GENOTIPO

CELLULA LEUCEMICA

MORFOLOGIA

METABOLISMO

INTERAZIONI

FENOTIPO

Citogenetica Convenzionale

Citogenetica molecolare

FISH in interfase

FISH in metafase

Multi-FISH

CGH (ibridazione genomica comparativa)

CGH microarray

Citogenetica Convenzionale

Prenatale

- Amniocentesi- Villocentesi

Postnatale

- Citogenetica ematologica- Citogenetica oncologica

liquido amniotico15°-16° settimana

villi coriali10°-11° settimana

DIAGNOSTICA PRENATALE

Female with more than 35 years

Other child with chromosomal aberrations

Fetal malformation durin ecography control

Mother or father with balanced chromosomal aberration

INDICATIONS

Parents request

Spontaneous abort

15-20 ml of amniotic liquid

centrifuge

IN SITU TECHNIQUE

Petri dishes

colony check under inverted microscope

harvesting directly on a dishes

color staining and banding

karyotyping of three metaphases for each colony

Anomalie numeriche dei cromosomi sessuali

Klinefelter syndrome (XXY)47 cromosomiMaschiSintomatologia assente alla nascitasterilità

XYY syndromeMaschi con due YNormale fertilità

Turner syndrome (XO)45 cromosomiFemmineBassa statura, linfedema mani e piedi

Sindrome XXXfemmine con XXXFeconde, difficile identificazione

Numerical aberration of autosomal chromosomes

Patau syndrome (trisomy 13)

Down syndrome (trisomy 21)

Edwards syndrome (trisomy 18)

Multiple malformation (renal, cardiac)Menthal retardation

Laboratorio di citogenetica ematologica

Campioni : midollo osseo sangue periferico linfonodo

COLTURE

RACCOLTA DELLE CELLULE

PREPARAZIONE DEI VETRINI E ANALISI

PREPARAZIONE DELLE COLTURE

Midollo osseo: 19-25 X106 cellule

Sangue periferico: 19-25 X106 cellule

Linfonodo: 50-70X106 cellule

Terreno RPMI 1640+20%FCS+glutammina+pennicillina/streptomicina

Tempi: Coltura direttaColture a breve termine (24-48-72h)

RACCOLTA

Trattamento con colchicina

Soluzione ipotonica (KCl 0,075M), 10 min. 37°C

Fissativo di Carnoy (metanolo/acido acetico 3:1)

pellet citogenetico

Citogenetica convenzionale cariotipo

Citogenetica molecolare FISH

PREPARAZIONE dei VETRINI

Prelavaggio dei vetrini in etanolo

microscopio invertito

Fissaggio su piastra calda per alcuni secondi

Invecchiamento a 60°C overnight

Bandeggio

Cariotipizzazione (15-20 metafasi)

Ciclo cellulare

G-BANDING KARYOTYPE

R-BANDING KARYOTYPE

Human Chromosomes

telomere

p arm

q arm

centromere Male 46,XY

Female 46,XX

methacentricsubmethacentric

acrocentric

Dimension and centromere position

REGION

BAND

15

14

13band 5p14

An International System for Human Cytogenetic Nomenclature

ISCN

CHROMOSOME BAND AND NOMENCLATURE

Region and band are numbered

consecutively from the

centromere outward along

each chromosome arm.

The centromere (cen) itself is

designed 10.

In designating a particulary band1) the chromosome number2) the arm symbol3) the region number4) the band number

15

14

13

Conventional Cytogenetics

Normal karyotype

Abnormal karyotype Numerical abnormalities monosomies trisomies tetrasomies Structural abormalities translocations deletions inversions

Translocations reciprocal

non reciprocal2 break on donor chromosome1 break on recepient chromosome

t(8;21)(q22;q22)

terminal and interstitial deletions

inv / del(16)(q22)inv / del(16)(q22)

pericentric inversion

nl3 nl3 inv(3)(q21q26) inv(3)(q21q26)

paracentric inversion

Karyotype designationInternational System for Human Cytogenetics Nomenclature

(ISCN 2009)Examples

3) male with trisomy 8 47,XY,+8

4) female with monosomy 7 45,XX,-7

5) female with translocation 46, XX,t(9;22)(q34;q11) between chr 9 and chr 22

6) male with a deletion on 46,XY,del(5q)(q13q33)the long arm of chr 5

7) female with inversion 46,XX,inv(16)(p13q22)involved chr 16

1) normal male 46,XY

2) normal female 46,XX

Definition of “clone”

A clone is defined as a cell population derived from a single progenitor

For trisomies or structural rearrangements, the same aberration has to be present in at least two metaphases

For monosomies, the chromosome loss has to be present in at least three metaphases

Fanconi’s Anemia (autosomica recessiva)

Test al DEB o alla MMC(test di fragilità cromosomica)

- Linfociti T di sangue periferico

- Colture cellulari 72/96 h

cariotipo costituzionale

analisi di rotture e presenza di figure quadri- tetra- radiali

dopo coltura con DEB (diepossibutano) e/o MMC (Mitomicina C)

% cellule con rotture spontanee e indotte da agenti

Fanconi anemiachromosomal fragility

• Spontaneous

• Inducted by Mitomycin C, diepoxibuthan (DEB)

gapbreak tri-quadriradial

WHOWorld Health Organitazion

Classification of Tumors2001

morfologia, immunofenotipo, genetica, clinica

AMLPROGNOSIS

Translocation Genes FAB Prognosis

t(15;17)(q22;q11) PML-RARA M3 Favorable

t(8;21)(q22;q22) ETO-AML1 M2 Favorable

inv(16)(p13q22) MYH11-CBFB M4eo Favorable

inv(3)(q21q26) EVI1 M1 Unfavorable

t(8;16)(p11;p13) MOZ-CBP M4-M5 Unfavorable

t(6;9)(p23;q34) DEK-CAN M2-M4 Unfavorable

t(3;5)(q25;q35) NPM-MLF1 M6 Unfavorable

ALL PROGNOSIS

Translocation Genes Type of ALL Prognosis

t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL B-ALL, mixed ALL Unfavorable

t(11;…)(q23;…) MLL B-ALL, T-ALL Unfavorable

t(4;11)(q21;q23) MLL-AF10 B-ALL, mixed ALL Unfavorable

t(12,21)(p13;q22) ETV6-AML1 PRE-B ALL Favorable

t(8;14)(q24;q32) MYC-IgH L3 Unfavorable

t(14; )(q11; ) TCR T-ALL Unfavorable

Lesioni genetiche criptiche

traslocazioni telomeriche

microdelezioni

inserzionic-KIT FLT3 NPM1WT1

Mutazioni geniche

MLLAML1

RAS

CARIOTIPI NORMALI

t(12;21)(p13;q22) t(12;21)(p13;q22)

Cryptic

Translocation

Cryptic

Translocation

Cryptic

Translocation & Deletion

Cryptic

Translocation & Deletion

Cytogeneticst(12;21) often remain undetected

CARIOTIPO

Diagnosi

Monitoraggio della malattia (MRD)

Limiti

Citogenetica Convenzionale

Citogenetica molecolare

FISH in interfase

FISH in metafase

Multi-FISH

CGH (ibridazione genomica comparativa)

CGH microarray

Utilità nell’utilizzo della citogenetica molecolare

Cariotipo normale

Assenza di cellule in metafase (I-FISH)

Traslocazioni non discriminabili all’analisi del cariotipo

Affiliazione di linea di lesioni specifiche (FICTION)

Studio di traslocazioni rare (M-FISH)

Studio di cariotipi complessi (Multi-FISH/CGH)

Citogenetica: studio delle piastre metafasiche anomalie cromosomiche (numeriche e strutturali)

Citogenetica molecolare: Ibridazione In Situ in Fluorescenza (FISH)

FISH in interfase FICTION

FISH in metafase Multi-FISH Micro-FISH Ibridazione Genomica Comparativa (CGH)

Biologia molecolare: Southern Blot PCR (Polymerase chain reaction) Microarray (studio dell’espressione genica)

Ibridazione In Situ in Fluorescenza (FISH)

PRINCIPIO

APPLICAZIONI

VANTAGGI

TECNICA

PRINCIPIO

La FISH è una tecnica di studio del

DNA con cui, sequenze specifiche di

acido desossiribonucleico possono

essere studiate direttamente su

cromosomi, nuclei, cellule intere e

sezioni di tessuto.

IBRIDAZIONE

+DNA target Sonda marcata con aptene

DENATURAZIONE RIVELAZIONE

Ab anti-aptene

Ab

I)

II)

FISH: metodica

APPLICAZIONI

Caratterizzazione di anomalie cromosomiche sia numeriche che strutturali

Identificazione dei geni coinvolti nei punti di rottura dei riarrangiamenti cromosomici

Definizione dell’entità di un clone cellulare aberrante

Studio di cellule con cariotipo normale per l’identificazione di eventi molecolari criptici

Studio combinato fenotipo/genotipo per l’identificazione della linea cellulare a cui la cellula anormale appartiene

VANTAGGI

Studio molecolare su cellule intere e su preparati

citogenetici

Localizzazione cromosomica di eventi molecolari aberranti

Definizione quantitativa del clone cellulare anormale

Classificazione morfologica e/o fenotipica delle cellule

anormali

ANALISI IN MICROSCOPIA A FLUORESCENZA

FILTRI A SINGOLA BANDA PER LO STUDIO DI SINGOLI FLUOROCROMI

FILTRI A DOPPIA E TRIPLA BANDA PER LO STUDIO SIMULTANEO DI PIU’ SONDE MARCATE CON FLUOROCROMI DIVERSI

TELECAMERA PER LA CATTURA DEI SEGNALI

SOFTWARE DI ANALISI DI IMMAGINE

ANALISI

DNA TARGET

Campioni cellulari di sangue periferico, midollo

osseo, sezioni di tessuto

Preparato citogenetico (cellule fissate dopo lisi

della membrana cellulare), citocentrifugati,

apposizioni cellulari

Le cellule che si vogliono studiare vengono

poste su vetrini

Tipologia delle sonde di DNA utilizzabili in FISH

sonde per sequenze ripetute: regioni centromeriche regioni pericenromeriche

regioni telomeriche

sonde per sequenze specifiche: locus-specifiche gene-specifiche riarrangiamento-specifiche

sonde per interi cromosomi (painting)

sonde specifiche per il braccio corto o lungo del cromosoma

sonda Multi-FISH (24 paintings)

sonde da microdissezione cromosomica

Sonde di DNA

A doppia elicaA singola elica

Vettori : Tipo Dimensioni (kb)

cosmidi 35-45

plasmidi 35-45

PAC 100-300

BAC >300

YAC 100-1000

I-FISH

Studio di casi con cariotipo normale

Studio di casi con cariotipo non valutabile

Valutazione della MRD durante il trattamento

FISH in interfase

DNA target:

nuclei fissati

citocentrifugati di cellule intere

apposizioni di tessuto

sezioni di tessuto

cellule intere marcate con anticorpi specifici

(FICTION)

Sonde utilizzabili:

sonde centromeriche e pericentromeriche, sonde

per regioni specifiche, sonde per riarrangiamenti

genici specifici

t(9;22) (q34;q11) t(2;5)(p32;q35)

BCR

ABL Ph-

Ph+

NPM

Pattern di ibridazione normale

Pattern di ibridazione alterato

I-FISH:STUDIO

-ANOMALIE NUMERICHE

monosomie / trisomie

amplificazioni

-ANOMALIE STRUTTURALI

delezioni / duplicazioni

traslocazioni /inversioni

del(5)(q)

LSI CSF1R (5q31)/LSI D5S721:D5S23 (5p15)

del(7)(q)

LSI D7S486 (7q31)/CEP 7 (centromero)

MLF1MLF1C - 3C - 3

MLL gene - 5’ - 3’

MLL amplification

I-FISH nei trapianti sex-mismached

C-X C-Y

FISH in METAFASE

Studio di traslocazioni/geni di fusione

Definizione citogenetica di riarrangiamenti cromosomici criptici

Studio dei punti di rottura di traslocazioni rare/nuove e ancora non definite sul piano molecolare

Identificazione di nuovi geni coinvolti nella patogenesi di malattie onco-ematologiche, sindromi congenite ecc...

DNA target:

Piastre metafasiche

Sonde utilizzabili:

sonde centromeriche e pericentromeriche,

sonde per regioni genomiche specifiche (loci

e/o geni), sonde per riarrangiamenti genici

specifici, sonde microdissettate da cromosomi,

sonde painting per interi cromosomi o per un

singolo braccio cromosomico, Kit MULTI-

COLOR

FISH in METAFASE

GENE CLONING

Through breakpoint narrowing

BAC regione 1q24

1q24

1q24

SONDA PAINTING PER IL CROMOSOMA 12

MULTI-FISH

Ibridazioni in situ in fluorescenza

utilizzando simultaneamente 24

painting cromosomici che identificano

con colori diversi le 22 coppie di

cromosomi autosomici e i due

cromosomi sessuali X e Y

MULTI-FISH

Definizione di cariotipi complessi

Identificazione del materiale cromosomico che partecipa in traslocazioni non bilanciate

Identificazione di marcatori cromosomici e cromosomi ad anello

La MULTI-FISH ha il vantaggio di identificare con un singolo esperimento tutti i riarrangiamenti cromosomici presenti al cariotipo

MULTI-FISH

marker

t(5;15)

add(1)(p36)

add(9)(q34)

add(15)(p)

marker

t(5;9)

add(9)(q34) add(15)(p)add(1)(p36)

t(1;6) der(1)

marker

Multi-Banding

marker

marker

MICRO-FISH

Tecnica di FISH con sonde generate con

procedura di microdissezione cromosomica

e PCR

Produzione di sonde di DNA ottenute da

regioni cromosomiche specifiche

IL DNA cosi isolato viene amplificato con

metodica di PCR

Le sonde che possono essere generate

sono: painting per interi cromosomi, per un

braccio cromosomico, o per singole bande

cromosomiche

Studio di riarrangiamenti cariotipici non

definibili sulla base della citogenetica

convenzionale utilizzando sonde generate

da cromosomi normali

Sonde microdissettate da cromosomi

coinvolti in riarrangiamenti genici

(traslocazioni, inserzioni, marcatori, rings)

per identificare le regioni genomiche

coinvolte nel riarrangiamento specifico

MICRO-FISH

1)

Microdissezione cromosomica

da piastre metafasiche con

l’ausilio di un microscopio

ottico invertito

2)

Recupero della banda

cromosomica microdissettata

e amplificazione + marcatura

con metodica di PCR

3)

Utilizzo della sonda generata

per esperimenti di FISH in

metafase

1p36

Impossibilità di associare la lesione genetica al tipo di cellula che la possiede

sviluppo di una serie di tecniche affini per questo fine

Le metodiche fino ad ora descritte (I-FISH; M-FISH; multi-FISH)

lavorano su cellule lisate (sol. ipotonica)

FICTION(Fluorescence Immunophenotype and interphase Cytogenetics as a Tool for

Investigation Of Neoplasms)

•Analisi simultanea del genotipo e del fenotipo cellulare

•Permette l’affiliazione di linea di ciascuna anomalia genetica

•Può individuare anomalie genetiche di tipo numerico o strutturale

FICTION

Preparati cellulari: citocentrifugati

strisci di sangue midollare e periferico

sezioni di tessuto in paraffina

Caratterizzazione immunofenotipica:

anticorpo primario contro l’antigene cellulare che si vuole studiare;

cascata con 3 anticorpi policlonali legati ad un fluorocromo rosso (cy3), blu

(amca), o giallo (fluoresceina);

valutazione microscopica della fluorescenza;

fissaggio delle cellule (Sol Carnoy e paraformaldeide)

Denaturazione simultanea cellule (su vetrino) e sonda

Protocollo della I-FISH

FICTION

IMMUNOFENOTIPO:

marcatura indiretta con anticorpi monoclonali specifici per antigeni di membrana

I-FISH con sonde centromericheo locus specifiche

ANALISI in microscopia a fluorescenza CD13

BCR/ABL

B T

PLURIPOTENT STEM CELL

MYELOID MIXED PROGENITOR

PROGENITOR LYMPHOID

THYMUS

PROG. ERYTROID

PROG.MEGACA.

RED CELLS

PLATELET

PROG.GRANULO/MONOCYTE

MONO GRANU BASO EOSIN

PROG.EOSINOPHILS

LYMPHOCYTES