CU9700458

2NICÁY ENSAYOS IMMUNORADIOMETRICOS

THE RADIOMMUNOANALISIS

Caso, R.

Centro de Isótopos, La Habana (CU)

La Habana, Cuba1997

VOL 2 8 .fe

Técnicas Isotópicas para hummodiagnoslico: Radkrfnmunoanálisis y ensayosfaummoradiomét ricos.

Isotopic methods for jmiwfl»w^^#pMMi'c' The Radioünmunoassaj andimmunoradiometríc assay.

Raúl CasoCentro de Isótopos (CENTIS)

La Habana, Cuba.

¿Stityject categories: «.62.200

Key words: Kadioimtmmoíissay: Mi; antigen-nnliliody reactions;i<wiÍTia»i«>!r. vxhiR1 12. : <j\\ latt'Hui^, (jiiality coulml

Técnica* tviiíApÚMs para ininiuiorfiagmisUtu KaitioiruiíuiioauiliMs y uisavosínmiinornriiomrl ricos.

HTCSUMÜNHl presentí* trabajo brinda información acerca de los métodos isotópicos mas empleadospara el jiunuixxiiajtuostico: e) RadioiiumiJioaiiáltaiN (RÍA) y l«*s ensayosinmuiionuiioiucüicos (IRMA). Se describen los principies básicos de estos ensayos ticunión, las particularidades de la reacción nnligeno-anlicueij)o, los métodos p;ua larndioyodanon COTÍ \-l2*> de anfígenos y íuiricucrpos, asi como la purificación yuuaclefi/^cioit tlt U» mismos. Por otra i*u1e se presentan los métodos de separación, de lasfraccione unida y libre, empicados en estos tipos de ensayos. Por ultimo se ofrecen algunasconsidcrnciont-w acerca fiel control de calidad en ios úununoensayos. El trabajo concluye conlas perspeem-as do los cnsnj'os in vitro tipo RÍA c IRMA

ABSTRACTThis work offers an explanation about Hie more used isolopic lecluiiqucs forimrnunodiagnosis: the Radionnmunoassay (RIA) raid irnmtmoradiometric assay (IRMA). Itdecribes die basic principles of these assays, the antigen-antibody reaction, theradioiodiuatiou methods with 1-125 for Antigens and antibodies, the purification andcharacterization of labelled compounds. On the other hand Uie present work gives a reviewof the methods for separate the bound and free fractions. At the end it offers the principles ofthe quality control of imraunoassays and the future Unes of research in the fíeld of RIA andIRMA.

INTRODUCCIÓN

El Radioiiuminoanálisis (RÍA), así como otras metodologías relacionadas con la unióncompetitiva y no competitiva a los analitos, ha conducido a importantes avances durante lasultimas (It-cjKbi.s ei» e) campo de 1» clínica médica, esj)eciali nenie en \a endocrinología,diagnostico luiuúral, bcgukuicutú de tratamientos con diversos fármacos, etc.].A alia sensibilidad de estas técnicas nucruanalílicas permite la cuautifícación de sustanciasqiic se cnrnontnn en muy bajas concentraciones en los líquidos biológicos. Por ejemplo, las

|»i>tcicMS se luillaír en él plasma en t-oucx-iitraciones {«cornolares (10 '" M't y nim.-. i l l ,) Kl>

Dicbn inrtii.T- •I'.- ía liie iiitio>Uici.li por Herson y Yullow entre los nños 1956 y I960 cou lafinalidad rio estudiar el ínciaboltsmo de la insulina en la di:il>ck.\ oti!i>vin<lo como tui t ivo

unit \n> utoleetilii.s fíe m»til«ua jMeseiiie> en lj> nitioii.i :iiihsue>x> eonteutetirtc nnli-

i. Je i-i.tt itiixio JIM.naioii una t«.x'i»olo)jin *U- alta osrH^ilKi.J^o1

su ••':. l'i n t o |l)nn;i in'k'i<xndiente y c.¡.-.¡ simultánea. .!i.:-aiio!lt' en l';'.^" u¡i ensayo

i 5vira (telrrminaT ]".;. Mülr/andv como ivaclivo esp-i iiu-.- Jo unión l;i pi-Mcinn

pliiMii;tt)i J< it¡tus|K>it.'iilct¡i (k-1 ion i unías tirón ie:»s t I'HÍT'I.

VA l ) r CLiivl. ;mloj J e tuu> J e los nun, mn>oiUnlc,s liluas s*»l>iv el KL\ . eiinuieio nos «¡e IM>-

v o n l a j í i 5 in.V i j v i i r u a i i v n s Ao e s t o m c t o « l o :

! A l t n o ? { w t T j r i d a d y s e n s i b i l i d a d c o m p a r a d a r o n |<Ss r u c t i v í \- C!.I:-KN>-: J t 1 .K i cn ¡u ¡ ; . i - K'MI

1. HHIII IIH«-ÍI;IN NUNt«iwi«N mi r>iNleiM»lMw* luelmlo-N ik'deteinun.'icion

.'. 1,! lia !. -L ^. litcil »U .!c,..tiu4!a»

l l ' t l l i l i ) • 1 1 •<• " I t - l l l . l I ' ( ! • ! •

I'l ] H H H o!c l inios los niiiutii'H.ii.>.iNos 1;¡ unespecifico ( nins pcnemlr/ado tin aceptor) y nn íintiprno ( mas genentlizado un libando)lin \a liletHtuiH es |xwible ot**ervar una gran vantxlml de (leniHuiuAcione.s (1,-HIMS H cuín*lécuicus que uc ajustan al sistema particular que se quiere describir. Así Ben¿on y Yallow lodenomianmn radioinmunoanfilisis por competición, JHMÍS usalmn como reactivo especificode unión antisuero anti-insuhna, estableciéndose una reacción de comi«tcncia entre lasmoléculas de insulina fría y marcada pot una cantidad limitada de aitios de unión delanticuerpo. Ekin por su parte denominó a estas técnica radiohinwtuHUuilisis porsaturación,(\;inda a entender que virtualmente lodos los sitios de unión del aceptor seencuentran satinados por el antlgeno.

RADIOINMUNOANALISIS V TÉCNICAS RELACIONADAS

Posteriormente al RÍA (el cual utiliza como aceptor mi antisuero o anticuerpo que unecapccificamcntc a la sustancia por valorar), se desarrollaron una gran variedad <Je técnicas

K,pori

Radioanálisis con receptores (RRE): el aceptor es un extracto de receptores biológicosespecíficos de la sustancia por valorar.Análisis por competición proteica (CPBA): utiliza como aceptor proteínas plasmáticas,ejemplo: globulinas transportadoras.Análisis inmunoradiornétrico (IRMA): se trata de un método no competitivo, cuyofundamento se discute más adelante.Surgen también tecnologías similares en donde se excluye la utilización de un isótoporadiactivo para, la etapa, de c»an*'fi'''a/viApLos ensayos inmunoenzimáticos (HIA) son métodos no isotópicos. En este caso el ligandoes marcado con alguna enzima, ejemplo: pcroxidasa, la cual en el proceso de cuantificaciónreacciona con un sustrato que produce un compuesto coloreado en solución o cuantificablemediante el uso de un espectrofotómetro, colorímetro ó fluorimetro.Otros métodos no isotópicos se basan en el mareaje del ligando con sustanciasfluorescentes. La cuantiiícación en este caso se basa en la polarización de la luzfluorescente. Una interesante extensión de estos métodos ae basa en el empleo decompuestos de europio usados para el mareaje del ligando.* Estos compuestos emiten la luzfluorescente solamente después de un cierto tiempo de exitación. lo que ha pernulidomejorar las sensibilidades de los mismos.Sin einlwrgo hoy por hoy los n>étodos radioisotópicos continúan utilizándose debido a lasimplicidad de lodos los procedimientos de mareaje y la posibilidad de producir todos losconiponcnies de los Kits cu la mayoría de los lalxiratorios J-a tabla 1 refleja en i^reientos,las detmninaciones realizadas *x>r diferentes métodos inmunolócicos (J< s tintos fueronI Í N >U- d i s i e n t e s rcvistiis ini.cnincioiiiilcs que «Uiuvirotí el |xjn.>.t<> <!<•

lalil-i I ! X' ienni t ia t innc; ; rcili/-i<vi.s jxjr d i i e a n i c metívinr, íMiui.Hiolnpu <>';

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7 I16.1

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°A> I so tóp icos 'Vo N o isotópicos

K7.I

El esquema 1 muestra un resumen de los métodos iumunológicos empleador aclualmcnte.

En el esquema la división de los ensayos de unión se basa en la naturaleza del aceptar:• inmunoensayos: en donde el aceptor es el anticuerpo.• análisÍBÍB por competición proteica, en donde el aeeptor son proteínas transportadorasplasmáticas.• ensayos de receptores: en donde se utiliza los receptores celulares como aceptor.

* • - • ?

ENSAYOS DE MATERIALES BIOLÓGICOS

ENSAYOSBIOLÓGICOS

Se mide actividadbiológica que implicaunión a receptar celulary respuesta bioquímica

ANTICUERPOS

Ligandomarcado

Aceptormarcado

Isótopo Comp. FluorescLuminiscente

EnzimaIsótopo

ENSAYOS DEUNION

Tipos de aceptorea

RECEPTORES

Ligandomarcado

Isótopo Enzima

nENSAYOSFÍSICO-QUÍMICOS

Se determinan laspropiedades fisico

química del compuesto

PROTEÍNASTRANSPORTADORASDEL PLASMA

Ligandomarcado

EIANÍA FIA/UA IRMA

MÉTODO DIZ ENSAYOr ~«RA

PRINCIPIOS BÁSICOS I)K LOS KNSAYOS I)K UNION.

Estos métodos podemos agruparlos en dos tipos de ensayos cuyos fundHiuentott düíeren:I. Enuyos Competitivos,II. Ensayos Nó Competitivos.

I. Ensayos Competitivos.

Se denominan asi a aquellos métodos basados en la competición entre el ligando y elradioligando por un numero limitado de sitios de unión del aceptar especifico.El más difundido de estos métodos es el radtoinmunoanálisis, en cuyo caso el aceptarespecifico es un anticuerpo (Ac), al ligando se le A>nrtmirai antigeno (Ag) y al radioligando,antigeno macado (Ag ) ó trazador.Poseen básicamente el mismo fundamento los ensayos por competición proteica y losanálisis con receptores. -Analizaremos los principios del RÍA para ejemplificar los ensayo» competitivos.

a. el antlgeno, que es la sustancia por valorar, presente en las muestras incógnitas y en los

b. elÁg'^qoe ae tnta de la misma especié molecular del Ag al cual se le ha incorporado un

c. el anticuerpo especifico.d. un sistema de separación.

En el gjfffrTT"» ponemos una rff«ti4yd fija de trazador y una cantidad fija y limitada del Ac,tal que el número de sitios del Ac se encuentre en defecto, por ejemplo el Ac une 30-50 %del trazador. Al agregar a dicho sistema una cierta cantidad de Ag frió se establecerá unaoomp«t*oo¡a «nir» «1 Ag y «1 Ag* por «1 A© (Figura 2).

Si luego de cierto tiempo de incubación, necesario para alcanzar el equilibrio, separamoseficiememente las moléculas del Ag* y Ag unidas al Ac de los que se encuentran libre, lamedida de radiactividad presente en la fracción unida guarda una relación inversa con lacantidad de antigeno frió presente en el medio de reacción. Es decir a mayor masa deontigeno (Ag) menos actividad en la fracción unida (Figura 2).

1 jg 2. Esquema del HTA.

1.

Complejo Ag-AcI nut ion Uiiith í

2.

-f

Complejo Ag-Ac Ag LibreF. Unida (B) F. Libre (F)

- * _f * .

Compro Ag-Ac AglüxeF.UnidaíB) F. libre <F)

O

O

O

o

Complejo Ag-Ac Ag LibreF. Unida (B) F. Librc (F)

Véi\ac como a medida que aumenta [ O ] disminuye la actividad de D ó aumenta lancfivjdíid de 1*.

Kti el esquema:

OTno

Si de esta manera procesamos estándares de concentración conocida de la sustancia porvnlorfti. {xxleinoa connlnm lum CIHV/I «íccnlilnwcióii re|>rcí»cnífmdo \n nc<ivi<ínfí moríiHn en \nTiacciún \niiib de cad-'i vuio de los estáinJarcs cu iuncióik ¿le MI eone*intrí»cu'm (I ip *i

Fig 3. Curva de calibración del RÍA.

B t

B¡

En dicha curva te extrapolan los valores de actividad medida de la fracción unida d» lasmuestras desconocidas y obtenemos la concentración de las mismas.Existen otras formas de representación gráfica de la curva de calibración; 1/Bo, T/Bo, Bo/B,F/B en función de la oaaceatracióa ó logaritmo de la oonoentntción.Se h*Ti api irado 'fiyrrrt*^ métodos t*w* **nftt*coi> para el ajuste de 1& curva, como son¿

•. -métodos díaregreiion0mftfl1i?aicion de la curva). .. ¿;l

• • • • ñ ^ í - ' . M m - • • • ' • •• • • • ^ v - i ^ • • • • - . - . . . • •

Log métodos de wgjyito lineal son los mas usados y «e basan en la determinación pormétodos ¿oadrados) del interoccto y la peodieote. Esto métodopennite mtnimÍ7aT la difefcncia entre el valor experimental y el valor dado por la teda deajusta para distintos valores de X.La linealización de la curva se deriva de la función:

1 de la cual obtenemos

+ pXi - y

Para que la liaeolizocióii sea una lloea recta se debe emplear log de la concentración ó sea

Ventajas de este método de representación granea.1 Solamente 2 parámetros son ajustables.2. Iírtjo conicioiies ideales ( relación Ag/Ac óptima y sitios de unión del Ac CMHI

[Y- -1 (lofrX) ó -2.303 (logioX).3. Se simplifica la construcción de los límites de confianza al 95% alrededor de la línea.4. Fácil aplicación de los métodos de control de entidad de la curva estándar.

Para el ajuste de la curva de patrones a una linca se puede emplear la regresión linealponderada, eslo es debido a que en la regresión lineal simple las respuestas variables de losdistintos niveles de dosis dan igual constribución a la derivación de la ¡Elidiente. Sin

A) t i l \n »t-}>ieíiii>ii |H>n«krt<u~la la (Ksiuheiile «e deüvin <\e los puntos vnrinblcfi mrts

\

l**ifi 4. Regresión lineal ajiiiplt' y ponderad;]

xlogitY logitY

Regresión lineal log CSimple

Reacción antigeno^anticuerpo.

Regresión lineal log CPonderada

La reacción de una molécula de anticuerpo con un antigeno forma el complejo antigeno-anticuerpo que es reversible:

s Ag + Ac « * Ag - Ac

Las fuerzas que facilitan la unión anrlgeno-anticoerpo no son de origen covalente, diferentesformas de unión oonatribuyen a la fonnaokm de orto complejo:1. Electrostáticas (atracción de átomos cargados positivos y negativos).2. Puentes de Hidrógeno (atracción entre átomos polarizados opuestos de hidrógeno yoxigeno).3. Van Def Waals (atraocióti cutre elootróaos y núakx» «támiaon).4. London (depende de polaridad electrónica de grupos interactivos),etc.

Eü Ú equilibrio ite puede aplioar hi Ley de acción de masas y las velooidadoa do la roaootóade asociación y disociación se igualan y por lo tatito se obtiene:

Ka = )£L_= t Ag - Ac }k? " [Agí |Ac]

[ AgJ concentración molar del antigeno l({>re| Ac] concentración molar del anticuerpo librej Ag-Ac) concentración molar del complejoKa constante de aíluidad del anücucnx) (L/M).

J n Kn da cuenta de la avidez, de la unión entre el upando y e! aceptor Cnanto mayor sea Ka,HtHyor Htnn \n píxuxwckrti fie RMCtantes en 1« Awinfl unkla, mm ve/, nlcnnzado el equilibrioD;ulo que las concentraciones de los rcacUuitcs en C*UM sislcinas es muy K'ija, Ka del» scimuy alia para dar una unión suficiente, que nos pcnniüi efectuar la determinación de

s [v>r tanto cuanto mayor sea la avidez del antisucro ]xv el antigeno, mayor sera la] ó Midml «le niwtnncin w ,M»^r

La Ka de loe Ac que se usan en RÍA están enire 109 - 1012 IVM. La digminución de la Kapuede estar dado por las grandes moléculas proteicas, debido a que cuando estas se unenpueden Moquear para las otras moléculas proteicas los punios antigénioos del anticuerpo.La sensibilidad de los Ac es aproximadamente I/Ka, ó sea que la concentración menor quepuede detectarse por RÍA seria aproximadamente 101 2 M, ó sea pmol/L.

Scatchard Plot.

En 1949, Scatchard propuso un tipo de análisis en que se obtienen por deduccionesmatemáticas simples de los datos obtenidos en forma experimental, los valores para la Ka yel número de sitios de unión del Ac. Este upo de análisis se aplica a toda reacción ligando-acsplor, an fVwKfo se puodan identificar las fracciones libros y

Partimos de la ecuación de la Ka:

0)

La cantidad total de Ac presente en el medio de reacción, esta definida por el AC unido alMÍ i*

[Ac total] = [Ac libre] + [Ag-Ac]

La forma de conocer la proporción de las fracciones libre y unida del Ag es por medio de la

La cantidad de Ac no reactivo (libre) seria:

[Ac] - [Ac total] - IAg-Ac]

reajustando la expresión (1) y sustituyendo en ella la (3) tenemos:

lAg-Ao]-KnIAgHAc]íAg-Acj = KalAg] QAo total] - [Ac-Ag])

Si agrupamos en un mismo miembro de la ecuación la tracciones libre y unida del Ag,por lo ouantifiooojtWi tfcj trtwackw tomlnjrmwi:

- Ka[Ac total] - Ka[Ag-Ac] ó B/F - Ka q - Ka B|Ag]

I ' l l >

]j-autigcuo unidoJ' -antlgciio Ubre

tío

Ul da táúeui Ao lUuAti ÍUJ Au.

< )btciifiuos <Jc esta maiicm una iwta c*ui iludiente ncpaiiva (Pip ."•), que nos rtim:V.n \n i>inintntl(D ti» «fitlitlnt) |xM lo jxm<tio«nrv

. t . . U H Ü Í I I H U I A I I . 1 . . « l i i . w .U» n i » . vi> • U l •"»•• | « M ni i h l w i - l ' l » M« *\ r i f v i U / 1 ' «U

Fig S. Gráfico del Scatcbard.B/F * .

»Ka (Ac policlonal.puede resolverse en doscomponentes de pendiente diferente)

* Ka (Ac monoclonal)

« B

En Ja mayoría de los «mayos «1 gráfico del Scaichard no es una roda sino una curva (Pig 5),que refleja la heterogeneidad del antisuero polidonal (contiene más de una especiemolecular de anticuerpo, cada uno con diferente afinidad por el ligando), en este caso seresuelve en dos ootnponóntca oon diferente pendiente (ó 00a düoronte Ka).En cambio se obtiene una recta cuando se encuentra presente una única espacie da sitie* de

del Ac, el cual se une a un atrHgre"» o un epitope detenninado del Ag (Ac

" : V Xa Kii que se ha definido basta el mor"*"**» pennite detenninar la afinidadintrínseca que seN. considera la suma de las faenas no covalentes de aíracción y repulsion resultante de la'h-^-'péaabáín del sitio de combioacióo del anticwapo y el detenninanto antigénico y

' correspondiente en el equilibrio.La afinidad funcional se relaciona con la reacción entre un antigeno bivalente o polivalentey un anticuerpo bivalente o polivalente y se caracteriza por un valor numérico.En cambio la avidez de los anticuerpos es un término descriptivo que se refiere alestablecimiento de los complejos formados por anticuerpos multivalentea y antígenosmuhivalentes, lo cual es facilitado por un número grande de eprtopes sobre el antígeno,muchos sitios de combinación sobre el Ac, muchos anticueqxjs diferentes reaccionando conuna variedad de determinantes sobre el Ag* la afinidad de tos sitios individuales del Agy elAc. ' 3

La multivaiencia de los antígenos permite el aumento de la afinidad 10 veces en la IgG y107 veces eu la IgM y se explica por el efecto extra de unión. Cada enlace Ag-Ac esreversible y con una sola unión por un sólo Ac entre dos moléculas de anttgeno, ladisociación «Je cualquiera de los dos enlaces permite el escape de una molécula de Ag, siliay dos uniones por dos anticuerpos aunque un enlace se disocie, el otro evita que lamolécula de Ag escape y la mantiene en posición para establecer el enlace roto. Por otraparte entran a jugar otras interacciones no especificas que aumentan la afinidad por ejemploIHN interacciones entre los Fe (fragmentos atnstantes) de los Ac.

Para determinar la afinidad funcional de los anticuerpos bivalentes o jxvlivalenlcs se utilizanlos siguientes conceptos:Constante de afinidad promedio (Ko) ó constante medio intrínseca Se determina CAMIH> lapendiente de la recta trazada en el punto de 50 % de ocupación de los sitios de combinacióndel anticuerjHi, ó sen [StJ/2, donde |St| es la concentración total <lc los sitios de unión del Ac

C t instante averoy.e (Kaw): (.'orresjxmdea un pionirdiode- las afinidades di> VA j^nhliuión de\ :»nt¡ciu>nfc*' v NI- determina romo la |R¡udicii«e de L'i recta que UIJC los cxtieiuo:-. «K I» curva

del S'-MK-Iülltl UlJ'/y)

\

Fig 6. Determinación de la Ko y Kave de los anlisueros.

B/F\ \ \

Kave

ÍSt] B

Por SU parte el índice de heterogeneidad (a) de los anticuerpos nos da la medida de ladispersión de Ko ó Kave, su valor es d© 0 - 1 y mientras mas cercano a 0, inás heterogéneaes la muestra. Paca su determinación se emplea la siguiente ecuación;

- a l o q C + alogKo en donde:

n: valencia del anticuerpo dada como la realación [SO/A, donde A es la concentración totaldel anticuerpo. . >;; .r. fracción de anticoerpo que ha unido antígeoo (r=B/A).a: jrylfo^ de heterogeneidad.Como resultado obtenemos una línea con pendiente positiva, cuyo valor será a.

..Vv;

De acuerdo a todo lo expresado hasta el momento podríamos definir los requisitosfundamentales para el RÍA:

I. Requerimientos de la sustancia por valorar (anatito):• la sustancia por valorar o una forma conjugada de la misma debe ser inmunogénica en

alguna especie animal, es decir inducir la producción de anticuerpos específicos• se debe diaponer de la sustancia en condiciones adecuadas (alto grado de pureza, ser

homogéneas, estables) para ser utilizada como estándar de concentración conocida.• la sustancia por valorar debe poder obtenerse altamente purificada para su posterior

marcación.• el estándar y el analito, presente en el suero, plasma, orina, etc, deben comportarse de la

misma manera frente al anticuerpo.

13. Requerimientos del compuesto marcado (trazador):• se debe disponer del compuesto marcado radioquímica y quünicaineutc puro y por lo

general, se requiere que posea una alta acuidad especifica.

HI. Requerimientos del anticuerpo:« debe poseer alto titulo (se utiliza aquella dilución del Ac que tenga una unión máxima

entre ?0 - MI % con el trazador).• defx» poseer alta especificidad• \n afinidad del Ac por el Ap debe ser tamo

«|i»t- bra el n»elOik>. l'Xislt* tina <<>uel«<t<ni

qtu, c:. puuxblc

clevndn mimo mñs sensible se rrqpiicrrIrt K.Ü V \n H t l I H l H ^ C ' i M t l ' l a t l <lr- í i»* í fH«K>

Knuc las desventajas qut: jxiseeu los Kadioimiiiiiioannlisisi;, jxxlenios citar.

1. Al existir competencia por el Ac, hay una cierta cantidad de sustancia por valorar quepermanece sin reaccionar lo que disminuye la sensibilidad.2. Para realizar la marcación con 1-125, la molécula por marcar debe tener restos Tirosina.Si la molécula tiene pocos restos (por ser pequeña) o si se encuentran formando parte delsitio inmunológicamente activo, incorporar un átomo tan grande como el yodo puede traerSerios inconvenientes, por ejemplo que el Ag frío y él marcado no reaccionen del mismomodo con el Ac.3. Los antigenos que se marcan son generalmente de menor peso molecular que losanticuerpos, esto implica que son más sensibles al daño radiolltioo. Además no aceptan enpromedio más de un átomo.de yodo por molécula lo que implica tener que controlarseveramente las condiciones de marcación.

H. Ensayos no competitivos.

Son los ensayos inmunoradiométricos (IRMA).Estos métodos se desarrollan después de la aparición del RÍA y fueron introducidos por

|M3ery Hales en 1968, tratando de superar las desventajas fundamentales del RÍA.

Las principales diferencias del IRMA con el RÍA son:»L»molécula manada en este' caso es el anticuerpo.

Las metodologías más usadas en los ensayos tipo IRMA son:a). Métodos que utilizan antigenos en fase sólida.b). IRMA de doble sitio.

a). Antigenos en fase sólida.Este es el método original descrito por Miles y Hales, en donde se incuba el Ac* en excesocon el Ag, luego de llegada al equilibrio la reacción, se agrega un Ag unido a una fasesólida (R)- celulosa, etc. La fase sólida fijará todo el Ac* en exceso que permaneció libre sinreaccionar (Fig 7).

Fig 7. Esquema del IRMA en el cual utiliza aniigenos unidos a fase sólida (R).

Ap + Ac • Ag - Ac + Ac(Fracción iixeesoUnida)

Ac' f K , Ac* -R(Fracción 1 ibre, fase sólida)

b). IRMA de doble sitio.

FRÍOS pueden llevarse a cnbo en fase liquida o tase sólidaA m b a s «r Iwitutn en t|tie el Ap, h i o reacción* MI una p i n n e í a elajw con el At i \s |*vi l ico h i oen exceso , luí . una segunda cLijia, se enfrenta el s i s t e m a a o l io u u l i c u u p o especif ico JJCIO

ni.'irra.fii. ' l u í a n l o conlra niro dr fcnninnnlc .'inti^.c'nin* d'.l Aj ' :• • i; • 1»_ nir,r¡:u I "'•. > ! I i n n c\/vo quert'1 t^loqucndo r n UT' L'«:nT''H"'inrh ' I ' T y '

1'ifi h Esquema del IRMA de doble siiio

Fa*e líquida Ac -< Ag • Ag - Ac

Ac'

Fose solidac + Ag

Ac - Ag - Ac*Este complejo precipita y se separa porcentrifugación.

"Ac-Ag

Ac

-Ag-Ac

. i f .••••'.' '.'•'. • En este caso se lava pant eliminarS . el exceso de Ac*.

La fose sólida puede ser papel, tubos plásticos, celulosa, etc.

Esta segunda metodología es la que mayor popularidad ha tomado y ha remplazado a-muchos RÍA debido a tres ventajas fundamentales:1. Mejor especificidad.2. Mejor precisión, '3. Mejor sensibilidad.

La mejorada especificidad puede explicarse debido al uso de dos especies de diferentesanticuerpos. Claramente si hay presente en el analito a medir dos epítopes antigénicosespecíficos, la especificidad del ensayo será mayor que en el caso dónde sólo se emplea unepítope.La mejor precisión de este tipo de análisis se debe a:a. El Ac debe encontrarse en exceso respecto al analito y por tanto la precisión de esteIjrocediniiento no es critica, esto significa que pueden ocurrir errores experimentales (porejemplo, pipeteo), siu afectar el análisis, comparado con el RÍA en dónde se empica unacantidad fijn de este reactivo y errores conducen a la pérdida de precisión.b. El empico de la tecnología de separación por fase sólida eu el KMA, el lavado repetido,la selección adecuada del ensayo y butter de lavado lian permitido manipular el componenteunión no especifica (NSB) en la respuesta, ya que mientras menores senn los NS13 mejorserá la precisión en In dosis Iwjn <U* la rurva estándar. conllevando a un análisis de mayorsensibilidad.. «I!l empleo de los antícueipos ínonuclouriles en en las técnicas de IRMA lia pcnnitul'desarrollar ensayos ninc sensibles

N\'i cual luera la niotivlologia aplicada, ante la ausencia de competerían sc observan que h

if.sjMiesIa ijue ht lee es diivclMMienir JMOJKÍKIOIIHI JI IM coiicontiac ion tie Hiihpeiio luo

presente en el tulxi de reacción. listo ijnplica que si gnificainos B : l\eonc), leudiéinou l'ig

9:

l i g 9. Representación gráfica del IRMA. Fig 10. Linealización de la curva del IRMA

13 logit H/I3o

C logC

Asi como hay ensayos de RÍA que pueden ser rectificados por el método del logit-log(linealización), hay IRMA que pueden dar una recta, cuando se gráfica logit B/Bo = f(log C)Fig 10. En casó de que el ensayo no sea rectificable por logit, lo más comunmente usado esel gráfico sigmoidal de B/Bo = fGog C) Fig 11.

Fig 11. Representación sigmoidal de la curva estándar en el IRMA.

Hleclq "Hopk" ó respuesta biiásicnI-'MO.oléelo «vuire en el IRMA tie ík»l>lo t)t«^ y c<Millev¡> a contusiones en l;i in(eipie4ación (lo

I...» iiisullaclüs. Ill hook OCUJIC cuando uuo de les rcqucriniicutüs l'-ásicos del ensayo, el

o \u \ so de Ac. iu> se sjilisiace

l'l ICIKSIIICIK> es explicado ipual (jue una curva de jnrcipitHción con ¡mtKiieqxwj Al línnl <lt*

\n i uiva 1H coiK^enliMoón <Íel Ae cu liimlH^a v C<»IIK» \H v^>ncenu>ición del l)t¿;utdo es IU.IVOÍ,

la tespuesla (a)iileos tie fracción unida) ol>sc-rvada después de la sepaiación disminuye

("<>nu> conseenencia una inisnin ícspnrsUj pudiera <JCIK(SC ¡\ dos concetiliricjoucs diferentes,

lo que puede eonllevni a una intc.rprrianón crrt'iira del resultado (Fip \.'»

!\i> Nicin | ) t ( e s p»)Siil>lr ; u i U K ' U U H la o o i K ' e n t r a i ' i o n d e l A e <MI ia i*s< s>ilui;i *..>

I .-.¡.ni u n i d o a l o s u i U > s d^ í c a c c i ^ n j ; i e l l o s U H S Í I K : ^ . c u e s t e c a s o l o ¡m jt'-¡ i...

I ¡ i . i < • f i l i h ; . ¡ - - i , i i < 1 1 I H . . , , i . , , u ; . . . . . . . , , . , , . . 1 1 - , ^ i v . . . . . .

tiKticnnn si l.'i rrr:pno::i.') cs vnhdn .1 tin

2. Imoei (in HH.IIIMIN HcciiciH tal e n tl<>* H*i|Kiiv i t v u n o n d e imjeHliHN eoii vi Ai ' e t i c a s e ,

acguido del luvudo y sigmeulc reacción con el Ac marcado. Bajo estas condicione» el oxcenode Ag IKXXIUCC una respuesta de platcu antes que el "book".

Fig 12. Efecto hook o respuesta bifásica en el IRMA de doble sitio.

Los principios de determinación de la constante de afinidad de los anticuerpos, explicadoscon anteñoñdad en kw ensayos competitivos, son válidos para este tipo de análisis puestoque también se basa en la reacción entre un aniigeno y un anticuerpo , en el que podemosidentificar las fracciones unida y libre.Los ensayos tipo IRMA tienen cierta limitación, a pesar de su probada superioridad sobre elRÍA y es que su potencialidad está limitada a la detección de 10 M- 10 I 5 M/L. Para obtenermenores sensibilidades se necesitan trazadores de mayor actividad especifica (por ejemplocompuestos fluorescentes de Europio).

PRINCIPIOS DE RADIOYODACIÓN DE ANTIGENOS Y ANTICUERPOS.

l,os radioindicadores de alta calidad constituyen una sustancia básica para losinmunoensayos radioisotópicosDiscutiiejuos algunos de los aspectos tuás iiuporlaníes relacionados con la preparación dees1 e_cornjx>ncí ite:1 Preferencia del isótopo 12M para los radioindicadores.2. Métodos utilizados para la prefwuación de 1<>,S ludioindicadoiei».3. Puiificaeiou de los trazadoiuü.-1 ('aractnri/acion de los trazadores rnrlioyoflados*». Hs(;»bilid.'id d<: los radioii

1. Prcfeicuna del .isótopo.1^\lj)aia IUÜ íadiyiüdiVarios radioisótopos luui venido utili/Andoric parn ;;er o.mplcaflos on la prepancion do.

t.'s ni las lécnic^is útunmologicas lile.1; c/uno: H ' 'l ' i. ele.xit|)ñiHtivo (i«- \n> * «mi tcr¡s>ticas ítsuiv-iiiK-lcHiis <le vsUvs i,soto|»>s se ol'rcct: cu

h. Lilila 2.

> » | H < I H < .(• . ¡< « t ' t l l t ' ) ¡ ( ' < 1 l l i | l l l < t <

C I - l u w i j ' - i ! < ' , . | . i i i i o l i . t K ' l . l l l s i i i i i t l i d . a l l . ' ( i t ' . ¿ - l i iI l l i t M i l . i <i<

l 'oi o h a |>;iilf cNle im>U>]x> jM'tiuiif o b t e n e r a l t a s H t l i v n i n d e a en]*-* i t i ca o <lt- ION «.

nwuculo.s. as I conio suficiente estabilidad de los misinos.OLru ventaja dv este isótojw es que jxüinile el mareaje directo de la mayoría de las proteínasy polipélidos y usando técnicas de conjugación permite la nuiioyodación de aquellos que nopuedan obtenerse poi vin diixxla talos ctMno loa cateroides.

Tabla 2. Cou^Kiracióu de los isótopos niás utilizados eu los ensayos innmtiológicosisotópicos

Pn>p¿e<indActividad lísf«clííca

Ci/mmolPeriodo de

semides integraciónAbundancia isotópicaEficiencia de oonteo

EnergíaMev

ToxicidadMétodo de detección

7 H29

12 afios

10'%40 % (ceutelleo

liquido)p'0.18

bajaCentelleo liquido

1601)

8 días

20%30%

p0.6Y 0.7alta

distal de centelleo

12*!

22(X)

60 días

95%70 % .

y 0.03

altaCristal de Centelleo

2. Métodos utilizados para la preparación de los radioindicadores.

Todos loa métodos pueden dividirse en dos grupos:a. Métodos de yodacion directa: el átomo de ^i. es directamente incorporado a la tirosina(y/o histidina) de las proteínas.b. Métodos indirectos de yodacion: en donde el l25I se incorpom a la molécula de unreactivo especial, el cual es acoplado covalenteuaente al antigeno.

a. Métodos de yodacion directa.En general los métodos de yodacion directa son más sencillos, involucrando una solareacción doixle el yodo se enfrenta a la proteina. COJJ esH>s métodos se obtienenreudinúeutos de yodacion mayaics, con el consecuente aumento de la actividad específica.Los métodos directos están limitados por la presencia de péptidos que contengan residuosque puedan ser yodados También se pueden presentar problenins si estos grupos íbrmnsiparte tlel t«iiüx> biok>gic»ii>etite activo. ()im lijx> <le prol>len»MS «SHXMJHIO « hi vixiac«Stidircctii u)iisistc cii el tliiño ocu^iouado poi lo^ icauivo:. mvoluuaJot, en Ui nuuc-iicioa.

HI principio imivcrsnl dc rndmyrvi/irioi) se mnostrn n

1 Y (complejo solvütado)

I t TYK HIS. THY Sr » M i i n > v < x l i i r n < i i »k*l i l l l l l l o ¡

tT< \\)C¡-

I'D l.'i I'MIIHT.'I ri,'i(».i f! \<i.lm- (i i v. i'.orf<vm,i'1<i n su fonnn cutAnrci I r) rn.il n<i

v li iniw t°<Hii|)lt*|i» »-.i|»nirtliiíetilt- HH> r) H^IW h»le coMipleio lenccuxin U H I ION

de los fx>lij>clnioti (iundaiucnLalincnlc eon la luusjiia, Juramente can histiduu uüijitóf ano) jwf uu mecanismo de sustitución electrulllica (St). HI exceso de agente oxidantey el resto de I* son reducidos por un agente reductor.

Entre los métodos más usados para la yodación directa se encuentran:a. Método del monocloruro de yodob. Método de la Cloramina-T.c. Marcación electrolíticad. Marcación enzimáüca.e. Marcación por yodógeno.Veremos a continuación los tres métodos más importantes de yodación directa.

Método de la Cloramina-T

Es el método más difundido para la radioyodación especialmente de proteínas de bajo pesomolecular. Este método fue publicado en 1962 por Greenwood y Hunter.La cloramina-T (que es la sal sódica del N-nwooclruro-p-talueno sulfanamida) ea aguagradualmente se descompone formando el ácido hipoclórico, el cual actúa como agenteoxidante. La reacción es detenida por la adición del agente reductor, generalmente elmetabisulñto de sodio, que reduce el exceso del agente oxidante y el T que no reaccionó. ElpH de la reacción de cloramina-T es 7.5.La reacción es técnicamente simple, rápida y se obtienen altas incorporaciones de yodo a laproteina.El principal problema ea que algunas proteínas pueden ser dafiadas fácilmente por loaagentes oxidante y reductor, por ello se recomiendan usar bajas concentraciones de estosagentes.

Kjemplo de un método de cloramina-T de nuestro lat)oratork>:

Mareaje de Tiroxina (T4):• 1 |.ig de Tj/ 5 |iL agua bidcstilada con gotas de NaOH

• )roOiNa125l• Cloramina-T 1 ing/jnl UO fig)

' • Ajytar 20 segundos» Metabisulfito de sodio 2.4 mg/mL (240• A\)licar me/x;la en columna RP-18 (11PLC), fase iuó\il Il/> aceloiútrilu : ácido

O i n t l > i . i ) u i ( i l a s I M H H Í I C I O U C K <k> l a r t ü u x u i n d e c i o u i j i i n i i i - T |>»w>íei i «>i>íe i iorKe

actividades especifica^ de proteínas. La actividad especifica leiultauk dependepriiu ijkilincnlc de h rclíicion molar enfro j^roicina y<xlo ;i£<?nfe oxidante

FMC I... UÜ jijcto«]o iui]\ suave (wir.'i inaruuioii de px.'kiuas, ti cual utiliza 1Jl a c i o j n !• -Mii.-íSíi 1 v: *».'i . ! : ! , i l i / ; i r la i r . u ( v > i i A<: O \ I , | ; H I Ó Ü >!< ! I c t i

I s l < l f | M i k v v , | , K i " U l u í i l i S i l l l . i | M I M , I K l i . l l o i n : . e n ! ' > 6 ( > .

I ;p prnteina C;;.IIKVAI;I.J.I con K\ h.i/vidoi y In Inctoperoxidasa, In reacción se inicia con lalulicion de pequeñas cantidades de peróxido de hidrógeno y es fumndn ¡KM la «die ion drcisletna ó solución tranpon.El método euziinático umüuiiiiiza el daño ocasionado a la proieioa, mantiene la integridadde su estructura,^nuitiendo obtener alto grado de conservación de actividad inmunología»y biológica.Algo de la enzaina siempre resulta mareada y no puede ser totalmente separada de laproteina debida a su peso molecular similar. Sin embargo este efecto es relativamentedespreciable debido a las pequeñas cantidades de lactoperoxidasa que se utilizan encomparación con la masa de proteina n aer marcada.

Ejemplo de marcación euídmática desarrollado en nuestro laboratorio.Mareaje de Prolactina humana.• 5 |jg Prolactina/ 25 iiL de buffer fosfato (PB) 0.05 MpH=7.4• 25 | iLdePB• lmCido I 2 5 I• 10 MLH2O2 (dilación 1/50 000)• 10 pL de lactoperoxidasa (0.5 mg/mL)• Egjf*** e incubar 3' minutos• Detener la reacción con 0.5 mL de PB 0.01M pH=7.4• Purificar en columna de ultragel ACA-54 1 X 60 cm con PBS 0.01 M pH=f7.4, .

Es un método de yodación moderno en fase heterogénea, que permite eliminar los efectos delos agentes oxidantes solubles sobre las protéiifas.El yodogeoo que ee 1,3,4,6-tetaacloro 3a-6a-difenilglucouril, es insoluble en agua y para suempleo se disuelve en diclorometano, una alícuota de esta solución es dispensada en elfondo de un tubo plástico, secada a temperatura ambiente ó en atmósfera de nitrógeno. Estostubos secos *con yodógeno adherido a las paredes se pueden conservar a - 20° C durantevarios meses.Este método fue mencionado por primera vez por Fraker y Speck en 1978.I i reacción comienza con el contacto del ^1 y la proteina a yodar cotí el yodógenoadsorbido en las paredes de los tubos de reacción. Después de algún tiempo (10 - 15IMHIUIOK) Re detiene la inacción por una simple cambio de ln mezcln de le^ocum «tc-1 vial deoxidación.liste método ofrece muy buenos resultados y elimina los efectos de Jos agentes oxidantes yreductores solubles

1 juilipío del nmeaic \A>\ vodógeno tic iiiicsüo l:ün)rntono.

M.ircviH' do l;i Hormona I uleinizanie humana (I.Ht• vial con 2 |ig de y< *.loj>eno enl(H) ¡iL de didoiomelano cvitijorado•, ? |ij< de 1 H/ 10 jtl ti.- IMi 0 1 M )>1) 7 4• O í i m i i < ! o ' " ' i

«• l i .u i ¡ c o u l . ' u ' . t t : dv. I i i . . i c l i v o s : i t iu . i t> i i :uK' . s \r~\ l:is. p a i c d e s d e l t t l l x » d e u •

• i s ! • <¡n:u t o n h I I M J ' : H Í ' l - >

v , < - ¡ M ( t i l M I I '• l l l t i M I l ' •

• uúatii i ' .'. }il. iii ]>]><). l M | i l I 7.1

• jxisai el conUuuilo cicl via! tk1 reacción a o t ro c o n 2(K) fiL l')3 0 . 0 5 M pi i 1A• lavar c) tulx> de mareaje con KI• purificar en columna de uttragel ACA-54 1 X 60 cm, eluir con PBS 0.1M

b. Métodos de yodación indirecta.Ellos métodos pueden ser utilizados para la yodación de pépüdos que no contenganresiduos tirostnicos o bien si los residuos tiroslnicos están involucrados en los centrosactivos del compuesto, lxw iniamos son empleador también para el mareaje de miNtauciait nopcpÜdicas como los esteroides.Los métodos indirectos son más complicados dado que el complejo a ser conjugado debe serpreviamente marcado con 125I, ruego purificado y finalmente incorporado a la proteina.Debido a esto, los rendimientos de marcación son menores y por k> tanto las actividadesespecificas también lo son.Como ejemplo daremos la conjugación con N-succimidil 3-(4 hidroxi-S-125-iodofenil)propkmato ó Reactivo Bolton-Hunter.

El compuesto Bolton-Hunier es previamente yodado usando el método de la Cloramina-T,posteriormente el reactivo yodado es extraído del medio acuoso por un solvente orgánico.Después de la separación; la reacción de conjugación se lleva a cabo empleando los gruposamino terminales de las proteínas.

OH

oCH2

CH2-í;_O11O

cloramina-TNal1" '

O| |

'il- CH2

—N ^ I\ : _ cil2

I !

tivo Holton-Huntcr

oV

Clh

C H 2 - CIIO

- O

Ester yodado

OI !C

-°-N< íO

O|

conjnpactón

Nil

— - N\h (CUV»,— c u1

< - ! ? > » - — I '

! ;t litsfamiiia, IIUÍIMIIIUIIICNICI, ik lamluin jmrdiu :.i i l;uilmuilt uiaicadoN poi d incu>dodc la clormnina I y pueden ser acoplados a gni|x>s tvuUfflilos dc In nii>t c-til;i uiodilUada|Mia foniuti un enlace aiuulico (ejemplo, en los estei oides).

3. Purificación de trazadores.

El objetivo do la purificación de loa trazadores es separar el compuesto nidioyodadobiológicamente activo de la mezcla dc reacción que contiene varios productos tales coinoyoduro que no reaccionó, agentes oxidante y reductor, com|>uesto no yodado u otros que sise yodaron pero no son de ínteres, asi como el material dañado producto dc la reacción.Para estos ¡iropósitoa se han desarrollado una variedad de metodologías. En la tnbla 3 acofrecen los me todos actualmente más ornplaadoa.

Tabla 3. Métodos de purificación del trazador.Método depurificaciónIIPLC-RPCromatografíaliquida de altapresión, faserevenía

Ejemplo decompuestosnucleotídospéptidosesteroides

Características del método

Se emplea fase reversa. En este sistema de partición la fasemóvil es más polar que la fose estacionaria. La faseestacionaria está usoalmente compuesta por partículas desilica con cadenas de hidrocarboao unidas ©ovalentemente yla fase móvü es usualmente buffer acuoso con adición desolventes orgánicos como metanol, acetonitrilo.La ventaja fundamental de este sistema es la granestabilidad de la fase estacionaria permitiendo una granflexibilidad en la selección de la fase móvil, la adición desales, cambios de pH, etc.

Cromatografíade permeaciónen gel

Proteínas En este caso debido a las interacciones bidrofóbicas fuertesgrandes(ej: que pueden establecerse entre las proteínas grandes y la faseGH, estacionaria, puede ocurrir perdida de la actividadProlactina, inmunológica y en estos casos se recomienda emplearetc) métodos de permeación en ge] basados en la exclusión

molecular.Las proteínas pueden ser excluidas usualmente con buñerfosfato a. pH neutrales.Existen columnas crornatogrúficas de este tipo para sercinplcadas_cn HPI./"..

trazadores ..radioyodndos

ciileiio.-, (nitr leti n.viist- |>HIH tleleíiiunai la talivlad »lel

,I IXIcriimiíK-ion <lc la at livulad cspccilica.

I^i nctivitliul esj)ccírica dc K>» linxmkneí< c« caí MI leí t¿mln }K>r 1H cantKÍH(i de I" inc<vr]x>m<k>cu la inolcculii. A mayor iticoqM>ración de rfi<iit)vo<lo en el compuestt). m.iyt>i acr.i la;u'liviila<J V:-.|K:* ilk^, L^lciilad.i coiH<> unidades dc radi.ic(i\idad ]V)i uiinJadcs dc masa.

I.:» ; « I i v i d . d l r \ | K ' » : i í k ' 4 « d r l o s r i H I I J H M S I H ' . l a d i o v i x h d í w n s«-t n l i l i / ^ < d < i s n i \ < \ \ <• I R M A

. 1> i « s < i ü M i t i . • i i i f i i n i ¡ i l ü » i i> o i | w i ; > ( i o n d i u n « i i . m o d o 1 i « > i i n . « l e t n l ; > . i « - « i . i . - a - l ' » I > l »

' i ' . 1 . ! : > • . A i . \ : , , u ,.;*. i l l . L l C . i d a . . . l a U U : m i n i h ^ H i i i u i l . ' . l i:., U .

I.) MKOi]xn;u ion .It- yodw, |H)i otra j>;n1t las pupaiac iones de alias a d i vid.uk s c>|x.t:ilic.i.sson generalmente menos estables que las <ic menor valor.

Pan» el cálculo de la actividad especifica (Aesp) del>e conocerse:- inasa de la sustancia radiomarcada.- total de radiactividad usada en la reacción.- rendimiento de radioyodación del compuesto marcado.

La Aesp se calcula por la expresión:

Aesp = actividad total X % rendimiento de yodaciónmasa de sustancia

marcada

La masa de la sustancia se encuentra a partir del pesaje o la concentración uaadft en lareacción. La radiactividad puede ser determinada por medición de un volumen conocido desolución de Na125I o por el uso de radiómetros.£1 rendimiento de yodación puede ser encontrado por algún método de separación, porejemplo HPLC, gel filtración, cromatografía de papel, electrofbrésis, etc.

b. Pureza radioquímica del producto marcado.

La pureza radioquímica definida como la micción de actividad total presente en la formaquímica deseada," caracteriza el contenido de impurezas radioquimica en el preparadopurificado. Los trazadores pueden contener moléculas dañadas de sustancias radioyodadas,agregados, degradados, yodo libre, etc. Alto contenido de estas sustancias én los trazadoresinfluye en la unión de los mismos con el anticuerpo.Los resultados de la pureza radioquímica son encontrados por técnicas de separación talescomo: croiualografia de papel, electroforesis, gel filtración y especialmente HPLC.Usualmentc el contenido de I libre, que es una de las principales impurezas, debe sermenor que 10%.

c. Iuniunurcactividad del producto marcado.

Este parámetro puede determinarse por:1. Unión del trazador en exceso de aotisuero

2. Comparación directa de ininuuoreactividad del trazador en el ensayo.

l>a inmutiorraclivídnd es el jwirnmetm fundiHMeni.il riel tmwidor. f-ale ptíctle determinarsejx>r la unión del mismo a un exceso oV ÍIH1».»MM"|H> es|x>ciíioo, cuya concentración sera JOVCUN> uui>oi que la usada en el ensayo de tralwjo sin la adición de oüus :uutaucia:i. Esteensayo cu un'is completo y sensible que la J»III\;//I radicKjiUniic.'»Hit e) equilibrio más de UJJ 90 % de un Imyaóot con buena tvilidad iiHininolojíitvi fiche unirseal anticuerpo CXMÍ buena calidad. Tanibícn jvxlrán uswirso tra/^idoius con inenorinmunotearlividad, p;uticularnientc aquellos que liayau sido ensajados cou anticuerposfuouvKloualcs (70 - 80 %). Valores iucn"ics que 70 % significan «juc el tray.itor see iu U ' . I U I M s c i i í i n i e i i t e d. 'tfiíido U n a l»tj:i i n t n u i K M r n c t j V T W i p u i v i c r"ir»i dr>«l'> jw^r in

o>nt ; t iu iu :n . i o n d e l I r a / a d o t t o n i n a U u a K s n>> i n i n u i t o i e i u ' t i v o ^ . )«>i e j e m p l o <lciii»lo a u n a

tv¡. . i i i i p l l.i . ' / p a n i u n í ) d e l l' h l u c o l u e n la | > i c - o u c i a d e cou l . ' i u i i iu i i i l cb i . iaica.J '»- ' i;iie n o

i c . " • ' > : • > ' • M I r l ; i t i í i . i i c i ' '

l a v.-.mwu me|.>, JL tonjpioUu la aclivkluJ ÍUIIIUIIOIOMC;I J d Ua^aJoi o ¡UÜOJUCRUJUL

«ii «I OK-.ÍVO ,lt I-'IA o IRMA y líctcnjtixiaiuio „, ,,o h.,) ¡,|toiaciones cu los iKuaiiwlms <li>edidnd .k-l ensayo, mies como unión maxima, unión no csjwíticn, determinación de hSensibilidad, OtC.

5. Estabilidad de los radioindicadores

EJ tiempo de vida media útil del radioindicador generalmente es más corto q«» «I díctelopor el tr iodo de semidesinlegración del radiouúclido I124 (60 días) y esto es debido a variosfactores:

• Descomposición radiolitica, la cual puede estar dada pordcsfompf}stnón primaria:dmcompoHÍdóu del yodo radiactivo y consecuente ionizaciónde las moléculas vecinas.

descomposición secundaria .producto de la primera descomposición, varios iones,ionradicales, radicales, moléculas excitadas y otros reaccionan con otras moléculas deltrazador.

• l)e*c«iiiijKWícíóíi química, e*t¿ causada ¡tor cambio* quimico* talas como oxidaciones,hidrólisis, etc. con lo cual puede haber ruptura de puentes disulfuros. etc.

• Daríos causados por la introducción del yodo en la proieina. La introducción de estedemeatp en jugar del hidrógeno causa una alteración en la csüuctuia de la protcina,pues el yodo es un elemento no constituyente de la protema y de dimensions grandes,

U f < 1 4 A A A i ^ i

0 principal factor que influye en la vida del radioindicador es la Aesp, mientras mayor seala incorporación del 125I en la molécula mayor serán tos daños ocasionados, por ello se debelimitar la entrada de un átomo de I2*I por molécula. Otro punto importante es la presenciadel solvente, el cual tiene gran influencia en el carácter de las moléculas formadas durante laprimera descomposición y la temperatura durante la conservación, la cual influyenotablemente en laa velocidades de las reacciones químicas. "Entre los medios -fundamentales para aumentar la estabilidad de los trazadores tenemos.1. uso de radiotrazadores de menor Aesp.2. Bajas temperaturas de conservación (menor que 0o C).3. Empleo de sustancias que inhiban la acción de radicales libres, por ejemplo etanol.4. Adición de proteínas protectoras (BSA, gelatina), las cuales puedan recibir parte de laenergía emitida de la primera descomposición

MKTODOS 1)K SEPARACIÓN EN RÍA E IRMA.

IX*sdc la introducción del iUA por Ynltnv y Hcrson. uno de los nspertev; ícemete mnsi i i ipviantrf l>« 8ido U ftojv»rj»riói» «'k* IH tin*ÍKHI unida (aiitH"»KT|x> uiml»> «I «oiíp.emV» y 1«üutcióu Iibic tauligcuo Iibrü eii la soluciou después de la üuuuuoieacciún. Las teoiicas descjiamción nlili/an las dilcicntes pj-opiedadeü Hsit\>-(juhuicas enlit ct anli^cix) en su formalünr y mnd.i, tales como carpa- lamafio. solubilidad, determinantes a«tijrrnjf.os y adsonriónninatcrialo; KólidoR.Los criteiios fuiukiucutales del uiekxio de separaciüu sou. eficicucia. que se deüiic cumo la

'i-oinplrtii si|).n;ni.'>n de las IÜUCIOIKS inu nilntni.) prolwjbili<l;t(l >lo cl?isiliv.'iito.s de formar-iTOiirn nsi COTIIO simplifidnd, eonionn;» v r.-tpuitv de la ir<rt(vjolni»i;t

' i 1 1 " " w l U '

l>"S¡¡i r h I i i ' í . - K U C i t e ; . d i f k i !

1. f "om]>orf.iiuienfo del ligando libre como Ihtuióu unidaExime siempre una fracción del ligando libre que se comporta como el unido incluso cuausencia del anticuerpo especifico, este fenómeno es conocido como error de clasificación,blancos ó unión no específica.Existen varías explicaciones a este fenómeno, uno de ello puede ser la adsorción del ligandolibre a las paredes de los tubos de ensayo, también a la presencia de tales impurezas en eltrazador que tienen propiedades químicas similares que la fracción unida. 1-a influencia delmedió de reacción es fnn anr>nnial en este aspecto, por ejemplo la presencia o ausencia desuero en el medio de incubación debe ser controlado, pues hay sistemas en doude ocasionan\m alimento significativo de la «nión inespecífica.

2. Separación incompleta de la fracción unida,- en algunos casos una proporción del Ac y por lo tanto del complejo ligando-Ac secomporta de forma similar que el ligando libre.- puede haber impurezas en el trazador que no reaccionan con el Ac y debido-a esto emergenen la fracción libre (ejemplo: yodo libre).- el proceso de separación puede conllevar a la disociación del complejo unido y la cantidad

-tte fracción übce puede ser mayor.

Las técnicas de separación podemos dividirlas en dos grupos:I. Técnicas basadas en la separación de la fracción libre.II. Técnicas basadas en la separación de la fracción unida.

L Técnicas basadas en la separación de la fracción libre.

Son técnicas DO especificas basadas en la adsorción del trazador libre en carbón dextran,silicatos u otros materiales, pero el resultado depende de: tiempo de contacto entre eladsorbente y la mezcla de reacción, temperatura, concentración de próteinas, etc. Por otra-parte el adsorbente puede competir por el ligando y conllevar a la disociación de la fracciónunida.

-Se requiere ademes de la centrifugación para la separación-del adsorbente de la mezcla dereacción.

\\. Técnicas basadas en laLseparación de Ini fracción jiinida

EsUu> podemos dividirlas cu no especificas y especifican.De los mélofios mespecifteos el más empleado es la precipitacióu química de la fraccióuunida pues las imrmnoolobiilinns tienen una de Ins solubilidades mas bnjns dentro do las|H«MtrinrtN v ptKMieit ¡>et j>rtxi|nimias con hiiltáto de amonio o 'le sodnv |xVhrtilenphív>l.cUtiuíl. l\jr ejemplo la 1)ÍG ¿.c precipita completamente cu ctauol ai 70 %. )tol¡£tiloii)ilicol *]1* "í. ¡Í tosíalo de zircouio ;il 1^ %, soluciones on lax luwlcs ]K<I*]UUILCCCU solubles la uiavoiiado lbs polipétidos pequeñosJ.;>1oh niélodotí MM i )H|>io\>s. IH> rtMjtiiereu {lenixkMi de intiiUieion MOI» tviinlos \A nVswnt;u;»ilcl mcUklo es <)ue tiende a piceipiLai' oüas proteínas constituyentes del suero y estas IICIMUMI

:I n«-ls-oiT>rr In li.irc-ión libre conduciendo :i altos valores de unión n

i "•> > r , , - i \ n i < > s <• s ) > r < i h , o s s r ( M S H i t t - t i l í i ( l i f t i | H l í u t< t t t v s \ > e t 1 1 H ,'i d f I.M l i : t e e i o n l l f i i d ' ! t « "

v i - . ! . ' A : ^ : i l i w i í e i } j . : ,

' • > • • • . . n ( . ! : ¡ t v . ; , •./.,,; , , • „ . , i ; : . r \ \ ' : r ,•! ^ ¡ ' v r | A r r ¡ i r | I ' P , , n - ••• ¡ - . • . f ; i . • ¡ a \H I . V i f , ! : . •. i-, :.

i i í K u t o i u . v c v - . a i n 1 t ' s l r j m i h l c i u a M s o l u c i o n ó c i n i \:< t r e m o d e I i l o M c . t u l i t t u i j w . , i M i l ; i m . i l

se incluye uua segunda reacción anngcim -HIIIICUI'IIM, con una concentración mas alt.n deiiiiniino^loUilinas. lín este jwiso el Ac ile la reacción pninanH m huí como AJÍ y el hepundoAc !.c iliupe contra l;m mmunogloUilinas de la-s CÜJICCÍUK un IUK cualiu. lúe producido elpuiuct Ac.) A mayor ventaja del método del doble anticuerpo, es que que puede nplicarsc a cualquier

, He logra una separación bástanle completa entre el ligando lil>rr y unido coi» Imjay precipitación ínesjxxiíjca.

1 i dtísvenJíij.'t fiitKÍimei)tal del niékxloes la imccsidad de mi IICHI¡K) adiciona! de inculviciónpara el desarrollo del precipitado (de 2A - 48 horas) Para acelerar la precipitación se utilizanmodificaciones como:1. adición al medio de incubación polímeros (polietilcnglicol 6000 o dextraua de allxi pesomolecular) que reducen el grado de ludratación del luacrocoruplejo foniiacío por el segundoAc y ol primer inmunocomplejo y asi disminuye su solubilidad permitiendo unaprecipitación más rápida.2. adición de suero portador (suero normal de conejo) que entra a formar parte de la retículadel inmunocomplejo, aumentando asi su peso molecular, permitiendo una precipitación másrápida. f 'Otra desventaja del método es la necesidad de la etapa de centrifugación después de laprecipitación. . .Una variante del método del segundo anticuerpo es el acoplamiento del mi<rmr> a una matrizsólida, con la cual se eliminan los requerimientos de adición de suero portador y polímeros,además en dependencia del tipo de fase sólida que se emplee, puede eliminarse la etapa decentrifugación. Otra variante de los métodos específicos de separación de la fracción unidaes el acoplamiento de loa primeros Ac a Tase sólida, por ello veremos a continuación losmétodos de separación basados en la fase sólida.

Métodos de fase sólida:

fin estos métodos el Ac ó aceptor está unido a una fase no soluble 1 a unión se hacepreviamente de modo que el aceptor ea insoluble desde el comienzo del ensayo,l^is matrices empleadas para estas casos son: poliestireno, polipropileno, poliacrilamida,celulosa, seplindéx, ele y se encuentran en forma de polvo, discos, rvmdas, lutxw

\. Até )>riK«s()h «k> mnioviliwicióii de Ac a fase sólida p»jedtai dividir.se en1. FÍSICOS, basados en la adsorción del Ac a la superficie del tubo de eusayo, am emliai goosle prtieeso ]Hiede ser reversible y en muchos casos poco rcproducibles..ü «.jirimicos: basados en In formación de enlaces covalentc; entre .residuos de Ac y los

s, C*MÍ lociifll he disminuye 1" dentición v itennilr IIK^O< precision.

íns ficncn sus limitaciones ya que:pe requiere de Ac cor» altos tirulos

- |HtriíícftCK>n de Ac <j*ei*ttalíñente )>it>ci|>!tacKHi química).tlccrccimicnL) de Ka de Ac unidos.¡Ardida de aclmdad ímnunológicninactivación química del Ac dumnte ni conscrvncion. emir <>ti;c:

: . i i i c n i b a i p i U i . . . . i . . l c i i i . u . t i c í . u . c u o i u L i & o i i a l L u i n . : i j t c c l i c . n i i ! i . % ( H - i n n i u t u l o u u a

:• i K ü ' i . ' i i > ! ' \\ * i : n - - - » • " • ! : ! i i n ¡ ! ' - : ': n o f J i ' ¡ H * n d ' ' ' ! u ¡ i i< J i - 1 -'a ] • i ( : . f t ; . i

M i l i ' . . { l i t i i ! ' : i ' i e l j ' I . T . i i l . i •! : . l l r ¡ i > l ' i i l m l ' l i ( l l i i l l i l . i l 1 . , . 1

Los métodos químicos se basan uu las reacciones (le iumoviluaciou tic piolciiuus ¡i I:>A|iHa )¿*s (cerneas niA« utilizadas, asi coi no los so}x>r(cs empleados eu cada caso semuestran n continuación:). 1HII»<>VIII/ACM'MI de Ac n tul*» tie poliprojMleno o polieMtiieiio niedieiiu» etilmx* vovHlcitle,utilizando la técnica del gluLaraldclúdo a través de la funnacióu de base de Schifl (ttiiión delgrupoCl |O conomino Icmunal rfc proteínas)2. Acoplamiento de Ac a celulosa micmcristalina mediante la aenvnnon con nietnjxrjodaiode Hodio.3. Acoplamiento de Ac a discos de teflóu mediante la técnica de la caiiHxlimida.

Todas estas íocnologías son cams y requieren de un elevado control en todos los posos de suobteoción.Actualmente se han desarrollado varias metodologías basadas en el mismo uijticipio de fasesólida (unión envalente) pero empleando partículas magnéticas como soporte que sonrelativamente menos caras y mas fácil de desarrollar.

De los materiales magnéticos el más comunmente utilizado para estos ñnes es la magnetita(FejO*). Batos materiales deben cumplir ciertos requisitos.- tamaño y fWreiffoo1 pequeños, de tal forma que se evite la sedimentación espontáneadurante la incubación- deben tener alta capacidad pam la captura del Ac.- tener alta suceptibilidad magnética para facilitar la rápida .sedimentación en un campomagnético de moderada intensidad.

hstas panículas usuarmente se cubren con una capa de polimero que contienen grujasfuncionales para faoilitar la union covalentede los Ac a \as pártanlas 'Hsíos {>>l»niems son:celulosa, suero de albúmina bovina polúncrizado, poHacriiamida, {A)hacroienia, agauMM,;it<}iiil derivados de silano, ck Se lia observado también que las ¡Kirtículas magnéticasTienen alta rapacidad pan? la adsorción física de las proteínas y pueden ser unlix/idis p.im¡•KA ílar Ac sin JWVIO recutamuetitocot) una cap» <le |K>limei<m

1.,'is ¡í.-itiiculns niagiic(u%'is íi IKISC <1C nnignc(i(;i rnAs ulifr/-uL-is cu f:i

en r l k t A r ( K M A en los ú l t imos artos son:

u u b o i l i m u l a (V.l)AC).

" I5:iiliciil.'i> fk' uinjyiclil.'i cubier tas con fieri vados nUjnütcos de ::)!an>> que (¡••¡•.III'IK.U :uníí¡ ' '

p n m í i n o s a t m v r ? de los cua les el Ac es í i c o p h d o u sando friTiranldehido o f-( ) / \ ( '

tila.-. ih i i l - iMlas I'«HI jH>!)«<• roleHI« eit <!<>M<kr r l Ar j•+ »•—<I*- s<-» utin<»vilt/>t«W»

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dckninnn dircciaiiicnic la ivlación seflal-niido. (inicias a la aplicación de rstas lecnica.snovedosas de tase solida se ha podido reducir considerablemente la inespecincidnd.

Entre los procedimientos más importante para Hi«njnu¿r los uniones inespecificas tenemos:1. Repunricacion del trazador.

2. Pro incubación de trazadores con matrices usadas en los ensayos, por ejemplo anticuerpomonoclonal-I1 se incuba con la matriz magnética durante unas horas a teui]>eratuniambiente, liste procedimiento es conocido como limpieza del trazador.3. Adición de suero. El suero es un fluido extremadamente heterogéneo y presenta efectospositivos para disminuir la unión inespeclfica, pero a su vez efectos negativos paradisminuir la unión especifica. Algunas proteínas del suero que probablemente no son lasmismas, actúan como competidoras ocupando sitios inespecificos y buscando sitiosespecíficos.4. Saturación de partículas magnéticas con BSA o proteínas de la leche.

Generalmente en los ensayos tipo IRMA se emplean anticuerpos policlonales purificadospara la úimovüización (Ac de captura) y los Ac monoclonales para la detección (marcados).En el caso de los RÍA la técnica más empleada es inmovilizar el segundo anticuerpo a la

CONTROL DE CALIDAD EN LOS ENSAYOS TIPO RÍA E IRMA.

El control de f*1íAtH es el conjunto de procedimientos que nos permiten evaluar lade cualquier análisis cuantitativo, específicamente en los ensayos que nos ocupan se estimala precisión, reproducibilidad y desviación. Además nos permite la identificación,cuanlificacíón y eliminación de los errores que se producen en todo análisis.Un resultado obtenido por un ensayo será confiable si el método analilico cumple con lossiguientes requisitos:• exactitud: es el grado de coherencia entre el valor obtenido a través de un análisis y laconcentración verdadera de la muestra.• precisión: es la desviación de una misma muestra alrededor de su promedio.• reproducibilidad: es la consistencia del resultado a lo largo del tiempo.• especificidad: capacidad de un anticuerpo para unirse exclusivamente a un aualito.• sensibilidad: niiuinia dosis detectable estadísticamente diferente de cero.• confíabilídad: validez del resultado obtenido e involucra todo los conceptos anteriores.

Ill» 1« (MHclicA sin cinUugo. vaina condiciones no ne cumplen cit su Mandad, va que elrebultado obtenido diferirá del resultado leal, debido a en ores que aíecUm Li piccLáóu y larejwodtu ibilidad de? ensayo.IX- lumia general los errores pueden clasificarse en:lirrores aleatorios: Reiteran tlis|)ers¿oii de los iesulta<k>s alicdedor de un V«1«M f¿ct*oia]piodueicudo imprecision. Pueden identificarse por análisis estadístico. Por ejemplo eiiuie^de ajwralo de tonteo, cnoies experimentales causados jxu pijietco, prciwraci^ti «It- muestras.UICUKIOS de pqwnición empicados, etc.¡'nun \ \i\itmain<»v. .n» »U' iwiluiale/a C«>II»IAUU' > ton<liK'<'ii «i «IVSVIHCIÓII <df,s|»la/^iiiM:i»l«>

.^JÜICIII;IUL\)) LII la mciiiuoii alc|;'indi)lu dfl vaK>i veid.-ideío. Su idcuUÍica.Ucii l\ | ) K I | | ; H I ( I | » l n r - l K I > « ¡ i - | > ; r , n l i : l ) : < ! l M n O N l i m . l t l i ' M l d e n i H i ' : . 1 l : r ; | ' " 1 U I V I n t f • > > v J i Í | < •;• i . ' : . ¡ Ü i 1 1 1 i

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H 4 41 f l t ' i * l l i tu t i v l l < » í ) . » , s . - ^ U . - t ( M * M | í ( s ( I >| u | U " 1 < S H * ' N t \* • I I H ' M I M M h ' l l f i f

l/>s emires aleatorios se tratan de eliminar pero sin embargo nunca es posible una completaeliminación, por lo tanto el control de calidad del*.* estar encaminado a eliminar \HH CHWHHH

de errare* sistemáticos.

El control de calidad de forma general podemos dividirlo en:- control de calidad interno: es el control que se realiza en el laboratorio y JXXICIIHWI dividirloen control intra análisis que evalúa la precisión y desviación de cada análisis y el interanálisis que evalúa la rcpruducibüidad y desviación de un análisis con res()ecto a otro.- control de calidad externo: es el que realiza una agencia regional, nacional o internacionaly evalúa reproducibilidad y desviación.

Los elementos fundamentales del control de calidad intra-análisis son:1. Evaluación de la curva dosis-respuesta. Los parámetros que se evalúan en cada caso son:-unión no especifica.-unión máxima del antisuero con el trazador,-dosis al 50 % de unión de la curva (ED-50).-pendiente e intercepto.

Loa tres primeros parámetros se obtendrán fácilmente con cualquier representación gráficade la curva. La pendiente puede ser obtenida de la linealización de la curva. Guando la curvase íinaalfon ]a validación de la recta se realiza mediante pruebas estadísticas tales como:coeficiente de correlación: a través de la regresión. -valor ¿^.desviación de la dosis y describe la dispersión de las estimaciones individualesalrededor de la linea de regresión al mejor ajuste de la linea recia. Si Syx es menor que 0.23obtenemos buena precisión.Prueba de Fisher (F): compara la vanan?» de dos grupos estableciendo si arabas varianzaflpertenecen a una misma población. Ésta se considera la prueba más sólida para comprobarcuan bueno es el ajuste de los puntos a la recta. Si F calculado es menor que el tabulado al95 % de confianza, la varianza no es significativa y por lo tanto la linca de regresión sepuede considerar lineal.

2. Coeficiente de variación promedio (CVP): es un índice de la precisión general del ensayo.

v Relación lesjMiesia-efToi (RRTiV n diferencia fiel OVP. la RR1Í es una medid* <le laprecision pciH-raJ de) ensayo que desenlie canto ct error en la respuesta varia según larespuesta.

•t Perlíl de Htipreosion entrega una imagen de la> ivtracleri.s ticas del em.tvo y del tnleivaioni ti dt concentración de IraU'uo para la curva dosis respuesta Permite dcíctnonai hi do:".i.s aj.xiUir de la cu.tl la <:uiv:i tiene1 una precision aceptable ícqucrida para los objcíiViV* clínicos ode investigación. Permite detenninar la sensibilidad funcional del ensayo (minima dosisdeteclnble-MI >l>>.

5 Muestras de control de calidad: se dolmen usat (res muestras de control con v;i!orrs !VIJOK.medios y altos., cubriendo el intervalo do In CHIT;! estándar I ns muestra*- t'"-|is.'"s- vrp'iráT!

i t . ¡ i i U n i . . ; . i l U n i i l u : ¡ l i U ' t l U i S ( ( l i l i l í i . \ l i l i C U " I M s l t . i u a t K u t j l i e | i l i c d i . ' > n U l l l l i í i . l i . i . > l i . l

.' i <i I e

de contacto de reactivos durante la etapa de separación, liemjx) de decantación,equilibrio inadecuado, etc-cálculo del coeficiente de vararían intra-ensayos (¡irerisión).

6. Otros coino paralelismo, recuperación, ensayo de conüules externos (QCE). etc.

elementos qtie se evalúan en el control inter-análisis son:

1. Estudio de reprodiicibilidad inter análisis con la medición de las muestras de control decalidad en cada ensayo. Estas muestras servirán para construir los gráneos de control decalidad (Shewhart), asi como para calcular el coeficiente de variación inter-analisis.

2. Perfil de imprecisión acumulados. Si el perfil de imprecisión de un ensayo determinado esmuy diferente a los anteriores podría constituir un criterio de rechazo.

3. Aplicación de test estadísticos (análisis de varianza, lest no paramétricos, etc).

Loe criterios de rechazo de un análisis son:-El ensayo es rechazado cuando un control excede la media ± 3DE (uno de ties controles).-El ensayo es rechazado cuando dos de los controles exceden media ± 2DE (dos de trescontroles).-El ensayo es rechazado cuando las Ires muestras exceden media ± IDE.

El criterio de rechazo debe ser flexible y dependerá de las características que exijan cadaensayo. Se tendrán en cuenta además todos los parámetros del control de calidad que seevalúan en cada ensayo para tomar una decisión de rechazo.

Para concluir este capitulo se ofrece una breve explicación del sistema de control de calidadque desarrolla nuestro Departamento en la producción de Kits RÍA e IRMA:Ira etapa: Aplicación del control de calidad inlrá e inler análisis a los ensayos. Cada lote deproducción está respaldado por la aplicación de los controles de calidad mencionadosanteriormente.2da eUijxi: Control del producto terminado por el Dpto de control de calidad del centro \despacho del misino cu caso que cumpla los iequisitos de control establecidos.ira etapa: Seguimiento de estudios de estabilidad Hcl producto duranic la vida útil tie!tni.siiK> .

KÍ T I VAS J)| IOS ANÁLISIS IN VITIIOTIPO HIA K IRMA

ti Oip.tinMiio lnlcni.i(.ioiu»l <Jc \u Jvnergia Alóinici cu mi rcjxHtc tuuil del program,! deinvestigación eooiditiudo 1991 - 1995, editado cu Noviembre de 1996, definió las priciiMilet.lineas (k investigación futura cu c;.ic auupo.

I i)u»aiiolk> tic nuSUxluH de úuuovilr/acion de unlicik.->|)oK en su|x;riicit de IHIKJS plásticos)Kiia RlA c IIlIylA. Aunque se luí Uabujado en cllu no se luí lüpjado optimizar unamc1odo|i>g1a para el pnx*so, ndemas son mclodos que requieren de elevado control en lodas«us eií>|>as lo epie emvueoe el

2. Desarrollo de reactivos de bajo costo para hormonas esteroideas, puesto que la principaldificultad para desarrollar un RlA específico y sensitivo de esteroides está en la preparaciónde trazadores y ant itsierjxw. • .

3. Desarrollo de Kits RIA/IRMA de bajo costo para marcadores tumorales y enfermedadesinfecciosas.

4. Preparación de proteínas humanas y hormonas pcpUdicas por el método del DNArecombinanie para ser usado como estándares e inmunógenos, teniendo en cuenta el artocosto de los materiales extraídos de hipófisis y las crecientes dificultades relacionadas con elprocesamiento de materiales biológicos. • .

JJIIÍUOGRAIJA

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