Áҵðҹ¡Òû¯ÔºÑµÔ§Ò¹µÃǨÇÔà¤ÃÒÐË�àª×éÍ䢌ËÇÑ´ãËÞ‹ÊÒ¾ѹ¸Ø�ãËÁ‹ª¹Ô´ A (H1N1)·Ò§ËŒÍ§»¯ÔºÑµÔ¡ÒêѹÊÙµÃÊÒ¸ÒóÊØ¢

¡ÃÁÇÔ·ÂÒÈÒʵÃ�¡ÒÃá¾·Â� ¡ÃзÃǧÊÒ¸ÒóÊØ¢

A(H1N1)

¨Ñ´·Ó¤ÃÑ駷Õè 1àÁÉÒ¹ 2553

MOPH-DMSc- CL01

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม

ชนด A (H1N1) ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข

ISBN 978-616-11-0354-5

จดทำาครงท 1 เมษายน 2553

พมพครงท 1 จำานวน 1,000 เลม

สงวนลขสทธ

จดพมพโดย

กรมวทยาศาสตรการแพทย

กระทรวงสาธารณสข

88/7 ถนนตวานนท อ.เมอง จ.นนทบร 11000

โทรศพท 0 2589 0022, 0 2951 0000

www.dmsc.moph.go.th

พมพท

บรษท พ.ศ. พฒนา ออนไลน จำากด

12 หมอมแผวแยก 3 ถ. พระราม 6 ซ. 41

แขวงสามเสนใน เขตพญาไท กทม. 10400

โทรศพท 0 2279 6222 โทรสาร 0 2279 6203-4

สาร

รฐบาลมความมงมนในการเสรมสรางคณภาพชวตของประชาชนในทกๆดาน โดยเฉพาะการ

ดแลสขภาพอนามยของประชาชน ซงกระทรวงสาธารณสข ไดมการพฒนาทงดานการบรหารจดการ

เทคโนโลย การบรการ และการมสวนรวมของประชาชนในทกภาคสวน เพอยกระดบมาตรฐานคณภาพชวต

โดยการใหบรการสาธารณสขแกประชาชนทกระดบ อยางทวถงทง ๔ มต ไดแก การสงเสรมสขภาพ

การรกษาพยาบาล การปองกน และควบคมโรค รวมทงการฟนฟสภาพของผปวยใหกลบมาใชชวตในสงคม

ไดอยางปกต

นโยบายสำาคญของกระทรวงสาธารณสข ทไดดำาเนนการอยางเรงดวน และตอเนอง คอ

การดแลการระบาดของโรคทอบตใหม ทกำาลงเปนปญหาตอสขภาพ และความกงวลใจของประชาชน เชน

เชอไขหวดใหญสายพนธใหม ๒๐๐๙ รวมทงการเตรยมความพรอมทจะปองกนโรคระบาด ทมแนวโนมอาจ

จะเกดขนในอนาคต ดวยการวางแผนการลงทนทงดานอปกรณ เครองมอ และกำาลงคน เพอสรางความ

เชอมนในประสทธภาพประสทธผลการควบคมโรค รวมทงเพอรองรบการจดการปองกนหรอรกษาไดอยาง

ถกตองตามหลกวชาการ และเปนทยอมรบของนานาชาต

ผมขอเปนกำาลงใจใหคณะผบรหาร และเจาหนาทหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขทกทาน

ใหสามารถดำาเนนงานประสบผลสำาเรจตามเจตนารมณทดในการดแลประชาชนชาวไทยทกคนใหมสขภาพ

แขงแรงตลอดไป

(นายจรนทร ลกษณวศษฏ)

รฐมนตรวาการกระทรวงสาธารณสข

I

นโยบายการบรการ

ประเทศไทยไดเผชญกบการระบาดของโรคไขหวดใหญททำาใหมผปวยและเสยชวตจำานวนมากมาแลว

ตงแต พ.ศ. ๒๔๖๑ - ๒๔๖๒ มประชาชนปวยคดเปนรอยละ ๒๗.๓๒ เสยชวตรอยละ ๐.๙๕ ของประชากร

ทงประเทศ ตอมามการระบาดประปรายเกอบทกป

ในการระบาดใหญ ป พ.ศ. ๒๕๒๑ มการสำารวจในกรงเทพมหานคร ชวงระยะเวลาสนๆ ระหวาง

เดอนกมภาพนธ-มนาคม พบวามผปวยประมาณ ๓๖๐,๐๐๐ ราย อตราปวยเทากบ ๗๕ ตอพนประชากร

(หรอเทยบเทา ๗,๕๐๐ ตอแสนประชากร) ผปวยสวนใหญอายในวยตำากวา ๒๐ ป และในป พ.ศ. ๒๕๒๘

มการระบาดคอนขางรนแรง มรายงานผปวยทวประเทศ ๙๒,๑๘๐ คน หรอ ๑๗๘.๔ ตอแสนประชากร และ

เสยชวต ๔๐ คน

ในชวงป ๒๕๔๘ - ๒๕๕๑ ทผานมา หนวยงานทรบผดชอบไดดำาเนนการตามแผนยทธศาสตรการ

แกไขปญหาไขหวดนกและแผนยทธศาสตรการเตรยมความพรอมในการปองกนและแกไขปญหาการระบาด

ใหญของโรคไขหวดใหญมาอยางตอเนองจนถงปจจบน

จากการพฒนาสายพนธของโรคไขหวดใหญ ทำาใหประชากรทวโลกเกดความหวาดกลว รวมทง

ประเทศไทยดวย ดงนนกระทรวงสาธารณสขไดมแผนแมบทในการเตรยมความพรอมสำาหรบการระบาดใหญ

ของโรคไขหวดใหญ พ.ศ. ๒๕๕๒ รวมทงจดทำาคมอสำาหรบแพทยและบคลากรทางสาธารณสขเพอใชเปน

แนวทางปฏบตในการดแลผปวยทตดเชอ หรอสงสยวาอาจตดเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

สถานการณปจจบนทมการระบาดของเชอไขหวดใหญสายพนธใหม ๒๐๐๙ กระทรวงสาธารณสข

จงม นโยบาย สงเสรม สนบสนนหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขของโรงพยาบาลในสงกดสำานกงาน

ปลดกระทรวงสาธารณสขดำาเนนการ ดงน

๑. หองปฏบตการชนสตรสาธารณสขของโรงพยาบาลศนยทกแหง ดำาเนนการใหบรการตรวจวนจฉย

โรคไขหวดใหญสายพนธใหม ชนด A (H1N1) ในปงบประมาณ ๒๕๕๓

๒. กรมวทยาศาสตรการแพทยใหการสนบสนนองคความร เทคนคทางวชาการ และคำาปรกษา เพอ

ใหหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขของโรงพยาบาลศนย หรอโรงพยาบาลทวไปทมความพรอม สมครใจ

รวมพฒนาบรการตรวจวนจฉยโรคไขหวดใหญสายพนธใหม ชนด A (H1N1)

การสนบสนนหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขดงกลาว จะทำาใหโรงพยาบาลศนย / โรงพยาบาลทวไป

ซงเปนหนวยบรการหลกในระบบบรการสขภาพของประเทศ สามารถตรวจวนจฉยและปองกนการแพรระบาด

ของโรคไขหวดใหญสายพนธใหมและโรคอบตใหม อยางมประสทธภาพ และสรางความมนใจในคณภาพระบบ

บรการสาธารณสขใหกบประชาชนทกคน

(นายไพจตร วราชต)

ปลดกระทรวงสาธารณสข

II

คำ�นำ�

ไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) เปนโรคอบตใหมทเรมมการระบาดจากตางประเทศสประเทศไทย

ครงแรกในป พ.ศ. 2552 จนกอใหเกดความตนตกใจทวประเทศ เกดเปนปญหาสาธารณสขทสำาคญของประเทศจนถง

ปจจบน หองปฏบตการชนสตรสาธารณสขจงมบทบาทและหนาทในการตรวจวเคราะหใหไดผลการตรวจทมคณภาพ

เชอถอได เพอชวยในการตรวจวนจฉยของแพทยไดถกตอง แมนยำาและรวดเรว เปนประโยชนยงในการตรวจรกษา

และวางแผนในการควบคม และปองกนไมใหมผปวยใหมเพมขน

กรมวทยาศาสตรการแพทยไดจดทำามาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม

ชนด A (H1N1) ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขขน เพอเปนแนวทางและเกณฑการดำาเนนงานสำาหรบหอง

ปฏบตการชนสตรในโรงพยาบาลตางๆ ทมศกยภาพ ทเหมาะสม และมความพรอมใหบรการตรวจวเคราะห เพอ

สนบสนนนโยบายในการปองกนและควบคมการระบาดของโรคไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) ของกระทรวง

สาธารณสข

มาตรฐานการปฏบตงานฉบบน จดทำาขนโดยมงหวงใหหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข ใชอางอง

ในการจดทำาวธปฏบตงานของหนวยงาน จะเปนประโยชนสำาหรบหองปฏบตการในการจดตงหรอทบทวนความ

สามารถของหองปฏบตการเพอตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) และเตรยมความพรอมใน

การขยายศกยภาพใหบรการตรวจวเคราะหรายการทดสอบตางๆ ทใชหลกการตรวจวเคราะหสารพนธกรรม ซงม

แนวโนมจะนำามาใชตรวจวนจฉยโรคตางๆ ตอไปในอนาคต ไดอยางมประสทธภาพ

(นายจกรธรรม ธรรมศกด)

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

III

คำ�ขอบคณ

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม ชนด A (H1N1) ทางหอง

ปฏบตการชนสตรสาธารณสขฉบบน เปนผลสำาเรจจากความรวมมอทางวชาการทสรางสรรคของคณะผเชยวชาญ

ทงในระดบนโยบายและฝายปฏบตการ ซงประกอบดวยผบรหารและนกวชาการทกรมวทยาศาสตรการแพทย

มอบหมายใหดำาเนนการจดทำาขน เพอเปนมาตรฐานการปฏบตงานฉบบหนงทใชหลกการตรวจวเคราะหสารพนธกรรม

ในการนำาไปประยกตใชกบการตรวจวเคราะหอน และเปนประโยชนตอผทำางานในหองปฏบตการ งานนสำาเรจลลวง

ไดเปนอยางดดวยความเสยสละเวลา ทมเทความคด แรงกายและแรงใจ ตลอดจนไดรบการสนบสนนอยางดยง

จากผบรหารกระทรวงสาธารณสข โดยเฉพาะผอำานวยการโรงพยาบาลศนย และหวหนากลมงานพยาธวทยาคลนก

ของโรงพยาบาลศนยทวประเทศ ผมขอขอบคณเปนอยางสงตอทกทานไว ณ โอกาสน และหวงวาคมอฉบบนจะ

เปนประโยชนตอเจาหนาทของภาครฐและเอกชนทเกยวของ เพอใหบรการแกประชาชนผรบบรการและแกประเทศ

ชาตตอไป

(นายนพนธ โพธพฒนชย)

รองอธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

ทปรกษาคณะทำางานจดทำามาตรฐานการปฏบตงาน

ตรวจวเคราะหไขหวดใหญสายพนธใหม ชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข

IV

สารบญ หนา

สารรฐมนตร I

นโยบายการบรการ

คำ�นำ� III

คำ�ขอบคณ IV

บทท 1 บทนำา 1

บทท 2 ขอบขาย 2

บทท 3 นยามและคำายอ 3

บทท 4 วธมาตรฐานสำาหรบการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) 4

บทท 5 การควบคมคณภาพ 10

บทท 6 การบำารงรกษาและสอบเทยบเครองมอวทยาศาสตร 12

บทท 7 ความปลอดภยทางหองปฏบตการ 13

ภ�คผนวก

ภาคผนวก 1 การคำานวณหาความเขมขนของ primers และ probes 15

ภาคผนวก 2 วธการเกบและสงตวอยาง 16

ภาคผนวก 3 ตวอยางวสดและอปกรณ 18

ภาคผนวก 4 ตวอยางพนทปฏบตงาน 20

ภาคผนวก 5 ตวอยางตารางบนทกผลการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) 21

ภาคผนวก 6 แบบประเมนคณภาพ 22

ภาคผนวก 7 การรบรองความสามารถการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม ชนด A (H1N1) 26

ตามมาตรฐานการปฏบตงานทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข กระทรวงสาธารณสข

ภาคผนวก 8 เอกสารอางอง 29

ภาคผนวก 9 คณะผจดทำา 30

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 1

บทท 1บทนำ�

เชอไขหวดใหญเปนเชอทมกเกดการเปลยนแปลงสายพนธไดเสมอโดยอาจเปลยนเพยงบางสวนขององคประกอบ

ไวรสจนถงเปลยนเปนสายพนธใหมทไมเคยพบมากอนและผคนทวโลกยงไมเคยมภมคมกนตอเชอสายพนธใหมนซง

การเปลยนแปลงนอาจเกดโดยธรรมชาตของไวรสเองหรอจากการผสมขามสายพนธจนไดลกผสมใหมการตรวจวเคราะห

ดวยวธใดกตามจงจำาเปนตองมการพฒนาปรบเปลยนใหสามารถตรวจจบเชอทอบตใหมนไดเชนเดยวกบการระบาดใหญ

ของไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)หรอเรยกทวไปวาไขหวดใหญสายพนธใหม2009ทเกดระบาดครงแรกใน

ประเทศเมกซโกการตรวจวเคราะหตวอยางผปวยรายแรกๆดวยวธตรวจหาสารพนธกรรมทเคยจำาแนกสายพนธไขหวดใหญ

ตามฤดกาลไดปรากฎวาไมสามารถจำาแนกสายพนธไขหวดใหญจากตวอยางดงกลาวไดทราบเพยงแตวาเปนเชอไขหวดใหญ

ชนดAเมอศนยควบคมและปองกนโรคแหงสหรฐอเมรกา(US-CDC)ไดแยกเชอและศกษาลำาดบพนธกรรมจนสมบรณ

จงทราบวาเปนเชอไขหวดใหญสายพนธใหมทไมเคยพบมากอนเปนลกผสมของเชอไขหวดใหญทมาจากสตวปกหมและ

คนจากขอมลการศกษาตวเชอจงนำามาสการพฒนาวธวเคราะหทองคการอนามยโลกไดแนะนำาใหหองปฏบตการทวโลกนำา

ไปใชคอวธCDCrealtimeRT-PCR(rRT-PCR)protocolforthedetectionandcharacterizationofpandemic

(H1N1)2009ซงตอมาหลายหนวยงานภายใตเครอขายองคการอนามยโลกและหนวยงานอนๆทไดรบรองเปนหองปฏบตการ

อางองในหลายประเทศไดพฒนาปรบเปลยนสวนประกอบของนำายาทใชเปนตวจบสารพนธกรรมของไวรส(primers/probes)

ขนมาใหมทงวธทเปนConventionalRT-PCRและRealtimeRT-PCRทงนเพอเพมความไวและความจำาเพาะให

มากขนนอกจากนยงมชดนำายาสำาเรจรปทใชหลกการPCRผลตโดยบรษทเอกชนหลายแหงวางจำาหนายสวนชดตรวจแบบ

รวดเรว(influenzarapidtestkit)ทใหผลภายใน15-30นาทอาศยหลกการimmuno-chromatographyไมสามารถ

จำาแนกสายพนธไขหวดใหญไดเพยงแตจำาแนกวาเปนเชอไขหวดใหญชนดAหรอBเทานนหองปฏบตการทเปนผใชจง

ตองเลอกวธทเปนมาตรฐานหากใชวธอนๆหรอการใชชดนำายาสำาเรจรปตองมขอมลจากบรษททผลตซงแสดงกระบวนการ

พสจนความถกตองของวธโดยมคาความไวและความจำาเพาะสามารถตรวจชนด/ปรมาณไดครอบคลมตามวตถประสงคของ

ผใชนอกจากนหากหองปฏบตการใดกตามดดแปลงจากวธมาตรฐานหรอพฒนาขนเองตองทำาการทดสอบความถกตองของ

วธตนเองเทยบกบวธมาตรฐานวามความไวความจำาเพาะเทยบเทากนหรอไมและพงตระหนกวาการควบคมคณภาพตลอด

กระบวนการวเคราะหมผลตอความถกตองและความนาเชอถอของการรายงานผลรวมทงการตดตามความกาวหนาของ

เทคนคการปรบเปลยนวธและการใชตวควบคมผลบวกใหทนสมยจะทำาใหสามารถตรวจจบเชอทอาจกลายพนธจากเดมได

ซงจะเปนประโยชนตอการควบคมและปองกนโรคไดทนตอสถานการณ

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข2

บทท 2ขอบข�ย

เพอใชเปนมาตรฐานการปฏบตงานและแนวทางการดำาเนนการตรวจประเมนเพอใหการรบรองวาหองปฏบตการ

ชนสตรสาธารณสขของสถานพยาบาลทงภาครฐและเอกชนมความสามารถจะดำาเนนการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญ

สายพนธใหมชนดA(H1N1)ตามขอกำาหนดทจำาเปน(essentialrequirement)และมคณภาพตามมาตรฐานทกระทรวง

สาธารณสขยอมรบ

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 3

บทท 3นยามและคำายอ

นยาม มาตรฐานการปฏบตงานหมายถง มาตรฐานการปฏบตงานสำาหรบประเมนคณภาพหองปฏบตการ

ชนสตรสาธารณสขและผปฏบตงานใชเปนแนวทางดำาเนนงานตรวจ

วเคราะหโดยมการจดทำาเอกสารหรอคมอปฏบตงานทถกตองชดเจน

และมการรายงานผลทเชอถอได

คำ�ยอ cDNA = complementarydeoxyribonucleicacid

EtBr = Ethidiumbromide

PCR = polymerasechainreaction

NTC = Notemplatecontrol

RNA = Ribonucleicacid

RT-PCR = Reversetranscriptasepolymerasechainreaction

VTM = Viraltransportmedia

InfA =InfluenzaA

SwH1 = SwinesubtypeH1

RNaseP = Ribonucleaseprotein

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข4

บทท 4วธมาตรฐานสำาหรบการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญ

สายพนธใหมชนด A (H1N1)หลกก�รของวธทดสอบ วธ Conventional RT-PCR เปนวธปกตในการตรวจสารพนธกรรมเรมจากการใชนำายาสกดเอาสารพนธกรรมของไวรสไขหวดใหญซง

เปนชนดRNAจากตวอยางผปวยแลวเปลยนRNAใหเปนDNAโดยอาศยเอนไซมreversetranscriptase

จากนนเพมจำานวนDNAของไวรสสวนทตองการตรวจสอบดวยเอนโซมTaqpolymeraseและไพรเมอร(primer)

ทจำาเพาะตอไวรสหรอจำาเพาะตอสบทยปของไวรสในกรณของไวรสinfluenzatypeAจะตองใชไพรเมอรจำาเพาะ

ตอHAgeneซงม16ชนดหรอNAgeneม9ชนดสำาหรบไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)จะ

ใชไพรเมอรทจำาเพาะตอH1swinegeneเมอไดDNAทจำาเพาะเพมขนจงนำาไปตรวจหาขนาดDNAโดยวธ

agarosegelelectrophoresisเปรยบเทยบกบขนาดDNAมาตรฐาน(DNAmarker)และตวอยางควบคม

คณภาพ(positivecontrol,negativecontrol)และอานผลโดยเครองUV-transilluminator

วธนมคาใชจายนอยทสดแตจะใชเวลานานอานผลยากและมการปนเปอนไดงายใชตรวจตวอยางทม

จำานวนไมมากนก

วธ Realtime RT-PCR เปนการตรวจหาสารพนธกรรมโดยใชเทคนคการตรวจวดแสงฟลออเรสเซนตมาผสมผสานกบเทคนค

conventionalRT-PCRทใชเครองมออตโนมต(realtimePCR)มาชวยในการเพมปรมาณDNAและอานผล

รวมทงเพมความจำาเพาะโดยการใชDNAprobeทตดฉลากดวยสฟลออเรสเซนตตรวจจบDNAของไวรสทเพม

ขนจากนนจะผานระบบวเคราะหผลแสดงออกมาเปนรปกราฟหรอตวเลขทแสดงคาความเขมของแสงในแตละรอบ

ของปฏกรยาสามารถอานผลปรมาณไวรสหรอพบ/ไมพบไวรสโดยไมตองทำาgelelectrophoresisบนแผนวน

จงชวยลดการปนเปอนวธนจงสะดวกและใหผลตรวจทรวดเรวกวาวธconventionalRT-PCRปจจบนนยมใช

มากในงานตรวจวเคราะหเนองจากสามารถตรวจตวอยางไดคราวละมากๆรายงานผลไดรวดเรวแตมขอจำากดท

เครองrealtimePCRยงคงมราคาแพง

พนทปฏบตง�น หองปฏบตการตองมพนทและสงแวดลอมทเหมาะสมเพอใหเกดความปลอดภยตอบคลากรในหองปฏบต

การและปองกนการปนเปอนของเชอสสงแวดลอมภายนอกและควรแบงพนทออกเปน3สวนคอ

-สวนสกดพนธกรรม ประมาณ9ตารางเมตร(อาจจะกนผนงแบง

พนทในหองปฏบตการจลชววทยากไดและใชรวม

กบงานตรวจเชอวณโรคกได)

-สวนเตรยมนำายาสะอาด ประมาณ6ตารางเมตร

-สวนขยายพนธกรรมและตรวจหาสารพนธกรรม ประมาณ6ตารางเมตร

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 5

หองเตรยมนำายาเปนหองทตองควบคมใหปราศจากการปนเปอนของตวอยางและสารพนธกรรมทกชนดอปกรณและนำายาจงตองเตรยมไวใชเฉพาะหองเทานนหามนำาออกไปใชภายนอกหองและไมนำาอปกรณและนำายาทใชจากกจกรรมอนเขามาใชปะปนโดยเดดขาด

ตวอย�งสงตรวจ ควรเกบตวอยางใหเรวทสดภายใน1-3วนเมอเรมปรากฏอาการของโรคและเกบซำาอกครงหากผปวยมอาการปอดบวมหรอปอดอกเสบวธการเกบใหใชวธปราศจากเชอ(aseptictechnique)โดยเกบตวอยางสารคดหลงจากระบบทางเดนหายใจไดแกNasopharyngealaspirate(NPA),Nasopharyngealwash(NPW),Bronchoalveolarlarvage,Trachealaspirate,Nasopharyngealswab(NPS),Throatswab(TS),Nasalswab(NS)เปนตน

เครองมอและวสดวทย�ศ�สตร วธ Conventional RT-PCR วธ Realtime RT-PCR 1. เครองConventionalPCR1เครอง 1. เครองRealtimePCR1เครอง 2. ชดElectrophoresis1ชด 2.BiologicalsafetycabinetclassII1เครอง 3.เครองUVtransilluminatorพรอมชดถายภาพ 3.HighSpeedCentrifuge1เครอง 1เครอง 4.BiologicalsafetycabinetclassII1เครอง 4.LowSpeedCentrifuge1เครอง(ปนplate) 5.HighSpeedCentrifuge1เครอง 5.Minicentrifuge1เครอง 6.Minicentrifuge1เครอง 6.Vortex2ตว 7.Vortex2ตว 7.Heatingblock1เครอง 8.Heatingblock1เครอง 8.PCRcabinet1เครอง 9.PCRcabinet1เครอง 9.Freezer–20๐C1เครอง10.Freezer–20๐C1เครอง 10. ตเยน2เครอง(เกบตวอยาง1เครอง และเกบนำายา1เครอง)11.ตเยน2เครอง(เกบตวอยาง1เครอง 11.Autopipette3ชด(1ชดประกอบดวย และเกบนำายา1เครอง) ขนาด10,100,200,1000ไมโครลตร)12. Microwave1เครอง 12. PCRtubewithopticalcap13.Autopipette3ชด(1ชดประกอบดวยขนาด 13. realtimePCRplate 10,100,200,1000ไมโครลตร)14.PCRtube 14.Filtertip15.Filtertip 15.primersและprobes16.primers 16.นำายาrealtimePCR17.นำายาPCR 17.Positive/Negativecontrol18.Positive/Negativecontrol 18.ชดสกดสารพนธกรรม19.ชดสกดสารพนธกรรม20.DNAmarker21.สารเคมและนำายาสำาหรบgelelectrophoresis

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข6

ขอควรระวงกอนก�รทดสอบ 1.ความปลอดภยในการเตรยมตวอยางและการสกดสารพนธกรรมของเชอไขหวดใหญจากตวอยางผปวย

ใหปฏบตตามคำาแนะนำาWHOLaboratorybiosafetymanual,3rdeditionซงองคการอนามยโลกไดแนะนำาให

ใชหองปฏบตการชวนรภยระดบ2(Biosafetylevel2)

2.กรณทใชเครองมอและนำายาไมตรงกบวธทดสอบระบไวตองขอคำาปรกษากบบรษททจำาหนายเครองมอ

และนำายาเพอปรบตวโปรแกรมของเครองPCRใหเหมาะสมกบชนดของนำายาและทดลองวเคราะหกบตวอยางท

ทราบคากอนเมอผานการประเมนแลวจงจะนำามาใชวเคราะหจรงได

ขนตอนก�รทดสอบดวยวธ Conventional RT-PCR และ Realtime RT-PCR 1.สกดสารพนธกรรมของเชอไขหวดใหญจากตวอยางผปวยโดยปฏบตตามคมอของชดสกดท

หองปฏบตการเลอกใช

2.เตรยมprimers/probesใหไดความเขมขนทพรอมใช(workingconcentration)ตามวธทดสอบท

เลอกใชตวอยางเชนวธconventionalRT-PCR(ตารางท1)หรอวธrealtimeRT-PCR(ตารางท2)

ตารางท 1 ตวอยางชด Primers และสตรนำายาสำาหรบตรวจวเคราะหหาสารพนธกรรมไวรส ไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) ดวยวธ conventional RT-PCR

Primer Sequence (5′g3′) Working Gene target Product con. size

M30F2/08 ATgAgYCTTYTAACCgAggTCgAAACg 20µM Matrixgene (InfA) 244M264R3/08 TggACAAANCgTCTACgCTgCAg 20µM

NIID-swH1-F1 TgCATTTgggTAAATgTAACATTg 20µM HAgene (swineH1) 349NIID-swH1-R1 AATgTAggATTTRCTgAKCTTTgg 20µM

GADPH-6Fw gAAggTgAAggTCggAgT 20µM GADPHgene (HumanRNA) 226GADPH-231Rv gAAgATggTgATgggATTTC 20µM

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 7

ตารางท 2 ตวอยางชด primers และ probes สำาหรบตรวจวเคราะหหาสารพนธกรรมไวรส ไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1) ดวยวธ realtime RT-PCR

Primer/Probe Sequence (5′g3′) Working Gene target con.

InfA-f gACCRATCCTgTCACCTCTgAC 40µMMatrixgene

InfA-r AgggCATTYTggACAAAKCgTCTA 40µM(InfA)

Inf A Probe P1 TgCAgTCCTCgCTCACTgggCACg 10µM

H1sw-FM CATTTgAAAggTTTgAgATATTCCC 40µMHAgene

H1sw-RM ATgCTgCCgTTACACCTTTgT 40µM(SW-H1)

H1sw ProbeM P2 ACAAgTTCATggCCCAATCATgACTCg 10µM

RnaseP-f AgATTTggACCTgCgAgCg 40µMRNasePgene

RnaseP-r gAgCggCTgTCTCCACAAgT 40µM(HumanRNA)

RNaseP Probe P1 TTCTgACCTgAAggCTCTgCgCg 10µM

หมายเหต : 1. P1 = 5′ - end labeled with FAM and 3′ -end labeled with BHQ1 2. P2 = 5′ - end labeled with FAM and 3′ -end labeled with BBQ

3.เตรยมmastermixหรอสวนผสมของprimers/probesกบนำายา(bufferและenzyme)ปรมาณ

ของนำายาแตละชนดใหใชตามคมอทแนบมากบนำายา

4.เตมnegativecontrolหรอnotemplatecontrol,RNAจากตวอยางผปวยและpositivecontrol

ลงในหลอดนำายาmastermixควรเรยงลำาดบการเตมดงน

ลำาดบท1 เตมRNasefreewaterในหลอดทเตรยมเปนNotemplatecontrol(NTC)โดยเตม

ภายในหองทเตรยมmastermix(กอนทจะนำาเขาหองเตมตวอยางRNAของผปวย)

ลำาดบท2 เตมตวอยางRNAของผปวย

ลำาดบท3 เตมinternalpositivecontrolสำาหรบhumanRNA

ลำาดบท4 เตมRNAinfluenzapositivecontrol(ควรมตหรอพนทแยกออกจากสวนทเตม

RNAของผปวย)

5.นำาหลอดปฏกรยาเขาเครองConventionalPCR/RealtimePCRเพอเพมจำานวนสารพนธกรรม

ตงอณหภมและจำานวนรอบของปฏกรยาตามวธทดสอบทเลอกใช

6.การอานผล

6.1 วธ Conventional RT-PCR

ตองนำาPCRproductจากขอ5มาทำาGelelectrophoresisเพอตรวจสอบแถบปฏกรยา

หรอPCRbandตามขนตอนดงตอไปน

6.1.1 เตรยม2.0%agarosegelขนาด6x10.5เซนตเมตรใหชงผงagarose2.0กรม

ผสมกบ1xTBEbuffer100มลลลตรตมใหเดอดโดยใชMicrowaveจนgelใสละลายเปนเนอเดยวกนตง

ทงไวจนอณหภมลดลงประมาณ55องศาเซลเซยสถง60องศาเซลเซยสเตมEthidiumBromide(ความเขม

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข8

ขน10มลลกรมตอมลลลตร)ปรมาณ5ไมโครลตรเขยาใหทวแลวเทลงในgelcassetteปรมาณ30มลลลตร

พยายามเทอยาใหมฟองอากาศถามใหใชปลายtipแตะฟองอากาศจะหายไป(อาจผสมEthidiumBromideลง

ใน1xTBEbufferแทนการใสลงgelโดยมความเขมขนสดทายเทากบ5ไมโครกรมตอมลลลตรเมอทำาGel

electrophoresisเสรจใหนำาgelแชลงในEthidiumBromideประมาณ15-30นาทจงนำามาวางทเครองUV

transilluminatorแลวถายรป)

6.1.2 ผสมPCRproduct10ไมโครลตรกบloadingdye10x1.5ไมโครลตร

6.1.3เตรยมDNAmarkerผสม100basepairDNALadder(50ไมโครกรม)1ไมโครลตร

กบH2O3ไมโครลตรและloadingdye1ไมโครลตร

6.1.4การทำาGelelectrophoresisโดยวางgelลงในchamberของเครองelectrophoresis

แลวเตมTBEbufferใหทวมgelหยอดตวอยางและpositivecontrol12ไมโครลตรตอชองและชองสดทาย

ใหหยอดDNAmarkerและปรบpowersupplyไปท135โวลตหรอไมเกน20โวลตตอความยาวgel1

เซนตเมตรใชเวลาประมาณ30-40นาทหรอสของloadingdyeวงมาถงระดบทเหนอจากขอบgelประมาณ

1เซนตเมตรนำาแผนgelมาวางทเครองUVtransilluminatorแลวถายรป

6.1.5อานตำาแหนงของbandในชองของตวอยางเปรยบเทยบกบDNAmarkerและ

positivecontrol

6.2 วธ Realtime RT-PCR

6.2.1 ผลการทดสอบจะแปลผลไดเมอpositivecontrolมคาCtvalue(thresholdcycle)

นอยกวา40cycleและไมมการปนเปอนในตวอยางNTC(Notemplatecontrol)

6.2.2 ตวอยางผปวยทใหผลบวกตอInfAหรอswH1ตองมคาCtvalueนอยกวา40

cycle(คาCtระหวาง35-40cycleถอวาweakpositiveในผปวยบางรายอาจตองขอตวอยางสงตรวจใหม

เพอเปนการตรวจยนยนซำาอกครง)

6.2.3 ตวอยางผปวยทใหคาCtvalueของRNaseP มากกวา35cycleบงชวาตวอยาง

ผปวยอาจมจำานวนเซลลเยอบไมเพยงพอตอการวเคราะหควรขอตวอยางสงตรวจใหม

ก�รร�ยง�นผลวธ Conventional RT-PCR และ Realtime RT-PCR 1.การรายงานผลวาตวอยางผปวยพบสารพนธกรรมของไวรสไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)

เมอพบผลบวกของยนทง2ชนดคอInfA,swH1หรอ3ชนดคอInfA,swH1และGADPH/RNaseP

(การตรวจหาHumanRNAซงในทนตรวจยนGADPH/RNasePเปนการตรวจสอบคณภาพตวอยางวามเซลล

เยอบทางเดนหายใจในตวอยางผปวยมากพอสำาหรบการตรวจหาเชอไวรสดวยวธPCRหรอไม)

2.ตวอยางผปวยทใหผลลบGADPH/RNaseP(HumanRNA)ไมสามารถสรปผลไดควรรายงาน

ตวอยางผปวยมจำานวนเซลลเยอบไมเพยงพอตอการวเคราะหควรเกบตวอยางสงตรวจอกครง

3.ตวอยางผปวยทใหผลบวกswH1ตองใหผลบวกตอInfAดวยเสมอหากInfAใหผลลบ

ควรตรวจซำาหรอขอตวอยางสงตรวจใหม

4.ตวอยางผปวยทใหผลบวกInfAอาจใหผลบวกหรอลบตอswH1หากswH1ใหผลลบอาจ

หมายถงตวอยางผปวยมเชอไขหวดใหญสายพนธอนหรอมจำานวนเชอไวรสนอยกวาคาตำาสดทวธจะสามารถตรวจ

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 9

พบswH1geneได(พจารณาจากความเขมของbandInfAหรอคาCtInfAซงมกมคามากกวา35cycle)

กรณทตองการสอบสวนโรคอาจตองวเคราะหเพมเตมเพอหาไขหวดใหญตามฤดกาลหรอขอตวอยางสงตรวจใหม

เพอใหไดตวอยางทมปรมาณของเชอไวรสมากขน

ตารางท 3 สรปการรายงานผลวธ Conventional RT-PCR และ Realtime RT-PCR

แบบท ผลการวเคราะห การรายงานผล

Inf A sw H1 GADPH

/RNaseP

1 - - - ตวอยางผปวยมจำานวนเซลลเยอบไมเพยงพอตอการวเคราะหควรเกบ

ตวอยางสงตรวจอกครง

2 - - + ไมพบสารพนธกรรมของไวรสไขหวดใหญชนดA

3 + - + พบสารพนธกรรมของไวรสไขหวดใหญชนดA

4 + + + พบสารพนธกรรมของไวรสไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)

หมายเหต : 1. InfA=InfluenzaAหมายถงยนทตรวจพบไดในเชอไขหวดใหญชนดAทกสายพนธ

2. swH1=SwinesubtypeH1หมายถงสวนของHAgeneในไขหวดหมสบทยปA/H1ซงพบไดในไขหวด

ใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)เชนกน

3. GADPH=GlyceraldehydephosphateหมายถงRNAทตรวจพบไดในเซลลของคนทำาหนาทในการ

สงเคราะหGlyceraldehyde3-phosphateสารintermediateของขบวนการgluconeogenesis

4. RNaseP=RibonucleaseproteinหมายถงRNAทตรวจพบไดในเซลลของคนทำาหนาทในกระบวนการ

สงเคราะหเอนไซมribonuclease

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข10

บทท 5การควบคมคณภาพ

การตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขเพอใหไดผลวเคราะหหรอขอมลทมคณภาพจำาเปนตองมการควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการโดยผปฏบตงานในหองปฏบตการและการควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอกเพอผลการทดสอบแมนยำาและเชอถอได

การควบคมคณภาพภายในหองปฏบตการ การดำาเนนการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)โดยวธPCRมปจจยหลายประการทมผลตอการวเคราะหสารพนธกรรมผปฏบตงานจงควรตระหนกระมดระวงและดำาเนนการเพอใหปจจยทเกยวของกบการตรวจวเคราะหดงกลาวสงผลตอผลวเคราะหนอยทสดเพอใหผลวเคราะหหรอขอมลมความถกตองเปนทยอมรบและเชอถอไดดงน 1. บคลากร 1.1หองปฏบตการควรมบคลากรเพยงพอมคณวฒและประสบการณเหมาะสมกบงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญหรอไดรบการฝกอบรมดานเทคนคการตรวจวเคราะหดวยวธPCR 1.2มการบนทกและจดเกบเอกสารรายละเอยดคณวฒการฝกอบรมและการประเมนความสามารถทางหองปฏบตการของบคลากรทเกยวของกบรายการทดสอบ

2. สถานทและสภาวะแวดลอม 2.1 มการออกแบบและจดการพนทปฏบตงานทไมทำาใหเกดปญหาตอคณภาพของงานและความปลอดภยของผปฏบตงาน 2.2 มการจดการแสงไฟฟาการระบายอากาศนำาขยะวสดทนำากลบมาใชอกและสภาวะแวดลอมใหเหมาะสมสำาหรบการทำางาน 2.3พนทปฏบตงานการตรวจวเคราะหสารพนธกรรมควรเปนหองทตองควบคมใหปราศจากการปนเปอนของตวอยางและสารพนธกรรมทกชนดและควบคมการเขาออกหามผไมเกยวของเขามาในหองปฏบตการกอนไดรบอนญาตเชนผปวยเจาหนาทและผมาเยยมจากภายนอก 2.4 มการตรวจสอบและดแลรกษาพนทปฏบตงานใหสะอาดเรยบรอย 2.5 มการจดเกบและทำาลายสารอนตรายและมวธการปองกนการตดเชอการแพรกระจายเชอสสงแวดลอมอยางถกตองตามหลกวชาการ

3. เครองมอในหองปฏบตการ 3.1 หองปฏบตการตองมพนทจดวางเครองมอวทยาศาสตรทจำาเปนในการตรวจวเคราะหอยางเหมาะสม 3.2 หองปฏบตการตองมเครองมอวทยาศาสตรทจำาเปนและเพยงพอในการตรวจวเคราะหเชนตปราศจากเชอ(BiosafetycabinetclassII)เครองเพมปรมาณสารพนธกรรม(PCRthermocycler)เครองGelElectrophoresisเครองGeldocไปเปตอตโนมตเปนตน 3.3 มการตรวจสอบดแลการทำางานของเครองมออปกรณอยางสมำาเสมอใหพรอมใชงาน 3.4 มคมอการใชงานและบำารงรกษาเครองมอณจดปฏบตงานซงอาจใชเอกสารจากผผลตทจดเตรยมไวพรอมใชตามความเหมาะสม

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 11

4. วธปฏบตกอนการตรวจวเคราะห 4.1 มมาตรการดานความปลอดภยตามวธมาตรฐานขององคการอนามยโลกในการรบและเตรยมตวอยางกอนกอนการตรวจวเคราะห 4.2 ตรวจสอบใบคำาขอสงตรวจและขอมลของผปวยทจำาเปนตอการวเคราะหผล 4.3 มการบนทกรบตวอยางในสมดแบบฟอรมหรอในคอมพวเตอรหรอระบบอน 4.4 มเกณฑการปฏเสธตวอยางและขอปฏบตในการแจงใหผสงตวอยางรบทราบ 4.5 มคมอการดำาเนนการเกบรกษาและทำาลายตวอยางหลงการตรวจวเคราะหแลว

5. การตรวจวเคราะห 5.1 ในกระบวนการตรวจวเคราะหทกครงจำาเปนตองมตวควบคมผลบวกและผลลบ(PositiveandNegativecontrol)กรณทหองปฏบตการไมไดใชชดนำายาสำาเรจรปทมาพรอมกบตวควบคมผลบวกและผลลบใหตดตอขอตวควบคมผลบวกและผลลบจากกรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสข 5.2 ผปฏบตงานตองปฏบตตามวธมาตรฐานในการปฏบตงาน(SOP:StandardOperatingProcedures)หรอคมอการใชชดนำายาอยางเครงครด 5.3 กรณทผลการวเคราะหบงชวาตวอยางไมมคณภาพหองปฏบตการตองแจงไวในใบรายงานผล 5.4 การวเคราะหและสรปผลตองมการตรวจสอบโดยหวหนาหองปฏบตการหรอผทไดรบมอบหมายและมการบนทกรบรองผลการตรวจวเคราะหทกครง 5.5 ควรตรวจสอบความถกตองของวธ(Methodvalidation)เมอมการปรบเปลยนprimers/probesทใชในการตรวจวเคราะหและบนทกผลไวเปนหลกฐาน

6. การรายงานผล 6.1 หองปฏบตการตองมวธปฏบตทชดเจนในการออกรายงานผลการวเคราะหวธการแจงผลการแกไขรายงานผลและการเกบรกษาขอมล 6.2 ขอมลในใบรายงานผลตองมความชดเจนมการแปลผลการตรวจวเคราะหตามวตถประสงคของผสงตวอยาง

การควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอก การควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอก(ExternalQualityAssessment(EQA),Proficiencytesting(PT))เปนการดำาเนนการโดยองคกรภายนอกหองปฏบตการทำาหนาทจดหาตวอยางทไดจดเตรยมใหมความคลายคลงกบสงสงตรวจจากผปวยมากทสดตวอยางดงกลาวทผานการตรวจสอบคณภาพแลวจะถกจดแบงสงใหหองปฏบตการตรวจวเคราะหตามวธทดสอบทหองปฏบตการดำาเนนการในงานประจำาวนและหองปฏบตการจะตองสงรายงานกลบมายงผดำาเนนการเพอเปรยบเทยบกบคาทกำาหนดซงอาจเปนคาอางอง(referencevalue)หรอคาพองกลม(consensusvalue)ซงผลการตรวจวเคราะหของหองปฏบตการแตละแหงททำาการตรวจวเคราะหตวอยางเดยวกนตองจดอยในเกณฑทยอมรบได(acceptablerange)จงจะถอวากระบวนการตรวจวเคราะหในหองปฏบตการนนๆมมาตรฐานเปนทยอมรบไดหองปฏบตการจะไดรบรายงานผลเพอนำาไปใชประเมนคณภาพการตรวจวเคราะหอนเกดจากปจจยทเกยวของทงเครองมอนกวเคราะหวธการและสภาพแวดลอม

การควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอกสำาหรบการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)โดยวธPCRขณะนกรมวทยาศาสตรการแพทยเปนผดำาเนนการทดสอบความชำานาญทางหองปฏบตการใหกบหองปฏบตการทเปนสมาชกโดยจดสงตวอยางProficiencytesting(PTsample)และรายงานผลการประเมนใหแกสมาชกเพอใหสมาชกนำาผลการประเมนไปพฒนาระบบคณภาพหองปฏบตการตามมาตรฐานสากลและทำาใหสมาชกและผใชบรการมความมนใจในความถกตองของการรายงานผลวเคราะห

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข12

บทท 6การบำารงรกษาและสอบเทยบเครองมอวทยาศาสตร

เครองมอวทยาศาสตรทใชในงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดสายพนธใหมชนดA(H1N1)จำาเปนตองตด

ตงในบรเวณทเหมาะสมแขงแรงและปลอดภยเพอการใชงานไดอยางมประสทธภาพและตองมการตรวจสอบ

และบำารงรกษาเครองมออยางสมำาเสมอรวมทงตองสอบเทยบเครองมอสำาคญทมผลตอการวเคราะหเพอผลการ

วเคราะหทถกตองซงอาจแบงการดำาเนนการออกเปน2กลมดงน

1.เครองมอทตองสอบเทยบเมอตดตง/จดซอเครองใหมและควรสอบเทยบพารามเตอรทจำาเปนตาม

ระยะเวลาทใชงานเชน

เครองมอ พารามเตอรทควรสอบเทยบ

1.RealtimePCR/PCRthermocycler 1.Averageheatrate

2.Averagecool

3.Accuracy

4.Uniformity

5.Filtertest(RealtimePCR)

2.Autopipette 1.Accuracyของปรมาตรทใชงาน

2.Precisionของปรมาตรทใชงาน

3.Biosafetycabinet 1.Downflowvelocity

2.Exhaustairvolume

3.Efficiencyoffiltration

4.Inflowvelocity

5.Sterilitytest

2. เครองมอทตองมการตรวจสอบ(monitor)เปนประจำาโดยบนทกผลจากเครองมอวดทตดตง

ประจำาเครอง

เครองมอ การตรวจสอบ

1.ตเยน/ตแชแขง บนทกอณหภมจากเทอรโมมเตอรประจำาเครอง

(เทอรโมมเตอรตองผานการสอบเทยบ)

2.Heatingblock บนทกอณหภมจากเทอรโมมเตอรประจำาเครอง

(เทอรโมมเตอรตองผานการสอบเทยบ)

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 13

บทท 7ความปลอดภยทางหองปฏบตการ

การปฏบตงานตรวจวเคราะหในหองปฏบตการทางวทยาศาสตรผปฏบตงานตองตระหนกและพงระลกถง

การปฏบตตนใหปลอดภยจากการตดเชอไขหวดในระหวางตรวจวเคราะหรวมถงการกำาจดสงสงตรวจอยางเหมาะสม

เพอใหสงแวดลอมปลอดภยดงน

1. ไมนำาตวอยางจากสตวและคนมาทดสอบในหองปฏบตการเดยวกน

2.การเตรยมตวอยางการสกดสารพนธกรรมจากตวอยางตองปฏบตในตปราศเชอ(BSCclassII)

เทานนและปฏบตงานตามคำาแนะนำาดานความปลอดภยของWHOLaboratorybiosafetymanual,3rd

editionหรอคมอดานความปลอดภยทางหองปฏบตการของแตละหนวยงาน

3.ผปฏบตงานตองใสอปกรณปองกนเชนเสอกราวนถงมอ2ชนผาปดจมกหมวกคลมผมแวนตา

4.ตองลางมอดวยสบหรอแอลกอฮอลทกครงหลงการทดสอบหรอเมอออกจากหองปฏบตการ

5.การปฏบตงานตองทำาดวยความระมดระวงโดยเฉพาะขนตอนททำาใหเกดการฟงกระจายของตวอยาง

เชนการปนการเขยาตองปฏบตงานในตปลอดเชอเทานน

6.ตวอยางและขยะตดเชอทตองการกำาจดตองทำาการนงฆาเชอหรอใสนำายาฆาเชอกอนนำาออกจากหอง

ปฏบตการ

7.หองปฏบตการตองมขอกำาหนดการจำากดการเขาออกสำาหรบบคลากรทไมเกยวของ

8.หองปฏบตการตองมวธปฏบตกรณเกดเหตฉกเฉนหรออบตเหตจากตวอยางหรอเชอหกหลนแสดงไว

ในทสงเกตเหนไดชดเจนรวมทงมอปกรณและนำายาพรอมใชในการกำาจดหรอลดการปนเปอน(Spillkits)

9.ตองมการทำาความสะอาดพนทการทำางานและหองปฏบตการรวมทงการกำาจดขยะของเสยเปนประจำา

ทกวน

10.สารทเปนอนตรายเชนEthidiumBromideซงเปนสารกอมะเรงควรทำาการdetoxifyหรอ

inactivateกอนทจะนำาไปทงเชนการใชชดกรองDestainingbags,BondExDetoxicificationCartridges,

ExtractorWasteReductionSystem

11.เจาหนาททกคนตองไดรบการอบรมความปลอดภยดานหองปฏบตการเปนประจำาอยางนอย1ครง

ตอป

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข14

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 15

ภาคผนวก 1 การคำานวณหาความเขมขนของ primers และ probes

ตวอยางท 1 ถาตองการเตรยม primer A ทมเนอสารอย 84600 picomoles ในสภาพผงแหง ใหมความ

เขมขน 100 µM ตองเตม RNase free water ปรมาตรเทาใด

การคำานวณ 100µM = 100µmole/liter

84600picomoles = 84600x10-6micromole(µmole)

= 0.0846µmole

เนอสาร100µmoleเตรยมในสารละลาย106 µl

เนอสาร0.0846µmoleเตรยมในสารละลาย= 0.0846µmolex106 µl

100µmole

= 846µl

สรปตองเตมRNasefreewaterปรมาตร846µlจงจะไดprimerAมความเขมขน100µM

ตวอยางท 2 ถาตองการเตรยม primer A มความเขมขน 25 µM ปรมาณ 100 µl ตองใช primer A

ความเขมขน 100 µM ปรมาณเทาใด

สตร C1V1 = C

2V2

C1=Initialconcentrationofsolution V

1=Initialvolumeofsolution

C2=Finalconcentrationofsolution V

2=Finalvolumeofsolution

การคำานวณ C1V1= C

2V2

100µmole(V1) = 25µmolex100µl

106 µl106 µl

V1 = 25µl

สรปตองใชprimerAความเขมขน100µMปรมาณ25µlรวมกบRNasefreewater75µl

จะไดprimerAมความเขมขน25µMปรมาณ100µlตามทตองการ

หมายเหต 1molar(M) = 106micromoles(µmole)/liter

= 1012picomoles(pmole)/liter

= 1 µmole/µl

= 106pmole/µl

1mole = 106micromoles

= 1012picomoles

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข16

ภาคผนวก 2วธเกบและสงตวอยางตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม

ชนด A (H1N1)การเกบตวอยาง

การเกบตวอยางสารคดหลงระบบทางเดนหายใจเพอตรวจหาสารพนธกรรมควรเกบตวอยางใหเรว

ทสดภายใน1-3วนเมอเรมปรากฏอาการของโรคและเกบซำาอกครงหากมอาการปอดบวมหรอปอดอกเสบ

วธการเกบใหใชวธปราศจากเชอ(aseptictechnique)โดยเกบตวอยางจากระบบทางเดนหายใจไดแก

Nasopharyngealaspirate(NPA),Nasopharyngealwash(NPW),Nasopharyngealswab(NPS),Throat

swab(TS),Nasalswab(NS),Bronchoalveolarlarvage,Trachealaspirateเปนตน

Throatswabใชswabปายภายในบรเวณposteriorpharynxจมปลายswabในviraltransport

media(VTM)หกดามswabทงปดหลอดใหสนท

Nasopharyngealswabเกบโดยสอดลวดswabเขาไปในรจมกถงสวนของnasopharynxทงไว

ประมาณ2-3วนาทคอยๆหมนลวดswabแลวดงออกจมปลายswabลงในVTMและตดปลายลวดสวน

เกนจากหลอดปดฝาใหสนท

Nasopharyngealaspirationเกบโดยใชสายพลาสตกทตอกบเครองดดสอดใสเขาไปในชองจมกดดตวอยาง

ประมาณ2-3มล.ใสในหลอดทปราศจากเชอกรณดดเสมหะไดนอยใหใชviraltransportmedia(VTM)ลาง

เซลลทคางสายลงในหลอด

Nasalswabใชswabสอดเขาในรจมกขนานกบpalateทงไวประมาณ2-3วนาทคอยๆหมนswab

ออกแลวดงออกจมปลายswabในviraltransportmediaหกดามswabทงเพอปดหลอดใหสนทไมควรเกบ

ตวอยางจากรจมกขางเดยวกนหลายswabในเวลาใกลเคยงกน

หมายเหต : ไมควรใชswabทมcalciumalginateหรอswabทดามทำาดวยไมเพราะอาจมสารทยบยง

ไวรสบางชนดหรอยบยงปฏกรยาPCRควรใชDacronหรอRayonswabทดามทำาดวยลวดหรอพลาสตก

ในกรณตวอยางเลอดเพอตรวจหาแอนตบอดดำาเนนการเจาะเลอด2ครงครงแรกในระยะเรมเปน

โรค(acuteserum)หรอวนทผปวยมารกษาและครงท2ระยะโรคทเลา(convalescentserum)เกบหาง

จากครงแรกอยางนอย2สปดาหโดยเจาะเลอดจากเสนเลอดดำาประมาณ3-5มล.ใสหลอดปราศจากเชอปดฝา

ใหสนทตงทงไวทอณหภมหองรอเลอดแขงตวปนแยกซรมแบงซรมใสหลอดปราศจากเชอเกบเขาตเยน4

องศาเซลเซยสเพอรอการนำาสง

การสงสงสงตรวจและขอควรระวง

ตวอยางสารคดหลงหรอswabทบรรจในภาชนะตองปดจกใหสนทพนดวยเทปปดฉลากแจงชอ

ผปวยชนดของตวอยางวนทเกบบรรจใสถงพลาสตกรดยางใหแนนแชในกระตกนำาแขงรบนำาสงทนทถาจำาเปน

ตองรอควรเกบไวในตเยน(4oซ.)หามแชในชองแชแขงของตเยน(-20oซ.)ถาตองการเกบนานเกน48ชวโมง

ใหเกบ–70องศาเซลเซยสสำาหรบviraltransportmedia(VTM)ตดตอไดทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

กรมวทยาศาสตรการแพทยโทร.029510000ตอ99248

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 17

รปท 1 อปกรณและวธการเกบตวอยาง

กานพนสำาล ไมกดลน การเกบตวอยางจากลำาคอ(Throatswab)

เกบตวอยางและใสในหลอดVTMโดยหกกานพนสำาลเพอปดหลอดใหสนท

รปท 2 การสงสงสงตรวจทไมเหมาะสม

ปดฝาหลอดไมสนท

ตวอยางไมแชในVTM

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข18

ภาคผนวก 3 ตวอยางวสดและอปกรณ

รปท 3 การตรวจดวยวธ Conventional RT-PCR

เพมสารพนธกรรมดวยเครองPCRthermocycler

เครองGelelectrophroresis

อานผลดวยการถายภาพแผนgelทแสดงแถบของผลบวก

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 19

รปท 4 การตรวจดวยวธ Realtime RT-PCR

อานผลดวยโปรแกรมวเคราะหแสดงเปนเสนกราฟและคาCt(thresholdcycle)

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข20

ภาคผนวก 4ตวอยางพนทปฏบตงาน

รปท 5 หองเตรยมตวอยางและสกดสารพนธกรรม

รปท 6 หองเตรยมนำายา

รปท 7 หองเพมจำานวนสารพนธกรรมและตรวจหาสารพนธกรรม

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 21

ภาคผนวก 5ตว

อยางตารางบ

นทกผ

ลการตร

วจวเคร

าะหเชอไขห

วดใหญสายพ

นธใหม

ชนด

A (H

1N1)

หนวย

งาน/โรงพ

ยาบา

ล................................................................

ห

องปฏ

บตการส

าขา...........................................................

วน/เด

อน/ป.....................................

WorksheetN

o..................................

นำายาบร

ษท......................................Lo

t………………..E

xpiredda

te………………..

ตวคว

บคมผ

ลบวก

1.InfALo

t………Ex

piredda

te…………2.H

1swLot…………Ex

piredda

te………3.R

NaseP

Lot………Ex

piredda

te……….

ลำาดบ

ท ชอ

-สกล

หม

ายเลข

หมาย

เลข

ผล

การว

เครา

ะห

สร

ปผล

หมาย

เหต

วส

ดตวอ

ยาง* ปร

ะจำาว

น**

Inf A

H1sw

RN

aseP

ผต

รวจวเคราะห

..................................................................

ผรบร

องผล

......................................................................

วนท

....................................................

*หม

ายเลขท

กำาหน

ดโดย

หนวย

งานร

บวสด

ตวอย

างสงตรวจ

**หม

ายเลขป

ระจำาวน

ทกำาห

นดโดยห

องปฏ

บตการตรวจวเคราะห

สาขานน

ๆ

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข22

ภาคผนวก 6

แบบประเมนคณภาพหองปฏบตการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม

ชนด A (H1N1)

ลำาดบ ขอกำาหนด ผลประเมน

สงทตรวจพบ/เอกสารอางอง Y N

1 องคกรและการบรหาร

ขอ1 มผรบผดชอบสงสดของหองปฏบตการและมผจดการคณภาพ(QM)หรอคณะกรรมการบรหารคณภาพในการบรหารจดการสามารถดำาเนนการตดตอผบรหารระดบสงสดขององคกรทมอำานาจตดสนใจ

ขอ2 มการกำาหนดหนาทความรบผดชอบของบคลากรทเกยวของตงแตการบรหารจดการหองปฏบตการกระบวนการตรวจวเคราะหการสมและเตรยมตวอยางทกขนตอนรวมทงระบบการรายงานผลและจดทำาเปนเอกสารไว

ขอ3 มระบบเอกสารเพยงพอสำาหรบการตรวจสอบยอนกลบความถกตองของวธปฏบตตามหลกวชาการ

2 พนทปฏบตงาน

ขอ4 มการควบคมการเขาออกหามผไมเกยวของเขามาในหองปฏบตการ

ขอ5 มการตรวจสอบดแลรกษาพนทปฏบตงานใหสะอาดเรยบรอย

ขอ6 มการจดเกบและทำาลายสารอนตรายและมวธการปองกนการตดเชอการแพรกระจายเชอสสงแวดลอมอยางถกตองตามหลกวชาการและมการแบงพนทเปน3สวนไดแก

สวนสกดพนธกรรม สวนเตรยมนำายาสะอาด สวนขยายพนธกรรมและตรวจหาสารพนธกรรม

3 เครองมอและวสดวทยาศาสตร

ขอ7 มพนทจดวางเครองมอวทยาศาสตรทจำาเปนในการตรวจวเคราะหอยางเหมาะสม

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 23

ขอ8 มเครองมอทจำาเปนเพยงพอในการตรวจวเคราะห

ขอ9 มการตรวจสอบดแลการทำางานของเครองมออปกรณอยางสมำาเสมอใหพรอมใชงาน

ขอ10มการสอบเทยบพารามเตอรทจำาเปน

ขอ11มการตรวจสอบ(monitor)เปนประจำาโดยบนทกผลจากเครองมอวดทตดตงประจำาเครอง

ขอ12มค มอการใช งานและบำาร งรกษาเคร องมอณ.จดปฏบตงานซงอาจใชเอกสารจากผผลตทจดเตรยมไวพรอมใชตามความเหมาะสม

ขอ13มบนทกการใชงานการสอบเทยบตรวจสอบและบำารงรกษาเพอการตรวจสอบยอนกลบได

4 การจดการตวอยางสงตรวจ

ขอ14มมาตรการดานความปลอดภยในการรบตวอยางการเตรยมตวอยางและการสกดสารพนธกรรมของเชอไขหวดใหญจากตวอยางผปวยปฏบตตามคำาแนะนำาWHOใหใชหองปฏบตการนรภยระดบ2

ขอ15ตรวจสอบใบคำาขอสงตรวจและขอมลของผปวยทจำาเปนตอการวเคราะหผล

ขอ16มการบนทกรบตวอยางในสมดแบบฟอรมหรอในคอมพวเตอรหรอระบบอน

ขอ17มเกณฑการปฏเสธตวอยางและขอปฏบตในการแจงใหผสงตวอยางรบทราบ

ขอ18มคมอการดำาเนนการเกบรกษาและทำาลายตวอยางหลงการตรวจวเคราะหแลว

5 วธทดสอบ

ขอ19มการจดทำาและปฏบตตามวธมาตรฐานการปฏบตงานหรอคมอการใชชดนำายาทเปนทยอมรบอางองไดอยางเครงครด

ขอ20กรณหากหองปฏบตการดดแปลงจากวธมาตรฐานหรอพฒนาขนเองตองมขอมลแสดงกระบวนการพสจนความถกตองของผลวเคราะหและบนทกรายละเอยดของวธทใชเปนลายลกษณอกษรอยางครบถวน

ลำาดบ ขอกำาหนด ผลประเมน

สงทตรวจพบ/เอกสารอางอง Y N

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข24

ลำาดบ ขอกำาหนด ผลประเมน

สงทตรวจพบ/เอกสารอางอง Y N

ขอ21มการตรวจสอบความถกตองของวธ(Method

validation)เมอมการปรบเปลยนprimers/probes

ทใชในการตรวจวเคราะหทกครงและบนทกผลไวเปน

หลกฐาน

ขอ22กรณทใชเครองมอและนำายาไมตรงกบวธทดสอบ

ระบไวมการปรกษากบบรษททจำาหนายเครองมอ

และนำายาเพอปรบตวโปรแกรมของเครองPCR

ใหเหมาะสมกบชนดนำายาและทดลองวเคราะหกบ

ตวอยางททราบคากอนและตองผานการประเมน

กอนนำามาใชวเคราะหจรง

ขอ23ในกระบวนการตรวจวเคราะหทกครงจำาเปนตอง

มตวควบคมผลบวกและผลลบ(Positiveand

Negativecontrol)กรณทหองปฏบตการไมไดใชชด

นำายาสำาเรจรปทมาพรอมกบตวควบคมผลบวกและ

ผลลบใหตดตอขอตวควบคมผลบวกและผลลบจาก

กรมวทยาศาสตรการแพทยกระทรวงสาธารณสข

6 บคลากร

ขอ24มบคลากรเพยงพอมคณวฒและประสบการณเหมาะ

สมกบงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญหรอไดรบ

การฝกอบรมดานเทคนคการตรวจวเคราะหดวยวธ

PCR

ขอ25มการบนทกและจดเกบเอกสารรายละเอยดคณวฒ

และการฝกอบรมของบคลากรทเกยวของกบรายการ

ทดสอบทไดรบมอบหมาย

ขอ26การวเคราะหและสรปผลตองมการตรวจสอบโดย

หวหนาหองปฏบตการหรอผทไดรบมอบหมายและ

มการบนทกรบรองผลการตรวจวเคราะหทกครง

7 การควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอก

ขอ27มการดำาเนนการเขารวมในโครงการทดสอบความ

ชำานาญทางหองปฏบตการและผลการประเมนผาน

เกณฑการยอมรบ

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 25

ลำาดบ ขอกำาหนด ผลประเมน

สงทตรวจพบ/เอกสารอางอง Y N

8 การรายงานผล

ขอ28หองปฏบตการตองมวธปฏบตทชดเจนในการออกรายงานผลการวเคราะหวธการแจงผลการแกไขรายงานผลการเกบรกษาขอมล

ขอ29ขอมลในใบรายงานผลตองมความชดเจนมการแปลผลการตรวจวเคราะหตามวตถประสงคของผสงตวอยาง

ขอ30กรณทผลการวเคราะหบงชวาตวอยางไมมคณภาพหองปฏบตการตองแจงไวในใบรายงานผล

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข26

ภาคผนวก 7 การรบรองความสามารถการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญ

สายพนธใหม ชนด A (H1N1) ตามมาตรฐานการปฏบตงานทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข กระทรวงสาธารณสข

กระทรวงสาธารณสขมกระบวนการรบรองความสามารถหองปฏบตการทเปนเอกภาพและโปรงใส

ภายใตความเหนชอบของคณะกรรมการซงสามารถดำาเนนการไดอยางเปนอสระ

1. คณสมบตของหองปฏบตการทขอรบรอง

เปนหองปฏบตการทมสถานทปฏบตการถาวรหรอเปนหนวยปฏบตการเคลอนท

2. ขอกำาหนดทวไป

2.1 ผลงนามในเอกสารขอรบการรบรองตองเปนผบรหารสงสดของหองปฏบตการทขอการรบรอง

หรอผรบมอบอำานาจ

2.2 ต อ ง ส ง เ อ กส า รแสด ง ร า ยละ เ อ ย ด ร ะบบคณภ าพและก า รดำ า เ น น ง านท ง หมด

ใหสำานกมาตรฐานหองปฏบตการกรมวทยาศาสตรการแพทยพจารณาภายใน30วนนบจากวนทแจงขอ

การรบรองโดยมเอกสารตางๆเชน

-คมอคณภาพ

-การบรหารจดการตวอยาง

-หลกเกณฑการสมและวธเตรยมตวอยาง

-วธการตรวจวเคราะห

-บนทกการตรวจวเคราะห

-การเกบรกษาการทำาลายตวอยางและการทงของเสย

-บนทกการฝกอบรมของเจาหนาทตรวจวเคราะห

3. ขอกำาหนดดานบรหารคณภาพ

3.1 องคกรและการบรหาร

-มผรบผดชอบสงสดของหองปฏบตการและมผจดการคณภาพ(QM)หรอคณะกรรมการ

บรหารคณภาพในการบรหารจดการรวมทงดานบคลากรและทรพยากรทจำาเปนในการปฏบตการทดสอบและสามารถ

ดำาเนนการตดตอผบรหารระดบสงสดขององคกรทมอำานาจตดสนใจ

-กำาหนดหนาทความรบผดชอบของบคลากรท เกยวของต งแตการบรหารจดการ

หองปฏบตการกระบวนการตรวจวเคราะหการสมและเตรยมตวอยางทกขนตอนรวมทงระบบการรายงานผล

และจดทำาเปนเอกสารไว

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 27

-มการควบคมงานตรวจสอบโดยบคลากรทรวธตรวจสอบและวธดำาเนนการและจดสดสวน

ของเจาหนาทปฏบตงานตอจำานวนตวอยางวเคราะหทสามารถดำาเนนการไดโดยผควบคมงานเปนผทมคณวฒ

ความรและประสบการณเหมาะสมเจาหนาทตรวจวเคราะหตองผานการฝกอบรมจากหนวยงานทเชอถอไดหรอ

ผานการอบรมตอจากผควบคมงานและตองไดรบการประเมนมอบหมายใหทำาหนาทตรวจวเคราะหเจาหนาทตรวจ

วเคราะหตองดำาเนนการวเคราะหตามวธทระบในคมอวธการตรวจวเคราะห

-มผลการเขารวมในกจกรรมการควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอกหรอการทดสอบความ

ชำานาญ

3.2 บคลากร

-หองปฏบตการตองมบคลากรเพยงพอมคณวฒทเหมาะสมไดรบการฝกอบรมและม

ประสบการณเหมาะสมกบงานทไดรบมอบหมาย

-มการบนทกและจดเกบเอกสารรายละเอยดคณวฒและการฝกอบรมของบคลากรทเกยวของ

กบรายการทดสอบทไดรบมอบหมาย

3.3ระบบเอกสาร

- มการจดทำาเอกสารระบบบรหารคณภาพและวชาการเหมาะสมเพยงพอและสอดคลองกบ

ระบบคณภาพตามมาตรฐานสากลหรอมาตรฐานทเปนทยอมรบของวชาชพ

3.4วธทดสอบตองเลอกจากวธวเคราะหดงน

วธมาตรฐานซงเปนทยอมรบของสากล

วธอนๆทมขอมลแสดงกระบวนการพสจนความถกตองของวธโดยมคาความไวและความ

จำาเพาะสามารถตรวจชนด/ปรมาณไดครอบคลมคามาตรฐานตามวตถประสงค

วธทดสอบทกกรณดงกลาวขางตนหากหองปฏบตการดดแปลงจากวธมาตรฐานหรอพฒนา

ขนเองตองมขอมลแสดงกระบวนการพสจนความถกตองของผลวเคราะหและบนทกรายละเอยดของวธทใชเปน

ลายลกษณอกษรอยางครบถวนชดเจน

3.5สถานทและภาวะแวดลอม

มขนาดและสงแวดลอมทเหมาะสมมมาตรการดานความปลอดภยโดยดำาเนนการตามวธมาตรฐาน

การปฏบตงานเรองความปลอดภยหองปฏบตการและมพนทจดวางเครองมอวทยาศาสตรทจำาเปนในการตรวจ

วเคราะหอยางเหมาะสม

3.6 เครองมอวทยาศาสตร

หองปฏบตการตองมอปกรณและเครองมอทจำาเปนและเหมาะสมสำาหรบการทดสอบและมการ

ตรวจสอบดแลการทำางานของเครองมออปกรณอยางสมำาเสมอใหพรอมใชงาน

3.7การบนทก

หองปฏบตการตองมระบบบนทกขอมลทเหมาะสมกบงานทปฏบตและเปนไปตามระเบยบท

วางไวโดยเอกสารตางๆระบชอผปฏบตงานวนทและรายละเอยดของขอมลทบนทกใหเพยงพอในทกขนตอน

เพอใหสามารถตรวจสอบยอนกลบได

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข28

3.8การจดซอและการใชบรการภายนอก

ในกรณทหองปฏบตการมการจดซอวสดอปกรณและใชบรการภายนอกเพอสนบสนนการทดสอบ

หองปฏบตการตองจดซอและใชบรการภายนอกทมคณภาพเพยงพอและหองปฏบตการตองบนทกและเกบรกษา

รายละเอยดเกยวกบวสดอปกรณทจดซอเพอใหสามารถตรวจสอบยอนกลบได

4. ขนตอนการขอการรบรอง

4.1หองปฏบตการยนขอรบรองความสามารถหองปฏบตการตอสำานกมาตรฐานหองปฏบตการ

กรมวทยาศาสตรการแพทยพรอมหลกฐานและเอกสารตางๆตามทระบในขอ2.2ของมาตรฐานการปฏบตงาน

ฉบบน

4.2 เจาหนาทตรวจความครบถวนของเอกสารและแจงใหผยนคำาขอทราบ

4.3 กรมวทยาศาสตรการพทยจะสงตวอยางควบคมคณภาพ(checksample)ใหผยนคำาขอนำากลบ

ไปตรวจวเคราะหเพอเปรยบเทยบผล(ถาจำาเปน)

4.4เมอไดรบรายงานผลการตรวจวเคราะหตวอยางควบคมคณภาพโดยองคกรภายนอกหรอผล

การทดสอบความชำานาญแลวกรมวทยาศาสตรการแพทยจะแตงตงคณะผตรวจประเมน

4.5คณะผตรวจประเมนจะตรวจคมอเอกสารตางๆทไดรบและจะไปตรวจประเมนเบองตน(ถา

จำาเปน)ณสถานทปฏบตการของผขอรบรองโดยจะแจงชอผไปตรวจประเมนและวนเวลาใหผขอรบรองทราบ

ลวงหนา

4.6 กรมวทยาศาสตรการแพทยจะแจงผลการตรวจประเมนเบองตนใหผขอรบรองทราบหากม

ขอบกพรองหองปฏบตการตองแกไขใหเรยบรอยกอนการนดหมายวนเวลาสำาหรบการตรวจประเมนครงท2

4.7 เมอผลการตรวจประเมนไดรบการแกไขขอบกพรองครบถวนตามเงอนไข(ยอมรบไดตามเงอนไข)

เจาหนาทผตรวจประเมนจะสรปผลและนำาเสนอผลการตรวจประเมนใหและคณะกรรมการรบรองความสามารถ

หองปฏบตการพจารณาเพอเสนอกระทรวงสาธารณสขใหออกใบรบรองตอไป

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 29

ภาคผนวก 8

เอกสารอางอง

1. กระทรวงสาธารณสข.แผนปฏบตการแมบทการเตรยมความพรอมสำาหรบการระบาดใหญของโรคไขหวดใหญ

พ.ศ.2552

2. US-CDCversion2009:SwineInfluenza,CDCREF.#I-007-05.

3. M.Panning,etal.DetectionofInfluenzaA(H1N1)virusbyReal-timeRT-PCR.Euro

Survill.2009;14(36).

4. WHOInformationforLaboratoryDiagnosisofNewInfluenzaA(H1N1)Virusin

Humans,Revised,23November2009.

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข30

ภาคผนวก 9 คณะผจดทำา

สำ�เน�คฉบบ

คำาสงกรมวทยาศาสตรการแพทย

ท119/2553

เรองแตงตงคณะทำางานจดทำามาตรฐานการปฏบตงาน

ตรวจวเคราะหไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข

ดวยกรมวทยาศาสตรการแพทยมหนาทในการใหองคความรดานระบบคณภาพและการตรวจวเคราะห

ทางดานหองปฏบตการ

จากมตการประชมกระทรวงสาธารณสขครงท6/2552เมอวนจนทรท30พฤศจกายน2552ไดมอบ

หมายใหกรมวทยาศาสตรการแพทยพฒนาศกยภาพหองปฏบตการชนสตรสาธารณสขของโรงพยาบาล25แหงเพอ

เปนการเตรยมความพรอมและดำาเนนการตรวจวนจฉยโรคไขหวดใหญสายพนธใหมชนดเอ(เอช1เอน1)เพอ

ใหการดำาเนนงานเปนไปตามนโยบายของกระทรวงสาธารณสขกรมวทยาศาสตรการแพทยจงแตงตงคณะทำางาน

การจดทำาเกณฑมาตรฐานหองปฏบตการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหม2009ประกอบดวย

1.นายนพนธโพธพฒนชย ทปรกษา

รองอธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

2.นายวฒนาอวาณชย ประธานคณะทำางาน

สำานกวชาการวทยาศาสตรการแพทย

3.นางเพญศรรอดมา รองประธานคณะทำางาน

สำานกวชาการวทยาศาสตรการแพทย

4.ผอำานวยการสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข คณะทำางาน

5.ผอำานวยการสำานกมาตรฐานหองปฏบตการ คณะทำางาน

6.นางสาวศรมาปทมดลก คณะทำางาน

สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

7.นางสาวอรอนงครชตราเชนชย คณะทำางาน

สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

8.นางสาวมาลนจตตกานตพชย คณะทำางาน

สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข 31

9.นางปทมพศวมลวตรเวท คณะทำางาน

สำานกมาตรฐานหองปฏบตการ

10.นายสธนวงษชร คณะทำางาน

สำานกมาตรฐานหองปฏบตการ

11.นางสาวจไรโชตชนาทววงศ คณะทำางานและเลขานการ

สำานกมาตรฐานหองปฏบตการ

12.นายวฒนพงศวทธา คณะทำางานและผชวยเลขานการ

สถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข

13.นางสาวเรวดสรธญญานนท คณะทำางานและผชวยเลขานการ

สำานกมาตรฐานหองปฏบตการ

ใหคณะทำางานมหนาทดงน

1. จดทำามาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหไขหวดใหญสายพนธใหมชนดA(H1N1)ทางหองปฏบต

การชนสตรสาธารณสขและเสนอคณะกรรมการบรหารจดการการบรการตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธ

ใหม2009เพอประกาศใชเปนมาตรฐานของกระทรวงสาธารณสข

2.ดำาเนนงานอนๆตามทไดรบมอบหมาย

ทงนตงแตบดนเปนตนไป

สงณวนท9กมภาพนธพ.ศ.2553

(นายนพนธโพธพฒนชย)

รองอธบดปฏบตราชการแทน

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

มาตรฐานการปฏบตงานตรวจวเคราะหเชอไขหวดใหญสายพนธใหมชนด A (H1N1)

ทางหองปฏบตการชนสตรสาธารณสข32

MOPH-DMSc- CL 01