela inmortalizacion es un prerequisite para la transforrnacion. Las celulas transforrnadasademas guardan otras caracterfsticas: no rcquieren suero en el medio, dependen menos de [aadhesion al sustrato y originan tumores cuando se inoculan en aniruales.

Como en e1 caso de los CP, las lineas cclulares tienen ventajas y desvernajas. Por unlade, al ser celulas inmortales, perrniten pasajes innumerables, sin la necesidad de tenet querealizar cultivos primarios a partir del animal. Por el otro, la inmortalizacion implica cambiosgenomicos que afectan el crecimiento celular. Dado que los virus rnantienen una relacion

estrecha con las funciones celulares, aquellas modificaciones pueden tambien repercutir en lareplicacion viral. Mientras que las celulas primaries mantienen caractetisticas propias deltejido de! cual provienen, las celulas de linea tienden a perderlas. Para muchos virus, lascaracteristicas de diferenciacion de sus celulas target son imprescindibles para cumplir suciclo replicative.

En los cultivos de explantos, se trata de obtener una pequeiia porcion de un organo(por biopsia, 0 de necropsia), el cual se coloca bajo condiciones de cultivo estricramenteprotocolizadas. Una caracterfstica importante es que se mantiene la organizacion estructuraldel organo, se crea un microambiente propicio para rnantener un tipo celular 0 lograr que untipo celular secrete 0 incorpore deterrninadas sustancias. E:I cultivo de este tipo requiere degrandes concentraciones de suero (15-40%), un procesamiento minucioso (eliminacion decoagulos, tejido necrotico, etc.) pero rapido (debido a la anoxia tisular) y perfodosprolongados de incubacion (3-60 dias). Otra dificultad es que se necesita de lograr una firrneadhesion del explanto a la superficie de cultivo, por 1 0 que debe agregarse colageno alplastico, 0 trabajar con coagulos de plasma sanguineo para dar anclaje. Considerando todaslas dificultades mencionadas, y con la amplia disponibilidad de lineas celulares diploides yheteroploides, cl cultivo de explantos no es una practica nada popu tar.

No todos los virus crecen en CT Para estos cases, la inoculacion de animales delaboratorio 0 del.huesped natural es el unico recurso para su propagacion.

Senaracion de cclulas~~-.~.~.~~.~----.~-------.-~

Los procedimientos usados para aislar celulas de los tejidos fueron disefiados paramaximizar la cosecha de celulas funcionalmente viables y disociadas luego de la digestion. Ladisgregacion de los tejidos puede ser mccanica, enzimatica o conjugar ambas alternativas. Enlos cultivos primaries es imprescindible aplicar ambos principios de disociacion, reducicndolas biopsias 0 trozos de organos a pequeiios pedazos, para fuego digerirlos con enzimas. Entreestas ultimas, las de uso mas frecuente son la tripsina, colagenasa (tipos L 2 3 y 4), elastasa,hialuronidasa, papaina, deoxirribonucleasa L pronasa y dispasa. Otro agente que se empleacon cierta frecuencia es el EDTA, el cual se asocia con tripsina a una concentracion de 0.02%.

Entre las colagenasas, las tipo 3 y 2 son las mas utilizadas como agentes disociativos. Sinembargo, la enzima que se utiliza por excelencia en Ia disgregacion de cultivos de tejidos es 1a

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tripsina a concentraciones de 0.25% a 0,05%, Si es necesario una disgregacion gentil 0 suavedel cultivo, lasenzimas de eleccion son la pronasa y dispasa, Los poderes digestivos relativosde las enzimas son bastante diferentes, como se refleja en la siguiente escala:

r------' ~-~---------- -. ------~

[i;~,~tcm~nte di{!cstivo

tripsina

colagenasa tipo 2

colegenasa tipo 1colagenasasa tipo

colagenasa tipo 3

deoxirribonucleasa I

papainaelastasa

hialuronidasa

debilmente digcstivo

Adaptado de Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, Figure 3B: 1.1 (2000)

Dado que la mayorfa de las enzimas son muy labiles e inestables, conviene prepararsoluciones stock, alicuotar y freezar a~20°C, evitando los ciclos decongelacion/descongelacion, Todas las preparaciones enzimaticas deben ser filtradas pormembranas de 0.22 urn,

Ademas del metodo enzimatico de disociacion de celulas, tecnicas adicionales deseparacion de poblaciones celulares pueden ser necesarios, EI metoda mas sencillo yeconomico para separa celulas es 1 21sedimentacion diferencial, sin embargo demanda muchotiernpo y tiene una capacidad limitada de separacion (10 6_10 8 celulas). EI proceso deseparacion puede ser acelerado si se emplean gradientes de densidad conocida ernpleandosustancias como Percell () Fico ll sumado a la centrifugacion. De esta manera, las celulas se

separan de acuerdo a cu cociente de gravedad, y por ejernplo, subpoblaciories sanguineaspueden ser divididas. Finalmente, existen otros metodos que combinan Ac con separacionelectrica () magnetics. Ejemplo del primero es el I''ACS (fluorescent automated cell sorter),que utiliza Ac fluorescentes dirigido contra receptores celulares, las celulas fluorescentes sonexcitadas por un laser, y la pasar de a una pm vez entre dos placas con cargas opuestas, lascelulas marcadas son deflectadas hacia una de las placas y colectadas en gotas separadas. Esuna tecnica muy utilizada en laboratories de inmunologia, cuya principal desventaja es lalimitada capacidad de coleccion (log celulas), Una variantes del FACS son la cuentasmagneticas (Dynabeads), en la eual los Ae estan conjugados can compuestos ferricos, y alpasar a traves de un campo magnetico contenido en una columna, quedan adheridos almagneto. Luego se eluye la poblaci6n celular atrapada en la columna y 56 obtiene un

preparado de extrema pureza.

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!:\.lJt~?~.9.t;;..C:QmCnZC<ILcnt.ihiG.k~ '?}D~diQ.$ . .dQ...., " :~ l J t..iYQ3.,Y_PIJSJ!_J~!.1c:nIPc:I[!tHnL{I~Ln_cubacion~

Partiendo de: un flask -1"25con monocapa de confluencia conocida, realice:1. Descarte mediante pipeteo el medio de cultivo, en fiasco a serdesinfectado.2. Agrcgue 2-:-; m l de PBS 1X esteril3. Lave toda la superficie celular mediante movimientos orbitales, EI objetivo es eliminar

todo resto de suero del medio. Descarte elPBS mediante pipeteo,4. Repita los pasos 2 y 3 al menos dOH veces.5. Adicione I -2 ml de un agente disociativo enzimatico (normalmente Tripsina +

ED'rA).6. Embeba toda Ia monocapa con movirnientos circulares durante unos 30-60 segundos.

Asegurese que toda la monocapa rue embebida.7. Descarte el agente disociativo mediante pipeteo, y rcpita los pasos 5 y 6. Descarte.

8. Incube a nQe durante 2--10 minutes. Observe de manera frecuente hasta que lamonocapa adquiere un tono opaco, 0 cornienza a desprenderse al colocar el flaskverticalmente. Las celulaes desprendidas se ven como un liquido lechoso.Alternativamente, puede dejar el flask sobre la mesada del flujo laminar, pew eltiempo de disociacion puede retardarse. Verifique el desprendimiento a traves delaobservacion rnicroscopica.

9. Retire de la estufa, y agregue al flask 2-5m1 de medio fresco (preferentemente consuero). De ser necesario. incorpore un inhibidor del agente disociativo para evitardafiar las celulas. Pipetee vigorosamente para desarrnar los grumos que se hubierenformado, y lograr una uniforrne suspension celular. Evite Is formacion de espuma queorigina la presencia del suero en el medio.

10. En este punto, las celulas pueden ser contadas y estimada su viabilidad

11. Si trabaja en un sistema libre de suero, luego del punta 9 coloque la suspension celularen tubo de centrifuga, y sornetala a 80~lOO g por 5 minutes. As] se Iiberara del excesodel agente discociativo enzirnatico.

12. Descarte el sobrenadante y resuspenda las celulas en media fresco. Repita el pasoanterior.

13. Ahora, puede contar las celulas y trasvasarlas a nuevos flasks.

Para asegurarse que los cultivos alcanzaron el punto optirno de crecimiento antes desubcultivar 0 freezar , 0 para evaluar comparativamente protocolos de crecimiento, essumamente util saber el numero de celulas de manera precisa, y conocer su viabilidad. Elmetodo mas comun, tambien eficiente y precise de cuantificacion celular es el uso de unhemocitornetro, de los cuales la camara de Neubauer es la 111;1S popular. Usualmente. lasuspension celular es homogcneizada, diluida y tcfiida con un colorante vital (Azul Tripan),Las celulas as! tratadas se introducen en la camara de conteo, y sc estirna su numero a travesdel conteo de celulas en cuadrados dibujados en el vidrio. Las celulas viables se yenpequefias, redondas y refractiles; mientras tanto las celulas no viables 0 rnuertas se tifien deazul, se ven hinchadas y grandes. La formula para conocer la concentracion celular es:

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A x B x C t0 4

Donde A: volumen de la suspension celularB: factor de dilucion en Azu l Trip an

C: numero prornedio de celulas viables104 ; es la conversion de (J, 1 nun' (capacidad de carga de la camara) a ml.

O tros m eto dosde cuantificacion celular se basan en la propiedad de ciertosfluorocrornos de unirse especificamcnte aJ I)NA (a timidina y adenina), con preferencia aDNA de doble cadena y sin interferencia con proteinas. El ejernplo tipico es el coloranteHoescht 33258, que se agrega a lisados de celulas, y merced a conocer la cantidad total deDNA (mediante fluoruntro] es posible inferir muy acotadamente el numero de celulas. Lasensibilidad del metodo es aproxirnadarnente 5 ng/mL, considerando que el contenido deDNA de una celula diploide hurnana es cercano a los g pg. Otro metoda de cuantificacioncelular se basa en un rnetodo de conteo electronico (Coulter Counter) que identifica particulas

del mismo volumen., con una pec ision el l 'Yr,para conteo de 10.0000 r11<:13parttculas.Finalmente, existen metodos colorimetricos (tipoELISA) que permiten conocer el numerofinal de celulas viables.Tiutre estos ultimos caben rnencionar los ensayos con Rojo Neutro,elucion de Crista] Violeta, M'rT, Fosfatasa Acida celular y Sulforodamina,

l~os H) mandamientos del clIltivo cdular {SCgUfiLJ)

1. Solo manipulee una linea celular a Ia vez, Este mandamiento de sentido comunreducira las posibilidades de errores en rotulacion, eontaminacion cruzadabacterian a 0 en tre lineas eel" la res,

2. Examine los cultivos diariamente para chequear contarninacienes, Descarte loscultivos sin usar que no scan necesarios .

. .3 . Mantenga los medics y reactivos separados para cada tlpo celular.4, Disponga de todos los mater'iales eficaz, segura y rutinariamente,5. Lave sus manns antes y despues de trabajar en el laboraturio. Si considera necesario,

utilice guantes esteriles,6. Dentro del flujn laminar, desinfecte con cantidades discretas de desinfectante

(alcohol 70") la superficie de la mesada, flasks, bote lias, etc.7. Evite la formacion de aerosoles denim del area de traba]o (por ej., pipeteo vigoroso)8. Realice controles de calidad de todos los reactivos, aun si los adquirio

comercialmente.

9. Asegurese que las estufas, flujos lamina res, filtros, microscopies y centrffugas hayansido limpiados, testeados y con su service a! dia.

10. Entrene y controle al personal que se inicia en las tecnicas basicas de cultivo celularantes de permitirle manipular material valioso.

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Aislamiento Primario Viral

Ante una enferrncdad de la cual se sospecha una etiologia viral. existen varies caminosposibles para llegar ann diagnostico, de los cuales el proccdimiento mas confiable es elaislarniento viral. El m ism ose lleva a cabo a partir de muestras obtenidas del individuo 0

animal enfermo. Si son varios los animales infectados. conviene muestrearrepresentativamente, Es ideal que la toma de muestras tenga lugar denim de los dos dim; de laaparicion de los siruomas porque la mayoria de los virus son diseminados s610 en los estadiosiniciales de la enfermedad,

(,Que muestra tornar y comov Dcpende de numerosos factores, pem no debenexceptuarse los organos que presentan lesiones. los humores (sangre, suero, LC]:Z). ni losorganos filtro (rinon, pulmon, bazo, Iinfouoduios]. En enfermedades respiratorias se tornanhisopados nasales 0 faringeos; en enferrncdades de la piel se obtienen raspajes 0 liquidos depuncion, etc. Si se trata de un examen postmortem, se realiza la necropsia y se precede deigual manera. Deben obscrvarse todas las norrnas tendientes a evitar tanto la contaminacionde la muestra, en la medida que las condiciones 1 0 perrnitan, asi e01110 Ia infeccion del

operador ante eventuales agentes zoonoticos. Los distintos especimenes (tejido, sangre, SUCH),

Iiquidos de puncion, hisopados, etc) presentan tecnicas de reco leccion y formas deacondicionarniento propias, pero siempre es conveniente remirir las muestras refrigeradas cinmersas en rnedio de transportee Se recornicnda el lISO de hielo comun, o hielo seco en casode que la muestra demore mas de 5 dias en arribar al laboratorio.

Como los distintos virus varian mucho en su cornposicion, estructura y estabilidad. esimportante seleccionar el medio de transporte adecuado que garantice la supervivencia tantode las celulas (;011"\0 de las particulas virales que cllas portan. Afortunadamcnte el mercadoofrece una gran variedad de medios, pew no hay uno universal, por 1 0 cual la eleccion delmismo debe ser cuidadosa,

E1 procesamiento estandar para el aislarniento viral, implica que las muestras scantratadas con antibioticos, homogeneizadas vigorosamente, clarificadas (para remover restoscelulares y bacterias) y Iuego inoculadas en cultivos celulares 0 animates apropiados,Usualmente se incuba 0.5 rn l de suspension por tuba 0 flask durante una hora a temperaturaambiente, luego se adiciona rnedio de rnantenimiento celular y se incuba durante tiernpovariable bajo condiciones apropiadas de temperatura, humedad y C02, realizando subpasajessi fuera necesario. EI crecimiento viral se observa como efecto citopatico (CPE, del ingles"cytopathic effect") en 1'1monocapa (ver mas adelante) 0 bajo otros indicadores (en caso devirus que no producen CPE).

Aislamiento de virus en cuitivos celulat"cs

Un buen laboratorio de diagnostico viral debe contar con un amplio stock de distintaslineas celulares, ya que las mismas jucgan a veces un papel fundamental en la etapa deaislamiento.

Se mencionan a continuacion algunos ejernplos de tipos celulares utilizados en elaislamiento de virus pertenecientes a distintas farnilias:Herpesviridae: BHY -1 y PRY crecen facilmente en celulas MDBK.Adcnoviridae: la mayoria de sus serotipos crecen bien en IIEK y Hcp2.Papovaviridae: de esta familia s610 los pertenecientes al genero Polyoma pueden SCI' aisladosen cultivos celulares, usandose HEK, NCI-H292, 0 celulas gliales fetales humanas.Poxviridae: vaccinia y otros poxvirus pueden sel' aislados en Vero, J\1K, fibroblastos diploidesy NCI-H292. .Reoviridae: Los reovirus 1, 2, y 3 son frecuentemente aislados a partir de muestras de

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garganta y recto, tras 15 dias de incubacion en MK, Hel.a, y NCI-H292.Paramyxoviridae: Algunos virus de esta familia pueden desarrollar ePE entre los 4 y 7 diasde incubacion, pero en general los cultivos deben ser pasados a ciegas por una sernana maspara asegurar el crecirniento viral.

Orthornyxoviridae: Influenza B, y C se recuperan facilmente a partir de cultivos de MK yMDCK.Picornaviridae: Esta familia incluye los generos Enterovirus y Rhinovirus, los cualesproducen ePE en NCI-H292, y otros tipos celulares, pero algunos virus Cocksackie A s610crecen en cerebro de raton Iactante,Togaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Filoviridae y Arenaviridae sonfamilias dificiles de aislar, por 1 0eual requieren medics y sistemas especiales,

Muchos virus producen CPE en los cultivos infectados. El ePE puede examinarseutilizando un microscopic invertido el cual permite ubicar una placa 0 botella de cultivo entre1a platina y el objetivo. El CPI~ es el resultado de cornplejas interacciones entre el virus y la

celula susceptible que resulta en alteraciones de la morfologia celular (fig. 3). Loscitornegalovirus (Flja. Herpesviridae) inducen aumento del volumen celular, mientras queotros miernbros de la misma familia (H8V -I, BIIV -1, PRY) inducen redondeamiento de lascelulas, Por 1 0 tanto, virus cercanos entre si pueden producir CPEs diferentes. Un casodiferente es el de los reovirus, que promueven una degeneracion celular con acumulacion degranulaciones intracitoplasmaticas, 0 por citar otro ejemplo, el virus respiratorio sincitialbovino que induce fusion entre las celulas.

Ei_g~ra}. ePE producido por infeccion de una monocapa can poliovirus tipo 1. A} antes de la infeccion, 8) lascelulas comienzan a redondearse a las 5 hs post infeccion (pi), C) la mayoria de las celulas se han redondeado (8hs pi), D) a las 24 hs pi las celulas se han despegado del sustrato y forman acumulos.

Algunos virus producen CPE en algunas celulas y no en otras. El tiempo que tarda enmanifestarse el ePE depende del tipo de virus, la dosis infecciosa y Ia linea celular empleadapero, en general, oscila entre horas y dias, Otros virus presentan variantes citopaticas y nocitopaticas, siendo un ejemplo el.virus de la diarrea viral bovina.

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Aislamiento de virus en Imcvo§ embrionados

En algunos virus (influenza, 0 aquellos cuyo huesped susceptible son las aves) se

recurre al huevo embrionado para su aislamiento. Este sistema es un receptaculo Ideal pamcrecer virus, por ser esteril y poseer un range variado de tejidos y cavidades que toleran tantoIa replicacion como la concentracion viral.

Se utilizan huevos fecundados de gallina. que: se incuban a 37 C en una atmosfera de62 % de humedad, con ventilacion forzada. Algunos sistemas poseen un mccanisno para rotarlos huevos a intervalos regulares.El huevo ernbrionado puede SCI' inoculado en lugaresespecificos y a distintos mementos de desarrollo. Por ejemplo, el virus de Newcastle seinocula en el saco alantoideo a los 9-11 dias de desarrollo (Fig, 4-), mientras que el virus de laBronquitis infecciosa debe inocularse en saco vitclino de huevos de 5-6 dias de edad.

As! como en las mono capas celulares se observe generalmente (~PE, en huevosembrionados inoculados suele visualizarse la presencia de pustulas (pocks) que se presentancomo areas de respuesta inflamatoria. 81 se realizan diluciones de una suspension viral,pueden inocularse varies huevos con cada dilucion, contar el numero de pustulas y luegocalcular el titulo viral de la misma manera que en cl caso de cultivos celulares.

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Figura 4. Crecirniento de virus en huevos embrionados ( de Principles of Virology, Flint SJ. et aI, 2000)

Deteccioll de Virus en cultivos cdillares en aus(~nda de ePE

Una vez infectada la rnonocapa celular, la presencia de CPE tras un determinadoperiodo de incubacion es indicative de la presencia de particulas virales infecciosas; pero laausencia de ePE no supone en. absoluto 1 0 contrario, ya que muchos virus no producen CPE.En estos casos se utilizan otto:'> tests que se cnumeraran a continuacion. Vale aclarar que estaspruebas tambien se usan para caracterizar virus que producen CPE, ya que la aparicion de esteno es patognornonica de ningun virus y conviene confirrnar mediante otras tecnicas.

Las pruebas de hemoadsorcion constituyen un metodo rapido para la deteccion deorthomyxovrus y algunos paramyxovirus, en casos donde el CPE es minimo, ° en aquellos

donde es evidente pero se busca discriminar rapidamente de otros virus que producen elmismo efecto.

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Las pruebas de interferencia viral son de suma utilidad cuando se intenta caracterizarel virus de la rubeola (RN Iogaviridae), ya que el mismo impide que otros v iru s in fe cte nlas celulas en donde se encuentra. tina vez infectada la monocapa con dicho se adicionauna cantidad conocida de algun enterovirus (por ej: virus cocksackie), se reincuba por tres

dias y se observa en los mismos la ausencia de rnicntras que en los controles infectadossolo con enterovirus se observa CPE.Los coronavirus productorcs de enfermedad respiratoria humana no desarrollan CPE

en sus fases replicativas en fibroblastos diploides. Una vez que complete su fase replicativa yalcanzo su pico de crecimiento comienzan a aparecer los cambios en la monocapa, queconsisten en una degeneracion pareja de in monocapa en los dias subsiguientes. El efectocitopatico es concomitante con la autolisis de los viriones recien formados. Al tiempo que elCPE cs complete, hay muy poco virus infeccioso en el cultivo.

Hay pruebas standard como Ia hernaglutinacion (HA) y 1a inhibicion de lahernaglutinacion (HI), la Fijacion del Complemento, etc, para ciertos grupos de virus. Porejemplo, los orthomyxovirus y paramyxovirus (entre otros) contienen glicoproteinas en sus

membranas capaces de aglutinar los globules rojos, Dicha aglutinacion es proporcional a lacantidad de virus.

A pesar de que el tipo de Cl'E puede ser indicative de un virus particular, siempre esconveniertte la confirrnacion pm otra tecnica rn aespecifica, Por ejemplo, los herpesvirusbovino 1, 5 (BH V -L BHV -5) yPRV (virus de la seudorabia) pueden infectar a1 ganado. Lostres virus producen d mismo CPE En estes casos conviene discriminar por medio deinrnunotluorescencia (IF) con anticuerpos especificos de virus. En el caso de BHV-l y BH V-5, ambos virus son lo suficientemente parecidos como para no ser diferenciados por suerospoliclonalcs y se requiere de anticuerpos monoclonales, especificos de epitopes. Para la IF seinoculan celulas crecidas sobre portaobjetos y luego se incuban con anticuerpos anti virusmarcados con fluoresceina. Lucgo de un extensivo lavado, las celulas se observan en el

microscopic de fluorescencia (tecnica directa). Para mayor sensibilidad puede ernplearse latecnica indirecta en Ia cual los celulas inoculadas son incubadas sucesivamente con elanticuerpo anti virus (anticuerpo primario) y un anticuerpo secundario dirigido al anticuerpoprimario, marcado con fluoresce ina. La tecnica es rapida y sensible pero requiere expericncia.

lnstrucdones para el T.P. de aislamiento viral

Toma de las muestrasRealizar la necropsia de los anirnales de manera aseptic a y tomando los recaudos necesariospara la seguridad del operador.1. Tomar muestras de los organos afectados y de los implicados de acuerdo ala signologfa

observada.2. Colocar las muestras en Placas de Petri esteriles sobre hielo, y lavarlas con solucion salina

esteril 0 PBS.3. Cortar los organos en trozos 10mas pequefios posibles,4, Pasar los trozos cortados a un mortero esteril y triturarlos con arena esteril y medio de

cultivo suplementado con doble dosis de antibi6tico y antifungico. Realizar la maniobrahastaobtener un macerado hornogeneo.

5. Pasar el macerado a un tubo esteril y clarificar (centrifugar 15', a 6000 RPM, a 4()C).6. Cosechar el sobrenadante.7. Inocular cultivos celulares.

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Inoculacion de cultivos celulares:

Se trabajara con frascos de cultivo de 25 cni de superficie ere 25 flasks), sembrados concelulas MDBK, en un 89-100 % de confluencia1, Descartar el medio.

2 Inocular el sobrenadante de la clarificacion (no mas de 3 ml por/lavk),3. Incubar a 37°(: en estufa gaseada (5% CO)} durante 45', agitando suavemente los frascos

cada 15',4. Quitar el medio (descartar en frascos que luego seran decontaminados).5. Agregar medio con 10% de suero fetal bovino (8FT)) y doble do sis de antibiotico y

antifungico.6. Incubar a 37°C en estufa gaseada (5% CO 2), hast a 1aaparicion de Efecto Citopatico.

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Cuantifieaci6n de virus

Cualquiera que quieta Ilevar a cabo un trabajo en Viro lgia debe conocer laconcentracion particulas virales infecciosas de las suspensiones virales que utilizara en sus

experimentos. pur ejernplo el experimenro al llevar a cabo requiere que una monocapa decelulas sea infectada eon una multiplicidad de infeccion de 10 (esto es, 10 particulasinfecciosas por celula presente en el cultivo), es mencster saber por un lado el numero decelulas a infectar, y pm otro la concentracion 0 titulo de la suspension viral a utilizaLEsta noes la unica situacion donde se requiere titular una suspension viral, Puede que en una etapaposterior del trabajo que iniciamos infectando celulas pasernos a la inoculacion de animates, y

que distintas dosis de nuestro virus produzcan diferentes efectos, por 10 cual estaremosobligados a conocer el titulo del inoculo para producir entonces el efecto deseado,

Actualmente, los virus animales son cuantificados tanto pot" medio de ensayos deinfectividad crCfD50; EID50; LD50), como por otros ensayos quimicos/biologicos(hemoadsorcion, hcmoaglutinacion, proteina total) 0 por conteo total de partfculas virales

utilizando el microscopic electronico.La mayor parte de los virologos consideran al ensayo de infectividad en placa como el

rnetodo de titulacion mils sencillo, apropiado , y sensitive a la hora de cuantificar infectividad.Sin embargo algunos virus como Influenza presentan poca eficiencia de plaqueo, por 10 cualson necesarios otros metodos, como la hernoaglutinacion,

En esta seccion se delinearan las tecnicas basicas de titulacion de virus, atendiendocon especial detalles aquella/s que se llevaran a cabo en los trabajos practices. Para detallesespecificos sobre virus individuates , el lector debera dirigirse a la literatura publicada.

Ensayos de Infcdividad

Los ensayos de infectividad estan disefiados para calcular el titulo viral, es decir elnumero de unidades infecciosas por volurnen, (ej: unidades forrnadoras de placa por rnililitro).Hablamos de unidades infecciosas para resaltar el heche de que cualquier suspension viralconsiste en una mezcla de viriones, algunos de los cuales son capaces de infectar mientras queotros (por ejernplo, partlculas defectuosas 0 DI) no 1 0 son. A nosotros nos interesan laspnmeras.

Las unidades infecciosas son consideradas como la menor cantidad de virus queproduce un efecto biologico detectable en el ensayo. Tal efecto es consecuencia del cicloreplicative que curnple un virus en la celula que infecta, y esta dado por cambios bioquimicosy morfo logicos dentro del huesped que en general culminan con la muerte celular. Comomencionaramos anteriormente, estes cambios morfologicos son denominados Efecto(' itopatico (ePE), y, al microscopic optico pueden adoptar distintas formas: redondeamientocelular. fusion (forrnacion de sincicios), 0 lisis total. Algunos virus no producen ePE ni matana sus celulas huesped, sino que las transforrnan en focos de crecimiento tumoral, y de estaforma puedcn visualizarse en una monocapa infectada.

Los ensayos de infectividad puedcn ser cuantales () focales, Los e nsa yo s < ;lla _n ta le sdetectan Ia presencia de virus infeccioso desde un enfoque de "todo o nada" planteando lassiguientes preguntas: (,presenta CPE la monocapa celular? l.esta infectado el huevo?, l,hamuerto un animal? En cambio, los ensayos ii1i~ale~ se basan en el conteo de foeosinflamatorios (pock) ,ode focos eon CPE, 1 0 cual permite una determinacion cuantitativa adiferencia de los primeros que aportan datos cualitativos. En la practica, se considera que unfoco pock 0 de CPE es originado por una 0 unas pocas particulas infecciosas, aunque puedeque ello no sea as! en todos los casas. Este grado de incertidumbre se refleja en el uso deltermino "unidad infecciosa" en vez del de "particula infecciosa",

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Dilucion de virus

La forma de determinar titulo viral es realizando diluciones seriadas de lassuspensiones virales, utilizando como diluyente medic de mantenirniento celular. Las mismas

se hacen 1: 10 0 I :2.5 (a rnenor factor, titulo mas precise). En general, el factor utilizado es 1en 10.

Estas siglas provienen del ingles "Tissue Culture Infective Dose 50" (D08i8 infectivade cultivos celulares 50), y se define como la dilucion viral necesaria para infectar el 50 % deuna serie determinada de cultivos celulares inoculados. Este test se basa en la presencia Ydeteccion de particulas virales capaces de producir CPE. Las celulas huesped son cultivadashasta forrnar monocapas cuasi-confluentes en placas de cultivo de 96 pocillos, a las que se lesagrega una dosis de las diluciones virales. Se realizan 10 rcpeticiones de cada dilucion comorutina. Una vez inoculadas las celulas, sc incuban en estufa para perrnitir que el virus repliquey el CPE teuga Ingar. Luego sc observan las placas con el microscopic invertido y se cucntanel numero de pocillos con CPE y el 111Ul1CrO de pocillos sin CPE. Por lo tanto es un ensayocualitativo ya que s610 nos dice S I hay o no CPE.

Los datos obtenidos se usan para calcular la TCID so , 10 cual puede hacerse tanto porel metoda de Reed y Muench como por el de Spearman y Karber. E,Iresultado de estc calculono nos dice cuantas unidades infecciosas bay sino que dilucion de nuestra suspension viraloriginal producira CPE en el 50 % de las celulas inoculadas.

Ensayo de Placa

El ensayo de placa es un ensayo de infcctividad que cuantifica cl nurnero de unidadesinfecciosas en una suspension viral dada. Se denominan placas a focos de infeccio n discretoslocalizados, los cuales se presentan como zonas de lisis celular 0 efecto citopatico dentro deuna monocapa celular. Cada placa se origina de una unica particula infecciosa, Io cual perrniteun calculo muy preciso del titulo viral.

Existen dos tipos de ensayos de placa; en suspension y en monocapa, y en esta guiasolo se presentara el ultimo. A una monocapa confluente de celulas se le agrega una pequefiovolumen de virus diluido, y luego de un breve tiempo de incubacion (para que [a adsorciontenga Jugal') se agrega una sobrecapa de medio scrnisolido. Dicha sobrecapa est a compuestapor una solucion de agar/agarosa 0 metilcelulosa, que pOl' su solidez relativa evita laformacion de placas secundarias a distancia y obliga a las particulas virales a invadir s610celulas vecinas a las primo infectadas.

Una vez inoculados los pocillo s y adicionada la sobrecapa, se deja incubar hasta quelas placas 0 focos can CPE sean discernibles, momento en el cual las celulas se fijan con unasolucion salina con formol y luego se tifien con cristal violeta. Las placas se observan a ojodesnudo 0, mejor, can ayuda de una lupa (fig. 5).

El titulo obtenido se expresa como Numero de unidades forrnadoras de placa por rnl(PFU rnl", PFU"" Plaque Forming Units) .

Vale la pena remarcar que antes de realizar un ensayo de placa hay que determinar elsistema virus/celula mas sensible y apropiado para llevarlo a cabo, y para ello hay que tener

en cuenta algunos factores como la sensibilidad del tipo celular utilizado a la infeccion;tiempo requerido para la adsorcion; tipo de agar utilizado (puede inhibir la replicacion viral);

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tiernpo de incubacion; capacidad del virus de producir CPE en cultivos celulares; etc.

I:igura.,~. Focos de lisis en un ensayo de titulacion. Las pequenas areas blancas representan focos de lisismientras que cl rondo oscuro corrcsponde a la monocapa intacta ,

Ensayos cn hucvos cmbrionados

Se ha desarrollado un metodo cuantitativo de titulacion de virus en embrion de polio(pock assay I ), el cual ha caido en desuso debido a las reformas legales que restringen el usodel huevo embrionado en los ensayos de laboratorio. Basicamente consiste en la creacion deun falso saco de aire en el huevo, dentro del cual se inocula el virus diluido. Luego de incubarPOt un lapse de tiempo, se cuentan las areas de inflamacion ("p()(',ks") resultantes de lareplication del virus en las celulas epitcliales de la membrana corioalantoidea. Cada area 0

pock es producida por una particula infecciosa, 1 0cual hace que este metodo sea cuantitativo,

Hemoag (utin aciiln

La capacidad de algunos virus de producir agregados de eritrocitos de distintasespecies se conoce como hemoaglutinacion, la cual se produce por la interaccion entreglicoproteinas virales y receptores de membrana de las celulas sanguineas. No todos los virushemoaglutinan, y algunos 1 0 hacen solo frente a eritrocitos de especies determinadas y bajoestrictas condiciones de pH y fuerza ionica,

Para que Ia reaccio n ocurra, debe haber una concentracion de virus capaz de establecerpuentes cruzados entre eritrocitos, causando asi su aglutinacion. Si se colocan los mismos enun pocillo de rondo concave, al no haber aglutinacion formaran un pellet en el fondo. Alproducirse la hemoaglutinacion se forma una estructura que t a p I Z 1 : 1las paredes del pocillo, lo

cual es bien diferente al pellet, de forma tal que ambas reacciones se distinguen a ojodesnudo.

La hernoaglutinacion no mide infectividad, ya que no hay replicacion viral en este tipode ensayo, solo indica el numero de particulas virales capaces de producir hemoaglutinacion,por to que no es un metodo muy sensible, ya que se necesita una gran cantidad de particulaspara que se produzca el efecto,

£ontco de parHculas

Existe un metodo.de titulacion en exceso dificultoso, que se vale del microscopicelectronico para contar particulas virales. Muy sucintamente, el metodo se basa en el uso departiculas de referencia de una concentracion conocida, las cuales se rnezclan con virus, y porvisualizacion en el microscopic electronico se determina la relacion virus/particulas, y con

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este numero se calcula la cantidad de virus total.

Eiercicio.§

Para determinar ei titulo de una suspension viral de Bl IV ~ J Cepa Cooper; se realize una

prueba de 'I'(]D50 en celulas MDBK Las diluciones fueron hechas l : 10, desde 1: 10 hasta1: 1O10 . PO I 'cada dilucion S0 utilizaron 8 unidades de prueba y se realizaron 2 eontroles sininfectar con igual numero de unidades de prueba cada UDO.

Luego de siete dias la lectura de la placa arrojo los siguientes resultados:

Bubo CPE en todas las unidades de prueba desde la dilucion L 10 hasta 1: 106.Hubo CPE en tres unidades de prueba en la dilucion 1: I 07.No hubo CPE en diluciones mayores.Los controles no presentaron CPI~.

Calcular eI TCID50 de la suspension viral original,Que volumen de suspension viral hay que utilizar para un ensayo de seroneutralizacion en elcual hay que infectar 50 pocillos con 102 l'e[D50 por pocillo (ensayo virus fijo-suerovariable).Que volurnen de suspension viral ha y que utilizar para infectar celulas en cubreobjetos(150000 por cubre) con un MOl de 0,1 .

!I!struccioncs para el ]'.P. de Titulacion viral~

Tener una placa de cultivo celular de 96 pocillos sembrada con una gota de suspension

celular (en medio de cultivo adicionado con 10% de SFB) al mornento de la titulacion.Realizar diluciones 1; lOde la suspension viral en tubos esteriles de Ia siguiente manera:l , Trabajar los tubos en hielo.2. Colocar 0.9 ml de medio sin suero en cada tubo.3. Agregar 0, I ml de la suspension viral al tubo # 1, homogcneizar con pipeta 10 veces.4. Descartar la pipeta.5. Can una nueva pipeta, aspirar 0.1 ml del tubo #1 y transferirlo al tubo # 2.6. Hornogeneizar con pipeta 10 veces.7. Descartar la pipeta.8. Seguir como en el punto 5, pero a partir del tubo #2, hasta completar las 10 diluciones.9. Descartar 0.1 ml del tubo #10.

10. Agregar una gota del contenido de Gada tubo por pocillo de cada columna, inoculando lascolumnas 1 a 10 con Ia suspension viral, y las 11 y 12 con una gota de medio sin suero(centro les).

11. Agregar una gota de medio sin suero en todos los pocillos,12. Incubar en estufa gaseada (37°e SOA )CO 2) durante una semana. Observar diariamente la

evolucion de las placas (aparicion de C:PI~).Resumiendo, los pocillos de las columnas 1 a 10 deberan tener a1 finalizar esteprocedimiento.I gota de suspension celular (previamente preparada), 1 gota de suspensionviral, y una gota de medio sin suero; mientras que los controles tendran una gota desuspension celular y dos gotas de medio sin suero.

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BASES PARAE1_, DIAGN()STICO VIROLOGICO POR MICROSCOPIAELECTR()NICA

Fundamento

El microscopio optico ha sido utilizado como instrumento de investigacion en lospasados tres siglos. La contribucion a la ciencia que ha aportado su USO, incluye laidentificacion de agentes causales de nurnerosas enfermedades, anatomia microscopica y

teona celular. Hoy, como en el pasado, el microscopio optico es un importante instrumento delaboratorio. Esta utilidad, sin embargo, esta restringida pm su limitada habilidad para formarimagenes definidas por debajo de los 2 urn de diametro. POI' ello no puede ser utilizado paraobservar objetos de menor tamafio, como bacterias 0 virus.

Para obtener imagenes de objetos mas pequeiios, incluyendo virus y macrornoleculas,se requiere un instrumento con mayor poder de resolucion. El microscopic electronico es ese

instrumento. Desarrollado entre los afios 1928 y 1934, tiene la habilidad de producir imagenesbien definidas de objetos mas pequenos a los que pueden verse con el microscopio optico. Elpotencial del uso del microscopic electronico en virologla fue rapidarnente reconocido con lapublicacion de la primera electron-rnicrografia de un virus en 1939, Hasta esc mornento, losvirus s610 habian podido ser detectados pOI" las lesiones que producian en celulas y tejidos.

[:1 gran valor de la microscopia electronica se encuentra en la observacion de objetosellyn tamano se encuentra entre 5 y 250 run, fango no cubierto por el microscopic optico y enel cual se encuentran practicarnente todos los virus conocidos. La microscopia clectronicaofrece la posibilidad de obtener micrograflas de particulas virales individuales y, de ese modo,establecer su forma y tamafio con adecuada precision.

EI Mic:roscopio Electronico

E1 poder de resolucion de un microscopic es la capacidad que tiene el mismo dediscernir entre dos objetos cercanos, Esta capacidad esta dada, entre otras caracterlsticas, porla Jongitud de onda de la radiacion utilizada (Iuz visible, luz UV, etc.). La longitud de ondade los electrones es unas 10.000 veces mas pequefia que la de la luz visible, y disrninuye conla aceleracion del voltaje aplicado, es por eso que la resolucion es mayor en un microscopicde 200 Kilovoltios (Kv) que en uno de 120 Kv. Es por ello que la resolucion del microscopicelectronico es mucho mayor que la del microscopic optico, pudiendo resolver particulas dehasta 2 om de diametro con perfecta definicion.

EI microscopio electronico trabaja mediante e! calentamiento de un filamento (catodo)de tungsteno 0 de exaboruro de lantano por aplicacion de una corriente de alto voltaje perobajo amperaje, que emite electrones. Estes electrones son acelerados mediante un anode quepo see LIn pequefio orificio que pueden atravesar forrnando un haz de electrones. EI hazprogresa a traves del tubo del microscopic 0 calion, donde una serie de bobinaselectromagneticas 1 0 concentran y corrigen aberraciones de forma similar a las Ientes delmicroscopic optico. Como el haz puede desviarse 0 sufrir distorsiones al chocar canmo leculas del aire, dentro del cation se debe mantener alto vacio, y es por esta razon que nose pueden observar organismos vivos. La muestra se coloca de manera que se interponga en elhaz de eleetrones provo cando una interferencia en las zonas de mayor contraste del objeto, elcual es resaltado por exposjcion a sales de metales pesados, proceso .. denorninadocontrastado. E1 haz sigue su viaje basta llegar a una placa fluorescente que es excitada parlos electrones formando una imagen visible que reproducira la interferencia producida par elpreparado. El haz tambien puede impresionar un placa fotografica sensible, obteniendose de

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este modo una electron-microfotografla del material observado. Para que el haz puedaatravesar la rnuestra esta debe ser dividida en secciones ultrafinas mediante un aparatollamado ultramicrotomo, el rnismo. mediante cuchillas especiales divide las muestras ensecciones que no superan los 60 nm de espesor. Lucgo de esto los cortes son montados engrillas de cobre de 3 mm de diametro y se realiza el contrastado con de uranilo y plorno.De esta forma la rnuestra ya esta lista para ser observada,

Existen dos tipos de microscopies electronicos: el microscopio electronico detransmision (MET) y el microscopio electronico de barrido 0 scanning (MEB () MES).Del prirnero ya hernos visto las bases de su opcracit'mEl funcionarniento del MliB. encambio, se basa en 1 2 1emision secundaria de electrones. Para ello se cubre hi muestra con unapelicula compuesta por oro y carbon. 1;:1hal. que llega hasta ella "rebota" y esa emisionsecundaria es transforrnada en una sefial electrica, que luego de ser amplificada y procesada sereconstruye en un monitor de television. POt ello C0l1 el MEB solo pueden verse superficies, y

no es necesario realizar cortes ultrafinos de la muestra. Es poco utilizado en viro logta.

Toma y pmcesamicnto de las mucstras

Los virus pueden ser aislados de un gran t1llH1CrO de rnuestras clinicas incluyendomateria fecal, orina, secrecion nasal, traqueal, liquido vesicular, huevo ernbrionado, celulas ysobrenadantes de cultivos de tejidos y, en general, de cualquier tejido 0 secrecion animal.Estas muestras deben ser preparadas para su observacion al ME< La preparacion varian'! S flasmuestras son liquidas 0 solidas.

1. ;:'1rocesamiento de mucstras Hguidas: Las muestras liquidas deben ser centrifugadaspara que las impurezas sedimenten y no dificulten la observacion de las particulasvirales, dicho procedimiento se denornina elarificacion y se realiza a baja velocidad(5.000(J) durante 1.5minutos, se extrae el sobrenadante y se vuelve a centrifugar, peroesta ve: a l O O < OOOGdurante 60 minutes. utilizando el s e d imen t o . Si la muestraconsiste en una suspension cclular que queremos conservar intacta, se debecentrifugar a menor velocidad para no producir citolisis (300G) y lograr un sedimcntodonde las celulas se concentren. A partir de alii las muestras pueden scguir doscaminos: se puede utilizer el sedimento de 1£1segunda centrifugacion para observarmediante tin cion negative en fresco, 0 se pucde incluir el sedimento celular, de laprimera centrifugacion, en agar al 1 % forrnando un "taco'I.que se procesara como unamuestra solida (para ello las celulas deben estar fijadas previarnente, englutaraldehido a! 2%). Las muestras de materia fecal deben ser primero diluidas al10% en agua desionizada (dill-O) y luego seguir cl procesarniento anterior.

2, Proccsamiento de ml1cstras s6lidas: Las muestras solidas deben ser fijadas, como

primer paso, en glutaraldehido al 2%) durante 2 a 12 horas a 4° C; debido a que estefijador posee poco poder de penetracion, el tamaiio de la muestra no debe superar los2 mrn de lado, Luego se realiza una posfijacion con tetroxide de osmio al 1 % quemejora la conservacion de Ia muestra, sobre todo de los lipidos, y deposita sales sobrediferentes estructuras aurnentando el contraste. De alli se pasa al lavado y posteriordeshidratacion en alcoholes de creciente graduacion. Antes de la inclusion se debepasar por un interrnediario miscible en alcohol y resina que es el oxide de propileno,para terrninar con la inclusion en resina, esta puede ser Epon 812, Maraglass, Spurr,Araldita.

Una vez que las muestras han sido procesadas. deben ser preparadas para su observaci6n.La observacion en fresco se realiza mediante tincion negativa, mientras que las incluidas en

resina deben ser cortadas en secciones ultradelgadas y contrastadas con sales de uranilo yplorno para su observacion, EI fundamento en ambas, es similar: enfrentar las muestras con

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sales de metales pesados que se distribuiran a traves de las diferentes estructuras biologicassegun su afinidad, dando un contraste que pueda ser evidenciado mediante el microscopicelectronico.

a) Tincien negative:

Esta es una tecnica rapida y sencilla que puede proveer un diagnostico viral en pocosminutes, en base a la afinidad de las sales por diferentes estructuras virales y al retardo en latransmision de los electrones que producen (Fig. 6). inconveniente es que se necesitan altostitulos virales de, por 1 0menos, 10 6ImL La metodo logla consiste en los siguientes pasos:

1. Preparacion de grillas recubiertas con una membrana de Colodion 0 Formvar, sobre lasque se realiza una cobertura de carbon pOI evaporacion (coating) que le proveera demayor resistencia mecanica a In membrana.2. Dentro de una placa de Petri con papel de filtro embcbido en NaOH 0.1 M que hara lasveces de camara humeda, se colocan dos planchas de vidrio sobre las que se aplica unapieza de Parafilm,EI NaOH tiene COlTl0 funcion crear un ambiente alcalino para disminuirIa forrnacion de precipitados en In so lucien de contraste,3. Sobre el Parafilrn se deposita una gota de 1 3 suspension viral por cada grilla que sepreparara y una got a de la solucion de contraste: acetate de uranilo al 1 'Y o 0 aeldofosfuningstlco al l'Yo (PTA). En general, sicmpre conviene tenet grillas contrastadas conuranilo y otras con PTA, ya que ambos tienen afinidades distintas par diferentes partes dela partlcula viral, dependiendo del virus; y, en algunos virus, el PTA puede afectar laintegridad de 1 21particula.4. Con una pima de punta muy fina se coloca la grilla debajo de la gota de suspensionviral, con la cara que posee la membrana hacia arriba y se deja que el virus se adhieradurante 5 minutes.5. Se retira la grilla de la suspension viral, se seca el exceso de liquido tocando uno de losbordes con papel de filtro, y se coloca sobre la gota de solucion de contraste, con Ia cawque posee la membrana hacia abajo, para que el precipitado que pueda contener estasolucion no se deposito sobre la grilla impidiendo una correcta visualizacion, Se dejaactuar la solucion por otros 5 minutes.6. Se retira la grilla de In solucion de contraste, se seca el exceso de la misma forma queantes, y se deposita en otra placa de Petri, can la cara que posee la membrana haciaarriba, sabre papel de filtro para que termine de secarse (aproximadamente 15 minutes).7. La grilla ya esta lista para su observacion al microscopio electronico. Se debe tener

sumo cuidado en la manipulacion de las gr illas luego de la tincion, ya que muchos virusno son inactivados poria fijaclon y siguen manteniendo su infectividad.

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FIGURA 6: tincion negative, coronavirus (arriba), rhabdovirus (abajo).

Nota; Esta tecnica puede sufrir modificaciones:- se pueden enfrentar iguales cantidades de suspension viral y solucion de contraste en un tuboeppendorf, y con la mezcla asi obtenida realizar las grillas;- otra tecnica consiste en ubicar las gotas con 1amezcla suspension viral/solucion de contrastesobre agar al 1% el cual absorbe las sales y disminuye la forrnacion de precipitado;- tambien se puede hacer la membrana sobre la suspension viral con 1 0 cual las partieulas

quedaran firmemente adheridas a la misma aumentando la cantidad de virus disponible parasu observacion

b) Cortes ultrafinos:

Los cortes ultrafinos se obtienen mediante un aparato que se denorninaultramicretomo y que trabaja con dos tipo de cuchillas: de vidrio y de dtamante, estasultimas producen mejores resultados pero encarecen ostensiblemente la preparacion, Lascuchillas de vidrio son mas econornicas y se preparan en el momento de su uso. Ambos tiposde cuchillas poseen un pequefia "cubeta" llena de diH20 cerca de su superficie de corte, a lacual van Ilegando los cortes, y de donde se retiran mediante un ansa 0 con la misma grilla.

Sobre los cortes tambien se realiza un contraste, pero esta vez se utilizan dos soluciones en lamisma grilla que son: el acetate de uranilo y el citrate de plomo, Los tiernpos de contrastado

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son mas largos ya que las so luciones deben penetrar la resina en que estan incluidas lasmuestras.

c) Inmuno-eleetro-microscopta OEM):

Esta tecnica provee un diagnostico mucho mas preciso que las anteriores y puedeevidenciar particulas virales en muestras con menor titulo. Se utiliza tanto para virus ensuspension como para cortes ultrafinos de tejidos infectados, Algunas de las metodologias queemplean esta tecnica se mencionan a continuacion.* Clumping, Se enfrenta el virus con anticuerpos espectficos sin marcar, de esta manerael

virus se concentra y aumenta la sensibilidad de la prueba. Se puede centrifugal' paraconccntrar los cornplejos atg-atc.

G Decoracion, Se enfrenta el virus con anticuerpos especificos sin marcar, estos puedenverse al microscopic electronico como un cumulo de material amorfo alrededor de lasareas reactivas. Se utiliza en virus de morfologia cornpleja y puede servir para detectar el

sitio de union al anticuerpo,f& Pseudo-replica. El anticuerpo se fija a la membrana de la grilla, con 1 0 cual al recibir el

virus este queda firmemente unido a la grilla mejorando la sensibilidad de la tecnica auncon muestras poco concentradas.

e Protefna A-oro. Luego de incubar la grilla con el virus, se agregan anticuerposespecificos sin marcar (anticuerpo primario ). Seguidamente se exponen las grillas a uncomplejo formado por una proteina extraida de la pared del Staphylococcus at/reusllamada Proteina A, unida a oro coloidal. Esta protelna tiene la capacidad de unirse a lafraccion Fe de las Ig independientemente del tipo y la especie, De esta forma se une a Iafraccion Fe del anticuerpo primario unido al virus, y el oro puede verse: clara mente comoesferas de diferente diametro marcando la particula viral, La dcsveutaja de esta tecnica es

que al ser la Proteina A inespecifica, tambien puede dar falsos positives.'" IgG-oro.EI fundamento es similar al de la tecnica anterior, perc en vez de Proteina A seutiliza IgG especifica contra el anticuerpo primario, unida tambien a oro coloidal (Fig. 7)"La IgG (anticuerpo secundario) se debe obtener de: otra especie distinta a la que se usapara obtener el anticuerpo primario. Esta metodologia puede utilizarse tanto parasuspensiones como para cortes ultrafinos de muestras incluidas en resina, y puede servirpara I" visualizacion de particulas virales completes 0 de productos virales individuales(fig, 8), En caso de cortes ultrafinos, el desafio can los anticuerpos puede realizarse antesde la inclusion (lEM pre-inclusion) 0 despues de la misma, sabre los cortes (IEM pos-inclusion). El procesamiento de la muestra para inclusion puede destruir los antigenos, 1 0

que haec mas convenientc la rEM pre-inclusion, aunque si los antigenos son intracelulares

(virus en citoplasma) solo pueden acceder a enos los anticuerpos al realizar los cortesultrafinos (IEM pes-inclusion).o r o

. , . 1 J J i ..

virion 11 > -0 0 0grilla

................V". . . . . . . . . .

F ig ura 7 . F un dam en to d e la inmu no -e lec tro m icro sco pia

3 3



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f . : i !w! :g_a~lnmunoelectromicroscopla de celulas BCBL-l que expresan la proteina K8.1 del herpesvirus asociadoal sarcoma de Kaposi. Esta glicoproteina se observa en la superficiecelular (esferas negras) con tres distintosaumentos, EI anticuerpo primario fue obtenido en conejo y esta dirigido contra la protein a viral KK I. EIanticuerpo secundario (cabra anti-conejo) esta conjugado con particulas de oro. (Li et al., 1. Virol, 73 :1341-1349,1999).

Ventaias y limitantes

Como toda metodologia, el uso de la rnicroscopia electronica en el diagnosticovirologico, posee ventajas y limitantes:til Ventajas:1. Es una tecnica rapida en comparacion con otros metodos, como el desarrollo en cultivos

celulares.2. No existen intermediaries, como reacciones serologicas 0 revelado de coloraciones, Se

pueden visualizar las particulas directarnente y no sus efectos deletereos.3. La contaminacion no es un problema tan grave como en el caso de los cultivos celulares,

Se requieren minimos cuidados a1respecto.

® Limitantes:L Se requiere un alto titulo viral (mlnimo lOG/mi).2. El equipo utilizado es muy costoso y pocas instituciones 1 0 poseen,3. El diagnostico morfologico no es de certeza ya que muchos viriones poseen una

morfologfa y tarnafio similar (con la IEM esto puede minimizarse).

Bibliografia

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Davis, HI) et a): Tratado de Microbiologia. Ed. Editorial Salvat. Barcelona. 1978..Ioklik, WK et al: Microbiologfa de Zinsser. 20 G Ed. Ed. Panamiericana. Buenos Aires. 1994.Mahy, BWJ & Kangro, no: Virology Methods Manual. l~.tEd. Academic Press. London.1996 .Lewis, PR; Knight, UP: Staining methods for sectioned material. 'EeL North-Holland.Amsterdam, 1977_Robards, AW; Wilson, A,B: Procedures in electron microscopy. Ed. John Wiley & Sons.Chichester, 1993,

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La reaccio~ de la polimerasa <:ncadena (peRl

En las celulas, Ia replicacion del DNA esta a cargo de las polirnerasas de DN A (DNAPol) las cuales sintetizan cada nueva cadena utilizando a 1 3molecule original como templado,Para que las cadenas ternplado sean accesibles para la polimerasa, la doble cadena 0 duplex deDNA debe abrirse, esto es, los puentes H que normal mente mantienen las dos cadenaspegadas tienen que desrnantelarse transitoriamente. En las celulas, dicha apertura es ejecutadapm otras enzimas y factores que asisten la replicacion.

Como todas las polimerasas de acidos nucleicos, las DNA Pol adicionan uno a uno losdeoxinucleotido trifosfatos (dNTPs) en sentido 5' -3' siguiendo las reglas decomplementariedad de bases (Fig. 9). Como las cadenas del DNA son antiparalelas, ladireccion de sintesis de una cadena es contraria a la direccion de Ia otra.

cadenanueva

cacenatemplado

. '

Eigm!!.2. Sintesis de una cadena de DNA

Las DNA Pol no pueden iniciar la sintesis de una cadena de DNA de novo, esto es,sirnplemente uniendose al ternplado y adicioriando dNTPs. Para que la enzima trabaje, lacadena templado debe estar unida a algun segmento de DNA (0 RNA) que aporte un extremaOH 3'. Este segmento recibe el nornbre de primer. En estas condiciones. las polimerasasadicionan el primer nucleotide y catalizan la union entre el grupo fosfato 5' del dNTP entranteCOll el grupo OH 3' del primer. De esta manera, una vez incorporado, el primer dNTP ofreceun nuevo grupo OH 3' para que la enzima puede adicionar el siguiente dNTP. Comoconsecuencia, la nueva cadena de DNA va creciendo, ofreciendosiempre un grupo OR 3' en su extreme libre. Por esa razon decimos que la sintesis opera ensentido 5'-3'.

Las DNA Pol de la celula suelen incorporar, a muy baja frecuencia, dNTPsequivocados, Por ejemplo, donde existe una A en el templado, incorporan una C en la cadenanueva. Las DNA Pol tienen la capacidad de detectar inmediatamente el error, escindir el

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dNTP equivocado y adicionar el correcto. Esta actividad enzimatica se denomina funcioneditora 0 proofreading.

La temperatura optima de trabajo de las DNA Pol celulares es de aproxirnadamenre 37C. Ciertas bacterias que viven en condiciones extremes de temperatura, deben adaptar sametabolismo a las condiciones reinantes. Una de tales bacterias es Thermus aquaticus. LaDNA Pol de T. aquaticus es capaz de sintetizar DNA a temperaturas superiores a 72 C,valores a los cuales las po limerasas eucariotas son cornpletamente inactivadas.EIdescubrimiento de 1 3DNA Pol de ·L aquaticus, polimerasa Taq, the central at desarrollo delres.

EI peR

El PCR es una tecnica en la cual una secucncia de DNA es replicada sisternaticamentebasta obtener grandes cantidades de esa secuencia. Cuando decimos "grandes cantidades"aludimos a que las mismas pueden detectarse con rnetodos relativarnente sencillo s. Dichasecuencia puede estar presente en bajisirnas concentraciones e incluso mezclada con otrassecuencias que no son de interes. De tal manera que la mayor ventaja del peR es la capacidadde amplificar secuencias especlficas de DNA que se encucntran a bajas concentraciones. Enrigor, el peR es tan efectivo en arnplificar secuencias que uno puede analizar secuenciasprovenientes de una {mica celula animal. In impacto de Ia tecnica tambien llego aldiagnostico. En este sentido, fue importante advertir que en muchos casos no es necesariopurificar el DNA de Ia muestra con dernasiado rigor.

De acuerdo a 1 0mencionado en In introduccion, cualquier reaccion de polimerizacionde DNA debe incluir un temp lad 0 de DNA, la polimerasa de DNA, dNTPs y primers. Senecesitan dos primers, uno para cada cadena del ternplado y, por razones que ac lararemosdespues, los mismos deben estar en exceso. Para lograr que las cadenas del ternplado se

separen y la polirnerasa pueda catalizar In reaccion, en vez de utilizer los facto res que empleaIa celula se usa la temperatura. Por arriba de cierto valor de temperatura, los puentes de H serompen y las cadenas del ternplado se separan (el DNA se desnaturaliza). Dicho valordepende de In composicion de bases del templado 0, expresado de otra manera, del contenidoen G y C de la secuencia templado. ILa Taq polimerasa funciona rnejor en un bufferapropiado y en presencia de Mgt+, por lo tanto ambos cornponentes deben estar presentes enla mezcla de la reaccion.

Una vez preparada In mezcla de reaccion, se la incuba a unos 94 C un minuto para quelas cadenas del templado se separen, Este paso se denornina desnaturalizacion. Luego sereduce la temperatura a, digarnos, 60 C par un I11llUtO de tal forma que los primers se unan(hibridicen) a las cadenas ternplado separadas. Este paso se denornina hibrid izacion 0

annealing', Luego se eleva la temperatura a un valor apropiado para maxima actividad de lapolimerasa Taq, linos 72 C, y se incuba por unos pecos minutes'. Con las dos cadenas delternplado "primadas", la Taq Pol sintetiza las cadenas hijas, Este paso se denomina extension

I Los organism os pueden diferir significativamente en su contenido en GC. Incluso la proporcion en GC puedecarnbiar de un segmento a otro del DNA En general e! contenido en GC es del orden del 50% pew en algunosvirus puede ser superior al 70%. Recorder que los pares GC del duplex de DNA se unen mediante 3 puentes deU:,mientras que los pares AT solo por dos. Por 1 0 tanto, S 1queremos separar cadenas de un DNA con altocontenido en GC deberernos emplear una temperatura superior a la empleada en una secuencia pobre en GC.C om o no siem pre se conoce el contenido en GC del ternptado, generaim ente se utiliza.nnatemperatura 1 0suficientemente alta como para separar cualquier tipo de DNA .2 La temperatura y tiempo exactos dependen de la composicion de bases, longitud y concentracion de losprimers., El tiempo depende de la longitud y concentracion de Ia secuencia target, y de la temperatura.

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del primer 0, simplernente, extension. Aunque estos pasos pueden manejarse manualmente sise disponen de varies banos de agua ajustados establernente a cada temperatura, 13 tecnica sesimplifica y optimiza con el usa de termocicladores. Estos aparatos pueden ser programadosde tal rnanera Ilue las reacciones autornaticamente son llevadas de un paso a otro sin cambial'

los tubes de lugar.La sucesion de los tres pasos mencionados, desnaturalizacion, annealing y extension,

constituyen un ciclo de PCH. (figura 10)" La verdadera arnplificacion ocurre cuando lasreacciones se sorneten a varios ciclos, usualmente entre 30 y 40. EI nurnero de ciclos dependede: 101concentracion inicial del DNA tatget y sc programa en el termociclador. En each cicloocurre exactamente 1 0 111 i s 0 1 o :el target se separa y los primers se pegan y extienden, Con cadaciclo, Ia concentracion de la secuencia target se duplica mientras que la concentracion deprimers disminuye. Esa es una de las razones por las cuales los primers se colocan exceso.Como en cada paso de desnaturalizacion la temperatura se acerca a Ia ebullicion (can elpeligro de la evaporacion y subsecuente concentracion de las partes), una vez mezclados loscomponentes en los tubas y antes de iniciar cl termociclador, se agrega una gota de aceitemineral la cual forma una pelicula protectora en la fase superior.

Notese que en el annealing (60 C en el ejemplo) el templado se mantienedesnaturalizado ya que SD concentracion es tan baja que dificilmente sus dos cadenas seencuentren e hibridicen. Los primers, par otro lado, al estar en exceso hibridizan con sussecuencias cornplementarias en el templado. Como la pol imerasa Taq es capaz de catalizar aalta temperatura, la renaturalizacion no es un problema,

Una vez concluido el ultimo ciclo, los productos amplificados ya pueden evidenciarsemediante electroforesis en geles de agarosa. La duracion de una reaccion de peR depende delnumero de ciclos programados pero, en general, oscila entre dos y tres hams.

Los prin!~I'SQueda claro que para llevar a cabo el peR debe tenerse una informacion minima

acerca de 1a secuencia a arnplificar. Conociendo la secuencia pueden disefiarse los primers. Eldisefio de los primers requiere ciertas consideraciones.

1) Longitud de los primers: usualmente se emplean primers de 18 a 30 nucleotidos, Cuantomenor sea la longitud, mas chance tenemos que una secuencia muy similar 0 identica seencuentre en el DNA, en euyo caso tambien se amplificarta una 0 mas secuencias que nonos interesan y que van a aparecer en el gel.

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cicio 1

ciclo 2

reqion a arnplrticar 39

.rrTTTTT·r-rT-rTT-r 3

DN A target, .1..LJ.. J.. JJJ ... L.J.J .LL_LL s

~;Figura 2

/' 5 TTTTTTT··TTTTTTT 3'

desnaturallzacicn

3LLJ_LLLJ_JJ_l_LLU s'

~

'TTTTTTT-ri I 1 1 I ! ".L~" "annealing" de

5'''I''i'Ti'' primers (:=)"_U_LLULLLLU..J_]_"

5' TfTrTT'rrTTTTTT",L4J._LL.;..j ,_L.;~L.LLLL. 5' •

5' Tl'TfTrTT-rT"r"'F'T"l" extension3' 1 I I 1 I I.Ll I , I I 1 1 15'

~

S' I 1 I I! I ,- I ! a

3,L.L.J.,....L.L_j._.1 ~ 'I I ! , ) i .5'

desnaturalizacion

3' 1 I I 1 I.LLLL.LLL5'

5' tTTT1-n" I !. 1 I I I 1"

3'~5'

"annealing" deprimers (~)

extension5 'f'TrTITTI~r~T"'f"'"1'II a :

"L4J.. 1 I i I ; I I I I ! 1_

TI"'1~rT"'I" n-'-rr~"3 I I 1 I I I I I I I! I 1 15'

2) Composicion de los primers: general mente se seleccionan aquellos con un contenido GC

entre 50 y 60% cuando el organismo fuente de DNA 1 0 permita, La composicion de los

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cornplementaria a una region mas 0 menos central de! producto amplificado. Despues dela hibridizacion, la membrana se lava y se pone en contacto con una pelicula fotografica(radioautografia). Otra forma de consratar la autentic idad del.producto es disenar primersde tal forma que la region amplificada incluya uno 0 dos sitios para enzimas de

restriccion. Cuando los tubes salen del rerrnociclador, una alicuota es tratada con la0lasenzirnas de restriccion y los productos de digestion son corridos en paralelo con el

producto aruplificado no digerido. Si el tamafio de las bandas del digesto es el apropiado ala posicion de los sitios de restriccion en ciDNA target, la amplificacion fue genuina.

SC!;Jd~n£i.4§ targ~tdeBNA

Ciertos organismos como los virus pueden tenet genomas de RNA en vez de DNA.Las polimerasas de DNA no pueden replicar RNA y no existe ninguna polimerasa deRNA con las caracterfsticas de la Taq, La forma de solucionar estc defict es mediante unavariante del PClt conocida comoRT-PCR (Reverse Transcriptase-Pf'R). En estos cases elRNA es convertido en DNA de doble cadena mediante incubacion con Ia enzimatranscriptasa reversa (R>I) La RT es una enzima codificada por los retrovirus queactualmente se dispone comercialmente. Usando el RNA como templado, primers ydNTPs, 1aRT sintetiza DNA de doble cadena a partir del RNA Los protocolos actuales deRT-PCR permiten poner todos los reactivos (RNA, RI, Taq, primers, etc) en el tubofacilitando la reaccion. La reaccion de RT lleva aproximadamente una hom, tras 1 0 cuallos tubos se pasan al termociclador.

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primers se relaciona con la temperatura de annealing". Aurnentando la temperatura deannealing se mejora la discriminacion frente a primers que hibridizan incorrectamente,Por 1 0 tanto, se logra mayor especificidad. En general, se utilizan primers de iguallongitud y tm4.

3) Estructura: si se encuentran zonas de complernentariedad dentro de un primer, el mismopresentara tendencia a autohibridizar, disrninuyendo su efectividad. Igualmente, 51 exist enregiones de cornplementariedad entre los dos primers, los mismos tenderan a formatduplex, con el mismo resultado negative ..

Actualmente existen soft wares que permiten escoger los rnejores primers posibles para lasecuencia target que se desea amplificar. Estes programas consideran los puntosmencionados arriba y seleccionan el mejor par de primers "teoricos",

ConsidQrj~ciQJtG9

1) La longitud del producto arnplificado: este parametro usualmente depende del uso que sehace del Pt.R. Si el producto va a emplearse para reacciones posteriores (e.g. clonado), esmuy importante que el mismo sea copia fie! de la secuencia target. A diferencia de lapolirnerasa eucariota, la Taq no posee actividad proofreading. Por lo tanto, a mayorlongitud del producto, mayor chance de errores en la incorporacion de nucleotidos, Endiagnostico, este no suele SCI' un problema. En general, altas ternperaturas de annealing yextension y bajas concentraciones de dNTPs resultan en maxima fidelidad.

2) Concentracion de MgH: este parametro es importante ya que influye en el annealing delos primers, la especificidad del producto, y la actividad y fidelidad de la cnzima.

3) Numero de ciclos: un error comun es pensar que a mayor cantidad de ciclos mejores

resultados. Demasiados ciclos pueden aumentar la cantidad y complejidad de productosamplificados inespecificos,

De 1 0 mencionado anteriormente se deduce que antes de utilizar sistematicamente unareaccion de peR se requiere de un tiernpo de optimizacion. La obtencion de buenacantidad y calidad de producto especifico amplificado requiere encontrar los primersapropiados, la concentracion optima de Mg++, los parametres de temperatura y tiernposacordes al sistema, etc.

mycltQtor~.0js d~tos ..Pl:odw:::tos ImmUfl( :~!~IQ$

Los productos amplificados son corridos en gcles de agarosa al 0.5-] % duranteaproximadamente una hora. En paralelo se corren marcadores de peso molecular loscuales permiten deterrninar si la banda correspondiente al producto amphficado es deltamafio adecuado. Cuando se pone a punto una tecnica de peR para diagnostico, esimportante coufirmar que el producto arnplificado corresponde realmente a la secuenciatarget, sobretodo cuando se parte de genornas muy cornplejos donde no seria improbableuna amplificacion inespeclfica (aim con un tamafio del producto identico al esperado).Una forma de cornprobar Ia autenticidad del producto es mediante Southern blotting. Lasbandas del gel son transferidas a una membrana de nitrocelulosa la cual es luegoenfrentada a una sonda marcada radiactivamente. La sonda generalmente es

4 L a c orn pos ic io n de losprimers es un d ete rm in an te d e!valor T I J I >0 "melting temperature", la temperatura a lacual se separan las eadenas de un D NA. Amayor contenido en GC , m ayor~II' La temperatura de annealing parael peR generalmente es 5 CPOI' debajo del T",de los primers.

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virologia guia de tp

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