j. Soc.Cosmet.Chem.,4 1, 173-185 (May/June 1990)

Axillary malodor production: A new mechanism

(Tradução)

C. FROEBE, A. SIMONE, A. CHARIG, and E. EIGEN,Colgate-Palmolive Technical C enter,9 09 River Road,Piscataway , NJ 08854.Received Ma y 15, 1990.

SINOPSEO mecanismo proposto por Eigen (1) para a geração de mau cheiro axilar de

esteróides tem sido explorada de trabalhos anteriores indicaram que o odor axilar é, em grande parte devido aos esteróides 16,5 alpha-androstene-3 beta-ol ; e 16,5 alpha androsten-3 one . Segundo Eigen, que teorizam que as secreções apócrinos estéreis e inodoros da axila contêm esses esteróides como os sulfatos solúveis em água e glucuronidos e odor que é produzida apenas após os esteróides livres voláteis são libertados a partir destes ésteres por enzimas hidrolíticas, tais como bactérias e aril sulfatase beta-glucuronidase. O suporte para esta hipótese foi obtida através da produção de odor estéril, inodoro suor apócrina pela adição de uma das duas enzimas ou do corynebacterial estirpes que os produzem. Finalmente, a produção de mau odor esteróide pode ser impedida por inibidores de beta-glucuronidase e de arilsulfatase.

INTRODUÇÃOA axila humano é preenchido com duas classes de glândulas sudoríparas: As

glândulas écrinas produzem uma secreção aquosa em resposta ao calor. Glândulas apócrinas produzem micro gotículas de uma secreção viscosa em resposta ao estresse emocional. Suor apócrina é uma mistura complexa contendo colesterol, esteróides, lípidos e outros, bem como 10% de proteína. Ele foi reconhecido já em 1956 que o odor axilar é gerada a partir da secreção apócrinas. Embora o fluido estéril é inodoro, a acção das bactérias sobre certos componentes presentes no suor produz o odor nas axilas característica (2). Embora o ponto de vista inicial de Strauss e Kligman era que qualquer ou toda a população axilar possam causar odor, dentro de poucos anos Shehadeh e Kligman encontrado que foi causado principalmente por tipos gram-positivas (3).

Trabalhos recentes sugerem duas classes de odores na axila: ácidos graxos de cadeia curta, e.g. ácido isovalérico, e os esteróides andrógenos, especialmente o 5-alfa-androstenol e 5-alfa-androstenona (SEEF igura 1) (4). Deve ser mencionado que, enquanto estas espécies foram quimicamente identificado na axila através de métodos cromatográficos de gás, a identificação deles como odorantes axilares tem dependido meios organolépticas. Portanto, a identificação positiva destas três espécies principais como os odores axilares ainda não foi feita. De fato, outros compostos relacionados podem contribuir para o odor complexo.

Foi encontrada uma correlação entre a composição da flora das axilas e a natureza do odor produzido: Onde a população microbiana axilar é dominada por

bactérias corineformes (difteróides lipófilos) o cheiro acre (cheiro azedo; forte e penetrante) das delta-16 esteróides é aparente, enquanto que, se a axilar população é dominada por tais micrococos como Staphylococcus epidermidis, o odor a ácido isovalérico (queijo velho) prevalece odor axilar .Pronounced está correlacionada com a ocorrência da flora corineformes (5); é sobre os compostos esteróides associados a estas estirpes que esta pesquisa se concentra estudos .Muitos identificaram esteróides axilares e ligaram a sua presença com bactérias indígenas (4- 13); no entanto, o mecanismo de ação bacteriana permaneceu incerto (9,12).

Uma vez que eles não são tipicamente solúveis em água, os esteróides são normalmente transportados em corpo fluidos como seus conjugados solúveis em água ou com sulfato de ácido glucurónico (14). Quando começaram a especular sobre a origem de esteróides livres voláteis na axila, temos a hipótese de que a secreção apocrine continha os esteróides como conjugado (S1) solúvel em água. Conversão in vivo para o esteróide livre, geralmente requer a acção de enzimas hidrolíticas. Parecia provável que era a produção destas enzimas que representavam a contribuição das bactérias para a geração de odor nas axilas (Figura 2). Nós teorizou que o suor apocrine estéril iria depositar os inodoros, conjugados solúveis em água para cabelo e pele na axila, onde enzimas secretadas por bactérias locais iria liberar os, odoríferos, esteróides livres voláteis.

As enzimas esperados para hidrolisar os ésteres de esteróides pode ser qualquer uma de várias esterases exo bacterianas - por exemplo, beta-glucuronidase (beta-L) e aril sulfatase (AS). Estas enzimas podem ser detectadas com o glucuronido sintético substratos-metilumbeliferilo (4-MUG) e sulfato de 4-metilumbeliferil (MUS-4), respectivamente, ambas as quais libertar fluorescente 4-metilumbeliferona (MU 4e-) aquando da hidrólise (Figura 3) (14,15).

Estes substratos fluorogênicos são realmente modelos dos glucuronides esteróides e sulfatos. Por isso, iniciou uma série de estudos para testar a visão de Eigen, e este artigo descreve esses experimentos.

MATERIAIS B-glucuronidase de E. coli e aril sulfatase de Aerobacter aerogenes 4, -

glucuronido metilumbeliferil, sulfato de 4-metil, 4 -methylumbelliferone, e D-sacárico-delta-lactona de ácido compra foram da Sigma Chemical Co. de sódio com hexametafosfato (SPORIX) foi obtido do International Fornecimento.

Secreção apócrina foi obtido a partir de hera Research Labs (Filadélfia, PA). O fluido foi recolhido de acordo com o método descrito por Labows et al. (10). Foram utilizados onze indivíduos. A área axilar foi rapada, lavados com uma solução a 0,1% de Triton X-100, lavados com água, secos com papel absorvente, em seguida, lavado com hexano. Uma injecção intradérmica de 0,1 ml de 1: 2000 adrenalina foi realizada para estimular as glândulas apócrinos. Pipetas (10 microlitros) foram colocados diretamente sobre a pele para coletar as gotas de secreção de glândulas apócrinas. As amostras foram congeladas até estarem prontas para uso .Samples foram eluídas a partir dos tubos capilares com tampão Tris 0,1 M, pH 7,0, para utilização em estudos de odor-gerações. Culturas difteróide lipofílicos foram fornecidos pelo Dr. John Labows no Monell Chemical Senses Center (Philadelphia, PA); eles eram culturas de estirpes originalmente isoladas a partir axilas humano em Monell.

Glicinato de zinco foi preparado pelo método do Dubsky e Rabas (16): 52,5 g (0,6 mol) de glicina e 20,35 g (0,25 mol) de ZnO foram agitados em 300 g de água a 75 ° C até que uma solução límpida foi obtida, e, após arrefecimento a produto foi precipitado com 300 g de etanol. Os cristais brancos foram lavados três vezes com etanol absoluto e secou-se em vácuo. Zinco como determinado por absorção atómica foi de 27% (teórico, 30%), glicina e por Kjeldahl foi de 68% (teórico, 70%). Solubilidade do glicinato de zinco (Z n-GLY) em água a 20 ° C e pH 7,2 foi encontrada a partir da concentração de zinco de uma solução saturada de ser de 5 g / 100 ml.

MÉTODOS

PILOT STUDY

Um estudo duplo-cego triagem foi projetado para detectar as enzimas beta-G e AS nas secreções axilares. Os esfregaços foram tomadas a partir da axila de vinte homens, classificada pela profissionais de odor avaliadores (Hilltop Laboratórios, Cincinnati, OH) como 10 "high-odor formadores "e 10" formadores de baixo odor ". Tripticase placas de ágar de soja foram preparadas contendo 4 -MUS (substrato para aril sulfatase) ou 4-MUG (substrato para a beta-glucuronidase) a uma concentração de 25 ppm. Eluições dos swabs foram semeadas em ambos substratos, incubadas durante 24 horas, e a fluorescência das placas foi estimada visualmente.

Ensaio quantitativo SEMI de beta-glucuronidase e arilo Sulfatase

A conversão medida ensaios de enzima a 37 ° C dos substratos não fluorescentes 4-MUG (por beta-L) e 4 -MUS (para AS) ao produto fluorescente, 4 -MU (Figura 2). O misturas de ensaio continham:

Para estudos semiquantitativas, fluorescência foi detectada por lâmpada UV de onda longa (Black-Light Eastern Corporation, Modelo XX 15). Os efeitos de inibidores sobre as reações enzimáticas foram avaliadas por substituindo as soluções aquosas de inibidor de teste, em 0,1 mM a 100 mM, para a água. Para excluir a camuflagem da reação da fluorescência pelos inibidores, testes separados foram realizados comparando a fluorescência a partir de 4 -MU na concentração máxima esperada no misturas de reação da enzima com inibidor ou solução ou água.

Ensaios quantitativos de beta-G E AS

Vários inibidores de cada beta-L, e EA, foram ensaiados por fluorometria quantitativa.Os estudos foram realizados com um modelo Perkin-Elmer MPF-3 com uma Osram XBO alta pressão da lâmpada Xenon, usando apenas curetas de quartzo. Antes da realização de ensaios quantitativos que era necessário para determinar a absorção e emissão máximos do produto fluorescente 4 -MU, bem como uma gama de concentrações para as quais a intensidade de fluorescência desta espécie varia linearmente com a concentração. Uma solução de 4-MU, 2 micro g / ml, foi preparada em tampão Tris 0,1 M, pH 7,0. O espectro de absorção foi digitalizada, dando um máximo a 334 nm. O máximo de emissão, 444 nm, foi obtido por digitalizar o espectro de emissão, enquanto a irradiação em 334 nm. Todos os estudos de fluorescência quantitativos utilizados esses parâmetros.

As curvas de calibração linear (Figura 4) foram gerados para as gamas de concentração, (1) 0.2micro g / ml 2,0 micro-g / ml e (2) a 0,02 mcg / ml-0,2 microg / ml. Os níveis de 4-MU gerados em beta-L e AS ensaios cair gama 1. O factor de

conversão foi de 1 fluorescência it = 0,09 micro H 4-MU. As amostras foram preparadas como descrito acima. Todos os componentes (excepto a enzima) foram aquecidos a 37 ° C antes da adição da enzima. Durante os ensaios, as misturas reaccionais foram mantidas a 37ºC. Intensidades de fluorescência foram medidos como uma função do tempo.

PRODUÇÃO CHEIRO EM apócrinas SECRETION

Estéril, secreção apócrina inodoro foi eluída a partir de capilares de 1,5 ml de tampão Tris 0,1 M, p H 7,0. No primeiro estudo, o suor apócrina foi tratada com beta-glucuroneto Estéril, secreção apócrina inodoro foi eluída a partir de capilares de 1,5 ml de tampão Tris 0,1 M, p H 7,0.

No primeiro estudo, o suor apócrina foi tratada com beta-glucuronido (E. coli) e a sulfatase de arilo (Enterobacter aerogenes) às 0, 01 mg / ml em tampão Tris, 0,1 M, pH 7,0. A secreção apócrina foi também tratada com o difteróide lipofílico e com uma cultura mista de bactérias axilares, cada suspensão em solução salina estéril.

No segundo estudo, os inibidores destas duas enzimas foram incluídos na reacção de mixtures-- Zn + + como gluconato de zinco, lactona de ácido sacárico, e hexametafosfato.As amostras foram preparadas em frascos de cromatografia de gás e selada com tampas de dobre.As amostras foram incubadas a 37ºC. No primeiro estudo, a avaliação do odor foram conduzidos a 16 h e 40 h de incubação. No segundo estudo, a avaliação do odor foram realizadas às 24 h e 48 h. Odor avaliações foram realizadas por um painel de cinco, incluindo um perfumista profissional.

A atividade da enzima na célula-Mídia Livre

Diphtheroids lipofílicos foi cultivado durante 18 horas em infusão de cérebro e coração contendo 0,1% Tween 80, centrifugadas durante 20 min, e o meio sobrenadante foi filtrado através de um Filtro de 0,22 micron. A solução de substrato (2 ml de 4-MUG ou 4-MUS) foi misturado com 1 ml do meio de filtrado (ou água, como controlo).

RESULTADOS

Estudo Piloto

Um estudo duplo-cego triagem foi projetado para detectar as enzimas nas secreções axilares. Em placas projetadas para testar a beta-G, dez amostras de suor deu alta fluorescência; nove deles veio de "formadores de alto odor." Apenas um veio de um "low-odor antigo." Em placas destinadas a testar para AS, seis das oito "formadores de alto odor" foram encontrados para ter limpando contendo AS (duas amostras foram perdidos), e apenas dois dos "formadores de baixo odor" dez tinham a enzima. Este estudo mostra que, pelo menos, algumas bactérias axilares gerar esterases esteróides e que a presença destas enzimas pode ser correlacionada com o odor axilar.

ENSAIOS semiquantitativo de enzimas: efeitos de inibidores

Vários inibidores de mamíferos beta-Gs e ASs têm sido relatados na literatura (18-32). Testámos vários destes compostos, bem como materiais relacionados no nosso ensaio. O inibidor clássico de beta-G é o ácido-A-lactona sacárico (gluconolactona (24)). Nós testomos este material, bem como os açúcares simples, manose, fucose, e galactosamina, e o pululano polissacarídeo. Um dos inibidores referidos de beta-L, EDTA (21), é um forte agente quelante. Assim, também testaram o-fenantrolina, citrato, gluconato, nitrilotriacetato, e hexametafosfato contra a enzima. A tabela I resume os materiais testados.

Diversos materiais foram encontrados para inibir cada enzima, mas três dos agentes tested--Zn + +, + Cu +, e hexametafosfato - inibida tanto beta-L e A S.

Ensaios quantitativos de beta-G E AS

Os efeitos de cinco inibidores de beta-L e três inibidores de AS identificados em ensaios semi-quantitativos foram estudados quantitativamente num ensaio de fluorescência .Como nos ensaios semi-quantitativos, o progresso das reações foi indicada pelo desenvolvimento de produto fluorescente 4-MU do substratos não fluorescentes 4, - MUG e 4-MUS. Os dados foram registrados como a intensidade de emissão de fluorescência como uma função do tempo. Um exemplo representativo dos resultados destes ensaios é dada na Figura 5, que mostra o efeito da concentração sobre a gluconolactona actividade beta-L. Lotes semelhantes foram construídos para cada inibidor. Em cada concentração, o declive começando indicado velocidade de reação inicial. Estas taxas foram, então, expressa como uma fração da velocidade da reação desinibida e plotados contra o log da concentração de inibidor (figuras 6 e 7).

Para beta-L (Figura 6) a gluconolactona foi o inibidor mais eficaz (1-10 range). Os cátions bivalentes, Zn + e Cu ++, foram eficazes em aproximadamente 10-100 micro M.O. agentes sequestrantes EDTA e fenantrolina foram significativamente menos eficazes, proporcionando a inibição em níveis milimolares.

Para AS, o Cu + + íon foi mais eficaz (0,01-10 micro gama M). Zn + + e fosfato foram eficazes em 10-100 micro M. Mais microbiana AS pertence à classe de tipo I, o qual não é significativamente inibida por sulfato ou fosfato, mas a partir de Enterobacter aerogenes (a enzima) é um pouco mais sensível do que a de outras bactérias (30). Esta propriedade é evidente em nosso estudo, em que o fosfato é encontrado para ser tão eficaz como cátion zinco. Estes estudos mostram que, pelo

menos, alguns bacteriana beta-L AS e pode ser inibida por Zn, Cu, agentes quelantes, ou gluconolactona.Tem sido desde há muito reconhecido que o odor axilar surge a partir da interação das bactérias com o suor apócrina. Uma classe de esteróides livres voláteis tem sido associado com o odor axilar e com uma população bacteriana particular - os difteróides lipofílicos. Nós suspeitamos que as enzimas responsáveis por este processo seriam aqueles capazes de liberar esteróide volátil livre de esteróides conjugados inodoros presentes na secreção apocrine estéril.Mostramos que uma cultura mista de bactérias axilares produz uma beta-glucuronidase  capaz de clivar um glucuronídeos esteróide. A partir de nossos testes preliminares, nós mostromos que uma outra classe de enzimas hidrolíticas, sulfatase arilo, também esteve presente em cepas axilares.Mostramos que uma beta-glucuronidase e um sulfatase de arilo, Ambos de origem bacteriana, vai clivar compostos inodoros na secreção estéril para produzir o odor axilar distinta. Assim, as enzimas hidrolíticas estão implicados na liberação de odor.Mostramos também que um difteróide lipofílico segrega ambas as enzimas necessárias para produzir o mau odor axilar secreção de esteróides estéril. Mostrámos que a geração de odor, a partir da adição de beta-glucuronidase ou a sulfatase de arilo ou difteróide lipofílico para secreção apócrina, pode ser evitada pela inclusão do inibidor da enzima de Zn + + e um pouco reduzido por glucarolactone (que inibe apenas o beta -glucuronidase mas não aril sulfatase). Esta substancia ainda mais o papel destas enzimas bacterianas em odor axilar.

ODOR PRODUCTION FROM APOCRINE SECRETION

Nos testes preliminares, culturas mistas de bactérias axilares convertido 4 CANECA de 4-MU, a julgar pelo aparecimento de fluorescência visível. Este resultado indicou que uma ou mais estirpes de bactérias axilares são gerando beta-L. Propusemos que a atividade desta enzima em determinados conjugados esteróides presentes no suor pode produzir odor axilar. Para testar esta hipótese, a secreção estéril, inodoro, apócrina foi tratada com a enzimas bacterianas individuais, beta-glucuronidase e aril sulfatase, e também com difteróides lipofílicos (1,3) e uma cultura mista de bactérias axilares em suspensão salina estéril. O odor produzido foi julgado por um painel de cinco, incluindo um perito, um perfumista profissional. Os resultados são apresentados

na Tabela II.

Nem suor apocrine nem qualquer uma das enzimas puras exibiram odor. As culturas de diphtheroids lipofílicos, e uma população mista axilar, teve a moderado a fraco característico mau cheiro de qualquer cultura bacteriana, mas não especial odor "suado". No entanto, quando o suor apócrina foi misturada com qualquer uma das enzimas, ou com ou bacteriana cultura, um odor forte, suado foi produzido.

Para confirmar e caracterizar a implicação de diphtheroids lipofílicos, a enzimasubstratos foram expostos ao meio de cultura isento de células. O meio exibiram ambos arilo sulfatase e actividade de beta-glucoronidase.

O facto de que o odor pode ser produzido pelas enzimas por si só indica que é a sua actividade que é a causa do mau cheiro axilar essencial de esteróide, confirmando a hipótese de os testes preliminares acima. O facto de que o odor produzido por difteróides lipofílicos sozinho sugere que esta estirpe pode ser um membro da população, que produz as enzimas, e é responsável pela sua implicação na produção de odor por Leyden et al. (6) e Jackman et al. (5). A presença de atividade enzimática em meio isento de células difteróide mostra que as enzimas são extracelular. Todas as conversões enzimáticas intracelulares subseqüentes dos esteróides que podem ocorrer parecem não ser essencial para a produção de odor.

Porque a secreção estéril sozinho gerado um cheiro almiscarado fraco após incubação a 37 ° C, testamos indígena para beta-L e AS atividade: A adição de 4-MUG, o substrato de beta-L, produzido a característica de fluorescência 4-MU, mas além de 4-MUS, o substrato aS, não teve qualquer efeito. A presença de beta-L endógena na glândula apócrina foi notado separadamente por Ohkubo e Sano (24).

Inibição da CHEIRO DE apócrinas SECRETION

Os resultados do segundo estudo são apresentados na Tabela III. Mais uma vez, o odor foi gerado apenas nas amostras contendo ou secreção apocrine com enzimas ou secreção apocrine com bactérias. Zinc glycinate foi altamente eficaz na prevenção de odor; o efeito de inibir a lactona de odores, embora significativo, foi mais fraca do que a de ZnGLY em ambos os sistemas; o polifosfato (SPORIX) não teve nenhum efeito (Sabe-se que os polifosfatos são hidrolizados em solução aquosa Possivelmente SPORIX foi degradado em fragmentos inativos durante a incubação;. é um dos mais fracos inibidores de beta-G na Tabela I.).

DISCUSSÃO

Tem sido desde há muito reconhecido que o odor axilar surge a partir da interacção das bactérias com o suor apócrina. Uma classe de esteróides livres voláteis tem sido associado com o odor axilar e com uma população bacteriana particular - os difteróides lipofílicos. Nós suspeitamos que as enzimas responsáveis por este processo seriam aqueles capazes de liberar esteróide volátil livre de esteróides conjugados inodoros presentes na secreção apocrine estéril.

Mostramos que uma cultura mista de bactérias axilares produz uma beta-glucuronidase capaz de clivar um glucuronido esteróide. A partir de nossos testes preliminares, nós mostrou que uma outra classe de enzimas hidrolíticas, sulfatase arilo, também esteve presente em cepas axilares.

Mostrámos que um beta-aril sulfatase e glucuronidasne, ambos de origem bacteriana, vai clivar compostos inodoros na secreção estéril para produzir distinta odor.Assim axilar enzimas hidrolíticas estão implicados na libertação de odores.

Mostrámos também que um difteróide lipofílico segrega ( exlui ) ambas as enzimas necessárias para produzir o mau odor axilar secreção de esteróides estéril.

Mostrámos que a geração de odor, a partir da adição de beta-glucuronidase ou a sulfatase de arilo ou difteróide lipofílico para secreção apócrina, pode ser evitada pela inclusão do inibidor da enzima de Zn + + e um pouco reduzido por glucarolactone(que inibe apenas o beta-glucuronidase, mas não aril sulfatase). Esta substancia ainda mais o papel destas enzimas bacterianas em odor axilar .