ISSN 373 - 580 X

Bol. Soc. Argent. Bot. 29 (3-4): 233-239. 1993

ESTUDIOS NUTRICIONALES EN ASCOBOLUS BIGUTTULATUS (FUNGI,

ASCOMYCETES). CRECIMIENTO VEGETATIVO

Por ALEJANDRO G. PARDO y FLAVIA FORCHIASSIN*

Summary Nutritional studies in Ascobolus biguttulatus. Vegetative growth. Vegetative growth of twocompatible strains of Ascobolus biguttulatus Ranalli et Gamundi was investigated, in liquid synthetic mediawith different carbon and nitrogen sources. Maximum growth wasobtained with a high concentrated glucose-urea medium (C: 1.66%; N: 0.14%). pH variation of the culture medium suggests the extracellular hydrolysisof urea. Besides glucose, the best carbon sources for growth were fructose, maltose and cellobiose. amongthe nitrogen sources tested, asparagine produced a good growth while the inorganic sources were onlyutilized at low concentrations.The two strainsshowed a similar behaviour, but one of them always grew morevigorously.

organismos experimentales, con el propósito de in¬

vestigar si entre ambas existían' diferencias en suAscobolus biguttulatus Ranalli et Gamundí es un comportamiento frente a iguales tratamientos

Ascomycete coprófilo y heterotálico descripto por nutricionales.Ranalli y Gamundí (1975) quienes también realiza¬ron estudios acerca de su ciclo biológico y sucitología. Los estudios de nutrición en los hongosson la base del conocimiento de su fisiología ya que

INTRODUCCION

MATERIALES Y METODOS

Organismo: Para todas las experiencias se utiliza-

permiten comprender la influencia de determina- ron las cepas 7 y 8 de Ascobolus biguttulatus (BAFCdos factores sobre sus funciones, como primer paso 23346), correspondientes a un par compatible paraa la elucidación de procesos fundamentales, tales la reproducción sexual. Los cultivos se conservaroncomo caminos metabólicos, producción y utiliza- a 4°C en tubos deensayo con medio de cultivo PFención de energía, incorporación de nutrientes y regu- pico de flauta (Gamundí y Ranalli, 1966).

Medios de cultivo: El medio de cultivo basal con-lación génica.Varios estudios nutricionales se han realizadoen sistió, por litro de agua bidestilada, de: S04Mg •

miembros del géneroAscobolus: A inmersus (Yu-sun, 7H40, 0,5 g; P04HK2, 0,6 g; P04H2K, 0,5 g; S04Cu 51964), A. crenulatus (Galvagno, 1976), A.furfuraceus H20, 0,4 mg; Cl2Mn • 4 F120, 0,09 mg; B04Hy 0,07

(Lima y Mercuri, 1984; Cinto et al, 1986). En A. mg; MoOzNa •2H20, 0,02 mg; Cl3Fe, l.mg; Cl2Zn,10

biguttulatus se ha determinado el crecimiento en mg; CIH-Tiamina, 0,1 mg; Biotina, 5 pg.función de distintas concentraciones de glucosa,asparagina y vitaminas (Cinto et al, 1977; 1978), ron y se adicionaron a las concentraciones indica-sugiriéndose un medio de cultivo adecuado para el das en cada experimento.crecimiento de este hongo.

El objetivo del presente trabajo fue profundizar sacarosa (S), maltosa (M), celobiosa (C), almidónestos estudios, determinando la influencia de dis- (Al), carboximetilcelulosa (CMC).tintas fuentes carbonadas y nitrogenadas, así comola concentración de carbono y de nitrógeno sobre el glicina, NO,Na, C03(NH4)2, S04(NH4)2, P04H(NH4)2.crecimiento vegetativo de A. biguttulatus. Dado queesta especie es heterotálica, dos cepas compatibles del medio de cultivo más favorable para el creci-para la reproducción sexual fueron utilizadas como miento vegetativo se realizaron las combinaciones

de cinco concentraciones de glucosa y cuatro deurea (Tabla I).

Todas las drogas utilizadas fueron de grado ana¬lítico. Las soluciones stock de las vitaminas y las

Las fuentes de carbono y de nitrógeno se varia-

Fuentes de carbono: Glucosa (G), fructosa (F),

Fuentes de nitrógeno: Úrea (U), asparagina (A),

Para determinar la relación carbono/nitrógeno

* Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de CienciasExactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.Ciudad Univer¬sitaria, pabelón II, 4° piso.

233

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Tabla I.— Relaciones C/N utilizadas. Relaciones C/Nobtenidas al combinár las concentraciones indicadas de

glucosa y de urea en los medios de cultivo

fuentes de nitrógeno fueron esterilizadas por filtra¬ción. El medio basal y las fuentes de carbono fueronautoclavadas por separado y todos los componentesmezclados estérilmente. Los cultivosse realizaron enerlenmeyers de 125 mi con 50 mi de medio que seinocularon con un disco de 3 mm de diámetro toma¬do de la parte externa de una colonia de cinco días decrecimiento sobre Bacto-agar 2%. La incubación tuvolugar en cámara termostatizada a 23°C bajo ilumina¬ción continua de 4700 lux y agitación rotativa cons¬tante de125rpm.La cosecha del micelio fue realizadaen los días prefijados para el caso de la curva decrecimiento en el medio glucosa-urea (G-U). En el

Urea (%)

Glucosa (%) 0,05 0,1 0,2 0,3

0,5 8,7 4,3 2,2 1,41 17,4 8,7 4,3 2,92 34,8 17,4 8,7 5,83 52,2 26,1 13,0 8,74 69,6 34,8 17,4 11,6

peso seco (mg/ml)5

x

4 X\

/

X3

/

XX

/2

1

X

1

2. 40 6 8 1210 14

tiempo (días)

cepa 7 cepa 8

Fig- 1-— Curvas de crecimiento, medido como pesoseco del micelio, de las dos cepas de Ascobolus biguttulatus creciendoen medio G-U (glucosa-urea). . * '

234

A. G. Pardo y F. Forchiassin, Ascobolus biguttulatus

Efecto de la relación carbono/nitrógenoresto de las experiencias la cosecha fue establecida en

base a la curva de crecimiento correspondiente.El micelio fue separado por filtración a través de

papel de filtro en embudo Buchner a presión redu¬

cida. La estimación del crecimiento vegetativo serealizó por determinación del peso seco del miceliosecado en estufa a 70°C durante18 hs. Se determinó

el pH inicial y final de los medios de cultivo con un

pH-metro Photovolt.Los resultados son el promedio de tres experien¬

cias realizadas por triplicado, con un error standarden todos los casos menor al 5%.

El comportamiento de las dos cepas, crecidas enlos medios con distintas concentraciones de glucosay urea, fue similar, perosiempre con mayor nivel decrecimiento en la cepa 8.

Para concentraciones de glucosa relativamentebajas (1 y 2%) se observó que el crecimiento erafavorecido por bajas concentraciones de urea (0,05%y 0,1%), mientras que al aumentar la cantidad deglucosa el crecimiento disminuyó con las mismasconcentraciones de urea (Figs. 2 y 3). En cambioaltas concentraciones de glucosa produjeron mayorcrecimiento cuando se combinaron con altas con¬centraciones de urea, obteniéndose el máximo creci¬

miento con las concentraciones más elevadas de

RESULTADOS

Curvas de crecimientoglucosa y urea ensayadas (4% de glucosa y 0,3% deurea), equivalentes a 16 g C/l y 1,4 g N/l.

Se observó una variación del pH inicial de losmedios de cultivo (pH = 6) al final del período decrecimiento (Tabla 2). A altas relaciones C/N seobservó acidificación del medio de cultivo, mien-

A1 realizar lascurvas de crecimientoen medio G-U (glucosa 1%, urea 0,05%) se observó una marcadadiferencia en,el crecimientoentre ambas cepas, sien¬do mucho mayor el de la cepa 8 (Fig. 1). La cepa 7presentó un período lag más prolongado, alcanzan¬do el máximo crecimiento un día después que la tras que bajas relaciones C/N provocaron unacepa 8, aunque notablemente menor.

En base a las curvas realizadas se fijaron comodías de cosecha para los experimentos posteriores el "aproximadamente15, mientras que para la cepa 8 ladécimo día para la cepa 8 y el onceavo para la 7.

alcalinización del medio. Para la cepa 7 la relación

C/N límite entre estos comportamientos sería

misma sería 12.

peso seco (mg/ml)6

x5

4

+3

2

El

1

Oío 32 4 51

glucosa %

urea 0.3 %—— urea 0.05 % urea 0,1 % urea 0.2 %

Fig. 2.— Crecimiento de la cepa 7 de Ascobolus biguttulatus con concentraciones variables de glucosa. Las curvasrepresentan el crecimiento con distintas concentraciones de urea.

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peso seco (mg/ml)8

6

+

4 - +

x

2

0<0 52 31 4

glucosa %

urea 0.2 * urea 0.3 %—— urea 0.05 % urea 0.1 %

Fig. 3.— Crecimiento de la cepa 8 de A. biguttulatus con concentraciones variables de glucosa. Las distintas curvasrepresentan el crecimiento con distintas concentraciones da urea.

Tabla II.— Variación del pH. Se indica la variación delpH final respecto del pH inicial (6) en cada medio de

cultivo al momento de la cosecha, para ambas cepas deA. biguttulatus (7 y 8). Los medios contenían distintasconcentraciones de glucosa y de urea, que producen

distintas relaciones C/N (ver Tabla I)

Fuentes de carbono y de nitrógeno*

Se midió el crecimiento vegetativo de las doscepas de Ascobolus biguttulatus en todos los mediosde cultivo resultantes de la combinación de las fuen¬tes carbonadas y nitrogenadas, a una concentraciónequivalente a 16 g C/l y 1,4 g N/l.

* Para las fuentes orgánicas de nitrógeno (Fig. 4)se observaron tres grupos de medios en cuanto a laproducción de biomasa: para la cepa 8, G-U, F-U yM-A permitieron el máximo crecimiento; luego G-A, F-A, M-U y por último C-A y C-U con el menorcfecimiento. Para la cepa 7, también G-U, F-U y M-A fueron los mejores medios, siguiéndoles en otrogrupo G-A, F-A, M-U y C-A y por último C-U.

Sacarosa y glicina fueron totalmente inefectivaspara promover el crecimiento de ambas cepas, inde¬pendientemente de la fuente de nitrógeno o de car¬bono con la que se combinaron, respectivamente.

Con las fuentes inorgánicas de nitrógeno a una •

. concentración de1,4 g N/l, no se obtuvo crecimien¬to, independientemente de la fuente de carbonoutilizada. A menores concentraciones, con glucosacomo,fuente carbonada, se comprobó que el

Urea (%)

Glucosa (%)• 0,05 0,20,1 0,3

cepa 70,5 0,1 2,4 3,02,8

— 0,3

— 1,4

— 1,1

— 1,5

2,01 2,4 3,0

2 -1,6-1,2— 1,5

0,9 3,43 — 0,6

— 0,52,0

4 1,7

cepa 80,5 1,7 2,0 2,2 2,71 — 0,4

— 0,7

— 0,8— 0,6

U 2,5 2,72 -0,2

-1,9-1,8

2,6 3,13 0,8 2,14 — 0,4 2,2

236

A. G. Pardo y F. Forchiassin, A.'¡cobolus biguttulatus

Tabla III.— Crecimiento con fuentes inorgánicas denitrógeno. Crecimiento, expresado como mg de peso

seco de micelio/ml de medio de cultivo, de ambas cepasde A. biguttulatus (7 y 8), con distintas concentraciones defuentes inorgánicas de nitrógeno, utilizando en todos los

casos glucosa como fuente de carbono

Peso seco (mg/ml)8

6

Concentración (g N/l)

FuenteNitrogenada 0,35 0,7 1,44

cepa 7co3(NH4)2po4H(NH4)2SO4(NH4)2N03Na

1,390,94 01,29 1,62 0,41

2 0,090,11 0,42

0,08 0,12 0,31

cepa 8CO,(NH4)2PO4H(NH4)2SO4(NH4)2N03Na

0,78 1,18 00GU GA FU FA MU MA CU CA

Medios de cultivo

cepa 7 l

_____I cepa 8

2,66 0,711,160,30 0,040,180,13 0,100,12

Fig. 4.— Crecimiento de ambas cepas de A. biguttulatus (7

y 8), en medios conteniendo distintas fuentes carbonadas ynitrogenadas. GU: glucosa-urea; GA: glucosa-asparagina;FU: fructosa-urea; FA: fructosa-asparagina; MU: maltosa-urea; MA: maltosa asparagina; CU: celobiosa-urea; CA:celobiosa-asparagina.

Peso seco (mg/ml)5

4

C03(NH4)2 y el P04H(NH4)2 pudieron ser utilizadospara el crecimiento vegetativo (Tabla III), siendo laconcentración más efectiva 0,7 g N/l en ambos ca¬sos y para las dos cepas; mientras que el S04(NH4)2y el NOjNa fueron inefectivos ya que sólo hubotrazas de crecimiento en todas las concentracionesde N ensayadas.

El almidón y la CMC no pudieron ser probadosen la misma concentración de C que el resto de lasfuentes, debido a su insolubilidad a esa concentra¬ción; por lo tanto se determinó el crecimiento

vegetativo de las dos cepas en los medios Al-U, Al-A, CMC-U y CMC-A con concentraciones de C y N O

inferiores (4 g C/l y 0,46 g N/l). Los medios Al-U yAl-A fueron tan efectivos como el medio G-U co¬rrespondiente, para ambas cepas, mientras que conCMC sólo hubo trazas de crecimiento (Fig. 5).

3-

2

1 -

CMCU

Medios de cultivo

CMCAAU AA

cepa 7 L;.s.íl cepa 8

DISCUSION Fig. 5.— Crecimiento de ambas cepasde A. biguttulatus, enmedios conteniendo almidón y celulosa: AlU: almidón-urea; A1A: almidón-asparagina; CMCU: carboxi-Las dos cepas compatibles de Ascobolus

biguttulatus presentaron un comportamiento simi- metilcelulosa-urea; CMCA: carboximetilcelulosa-lar, ya sea respecto al tipo de fuente utilizada como asparagina.

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a su concentración. Sin embargo en todos los casos bajo potencial osmótico de estos medios. Dados ella cepa 8 presentó un crecimiento mucho más vigo- hábitat natural de esta especie (estiércol de herbívo-roso que la 7, siendo,según el medio utilizado hasta ros) y la presencia comprobada de sistemaun 100% mayor. Por lo tanto consideramos válida, celulolítico en otras especies del género Ascobolusla utilización de una cepa de Ascobolus biguttulatus (Mercuri, 1987), nos inclinamos por la segunda po-como modelo experimental, ya que las diferencias sibilidad.observadas fueron cuantitativas y no cualitativas.

El crecimiento vegetativo fue favorecido por al- C03(NH4)2 y P04H(NH4)2 con concentraciones de Ntas concentraciones de carbono y de nitrógeno.

El amonio pudoser aprovechado sólo a partir de

menores que las consideradas óptimas para urea. ElSobre la base de las variaciones de pH observa- S04(NH4)2 fue inefectivo para el crecimiento proba¬

das se propone como hipótesis un mecanismo de blemente debido a quees una sal cuyo anión es el dehidrólisis extracelular de la urea asociado a la un ácido fuerte, y suponiendo una más rápida in¬fijación heterotrófica de HC03‘. La urea sería corporación de NH4+ que de S04’, se produciría unhidrolizada extracelularmente en HC03' y NH4+; a brusco descenso del pH del medio de cultivo debi-bajas relaciones C/N (menor a 12 para la cepa 8 y do a los H+ de intercambio, el cual inhibiría el creci-menor a 15 para la cepa 7) se produciría una absor- miento del hongo (Byrde, 1965; Nicholas, 1965;ción más rápida de HC03' que de NH4+, elevándose Kraft y Erwin, 1967; Lima y Mercuri, op cit). Si bienel pH del medio debido a los OH1 de intercambio, el pH final (4,5) en este caso fue similar al obtenidoEn cambio cuando la relación C/N es mayor a las en el mediocon P04H(NH4)2, e incluso al de algunoscitadas, y dado que el C no sería limitante en este medios G-U, en éstos el descenso del pH fue gra-caso, la absorción de NH4+ sería mayor que la de dual, permitiendo así el crecimiento del hongo.HC03', produciéndose una acidificación del mediode cultivo debida a los H* de intercambio. La utili- cimiento independientemente de la concentraciónzación de carbono inorgánico (HC03) ha sido cita- utilizada. Algunos autores (Lima y Mercuri, op. cit.-,da para varios hongos (Cantino, 1949; Robinson, Morton y Mac Millan, 1954) han Citado una fuerte1978; Parkinson et al., 1990). Roon y Levenberg alcalinización del medio de cultivo al utilizar esta(1970) postularon un patrón de hidrólisis de urea, fuente de nitrógeno, lo que inhibiría el crecimientoasociado con la fijación heterotrófica de HC03' para de los hongos estudiados. Para A. biguttulatus des-Candida utilis. Lima y Mercuri (1984) plantean la' cártamos esta posibilidad, ya que no se observóposibilidad de fijación heterotrófica de HC03' en aumento del pH en el medio de cultivo. Por otraAscobolusfurfuraceus, hipótesis qüe podría ser váli- parte A. crenulatus escapaz de crecer con nitrato, sinda para el caso de A. biguttulatus dados los resulta- que se observe alcalinización del medio de cultivodos de este trabajo.

Al variar simultáneamente las concentraciones sultado obtenido a la incapacidad de A. biguttulatusde glucosa y urea se observó que para bajas concen- dé sintetizar nitrato reductasa, ya que en mediostraciones de urea, al aumentar la concentración de sólidos con esa fuente nitrogenada se produjo unglucosa se llega a un plateau, debido a una disminu- leve crecimiento e incluso formación de cuerposción en la tasa de crecimiento cuando un factor se fructíferos (Pardo y Forchiassin,1993), sin embargo,hace limitante en el medio de cultivo. Una disminu- al cambiar las condiciones experimentales (medioción en la biomasa puede deberse a diferentes líquido) es posible que se vea alterado el patrón decinéticas de crecimiento con las distintas concentra- ' producción o de activación de dicha enzima.ciones. Con altas concentraciones de urea el

Con N03Na, se registraron apenas trazas de cre-

(Galvagno, 1976). Tampoco podemos atribuir el re¬

nitrógeno deja de ser factor limitante, permitiendo AGRADECIMIENTOSentonces la utilización de mayores concentracionesde glucosa; obteniéndose así la mayor producciónde biomasa con las concentraciones más altas utili- )°-

zadas.

Al CONICET, por la financiación parcial de este traba-

BIBLIOGRAFIALos medios de cultivo, más favorables para elcrecimiento de ambas cepas fueron los que conte¬nían glucosa o fructosa en combinación con urea, ymaltosa en combinación con asparagina.

En las condiciones experimentales ensayadas lasacarosa, la carboximetilcelulosa y la glicina no fue¬ron aprovechadas para el crecimiento. La incapaci¬dad de A. biguttulatus de utilizar CMC podría de- CINTO, R. O., F. FORCHIASSIN, M. E. RANALLI y M. A.

berse a la ausencia del sistema celulolítico o bien al

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