Alternativa metoder för att påvisa antibiotikaresistens

Håkan Janson

Traditionell resistensbestämning Fenotypisk testning

• Lappdiffusion

• Buljongspädning

– Detektion med utodling (Golden standard)

– Detektion med fotometri

– Detektion med fluorofotometri

– Detektion med turbidometri (VITEK)

– Detektion med kalorimetri

• Agarspädning

Begränsningar med fenotypisk testning

• Ett stort inokulat i renkultur krävs

• Komplicerad preanalytisk process

• Begränsat organism-spektrum

• Analytisk variabilitet

• Lång tidsåtgång

• Relativt hög kostnad (om man inkluderar alla steg)

Molekylär resistensbestämning

• PCR för enstaka kända resistensgener – Makrolider (erytromycin, klaritromycin etc)

– Meticillinresistens (mecA, mecC)

– Vancomycinresistens (vanA, vanB)

– Enstaka betalaktamaser (tex utbrott av ESBL)

• Multiplex-PCR ev medmicro-array om man letar efter flera – Aminoglykosider, tetracyklin, betalaktamer, kloramfenikol,

erytromycin, kinoloner, sulfa, trimetoprim, rifampicin, isoniazid

– ESBL av olika slag

– ESBL-CARBA av olika slag

Begränsningar med molekylär resistensbestämning

• Vissa analyser är enkla – mecA, vanA, vanB,

– Andra är mer avancerade (ESBL mm)

– Somliga är mycket svårtolkade (porin-mutationer etc)

• Ofta måste man sekvensera PCR produkter

• Det är svårt att avgöra om genen uttrycks eller ej

• Kan inte detektera alla resistensmarkörer

• Hög kostnad

• Inte allmänt accepterade

Resistensbestämning av bakterier vi inte odlar

• Antalet agens vi detekterar med molekylärbiologiska metoder ökar – Chlamydia trachomatis – Neisseria gonorrhoeae – Mycoplasma genitalium – Mycoplasma pneumoniae – Chlamydophila pneumoniae – Legionella pneumophila – Clostridium difficile – MRSA, Salmonella, Campylobacter, Yersinia, EHEC…

• Hur hanterar vi resistensbestämningen av dem?

Makrolidresistens är ett icke försumbart problem

• I arter som – Mycoplasma genitalium

– Mycoplasma pneumoniae

– Helicobacter pylori

– Chlamydia trachomatis

• Arterna är svåra att odla men lätta att detektera med PCR

• Makrolidresistens kan detekteras med PCR med hög känslighet och specificitet

Traditionell Helicobacter pylori detektion och resistensbestämning

• Relevant när man misstänker terapisvikt

• Odling av biopsi från magslemhinnan

• Resistensbestämning mot Claritromycin, Metronidazol och Amoxicillin

• Resistensen är ibland svår att läsa av – Bl a pga mögelöverväxt

Helicobacter pylori detektion och claritromycin resistensbestämning

Mutationer

23S rRNA genen

Realtids-PCR

detektion

Smältpunktsanalys

avgör claritromycin-

känsligheten

Funderingar kring gonokocker (enligt Cathy Ison)

• Hur ska man kombinera resistensbestämning och molekylärbiologi för gonokocker? – Endast 54% av PCR-fynd kunde konfirmeras med odling – 72% av de med symptom kunde konfirmeras med odling

• Patientnära test på inmarsch – GeneXpert för GC/CT har bra känslighet (Tabrizi J Clin Micro

2013)

• Man måste behålla odlingsexpertisen för att kunna övervaka resistensutvecklingen. – Sentinelprovtagning för odling under 3 mån/år kan vara en

lösning

• För bedömning av behandlingssvikt fungerar inte PCR utan där måste man odla och resistensbestämma

Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net)

Andel MRSA 2011

MRSA-förekomst i Sverige

Antal MRSA i Sverige (från SMI:s hemsida)

MRSA-screening i realtid ”Halmstadsmodellen”

• Anrikning i selektiv buljong

• DNA-extraktion

• Kvantifiering av S. aureus-specifik gen – På vissa lab även mecA-gen

– På andra MRSA med SCCmec

• Besvaring av PCR-negativa prov efter 1 dygn

• Utodling av PCR-positiva prov

MRSA screening i Skåne

mecC (LGA251) = en ny variant av

mec gen som vi fn inte hittar i

molbiol screening. Därför odlas alla

buljonger med ”mycket” S. aureus ut

Måste vi överhuvudtaget odla MRSA?

• Med mec och nuc metod – JA

– mecA finns även i andra stafylokockarter -> blandningar av MRSE och MSSA blir falskt positiva

• Med ”Huletsky-metoden” dvs SCCmec –JA

SCCmec fallgropar

Nya SCCmec-varianter kommer att bli falskt negativa Kända MRSA-stammar kan mutera och bli methicillin-känsliga men ändå förbli PCR-positiva

Snabbare MRSA- screening som kan

utföras lokalt Cepheid® GeneXpert® eller

motsvarande

Låg sensitivitet (61%) och PPV (38%) enligt Roisin 2012 Eur J Clin Microbiol

Källa: Annual report of the European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net)

Vancomycinresistenta Enterokocker (VRE)

Vancomycinresistenta enterokocker (E. faecium och E. faecalis)

• Två olika resistensgener

vanA vanB Resistent mot både Resistent mot

Vancomycin och Vancomycin men känsligt

Teicoplanin för Teicoplanin

• vanA/B gener kan bäras av många andra bakteriearter (Clostridium, Bacillus, Eggerthella m fl) – Dessa är ej anmälningspliktiga enligt smittskyddslagen

Antal VRE i Sverige Specifika kloner orsakar då och då stora utbrott

Antal VRE i Sverige

0

100

200

300

400

500

600

700

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

VRE - buljonganrikning

Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner 2004

Andel E. coli som har nedsatt känslighet för 3:e generationens cefalosporiner 2011

Kan man detektera ESBL (Extended

Spectrum BetaLactamases) med PCR?

• ESBL – A

– ”Klassisk” ESBL som hämmas av betalaktamasinhibitor (> 100 varianter av t ex CTX-M, SHV, TEM-typ)

• ESBL – M

– Betalaktamas av AmpC- eller OXA-typ. Många varianter. Hämmas av oxacillin men inte av betalaktamasinhibitorer

• ESBL - Carba

– Den värsta sorten eftersom dessa även är bryter ned karbapenemer (imipenem, meropenem)

ESBL-CARBA

• Icke metallobetalaktamaser

– Klass A • KPC (USA, Israel, Grekland), SME, IMI, NMC, GPC

– Klass D (OXA-enzymer) • OXA-48 (Turkiet, mellanöstern, nordafrika), OXA-23, OXA-24/40,

OXA-51, OXA-58

• Metallobetalaktamaser (Klass B)

– NDM (Indien, Pakistan)

– VIM (endemisk i Grekland, spridd i världen)

– IMP (19 varianter spridda i världen), GIM, SPM, SIM

Många ESBL-stammar är multiresistenta

Vissa ESBL-Carba är totalresistenta

Andel Klebsiella pneumoniae som har nedsatt känslighet för karbapenemer 2011

Andel Klebsiella pneumoniae som är resistenta mot 3:e generationens cefalosporiner 2011

ESBL screening direkt från rektal-swab med multiplex PCR

• Fungerar rent tekniskt bra

– Anrikning behövs ej men bör DNA extraheras

– Färgad pinne bättre än faeces

• Hittar bara de varianter man letar efter

• Hittar inte nya varianter

• Bra vid utbrott av en given klon

– Detekteras med specifik PCR mot just den ESBL-varianten

Fenotypisk resistensbestämning

Metod Princip < 105 cfu

Billig Automatisk

Heterogen res

Äkta MIC

Snabb

Agarspädning Icke-växt på media innehållande olika ab-koncentrationer

Nej Ja Nej Ja Ja Nej

Automatisk resistenstest

Optisk mätning av tillväxt i substrat

Nej Ja Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja/Nej

Buljong-spädning

Växtinhibition i buljong innehållande olika ab-koncentrationer

Nej Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja Nej

Diskdiffusion Inhibition runt en ab-disk Nej Ja Ja/Nej Ja Nej Nej

E-test Inhibition runt en remsa med ab-gradient

Nej Ja Ja/Nej Ja Ja Nej

Annan befintlig resistensbestämning

Metod Princip < 105 cfu

Billig Automatisk

Heterores

Äkta MIC

Snabb

Kromogena agarsubstrat

Färgomslag när en produkt bryts ner

Nej Ja/Nej Nej Ja Nej Nej

Fluoroscerande färgning

Mikroskopi av levande/döda celler i närvaro av fluroforer

Ja Ja Nej Nej Nej Ja

PCR DNA amplifiering av resiistensgener

Ja Ja/Nej Ja/Nej Nej Nej Ja

Realtids mikroskopi

Filmande av bakteriers delning

Ja Ja Nej Nej Nej Ja

Nära förestående resistensbestämning

Metod Princip < 105 cfu

Billig Automatisk

Heterores

Äkta MIC

Snabb

Mikro-kalorimetri

Detektion av värmeproduktion

Ja ? Ja Nej Ja Ja/Nej

Cantilever teknologi

Vägande av bakterier med cantilever vibrationer

Ja ? Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej

Flödes-cytometri

Detektion av levande/döda celler

Ja Ja/Nej Ja Nej Ja/Nej Ja/Nej

Spinn av magnetiska kulor

Olika spinn beroende på hur många bakterier som fastnat

Nej ? Ja Nej Nej Ja/Nej

MALDI-TOF MS Detektion av ab-degradering + mönster

Nej Ja Ja Nej Nej Ja/Nej

Mikrodroppar Tillväxt eller substratkonversion i nl droppar

Ja ? Ja Ja/Nej Ja/Nej Ja/Nej

Helgenom-sekvensering

Sekvensering av hela genom

Ja Nej Ja Nej Nej Nej

Isoterm mikrokalorimetri

• Man mäter värmeproduktionen/reduktion över tid (t ex när bakterier tillväxer)

• Tekniken beskrevs 1780 (is i ett utrymme smälte snabbare ju större djur man lade i)

• Första artikeln är från 1918 (Hill) • Svenskar bakom den moderna designen (Wadsö

1968) • Torvald Ripa använde mikrokalorimetri för att

mäta vilka tillsatser som var bäst för blododlingar (1977)

Design

Man mäter:

Värmeflöde i mW

Energi i Joule (W x s)

P = E / t W = J / s

Exempel på resultat

Mycket bra korrelation med buljongspädning – dock ej mycket

snabbare

Von Ah et al, BMC Microbiology 2009, 9:106

Helgenomssekvensensering av framvuxna bakteriestammar

• ”Billigt”, enkelt och snabbt – Det kostar idag ca 60 euro för ett bakteriegenom – Kan göras på små bordsinstrument – Resultat inom 24 timmar

• Resultat kan användas till

– Typning och resistensbestämning (se Eyre 2012 BMJ Open) • 95% sensitivitet och 95% specificitet på ab-bestämning • 99,7% konkordans mellan fenotypisk AST och WGS AST (Zankari

JAC 2013 på 200 stammar och 3051 tester)

– Utesluta släktskap hos fenotypiskt lika stammar (se Köser 2012 NEJM)

– Fastställa spridningsvägar – både lokalt och globalt

Problem med helgenomssekvensering

• Avancerade förberedelser

• Dyrt om man kör få prov

• Genererar enorma mängder data

• Svårt för lekmän att analysera resultat

• Automation är nödvändig

ResFinder - Gratisverktyg för analys

• Databas med kända resistensgener

• On-line mjukvara som gör en BLAST sökning gentemot databasen

– Färdiga helgenom

– Ofärdiga helgenom

– Korta eller långa sekvenser

• www.genomicepidemiology.org

ResFinder hittar vad den skall bland redan sekvenserade bakteriegenom

Test av ResFinder (och MLST)

• 200 isolat (50 var av E. coli, S typhimurium, E. faecalis, E. faecium) isolerade från danska grisar

• 3051 fenotypiska test gjordes – 482 blev resistenta – 2569 blev känsliga

• Konkordans 99,74% – 7 skilde sig mellan fenotyp och genotyp (6 st var

streptomycin i E. coli)

• MLST och resistensprofil korrelerade dåligt (förutom för Salmonella typhimurium). – Resistensmönster är alltså inget särskilt bra

epidemiologiskt verktyg

Zankari et al. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 771–777

Resistensbestämning som kan komma

Metod Princip < 105 cfu

Billig Automatisk

Heterores

Äkta MIC

Snabb

Apoptos-markörer

Detektion av apoptosmarkörer

Nej Ja/Nej Ja/Nej Nej Nej Ja

Bakteriefag amplifiering

Detektion av fagreplikering i levande celler

Ja Ja/Nej Nej Nej Nej Nej

Flödes-cytometri

Detektion av levande/döda celler

Ja Ja/Nej Ja Nej Ja/Nej Ja/Nej

Kolorimetrisk detektion av respiration

Optisk detektion av cell respiration

Ja Ja Ja Nej Nej Ja

Elektroniska näsor

Detektion av flyktiga organiska ämnen

Nej Ja Ja Nej Ja Ja

Impedans Elektrisk skillnad mellan levande och döda celler

Nej ? Ja Nej Nej Ja/Nej

Infraröd spektroskopi

Absorptionsspektrum av bakterier under IR-ljus

Ja Ja/Nej Ja Ja/Nej Nej Ja/Nej

Resistensbestämning som kan komma 2

Metod Princip < 105 cfu

Billig Automatisk

Heterores

Äkta MIC

Snabb

LC-ESI MS Proteomics av levande döda celler samt resistensmarkörer

Nej Nej Ja Nej Nej Ja/Nej

Metabolomics (inkl ROS)

Förändringar i intracellulära molekyler

Nej ? Ja Nej Nej Ja

Mätning av mikroljud

Skillnader i vibrationer mellan levande och döda bakterier

Ja ? Ja Nej Nej Ja/Nej

NMR Molekylär uppsättning med magnetresonans

Nej ? Ja Nej Nej Nej

Raman spektroskopi

Absorption hos laserstrålade bakterier

Ja Ja Ja Ja/Nej Nej Ja/Nej

RNA sekvensering

Skillnader i genexpression Ja Nej Ja Nej Nej Nej

Konklusion ett

• Fenotypisk antibiotikaresistenbestämning kommer att förbi essentiellt för att:

– Hitta nya resistensmekanismer

– Detektera kombinationer av icke resistensgener som leder till fenotypisk resistens (efflux, poriner)

– Hitta känsliga stammar hos de som bär på resistensmarkörer

Konklusion två

• Molekylära resistensmetoder är ett viktigt komplement

– För enkel detektion av vissa markörer/kloner

– För potentialen i helgenomsekvensering

• Många nya spännande alternativa metoder är på gång

– Det kan dock ta flera år innan de är i rutinbruk på lab

– Ett undantag är MALDI-TOF…