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8/16/2019 ADN 2da parte jul_2013_4.pdf

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Tecnología e información del ADN

Schematic illustration of DNA cloning


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Algunas enzimas usadas en tecnología de ADN recombinante

Secuencias de reconocimiento para algunas endonucleasas tipo II


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3 sistemas de enzimas de restricción:

Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restricción (corta) y

modificación (metila). Al reconocer la secuencia específica de DNA corta al azar en sitios

distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte dejaextremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de

reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), además

de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores.

Tipo 2: Solo tienen actividad de restricción. Otras enzimas llevan a cabo la metilación. El

corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de él, por lo que el corte es

resistente y predecible. Por esta característica es que son muy utilizadas para clonación de

genes, ya que al cortar en sitios específicos se pueden recuperar secuencias conocidas. Sólo

requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP...

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomérica que realiza todas las actividades enzimáticas.

Tienen función de restricción y modificación. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio

de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de

reconocimiento en orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y

SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.

Hay otros sistemas de restricción descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli ( Eco571) que consta de una sola enzima que corta únicamente DNA metilado en una

secuencia específica, y que además metila.

http://es.wikipedia.org/wiki/Enzima_de_restricci%C3%B3n


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Trabajo in silico / bioinformático


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DNA sequences in a

typical E. coli

expression vector

Use of pBR322 to clone foreign DNA in E. coli and identify cells containing it


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X gal

En experimentos de clonación génica, este compuesto es usado como indicador de aquellas células que

expresan la enzima β-galactosidasa, codificada en el gen lacZ del operón lac.

X-gal es hidrolizado por la β-galactosidasa a galactosa y 5-bromo-4-cloro-3-hidroxindol.

Este último es oxidado a 5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo, un compuesto azul insoluble. De estemodo, si X-gal y un inductor de la β-galactosidasa (normalmente IPTG) son disueltos en el medio de

agar de una placa de cultivo, las colonias crecidas en la placa que posean un gen lacZ funcional podrán

ser claramente distinguidas por su coloración azul. Además de su color característico, la volatilización

del grupo indol produce un mal olor característico

http://www.esacademic.com/dic.nsf/eswiki/1255017

5,5'-dibromo-4,4'-dicloro-índigo

http://localhost/var/www/apps/conversion/tmp/scratch_6//commons.wikimedia.org/w/index.php?title=File:X-Gal.svg&page=1


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Bacteriophage cloning vectors



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Yeast Artificial Chromosome (Yac)

The yeast artificial chromosome, which is often shortened to YAC, is anartificially constructed system that can undergo replication. The design of a

YAC allows extremely large segments of genetic material to be inserted.

Subsequent rounds of replication produce many copies of the inserted

sequence, in a genetic procedure known as cloning.

The reason the cloning vector is called a yeast artificial chromosome has to do

with the structure of the vector. The YAC is constructed using specific regions

of the yeast chromosome. Yeast cells contain a number of chromosomes;

organized collections of deoxyribonucleic acid (DNA). For example, the

yeast Saccharomyces cerevisae contains 16 chromosomes that contain

varying amounts of DNA. Each chromosome consists of two arms of DNA

that are linked by a region known as the centromere. As the DNA in each armis duplicated, the centromere provides a region of common linkage.

http://www.bookrags.com/research/yeast-artificial-chromosome-yac-wmi/

Construction

of a yeast

artificial

chromosom

e (YAC).


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Use of hybridization to identify a clone with a particular DNA segment



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Probe to detect the gene for a protein of known amino

acid sequence


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Two approaches to site-directed mutagenesis

Mutagénisis

sitio-dirigidas

Proteínas usadas como etiqueta (tag protein/peptide)


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The use of tagged proteins in protein purification



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Construction of a cDNA library from mRNA



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PCR

Amplification of a DNA segment by

the polymerase chain reaction

PCR

“Polymerase

Chain Reaction”


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HistoriaPCR es una invención, no un descubrimiento.

Kary Mullis, el inventor del PCR, obtuvo el Premio Nobel en

Química en 1993.

Revolucionó el clonamiento molecular.

1983, Cetus Corporation, California.

1. Múltiples rondas de replicación in vitro agregando

DNA Polimerasa

2. Incorporación de Taq Polimerasa (Thermus

aquaticus)


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2

Que permite el PCR:

Genera múltiples copias de un DNA templado

Partiendo con una copia (teórica) puede amplificar sunúmero infinitas veces

Fragmentos de DNA amplificado pueden sersecuenciados, clonados, usados como sondas oanalizados por electroforesis

Genes defectuosos pueden ser amplificados paradiagnosticar enfermedades

Amplificación de secuencias de patógenos para su

identificación (p. ej., HIV)Fragmentos amplificados pueden usarse como

marcadores identificatorios en forénsica(“fingerprints”).

Como funciona el PCR

Replicación artificial, in vitro

No se replica todo el DNA presente en lamuestra templado sino que solo unpequeño fragmento (1-20000 bases).

Al igual que en replicación, el PCRinvolucra:

– Denaturación del DNA

– “Priming”

– Polimerización


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Iniciación - Formación del “ojo” de replicación

3’ 5’

3’ 5’

5’

5’

3’

3’

Origen of Replicación

5’

3’

3’

5’

5’

3’

5’

5’

5’

3’

3’ 3’

Funciones de replicación y las enzimasasociadas

LigasaUnión de

DNA PolimerasaPolymerización

PrimasaPrimer

EnzimaFunción

Helicasa

Proteínas SSB

Topisomerasa

Denat. DNA


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Las funciones de replicación son reemplazadas en el

PCR

N/A ya que sonfragmentos cortos

Unión de frag.

Taq DNAPolimerasa

Pol. DNA

Primers se

agregan a lareacción

Fuente del primer

PCRFunción

CalorDenat. DNA

Componentes de una reacción de PCR

Buffer (contiene Mg++), pH 8.2

DNA templado

2 Primers que flanquean el fragmento deDNA a ser amplificado

dNTPs

Taq DNA Polimerasa (u otra DNApolimerasa termoestable)


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PCRMelting

94 oC

5’ 3’ 3’ 5’

T e m p

e r a t u r a

100

0

50

Tiempo•RAMP

•HOLD

Melting

94 oC

T e m p e r a t u r a

100

0

50

Tiempo

3’ 5’

5’ 3’

To

PCR


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Melting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension

72o

C

T e m p

e r a t u r a

100

0

50

Tiempo

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

Melting

94 oC

Extensión:

1 min./Kb

Annealing:

Depende de

Tm de primers

PCR

PCR

Melting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC


100

0

50

30x

3’ 5’

5’ 3’

To

To

5’

5’

5’

Tiempo


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PCR

Melting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension

72o

C

T e m p

e r a t u r a

100

0

50

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

Tiempo

PCR

Melting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC


100

0

50

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

To

To

Tiempo


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PCR

Melting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers50 oC

Extension

72o

C

T e m p

e r a t u r a

100

0

50

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Tiempo

Fragmentos de

largo definido

PCR

Melting

94 oC

Melting

94 oCAnnealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC


100

0

50

30x

3’ 5’

5’ 3’ 5’

5’ 5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

5’

Tiempo


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DNA entre los partidores se duplica con cada ciclo

térmico

0

Ciclos

Número1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

Más Ciclos = Más DNA Número de ciclos

0 10 15 20 25 30Marcador

De tam.


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Amplificación teórica del PCR

Copias = 2n x y

donde y = número inicial de copiasn = número de ciclos térmicos

= 107,374,182,400

Si se parte con 100 copias, ¿cuantas copias se hacen

en 30 ciclos?

2n x y

= 230 x 100

= 1,073,741,824 x 100

¿Porque no se alcanza esta eficiencia?

General: componentes, ciclos, viales

Partidores, diseño, cantidad

Volúmenes de reacción

Buffers, sales, dNTPs, MgCl2 Programa: tiempos, Tos.

Taq: tipo, cantidad

Optimización del PCR


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Sensibilidad.

Contaminación de muestras con DNA no deseado.

Siempre tener control negativo y positivo

Usar reactivos y condiciones óptimas

Sector dedicado, puntas con filtro, etc.

Principal problema del PCR

TA Cloning

Taq tiene actividad de transferasa terminal; deja As

extras en extremos 3’OH

QuickTime™ and a

TIFF (LZW) decompressor are needed to see this pi cture.

GATAC…………………………………………GGTTCTA

ACTATG…………………………………………CCAAGA


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Tipos de PCR

Anidado (nested)

Mismatch (mutación, sitio de restricción)

Deleción/Inserción

Asimétrico (secuenciación)

Inverso

Ligation-mediated

RT-PCR

5’ y 3’ RACE


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The Human Genome Project strategy


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https://www.google.com.pa/search?q=humano&source=lnms&tbm=isch&sa=X&ei=6IDYUbSbFKHc0QHFkoCwCA&ved=0CAcQ_AUoAQ&biw=1422&bih=636#facrc=_&imgdii=_&imgrc=o2pd9RySl1B0XM%3A%3BizBU2qWP90OMJM%3Bhttp%253A%252F%252Fus.123rf.com%252F400wm%252F400%252F400%252Feraxion%252

Feraxion0804%252Feraxion080400807%252F2891069-esqueleto-humano.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fes.123rf.com%252Fphoto_2891069_esqueleto-humano.html%3B900%3B1200

Revisión del genoma Humano


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Synteny in the mouse and human genomes


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DNA microarray

DNA microarray


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DNA microarray

DNA microarray


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Organismos transgénicos

Organismos transgénicos

http://lightyears.blogs.cnn.com/2012/07/12/genetically-modified-mosquitoes-fight-dengue-fever/

Genetically modified mosquitoes fight dengue fever


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Alison Van Eenennaam, Ph.D. //// Cooperative Extension Specialist///Animal Biotechnology and Genomics

http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/Outreach/Overview_of_transgenic_fish_slide_show.pdf

Alison Van Eenennaam, Ph.D. //// Cooperative Extension Specialist///Animal Biotechnology and Genomics

http://animalscience.ucdavis.edu/animalbiotech/Outreach/Overview_of_transgenic_fish_slide_show.pdf


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Transfer of DNA to plant cells by a bacterial parasite

The Ti (tumor-inducing) plasmid of Agrobacterium tumefaciens.


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