wykład iv i v - biotka.mol.uj.edu.plbiotka.mol.uj.edu.pl/zbm/handouts/2004_04_therapy.pdf ·...
TRANSCRIPT
Wektory wirusowe
Wykład IV i V
Ideal vector for gene delivery:
• High transduction efficiency
• High and long-lasting transgene expression
• Cell-type specificity
• No cytotoxicity
• No induction of immune response
• High transgene capacity
• Easy for construction and multiplication
Wymagania stawiane wektorom w zależności od rodzaju choroby
1. Długotrwała lub krótkotrwała ekspresja 2. Ekspresja stała lub regulowana 3. Ekspresja systemowa lub lokalna
Wektory wirusowe
Integrujące się do chromosomów nie integrujące się
Adenowirusowe HSV
Retrowirusowe LentiwirusoweAAV
Integracja zależy od:-sekwencji LTR oraz integrazy (retrowirusy) -Sekwencji ITR oraz białka rep (AAV)
Retroviral expression Retroviral expression systemsystem
Wektory retrowirusowe
Oncoretrowirusy: mamamalian and avian C-type
Lentiwirusy: HIV and others
Spumawirusy
Konstrukcja wektorów wirusowych
1. Rozdzielenie genów oraz sekwencji działających in-cis na różne wektory plazmidowe dla uniknięcie odtworzenia wirusa poprzez rekombinację
- sekwencje kodujące niezbędne dla powstania cząstki infekcyjnej działają in-trans - stosowane w postaci plazmidów lub obecne w chromatynie komórek pakujących
2. Konstrukcja plazmidu zawierającego niezbędne sekwencje działające in-cis oraz gen terapeutyczny
Konsekwencje takich modyfikacji
1. Zniszczenie naturalnego, dobrze funkcjonującego zestawu genów, niezbędnego do powstania cząstki infekcyjnej wirusa prowadzi do zaburzenia syntezy wektorów:- mało wydajne pakowanie wektorów w porównaniu z wirusami - powstawanie dużej liczby cząstek defektywnych: niekorzystnie wpływają na transdukcję
Construction of retrovirus vector
1. Construction of retrovirus vector as a recombinant plasmid in E.coli
2. Introduction of a plasmid into a packaging cell line
3. Incorporation of vector transcripts into transmissible virus particles
4. Conversion of the transcripts into double-stranded DNA by reverse transcriptase
Schemat wektora retrowirusowego
Wektory retrowirusowe
Cechy retrowirusów Cechy zmodyfikowane
Zachowane sekwencje LTR 5’ i 3’
zachowana sekwencja ψ
Usunięcie genów gag, pol, env
wprowadzenie markera selekcyjnego
wprowadzenie genu terapeutycznego/reporterowego
cząsteczki infekcyjne wytwarzane są w komórkach pakujących
1. Ectotropic - infect only rodent cells (Eco-R receptor)
2. Xenotropic - infect most mammalianexcept rodent
3. Amphotropic - infect all mammalian (receptor Ram-1 and Glvr-1)
4. Pantropic - infect various species - VSV glicoprotein
Miano (titer)
Stężenie cząstek wirusowych i/lub liczba wirionów zdolnych do trandukcji
Liczba cząstek zdolnych do transdukcji zazwyczaj prezentuje tylko niewielką część całkowitej liczby cząstek wirusowych
Wektory retrowirusowe
Pojemność 8 kb Integracja do genomu komórki Tak Specyficzność tkankowa Tak Właściwości Transfekuje tylko
komórki dzielące się Czas trwania ekspresji DługotrwałaPoziom ekspresji Umiarkowany Bezpieczeństwo ryzyko mutagenezy
insercyjnej
Wektory lentiwirusowe
Transfekują komórki nie dzielące się
Zastąpienie wirusowego genu env (powinowactwo do komórek CD4) genem VSVG - szeroki zakres powinowactwa
Wektory lentiwirusowe oparte są na:HIV-1, HIV-2
SIV FIV
Samo-inaktywujące się wektory lentiwirusowe: delecja dolnego LTR powoduje po transdukcji transkrypcyjna inaktywację gónego LTR, ograniczając ryzyko rekombinacji i mobilizacji wektora
Wykorzystanie wektorów Wykorzystanie wektorów retrowirusowych retrowirusowych
1. Terapia niedoborów odporności – transfer limofocytów (niedobór ADA) lub komórek macierzystych (X-SCID)
2. Transfer genu samobojczego kinazy tymidynowej – zapobieganie reakcji GvH (przeszczep przeciw gospodarzowi) u pacjentów z po przeszczepie allogenicznym szpiku kostnego
Serotypy adenowirusów Serotypy adenowirusów i schorzenia przez nie wywoływane i schorzenia przez nie wywoływane
The simplest of adenoviral life cycle
Entry into the cellEntry into the cell
Uncoating ofUncoating of DNADNA
replicationreplicationtranscriptiontranscription
translationtranslation
Assembly of progeny Assembly of progeny virus particlesvirus particlesand exit from celland exit from cell
DNADNARNARNA
Funkcje genów adenowirusowych
E1A – reguluje ekspresję genów niezbędnych do replikacji genomu Ad- wyłącza nadzór białka Rb nad genami kontrolującymi metabolizm nukleotydów
i replikację DNA - interakcja z modulatorami transkrypcji:
deacetylazami histonowymi, acetylotransferazą histonową - w konsekwencji dochodzi do stabilizacji i akumulacji p53 - ponieważ nadekspresje p53 prowadzi do apoptozy komórek, wirusy uruchamiaja mechanizmy temu zapbiegające – zależne od genow E1B oraz E40rf6
E2 – koduje trzy białka zaangazowane w replikacji DNA – polimeraza DNA, białko wiążące jednoniciowe DNA oraz białko preterminalne
E3 – funkcje immunosupresyjne: gp19 – hamuje prezentację antygenów w kontekście antygenów MHC klasy II 14,7 oraz 10,4 kDa – hamuje apoptoze komórek inicjowana przez fas/fas ligand oraz TNFaPromotor białek E3 wymaga białek kodowanych przez E1
E4 – białka niezbędne do selektywnej ekspresji białek wirusowych kosztem genów komórkowych – np.. zahamowanie przenoszenia do cytoplazmy transkryptów genów komórkowych na rzeczgenów wirusowych
cdkCyclin A Rb
E2F
TTTCGCGC
c-mycc-mybcdc2 kinasePCNA
silent
cdkCyclin A Rb
E2FTTTCGCGC
c-mycc-mybcdc2 kinasePCNA
transactivate
P
Transcription factor E2F
Mann MJ, Mol Med. Today 2000
Quiescence
Proliferation
E1A Ad protein
Wejscie do komorki DNA wirusowe
NamnazanieDNAProdukcja
bialekwirusowych
Powstawnie wirusow
potomnych
Schemat dzialania adenowirusa w komórce
Receptor dla adenovirusów: CAR
Wejscie do komorki DNA wektora
NamnazanieDNAProdukcja
leczniczegobialka
Schemat dzialania wektora adenowirusowegopierwszej generacji
Adenoviruses
•• ~40 ~40 serotypes of adenovirusesserotypes of adenoviruses (for (for gene therapy typegene therapy type 2 2 andand 5 5 were usedwere used), ), causing usually mild illness in humans causing usually mild illness in humans
•• Genome consistsGenome consists a 36 a 36 kb doublekb double--stranded linearstranded linear DNA DNA withwith ITR ITR sequences at each sequences at each endend, , withwith::
Early genesEarly genes ((responsibleresponsible for for viral gene transcriptionviral gene transcription, DNA , DNA replicationreplication, , host immune host immune suppression and host cell apoptosissuppression and host cell apoptosis
Late genesLate genes ((coding proteins requiredcoding proteins required for for virus assemblyvirus assembly))
•• E1 E1 early gene is essentialearly gene is essential for for the subsequent adenoviral gene expressionthe subsequent adenoviral gene expression
leczniczy gen
region E1DNA adenowirusa
DNA wektora adenowirusowego pierwszej generacji
Adenoviral vectors
E1 E3
E2 E4
DeletionsVector Production Capacity Features
Viral protein neosynthesis, viral replicationdespite lack of E1
E1 (and E3) 7.5 kb∆E1 E1 complementing cells
Reduced viral proteinneosynthesis,
E1 and E4complementing cells
10 kbE1,E4 (and E3)∆E1E4
E1,E2A or E2B(and E3)
E1 and E2complementing cells
9 kb∆E1E2 Block of viral replicationsever inhibition of viralprotein synthesis
Benihoud K. et al. 1999. Current Opinion in Biotechnology 10: 440.
Wykorzystanie wektorów Wykorzystanie wektorów adenowirusowych adenowirusowych w terapii genowej w terapii genowej
1. Terapia błędów metabolicznych – niedobór OCT 2. Terapia chorób monogenowych – mukowiscydoza – brak efektów 3. Terapia chorób układu krążenia – transfer genów czynników angiogennych 4. Terapia nowotworów – możliwe, że toksyczność i nasilenie immunogenności
przyniesie dodatkowy efekt terapeutyczny
Adenoviral vectors of the first generation GreatGreat::•• Very high transduction efficiencyVery high transduction efficiency•• Broad host and cell type rangesBroad host and cell type ranges•• CanCan be be prepared in high titersprepared in high titers•• Can transduce mitotic andCan transduce mitotic and postpost--mitotic cellsmitotic cells•• Do not Do not integrate with genomeintegrate with genome•• Can harbor Can harbor ~ 7 ~ 7 kb of transgenekb of transgene
But:But:•• Strong immune responseStrong immune response to to viral proteins eliminate virally transduced cells withinviral proteins eliminate virally transduced cells within 30 30
daysdays•• Neutralizing antibody response prevents readministration of adenNeutralizing antibody response prevents readministration of adenovirus vector of theovirus vector of the
same same serotypeserotype
ThusThus:: Adenoviral vectors provide the highAdenoviral vectors provide the high but but transienttransient (<4 (<4 weeksweeks) )
transgene expression transgene expression
Helper-dependent adenoviral vectors
•• Very high transduction efficiencyVery high transduction efficiency
•• Broad host species and cell type rangeBroad host species and cell type range
•• CanCan transducetransduce mitotic and postmitotic and post--mitotic cellsmitotic cells
•• Can harbor ~ 35 kb (!) of Can harbor ~ 35 kb (!) of transgenetransgene
•• Do not integrate with genomeDo not integrate with genome
•• Do not produce any viral proteinsDo not produce any viral proteins
•• Show significantly reduced Show significantly reduced immunogenicityimmunogenicity in vivoin vivo
Drawback:Drawback:•• Difficult for producing in high titersDifficult for producing in high titers
Wypelniacz (intron)moze byc zastępowany leczniczym
genemSekwencja ITR(konieczna do powielenia DNA) ITRITRleczniczy genleczniczy gen
Sekwencja Ψ(konieczna zapakowania DNA do kapsydu)
Konstrukcja wektorów Konstrukcja wektorów helperhelper--dependent dependent
Sygnal pakowania DNA do kapsydu
Sygnal pakowania DNA do kapsydu
Wirus pomocniczy
loxP loxPmolekularne nozyczki
Leczniczy gen
Wektor gutless
Komorki
Powielanie DNA w komorkach
Produkuje bialka kapsydow,
NIE pakuje sie do kapsydow
Sygnal pakowania DNA do kapsydu
zostal wyciety Pakuje sie do gotowych kapsydow
Adenoviral vectorsAdenoviral vectors
No viral protein neosynthesis, No viral replication, Helpervirus contaminants (<0.1%)
∆E1 E1 (and E3) E1 complementing cells 7.5 kb Viral protein neosynthesis, viral replicationdespite lack of E1
∆E1E4 E1,E4 (and E3) E1 and E4complementing cells
10 kb Reduced viral proteinneosynthesis,
∆E1E2 E1,E2A or E2B(and E3)
E1 and E2complementing cells
9 kb Block of viral replicationsever inhibition of viralprotein synthesis
Gutless All viral genes E1 complementing cells,helper virus
36 kb
Vector Deletions Production Capacity Features
E1 E3
E2 E4
Benihoud K. et al. 1999. Current Opinion in Biotechnology 10: 440.
Wektory AAV Wektory AAV
Wirusy związane z Wirusy związane z adenowirusamiadenowirusami (AAV) (AAV)
Małe, niepatogenne wirusy DNA jednoniciowe
Do replikacji wymagają dodatkowych genów dostarczanych przez inne wirusy (adenowirusy lub wirusa opryszczki)
Integrują do DNA w chromosomie 19
Infekują wiele typów komórek: Wiązanie AAV-2 do komórek odbywa się poprzez siarczan heparanu. Wejście do komórek –poprzez integrynę αVβ5 oraz receptor dla FGF-2
Wirusy związane z Wirusy związane z adenowirusamiadenowirusami (AAV) (AAV)
Małe, niepatogenne wirusy DNA jednoniciowe
Do replikacji wymagają dodatkowych genów dostarczanych przez inne wirusy (adenowirusy lub wirusa opryszczki)
Genom AAV – 4681 nukleotydów, na końcach 145 nukleotydowe ITR (inverted terminal repeats)
ITR – niezbędne in cis – miejsce inicjacji replikacji - sygnał pakowania do kapsydu - integracja do genomu komórki - uwolnienie z chromosomu (w przypadku wektorów z rekombinantowego plazmidu)
SiteSite--specificspecific integrationintegration• AAV integrates usually stably into
a specific site on chromosome19q13.3 (AAVS1)
• Integration region- AAVS1 (RBS,TRS)
• Rep78 and Rep68 bind to a 109 bp DNA fragment near AAVS1 andcan mediate complex formation(DNA of chromosome 19 andAAV harpin DNA)
• Viral DNA replication withinAAVS1 are likely involved in site-specific integration;
Wektory AAV
usunięcie genów rep i cap wprowadzenie genu terapeutycznego
ITRITR
Wektory AAV Wektory AAV
- utrata zdolności do specyficznej integracji w chromosomie 19spowodowane brakiem białek Rep68 oraz Rep78
- integracja niespecyficzna (z niską, około 5-10 % wydajnośćia) - wystepują w postaci episomalnej
Serotypy AAV
5 serotypów (ostatnio doniesienia o szóstym)
Wystepują przeciwciała neutralizujące, ale nie zapobiegają ponownej infekcji – istotne dla Wykorzystania AAV w terapii genowej
- receptorem dla serotypu AAV-5 - PDGFR
AAV Helper-Free System
Do powstania AAV potrzebne sa tylko następujące geny adenowirusa: E1, E2A, E4 oraz VA
AAV Helper-Free System
- Safe, no adenovirus required - Stable expression in dividing and non-dividing cells - Broad host range - Infects both dividing and non-dividing cells - High titer virus - Up to 100% transduction efficiency, even on
difficult-to-transfect cell lines - Lower toxicity vs. non-viral methods of gene
delivery
Vectors in Vectors in AAV AAV helperhelper--free free systemsystem
HelperHelper--free production of free production of AAV AAV vectors vectors (2) (2)
Cechy wektorów AAV Cechy wektorów AAV
Zalety
1. Długotrwała ekspresja – integracja do genomu, także postać episomalna
2. Slutecznie transdukują wiele typów komórek, także w stanie spoczynku;
3. Wirusy niepatogenne, prawdopodobnie niskie ryzyko komórkowej odpowiedzi immunologicznej, ograniczone ponadto przez usunięcie sekwencji wirusowych
Ograniczenia
1. Niespecyficzna integracja (po usunięciu sekwencji rep)2. Mała pojemność – maks. 4 kb 3. Problemy z transdukcją niektórych typów komórek – próby ukierunkowania4. Trudność uzyskania odpowiednio dużej ilości cząstek wirusa5. Możliwość odpowiedzi humoralnej – przeciwciała rozpoznające białka otoczki
AAVAAV-- konkatameryzacjakonkatameryzacja
Zastosowanie wektorów AAV w terapii genowej Zastosowanie wektorów AAV w terapii genowej
1. Choroby układu nerwowego – np. choroba Canvana 2. Mukowiscydoza 3. Hemofilia – transfer genu czynnika IX do mięśni nóg
Wirus opryszczki (HSVWirus opryszczki (HSV--1)1)
Zalety bardzo duży genom – 152 kbp – liniowy, dwuniciowy DNA, zawiera przynajmniej 84 geny (ciągłe) – około połowa tych genów jest zbędna dla replikacji wirusa.
Możliwość wprowadzania transgenów o długości przynajmniej 30 kb
Możliwość uzyskiwania dużej liczby kopii cząstek wirusa
Nieotksyczne, mogą przebywać w stanie latencji przez długi okres czasu w komórkach
Transdukują liczne typy komórek
Ograniczenia
Brak doświadczenia z zastosowaniem rekombinowanych herpeswirusów u pacjentów
Problemy z nacelowaniem transdukcji na określony typ komórek
Zastosowanie wektorów HSVZastosowanie wektorów HSV--1 1
Badania eksperymentalne:
1. Nowotwory, w tym nowotwory układu nerwowego2. Choroby obwodowegi układu nerwowego 3. Chorby centralnego układu nerwowego 4. Uszkodzenie rdzenia kręgowego5. Leczenie bólu – transfer do nerwów czuciowych wydaje się być najbardziej obiecujący
Inne wektory wirusowe Inne wektory wirusowe
1.Retro-adenowirusy2. Wirus opryszczki 3. Wirus polio, zapalenia wątroby typu A4. Wirus Ebola...
wektor lentiwirusowy zawierający białka osłonki wirusa Ebola – transdukuje komórki nabłonka oddechowego
Wektory mieszane
1. AAV - HSV - gen Rep AAV umożliwia integrację wektora w określone miejsce na chromosomie 19
2. Retrovirus-HSV
3. Retro-adeno - wprowadzenie sekwencji LTR pozwala na integrację wektora do chromosomów komórki
- wektor taki może transfekować komórki nie dzielące się (jak adenowirus) a zarazem umożliwia trwałą ekspresję
Problemy wirusowej strategii dostarczania genów
1. Toksyczność2. Ograniczona specyficzność komórkowa 3. Ograniczona pojemność wektora 4. Problemy z syntezą i przechowywaniem 5. Ryzyko rekombinacji 6. Ryzyko transferu do komórek linii płciowej 6. Wysoki koszt