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Cri du Chat: dalla delezione citogenetica a quella molecolare Michela Malacarne E.O. Ospedali Galliera S.C. Laboratorio di Genetica Umana Genova San Casciano in Val di Pesa Novembre 2014 17° Raduno Nazionale Famiglie ABC Associazione Bambini Cri du chat

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Cri du Chat: dalla delezione citogenetica a quella molecolare Michela Malacarne E.O. Ospedali Galliera S.C. Laboratorio di Genetica Umana Genova

San Casciano in Val di Pesa Novembre 2014 17° Raduno Nazionale Famiglie ABC Associazione Bambini Cri du chat

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CORRELAZIONE

GENOTIPO FENOTIPO

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1971 CARIOTIPO Bande Q

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5

1971 CARIOTIPO Bande Q

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Regione critica (CdCCR) Niebuhr E et al., Hum Genet. 1978 Jun 9;42(2):143-56 “Cytologic observations in 35 individuals with a 5p- karyotype.”

5p15

•  35 CdC

•  21F/14M

DELEZIONI -  27 apparentemente terminali -  4 interstiziali -  4 da traslocazione sbilanciata

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DIAGNOSI mediante cariotipo bande Q

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1992 Ibridazione in situ non isotopica (FISH)

CARIOTIPO (citogentica standard) circa 5-8Mb

FISH (citogenetica molecolare) circa 150Kb

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Sonda marcata con fluorocromo

ibridazione

Sonda di DNA specifica per una regione

cromosomica

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IBRIDAZIONE IN SITU

Sonda marcata con fluorocromo

DENATURAZIONE IBRIDAZIONE RILEVAZIONE → →

DNA target

Separazione della doppia elica del DNA di sonda e target mediante calore

Sonda e DNA bersaglio vengono posti in contatto e questa si lega ad un sito specifico/ complementare

Mediante microscopio a fluorescenza si localizza la posizione della sonda legata al DNA di interesse

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RISULTATO FISH

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Y921-F7 5p14

Y748-C1 5p12 Y748-C1 5p12 Y816-F10 5p13 Y816-F10 5p13

breakpoint

RP11-661C8 5p15:33 RP11-661C8 5p15:33 RP11-661C8 5p15:33 Y767-E1 5p15.3 Y767-E1 5p15.3 Y767-E1 5p15.3

Y938-G6 5p15.2 Y938-G6 5p15.2 Y747-B11 5p15.2 Y747-B11 5p15.2 Y853-H12 5p15.1 Y853-H12 5p15.1

Y748-A4 5p14 Y748-A4 5p14 Y748-A4 5p14

Y774-B3 5p15.3 Y774-B3 5p15.3 breakpoint

Y951-E9 5p14 Y951-E9 5p14 Y951-E9 5p14 breakpoint

FISH Del5p15.33p13 Del5p15.3p14

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Mappa fenotipica Overhauser J et al., Hum Mol Genet. 1994 Feb;3(2):247-52 “Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region of the cri-du-chat syndrome”.

2Mb

• 49 del5p • 136 sonde FISH/5p

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Mappa fenotipica Overhauser J et al., Hum Mol Genet. 1994 Feb;3(2):247-52 “Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region of the cri-du-chat syndrome”.

5.9 Mb

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Mappa fenotipica Overhauser J et al., Hum Mol Genet. 1994 Feb;3(2):247-52 “Molecular and phenotypic mapping of the short arm of chromosome 5: sublocalization of the critical region of the cri-du-chat syndrome”.

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5p15.3

5p15.2

Gersh M et al., J. Am J Hum Genet. 1995 Jun;56(6):1404-10 “Evidence for a distinct region causing a cat-like cry in patients with 5p deletions”

Cat-like Cry Region

5p15.3

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5p15.3

5p15.2

5p15.1

5p14

Ritardo del linguaggio e caratteristiche facciali peculiari Church DM et al., Am J Hum Genet. 1995 May;56(5):1162-72 “Molecular definition of deletions of different segments of distal 5p that result in distinct phenotypic features”

Speech delay (DAT1)

Cat-like cry Childhood facial dysmorphism and moderate ID Adult facial dysmorphism and severe ID

• 17 del5p con SCdC atipica o asintomatici

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Cat-like cry CdCCR

(microcephaly, MR, dysmorphism)

Mild ID

No symptons

Mild-severe ID, microcephaly

Mappa fenotipica

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Correlazione delezione – ID Marinescu RC et al., Am J Med Genet. 1999 Sep 3;86(1):66-70 “No relationship between the size of the deletion and the level of developmental delay in cri du chat syndrome”

• 50 CdC con delezione terminale • FISH: YAC, BAC, cosmidi • Vineland composite/communication (capacita’ comunicative, motorie, socializzazione, abilita’ nelle attivita’ quotidiane)

No correlazione tra grandezza delezione e gravita’ ID

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Cerruti-Mainardi PC et al.,J Med Genet. 2001 Mar;38(3):151-8 “Clinical and molecular characterisation of 80 patients with 5p deletion:genotype-phenotype correlation”

Dysmorphisms

Microcephaly

Skills

Correlazione delezione – ID

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FISH Marinescu RC et al., Clin Genet. 1999 Oct;56(4):282-8 “FISH analysis of terminal deletions in patients diagnosed with cri-du-chat syndrome”

• 110 CdC: cariotipo con delezione terminale de novo

• 6% NO delezione terminale (7/110) : ü 1 traslocazione sbilanciata [t(5;10)]

ü  4 delezioni interstiziali ü 2 no delezione (cosmidi)

• 98% (108/110) delezione vista al cariotipo ma definizione corretta con FISH

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+

DIAGNOSI mediante cariotipo bande Q + FISH

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SEMA5A

SEMA5A • 10% di CDCCR (5p15.2) (Overhauser, 1994 - Gersh, 1995)

• >200Kb • famiglia delle TROMBOSPONDINE (classe V) • Omologo su cr.15 del topo • Proteina transmembrana

• Espressione nel cervello di topo (zona ventricolare della corteccia e gangli della base)

In vertebrati e invertebrati, SEGNALE REPULSIVO per: • guida nella migrazione dei precursori neuronali dalla zona ventricolare • guida nellla direzione di crescita degli assoni

Simmons AD et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998 Jan 26;242(3):685-91 “Molecular cloning and mapping of human semaphorin F from the cri-du-chat candidate interval”

+SEMAF +SEMAF

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(Ove

rhau

ser/G

ersh

) (C

hurc

h)

CTNND2

• 25% di 5p15.2 (CDCCR1 – Church, 1995) • >640Kb • Armadillo repeat family • Proteina intracitoplasmatica dei complessi di giunzione • Interazione con presenilina-1, N-caderina

• Espressione: -precoce in precursori dei neuroni e neuroni della zona ventricolare della corteccia, ippocampo, bulbi olfattivi -dendriti dopo migrazione

• Ruolo: -formazione e mantenimento struttura e funzione dei dendriti

Medina M et al., Genomics. 2000 Jan 15;63(2):157-64 “Hemizigosity of delta-catenin (CTNND2) is associated with severe mental retardation in cri –du-chat syndrome”

Delezione CTNND2: RM grave in CdC

Matter C et al., Neuron. 2009 Nov 12;64(3):320-7 “Delta-catenin is required for the maintenance of neural structure and function in mature cortex in vivo”

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Estrazione DNA

Estrazione DNA

Campione Controllo

Sonda Marcatura

DNA

Sonda Marcatura

DNA

Scanner

Software per analisi immagini

2000 ARRAY - CGH

Ibridazione Ibridazione

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2000  ARRAY – CGH t(5;19)

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Array-CGH mapping (speech – cry – face)

• 94 CdC (82 del. terminali, 12 del. Interstiziali)

• BAC array (5p specific, whole genome)

Cry (1,5Mb)

Face (2,4Mb)

Speech (3,2Mb)

Zhang X et al., Am J Hum Genet. 2005 Feb;76(2):312-26 “High resolution mapping of genotype-phenotype relationships in cri du chat syndrome using array comparative genomic hybridization”

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1  

Array-CGH mapping (speech – cry – face)

33Mb

11Mb

Zhang X et al., 2005

3.2Mb 1.5Mb 2.4Mb

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Cat-like cry – candidate gene Wu Q et al., Eur J Hum Genet. 2005 Apr;13(4):475-85 “Determination of the critical region? For the cat-like cry of Cri-du-chat syndrome and analysis of candidate genes by quantitative PCR”

Pianto CdC: difetti laringe + difetti neurologici

UBE2QL1 (FLJ25076 – 5p15.31): -ubiquitin-conjugating enzime (UBC-E2) -degradazione proteine -invertebrati e vertebrati -alti livelli di espressione in zona toracica e scalpo

640Kb

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Diagnosi mediante Array-CGH

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Gravita’ ID proporzionale a dimensione delezione? • 15 CdC: ID grave rispetto a delezione e fenotipo complesso

Zhang X et al., 2005

CNV in altre zone del genoma

Necessita’ di analisi “whole genome” per fenotipi complessi ?

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Fenotipi complessi

• 24 CdC con fenotipo complesso :-22 delezioni terminali -2 delezioni interstiziali

• Array-CGH (44K Agilent)

Lab ID Probe Start End Band Result Size Mb 275/08 A_14_P113829 11820693 11820752 5p15.2 -/+ 12

A_14_P109445 12038141 12038200 5p15.2 +/+ 295/08 A_14_P119762 15696061 15696120 5p15.1 -/+ 15,8

A_14_P100143 15794709 15794768 5p15.1 +/+ 303/08 A_14_126740 16207595 16207654 5p15.1 -/+ 16,5

A_14_126856 16504599 16504658 5p15.1 +/+ 306/08 A_14_P126698 16719123 16719182 5p15.1 -/+ 16,8

A_14_P131696 16832642 16832701 5p15.1 +/+ 267/08 A_14_P200736 17344437 17344496 5p15.1 -/+ 17,7

A_14_P110311 17766484 17766543 5p15.1 +/+ 249/08 A_14_P110311 17766484 17766543 5p15.1 -/+ 18,1

A_14_P127446 18134678 18134737 5p15.1 +/+ 297/08 A_14_P101692 1515936 1515995 5p15.33 +/+ 18,6

A_14_P136699 1536518 1536572 5p15.33 -/+ A_14_P127859 19991458 19991517 5p14.3 -/+

A_14_P101747 20142768 20142827 5p14.3 +/+ 278/08 A_14_P138430 2807528 2807577 5p15.33 +/+ 20,6

A_14_P124689 2945220 2945279 5p15.33 -/+ A_14_P132243 23153696 23153755 5p14.3 -/+

A_14_P129554 23419181 23419240 5p14.3 +/+ 269/08 A_14_P134968 22727449 22727508 5p14.3 -/+ 22,9

A_14_P119871 22889350 22889409 5p14.3 +/+ 281/08 A_14_P200722 23559985 23560043 5p14.2 -/+ 24

A_14_P103553 24037372 24037431 5p14.2 +/+ 309/08 A_14_P201844 24224207 24224266 5p14.2 -/+ 24,4

A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 +/+ 284/08 A_14_P201844 24224207 24224266 5p14.2 -/+ 24,4

A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 +/+ 255/08 A_14_P201844 24224207 24224266 5p14.2 -/+ 24,4

A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 +/+ 261/08 A_14_P106512 24369784 24369843 5p14.2 -/+ 24,5

A_14_P108371 24541015 24541074 5p14.2 +/+ 292/08 A_14_P123255 24680502 24680561 5p14.2 -/+ 25,1

A_14_P127802 25139934 25139993 5p14.2 +/+ 289/08 A_14_P136027 25710449 25710508 5p14.1 -/+ 26,1

A_14_P126855 26103823 26103882 5p14.1 +/+ 247/08 A_14_P138753 27866713 27866772 5p14.1 -/+ 28,4

A_14_P138753 28429673 28429732 5p14.1 +/+ 252/08 A_14_P109209 29643229 29643288 5p13.3 -/+ 29,9

A_14_P128000 29938708 29938767 5p13.3 +/+ 264/08 A_14_P128000 29938708 29938767 5p13.3 -/+ 30,2

A_14_P125148 30184899 30184958 5p13.3 +/+ 272/08 A_14_P126621 31520769 31520828 5p13.3 -/+ 31,6

A_14_P108810 31571583 31571642 5p13.3 +/+ 300/08 A_14_P108810 31571583 31571642 5p13.3 -/+ 31,6

A_14_P138712 31586121 31586180 5p13.3 +/+ 287/08 A_14_P136644 32266165 32266222 5p13.3 -/+ 32,3

A_14_P133059 32277940 32277999 5p13.3 +/+ 259/08 A_14_P200135 34079335 34079393 5p13.3 -/+ 34,4

A_14_P123756 34361110 34361169 5p13.3 +/+ 257/08 A_14_P200970 36644850 36644909 5p13.2 -/+ 36,6

A_14_P109135 36645053 36645112 5p13.2 +/+

NGS?

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BIOLOGI MOLECOLARI CITOGENETISTI

Array-CGH

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SEQUENZIAMENTO

GENE

GENE sequenze di 4 NUCLEOTIDI A,C,G,T che si alternano CODICE TRADUZIONE PROTEINA

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SEQUENZIAMENTO SANGER analizzo un gene alla volta

ACGT

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2010 Next Generation Sequencing fino a tutto il genoma

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NGS

POSSIAMO SEQUENZIARE:

-  pannelli genici di malattie note

Cardiomiopatia ipertrofica (19 geni)

Encefalopatie epilettiche (21 geni)

- esoma

- genoma

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NGS e CdC

•  Fenotipi atipici complessi

•  Pannello genico 5p

•  Esoma

•  Esoma + filtro bioinformatico

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NGS

ESOMA CROMOSOMA X:

-1.805 geni

- 1.200 OMIM

RISULTATO:

- 250 varianti 3 varianti per soggetto

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1964 2014

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CAMPIONI BIOLOGICI RACCOLTI: 115 DNA

75 PBL (linfociti separati)

73 LCL (linee linfoblastoidi)

54 LIL-2 (linfociti T attivati con IL-2)

3 Liquidi amniotici (amniociti)

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Famiglie Maura Masini Paola Cerruti Mainardi Andrea Guala

Franca Dagna Bricarelli Mauro Pierluigi Simona Cavani Domenico Coviello Chiara Viaggi Guido Zerega

Chiara Baldo Valeria Viotti