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Analyse du mécanisme et du rôle de l’inhibition del’autophagie par deux protéines complémentaires du

cytomégalovirus humainLina Mouna

To cite this version:Lina Mouna. Analyse du mécanisme et du rôle de l’inhibition de l’autophagie par deux protéinescomplémentaires du cytomégalovirus humain. Virologie. Université Paris-Saclay, 2015. Français.�NNT : 2015SACLS153�. �tel-01673785�

NNT : 2015SACLS153

THESE DE DOCTORAT DE

L’UNIVERSITE PARIS-SACLAY

Préparée à la faculté de pharmacie de l’université Paris-Sud

ECOLE DOCTORALE N°569

Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué

Spécialité de doctorat : Microbiologie

Par

Mme Lina MOUNA

Analyse du mécanisme et du rôle de l'inhibition de l'autophagie par deux

protéines complémentaires du cytomégalovirus humain

Thèse présentée et soutenue à Châtenay-Malabry, le 8 décembre 2015 :

Composition du Jury :

Mme IMBERT Berthe-Marie PU-PH / Université de Nantes -

CHU de Nantes

Président/Rapporteur

M MORIS Arnaud

Directeur de recherche/CIMI

Paris

Rapporteur

Mme BOTTI Joëlle MCF/Université Paris Diderot –

Institut Necker Enfants Malades

Examinatrice

Mme BEAU Isabelle Chargée de Recherche /INSERM

UMR-S 1185

Directrice de thèse

Mme ESCLATINE Audrey PU/Université Paris Sud - I2BC Co-directrice de thèse

1

Remerciements

Je tiens à remercier tout d’abord les membres du jury, particulièrement le professeur Berthe-

Marie Imbert et le Dr Arnaud Moris qui ont accepté d’être rapporteurs de mon manuscrit et de

participer au jury de ma thèse. Merci également au Dr Joëlle Botti d’avoir accepté d’assumer le

rôle d’examinateur.

Je tiens à exprimer toute ma gratitude et mes remerciements les plus sincères à Audrey

Esclatine qui m’a guidé dans mon travail et m’a aidé à trouver les solutions pour avancer dans la

recherche, pendant le stage de Master 2 et tout au long de ma thèse. Egalement, je la remercie

pour tes remarques, tes commentaires, tes critiques positives, ton suivi et pour ton

enthousiasme pour la recherche. En fait, tes multiples explications ont apporté beaucoup à ma

recherche.

J’aimerais profondément exprimer toute ma reconnaissance et mes sentiments les meilleurs à

mon directeur de thèse Isabelle Beau. Je te remercie chaleureusement de m’avoir aidé et

conseillé pendant ma thèse. Egalement, je te remercie pour ta disponibilité, tes connaissances

et pour m’avoir fait connaître pas mal de techniques que je ne connaissais pas.

Merci beaucoup à vous les deux, vous étiez tout le temps à mon écoute pour mes problèmes

professionnels et aussi personnels.

Je remercie tous les membres de l’ex UMR 984, en commençant par Marion, avec laquelle j’ai

eu le plaisir d’essayer des méthodes innovantes pour que nos manipes marchent. Françoise

pour son soutien et d’avoir consacré de temps tous les matins pour me demander si tout va

bien. Marie-francoise pour les bons moments que nous avons passé surtout ce dernier temps.

Merci David de m’avoir ‘protégé’ pendant l’écriture de ma thèse et de t’être gentil avec moi alors

que ça te demandait beaucoup d’effort !. Matthieu, avec qui j’ai partagé le bureau et qui sait bien

nous remettre à notre place. Idil, ma voisine de pays, merci pour les longues discussions et les

bons moments que nous avons passé autour d'un café syrien-turque. Raymonde qui a amplifié

une grande partie de mes constructions. Nadia, pour ces discussions pérennantes et sa volonté.

Et récemment, une grande merci à Eva pour son aide pendant la révision de l’article surtout

qu’elle a tous fait avec son gros ventre où le petit Adib se grandissait.

2

Un gros merci à Dorine. Grâce à toi Dodo j’ai pu obtenir le titre de Choupette 2013. Merci pour

les nombreux bons moments passés ensemble autour des petits déjeuners le matin. Merci pour

ton soutien, tes messages encouragants et ta présence dans ma vie comme une amie sur

laquelle je peux compter toujours. Et bien sûr, Nicole, qui restait jusqu’au dernier jour de travail

avant sa retraite un modèle pour tous pour son énergie et sa bonne humour. Nos réunions

quotidiennes matinales dans le couloire avec Dodo et après David, étaient des moments

uniques.

Merci aussi aux autres habitants de la tour E1, en commençant par les microbiologistes du 3ème.

Une spéciale dédicace à Véronique qui était de mon coté surtout quand j’avais besoin de

soutien. Nous avons partagé des moments difficiles sous la neige et la pluie et aussi des trajets

plus tranquilles dans la voiture. Merci aussi à Jamil pour son aide moral et de ses discussions

pérennantes à propos de notre cher pays la Syrie.

Un merci particulier avec une grande émotion à mon père et à ma famille en Syrie qui m’ont

encouragés et soutenus tout au long de mes études. Merci, je vous aime gros comme la Terre.

Une grande pensée à toi, maman, qui n’a pas pu voir l’aboutissement de mes études et qui

aurait être fier de moi ce jour là. Que ton âme reste en paix………

Merci à la famille et aux cousins en France pour l‘amour que vous me portez.

Mes dernières pensées sont tournées vers ceux qui partagent ma vie. Mon cher Ahmad, pour

ton soutien inconditionnel, ton encouragement pendant des longues soirées de travail et ton

amour infini. Grâce à toi j’ai pu avancer. Mon trésor Taïm qui m’a accompagné dés ma première

année de thèse.

Enfin, je voudrais remercier mon pays la Syrie qui’ m a financé tout au long de mes études

supérieures en France afin d’obtenir le grade de docteur. Merci aussi à l’université Paris-Saclay,

surtout la faculté de pharmacie à Châtenay-Malabry pour l’accueil.

3

Résumé

L’autophagie est un mécanisme constitutif et inductible de dégradation des composants

cytoplasmiques afin de maintenir l’homéostasie cellulaire. Elle est souvent modulée par les virus

car il s’agit également d’un mécanisme de défense antiviral. Elle peut avoir un rôle proviral

quand elle est détournée et régulée par les virus. Nous avons précédemment observé au

laboratoire que le cytomégalovirus humain (HCMV) stimule la formation des autophagosomes

de manière précoce indépendamment de l’expression des protéines virales, puis qu’il entraine

un blocage de l’autophagie aux temps tardifs. Dans ce travail, nous avons montré que ce virus a

développé des stratégies impliquant la synthèse de deux protéines virales, IRS1 et TRS1, pour

inhiber l’autophagie. De façon surprenante, nous avons également mis en évidence un rôle

proviral de l’autophagie aux temps tardifs de l’infection par le HCMV. Nous avons pu montrer par

des techniques de biochimie et d’imagerie cellulaire que l’expression aussi bien de TRS1 que

d’IRS1 est capable de bloquer la formation des autophagosomes dans les cellules. Nous avons

identifié le mécanisme d’action de ces protéines. Il est indépendant de la protéine kinase PKR

mais nécessite une interaction avec Beclin 1, une protéine de la machinerie autophagique. Nous

avons localisé le site d'interaction de Beclin 1 avec IRS1 et TRS1 (BBD pour Beclin 1 binding

domain) au niveau de leur région N-terminale. Ce domaine, conservé entre les deux protéines,

est nécessaire pour l’inhibition de l’autophagie. Le site d’interaction d’IRS1 a été identifié dans le

domaine en superhélice (coiled-coil domain) CCD de Beclin 1.

Nous avons caractérisé le rôle de TRS1 et IRS1 dans la modulation de l’autophagie dans le

contexte de l’infection virale, en utilisant différents virus mutants : des virus dans lesquels on a

supprimé soit le gène IRS1, soit le gène TRS1 et un virus dans lequel il manque les deux gènes

IRS1 et TRS1. Les résultats obtenus suggèrent qu’IRS1 et TRS1 sont effectivement toutes les

deux impliquées dans ce processus. Afin de mieux comprendre le rôle de l’interaction de ces

protéines avec Beclin 1, nous avons étudié le phénotype d’un virus mutant qui n’exprime pas

IRS1 et qui contient une délétion de la région BBD de TRS1. Nous avons montré que ce virus

mutant ne se lie pas à Beclin 1 et qu’il ne bloque pas l’autophagie. De manière surprenante, il

n’a pas de défaut de production virale, suggérant que l’inhibition de l'autophagie ne serait pas

essentielle pour la réplication virale. Nous avons développé d’autres approches, comme

l’utilisation de modulateurs pharmacologiques de l’autophagie ou de lentivirus hébergeant des

shRNA, qui montrent que l’inhibition de l’autophagie est capable de diminuer la production virale

et au contraire que sa stimulation l’augmente. Ces derniers résultats suggèrent que l’autophagie

pourrait être bénéfique au HCMV dans certaines conditions.

Mots clés : Autophagie, HCMV, IRS1, TRS1, Beclin 1, PKR.

4

Abstract

Autophagy is a constitutive and inducible mechanism of degradation of cytoplasmic components,

in order to maintain the cellular homeostasis. Autophagy is often modulated by viruses, because

it is also considered as an antiviral defense mechanism. It can have a beneficial role, when it is

hijacked and regulated by viruses.

We have previously observed in our laboratory that the human cytomegalovirus (HCMV)

stimulates autophagosome formation, at the early stage of infection, independently of viral

protein expression then, later on, it blocks autophagy. In this work, we showed that this virus has

developed strategies involving the synthesis of several viral proteins, such as IRS1 and TRS1, to

inhibit autophagy. Surprisingly, we also demonstrated a proviral role of autophagy at late stages

of infection with HCMV. We showed, through biochemical and cellular imaging technologies, that

expression of both TRS1 and IRS1 is able to block the formation of autophagosomes. We

identified the mechanism of action of these proteins. It is independent of the protein kinase PKR

but requires interaction with Beclin 1, a protein of the autophagic machinery. We mapped the

interaction site of Beclin 1 with IRS1 and TRS1 in their N-terminal region and called it BBD for

Beclin 1-binding domain. This domain (BBD) is conserved between the two proteins and

essential to inhibit autophagy. We also identified the site of interaction of IRS1 in the coiled-coil

domain (CCD) of Beclin 1.

We characterized the role of IRS1 and TRS1 in the modulation of autophagy, in the context of

viral infection, using different mutant viruses: viruses in which either the IRS1 or the TRS1 gene

has been removed and a mutant virus lacking both IRS1 and TRS1 genes. Our results suggest

that both IRS1 and TRS1 are involved in the regulation of this process. To better understand the

role of the interaction of these proteins with Beclin 1, we studied the phenotype of a mutant virus

that does not express IRS1 and which contains a deletion of the N-terminal region of TRS1. We

showed that this mutant does not bind to Beclin 1 and is not able to block autophagy.

Surprisingly, it has no defects in viral production, suggesting that inhibition of autophagy is not

essential for viral replication. We developed other approaches, including the use of

pharmacological modulators of autophagy or shRNA knockdown, which show that the inhibition

of autophagy is able to reduce viral production and, on the contrary, that its stimulation increases

it. These results suggest that autophagy may be beneficial to HCMV in certain conditions.

Keywords: Autophagy, HCMV, IRS1, TRS1, Beclin 1, PKR.

5

TABLE DES MATIERES

Remerciements…………………………………………………………………………………………....1

Résumé…………………………………………………………………………………………………….3

Abstract…………………………………………………………………………………………………….4

Abréviations ……………………………………………………………………………………………….8

Liste des figures………………………………………………………………………………………….11

Préambule………………………………………………………………………………………………..13

DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES…………………………………………………………………….17

1. LE CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN (HCMV)……………………………………………….19

A. Généralités ………………..……………………………………………………………………19

B. Caractéristiques générales des -Herpesvirinae…………………………………………...19

C. Epidémiologie…………………………………………………………………………………..20

i. Transmission horizontale………………………………………………………………20

ii. Transmission verticale…………………………………………………………………21

D. Structure du virus………………………………………………………………………………21

i. Génome viral……………………………………………………………………………22

ii. Capside………………………………………………………………………………….23

iii. Tégument………………………………………………………………………………..23

iv. Enveloppe……………………………………………………………………………….24

E. Cycle de réplication ……………………………………………………………………………24

F. Manifestations cliniques……………………………………………………………………….30

i. Infection chez les sujets immunocompétents………………………………………..30

ii. Infection au cours de la grossesse et maladie congénitale………………………..30

iii. Infections opportunistes chez les sujets immunodéprimés………………………..31

G. Traitements antiviraux…………………………………………………………………………32

H. Echappement aux mécanismes de défense antivirale……………………………………..35

i. Inhibition de l’apoptose………………………………………………………………...35

ii. Modulation de l’immunité innée……………………………………………………….36

iii. Modulation de l’immunité adaptative…………………………………………………37

iv. Les cellules NK………………………………………………………………………….39

I. Latence……………………………………………………………………………………….41

2. LES PROTEINES IRS1 ET TRS1 DU HCMV………………………………………………..43

A. Généralités……………………………………………………………………………………...43

6

B. Structures……………………………………………………………………………………….43

C. Fonctions………………………………………………………………………………………..44

3. L’AUTOPHAGIE………………………………………………………………………………...47

A. Généralités sur l’autophagie : historique et définition………………………………………47

B. Mécanismes moléculaires de l’autophagie………………………………………………….50

i. Initiation et formation du phagophore………………………………………………...51

ii. Elongation et fermeture de l’autophagosome……………………………………….55

iii. Maturation de l’autophagosome………………………………………………………57

C. Régulation de l’autophagie :…………………………………………………………………..58

i. Régulation de l’autophagie par la voie de signalisation mTOR……………………58

ii. Régulation de l’autophagie par des voies de signalisation indépendantes de

mTOR……………………………………………………………………………………63

iii. Régulation de l’autophagie par des voies de signalisation impliquant des facteurs

de transcription………………………………………………………………………….64

D. Fonctions biologiques de l’autophagie…………………………………….…………………65

i. Rôles physiologiques…………………………………………………………………..65

ii. Rôles pathologiques……………………………………………………………………69

4. AUTOPHAGIE ET VIRUS……………………………………………………………………...73

A. Modulation de l’autophagie par les virus…………………………………………………….73

i. Rôle antiviral de l’autophagie………………………………………………………...73

ii. Rôle pro viral de l’autophagie………………………………………………………...75

iii. VIH (Virus de l'immunodéficience humaine)………………………………………..80

B. Interaction entre les infections herpétiques et l’autophagie…………..............................81

i. Cytomégalovirus humain………..……………………………………………………...81

ii. Herpès Simplex Virus type 1…………………………………………………………...83

iii. Virus de la Varicelle et du Zona……………………………………..…………………87

iv. Epstein-Barr virus…………………………………………………………...…………..87

v. Herpesvirus associé au Sarcome de Kaposi…………………………………..…….89

PRESENTATION DES TRAVAUX…………………………………………………………………….91

Introduction……………………………………………………………………………………………….93

Article...…………………………………………………………………………………………………...95

7

Discussion………………………………………………………………………………………….…...134

RESULTATS COMPLEMNTAIRES …………………………………………………………………137

CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ……………………………………………………………...145

TRAVAUX ANNEXE…………………………………………………………………………………..155

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES……………………………………………………………..175

8

Abréviations

AC : assembly Complex

ARNdb ; ARN double brin

AMPK : AMP-activated kinase

ATG : AuTophaGy-related genes

ATU : autorisation temporaire d’utilisation

AMBRA1 : Activating Molecule in Beclin 1 Regulating Autophagy

AWOL : Autophagic exit WithOut Lysis

BIF 1 : Bax-Interacting Factor 1

Barkor : Beclin 1 interacting autophagy related key regulator

CMA : Chaperone-Mediated-Autophagy

CDV : cidofovir

CMH : complexe majeur d’histocompatibilité

CVB3 : le virus Coxsackie B3

DAPK : death-associated protein kinase

DENV : virus de la dengue

DFCP1 : double FYVE domain-containing protein 1

DRAM : Damage-Related 79Autophagy Modulator

ESCRT : Endosomal Sorting Complex Required for Transport

EBV : le virus d'Epstein-Barr

EBNA1 : Epstein-Barr nuclear antigen 1

eIF2 : αsubunit of the eukaryotic translational initiation factor 2

ERGIC : Endoplasmic Reticulum-Golgi intermediate compartment

GCV : ganciclovir

GCN2 : General Control Non-derepressible-2

HSV-1 et 2 : le virus herpès simplex 1 et 2

HCMV : le cytomégalovirus humain

HAART : Highly active antiretroviral therapy

HRI : Heme-Regulated Inhibitor

HPIV3 : le virus parainfluenza de type 3

IAV : le virus de la grippe A

IRGM : immunity-related GTPase M

IE : Immediate Early

IC : cytokines inflammatoires

IFN : interféron

JNK1 (c-Jun N-terminal protein kinase 1)

LC3 : Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3

LAMP-2A : Lysosome-Associated Membrane Protein type 2A

LIR-1 : leucocytes Ig-like 1

LMP1 : Latent Membrane Protein 1

LUNA : latency unique nuclear antigen

MICB : MHC class I-related chain B

MCMV : CMV murin

mCP : protéine mineure de capside

9

MAPK : Mitogen-activated protein kinase

MBV : Maribavir

mTOR : mammalian Target Of Rapamycin

MCP : protéine majeure de capside

NEDA : nuclear envelope-derived autophagy

NF-κB : nuclear factor-kappa B

NKG2D : Natural-killer group 2, member D

NIEPs : particules enveloppés non-infectieuses

NOD2 : nucleotide-binding oligomerization domain-containing-2

NRBF2 : nuclear receptor binding factor 2

NS1 : Non-structural protein 1

OIS : oncogene-induced senescence

PAMPs : motifs moléculaires associés aux pathogènes

PKR : protéine kinase dépendante de l’ARN double brin

PI3P : phosphatidylinositol triphosphate

PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase

PP1 : phosphatase 1 alpha

PGHS : protéoglycanes héparanes sulfates

p.i : post infection

PFA : foscarnet

PE : phosphatidyl-éthanolamine

PTEN : phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome ten

PINK 1 : PTEN-induced putative kinase 1

PV : le poliovirus

Rag : Ras-related GTPases

RE : réticulum endoplasmique

RTA : replication and transcription activator

RUBICON : Run domain cystein rich domain containing Beclin 1 Interacting protein

SCP : petite protéine de capside

SNC : système nerveux central

SNC : système nerveux central

STAT3 : signal tranducer and activator of transcription 3

STING : stimulator of interferon genes

SNAREs : Soluble N ethylmaleimide sensitive factor Attachment protein Receptor

TAP : transporter associated with antigen processing

TLR2 : Toll like receptor 2

TGN : Trans-Golgi Network

TNFR1 : Tumor Necrosis Factor Receptor

TAP : Transporter associated with antigen processing

TNF : tumor necrosis factor

TLR : Toll-like receptors

UPR : stress du réticulum endoplasmique Unfolded Protein Response

UL : unique long

US : unique short

10

UVRAG : UV irradiation resistance associated gene

Val-GCV : Valganciclovir

vFLIP : FLICE-like inhibitor protein

VHB : virus de l’hépatite B

vICA : viral inhibitor of caspase-8-induced apoptosis

vMIA : mitochondria-localized inhibitor of apoptosis

Vps34,15 : Vacuolar protein sorting 15 et 34

Vps35 : Vacuolar protein sorting-35

WIPI : WD-repeat protein interacting with phosphoinositides

11

Liste des figures

Figure 1 : Structure du cytomégalovirus humain……………………………………………………..22

Figure 2 : Représentation schématique du génome du HCMV……………………………….........22

Figure 3 : Cycle de réplication du HCMV……………………………………………………………..25

Figure 4 : Mécanisme d’entrée du HCMV au niveau de la membrane cellulaire…………………27

Figure 5 : Physiopathologie de l’infection par le HCMV……………………………………….........30

Figure 6 : Mode d’action des inhibiteurs de l’ADN polymérase virale UL54………………………33

Figure 7 : Antiviraux en développement contre le HCMV…………………………………………...34

Figure 8 : Modulation de la présentation des antigènes via le CMH de classe I et II par le

HCMV……………………………………………………………………………………………….........38

Figure 9 : Inhibition de l’expression du CMH de classe II par le HCMV……………………..........39

Figure 10 : Modulation de la réponse des cellules NK par le HCMV………………………………41

Figure 11 : Organisation et structure d’IRS1/TRS1………………………………………………….43

Figure 12 : Voie de signalisation PKR et sa régulation par HCMV et HSV-1……………………..44

Figure 13 : Les différentes formes d’autophagie……………………………………………………..48

Figure 14 : Les différentes étapes de l’autophagie…………………………………………………..50

Figure 15 : Origine du phagophore ou la membrane d’isolation……………………………………51

Figure 16 : Formation de l’omégasome et de l’autophagosome……………………………………53

Figure 17 : Régulation du complexe ULK par mTOR………………………………………………..54

Figure 18 : La structure de la protéine Beclin 1……………………………………………………....55

Figure 19 : Le système de conjugaison de l’ubiquitine et les deux systèmes de conjugaison

autophagique……………………………………………………………………………………………..56

Figure 20 : La protéine SNARE STX17 permet la fusion autophagosome-lysosome……………57

Figure 21 : Régulation de l’autophagie par la voie mTOR…………………………………………..59

Figure 22 : Différents complexes Beclin 1-Vps34 et leurs fonctions……………………………….60

Figure 23 : Différents partenaires de Beclin 1………………………………………………………..62

Figure 24 : Rôles physiologiques et pathologiques de l'autophagie……………………………….65

Figure 25 : Régulation de l’autophagie par les virus…………………………………………………77

Figure 26 : Modulation de l’autophagie par le HCMV au cours du cycle viral…………………….82

Figure 27 : Manipulation de l’autophagie par les herpesvirus………………………………………86

Figure 28 : La fixation du virus aux PGHS est nécessaire à la stimulation de l’autophagie…...139

Figure 29 : Impact des anticorps neutralisants anti-TLR2 sur l’autophagie induite par UV-

HCMV……………………………………………………………………………………………………141

Figure 30 : Etude de l’autophagie dans les celles HEK293 infectées……………………………142

Figure 31 : Implication du stress oxydatif dans l’induction précoce de l’autophagie……………143

Figure 32 : Stimulation de l’autophagie aux temps précoces de l’infection………………….......149

Figure 33 : Expression des protéines IRS1/TRS1 au cours de l’infection……………………….151

Figure 34 : Différents complexes Beclin 1/ PI3K de classe III…………………………………….152

12

13

Préambule

14

15

L’autophagie est un processus catabolique, hautement conservée, servant à la dégradation des

composants cytosoliques, des organites endommagés, des agrégats protéiques et des bactéries

intracellulaires, à travers une voie dépendante du lysosome. Elle peut être induite en réponse à

des conditions de stress. En outre, l'autophagie a été décrite comme impliquée dans les

réponses immunitaires innées et adaptatives. Plusieurs études ont montré que certains micro-

organismes peuvent être éliminés par la voie autophagique dans un processus connu sous le

nom de xénophagie. L’autophagie participe également à la production de peptides antigéniques

microbiens ou endogènes via les lysosomes et favorise la présentation des antigènes par les

CMH de classe I et II. Toutefois, plusieurs agents pathogènes, notamment les virus, ont

développé différentes stratégies pour éviter ou exploiter l’autophagie afin d’assurer leur survie et

l’autophagie joue dans ce dernier cas un rôle proviral.

Le cytomégalovirus humain (HCMV) est un virus pathogène opportuniste qui, comme les autres

membres de la famille des Herpesviridae, a la capacité de persister chez l'hôte dans un état

latent, après la primo-infection. L’infection par le HCMV des patients immunodéprimés entraîne

une morbidité et une mortalité importantes sans traitement, en particulier chez les receveurs de

greffe, alors que l'infection chez les sujets immunocompétents est généralement

asymptomatique ou paucisymptomatique.

Il avait été montré au laboratoire que le HCMV module l’autophagie dans les fibroblastes

humains de deux manières opposées. Quelques heures après l’infection, le HCMV stimule

l’autophagie indépendamment de la synthèse des protéines virales. Dans un second temps

l’autophagie est inhibée sous la dépendance de protéines virales néosynthétisées. Les objectifs

de cette thèse ont été de mieux caractériser les mécanismes moléculaires développés par le

virus pour inhiber l’autophagie et d’étudier l’impact de l’autophagie sur le HCMV.

Lors de l’infection par le HCMV, plusieurs réponses cellulaires ont été mises en place pour

contrôler l’infection. Cependant, le HCMV a développé des mécanismes pour contrecarrer ces

défenses cellulaires en inhibant l’apoptose, en limitant la présentation aux lymphocytes T des

antigènes via le CMH de classe I et II ou encore en supprimant la reconnaissance des cellules

infectées par les cellules NK. Parmi les mécanismes antiviraux mis en place par la cellule, on

trouve également l’arrêt de la synthèse protéique par activation de la voie PKR (protéine kinase

dépendante de l’ARN double brin) suite à la production d’ARN double brin (ARNdb) et

d’interféron (IFN), qui aboutit à l’inhibition de la réplication virale. Cependant, ce virus code

plusieurs protéines virales qui lui permettent d’échapper à tous ces mécanismes.

16

Parmi ces protéines, il a été mis en évidence que les protéines IRS1 et TRS1 bloquent

directement PKR et empêchent l'arrêt de la synthèse protéique. Un virus mutant HCMV

n’exprimant ni TRS1 ni IRS1 ne se réplique pas car la voie PKR est toujours activée. Il est

intéressant de noter que l’activation de PKR a également été décrite comme impliquée dans la

stimulation de l’autophagie. Nous avons donc exploré les fonctions d’IRS1 et de TRS1 comme

régulateurs de l’autophagie

Dans ce manuscrit, je présenterai tout d’abord des données bibliographiques sur le HCMV et

ses protéines virales IRS1 et TRS1. Je décrirai ensuite le processus autophagique et sa

régulation. Enfin, l’interaction entre l’autophagie et les virus, notamment les herpesvirus, sera

présentée dans la quatrième partie du manuscrit. Après ces parties bibliographiques, mes

travaux de thèse seront exposés sous forme d’un article actuellement en révision favorable.

Deux autres articles dans lesquels j’ai participé pendant ma thèse, ont été ajoutés en annexe.

Pour conclure, j’exposerai dans la dernière partie les conclusions de ce travail et les

perspectives qu’il ouvre.

17

Données

Bibliographiques

18

19

1. LE CYTOMEGALOVIRUS HUMAIN (HCMV)

A. Généralités

Le HCMV est un virus ubiquitaire qui possède une distribution mondiale. Il infecte une grande

majorité de la population et est responsable de maladies opportunistes. Il appartient à la famille

des Herpesviridae.

Les Herpesvirus qui infectent l’homme sont divisés en trois groupes :

Alphaherpesvirinae : trois virus humains appartiennent à cette sous-famille. Les

virus herpès simplex HSV-1 et 2 (HHV-1 et HHV-2), le virus de la varicelle et du

zona (VZV ou HHV-3).

Betaherpesvirinae : cette sous-famille contient trois virus infectant l’homme : Le

cytomégalovirus humain (HCMV ou HHV-5), et les herpesvirus humains 6 et 7

(HHV-6 et HHV-7). Ils ont un long cycle réplicatif et une gamme d'hôtes restreinte.

Gammaherpesvirinae : les deux virus appartenant à cette sous-famille sont

capables d’établir une latence dans les lymphocytes et sont responsables de

cancers comme le virus d'Epstein-Barr (EBV ou HHV-4) et l'herpesvirus humain 8

associé au Sarcome de Kaposi (KSHV ou HHV-8).

Alors que l’infection par le HCMV chez les hôtes immunocompétents est le plus souvent

cliniquement silencieuse et sans gravité, il peut provoquer de graves infections chez certains

individus, comme les personnes immunodéprimées. Le HCMV est aussi la première cause

d’infections congénitales. Des infections primaires (primo-infections) et secondaires

(réactivations et récurrences) sont possibles durant la grossesse et peuvent entrainer des

complications chez les fœtus et les nouveau-nés.

Ce virus, comme tous les herpesvirus, a la possibilité de persister dans l’organisme de l’hôte à

vie. L’immunité est acquise mais elle n’est pas complètement protectrice. Après la primo-

infection, le HCMV n’est jamais éliminé et reste en latence à vie dans son hôte. De ce fait, le

virus est sporadiquement excrété, ce qui constitue une source récurrente importante de

transmission (Mocarski, Shenk et al. 2013). Le HCMV a une haute spécificité d’espèce et

l’homme est son unique réservoir.

B. Caractéristiques générales

Il existe plusieurs cytomégalovirus qui infectent différents mammifères. Les cytomégalovirus

isolés chez une espèce de mammifères sont plus facilement cultivés dans des fibroblastes de la

même espèce. Lors de l'infection naturelle, le HCMV infecte les cellules épithéliales, les cellules

20

myéloïdes (monocytes, macrophages et cellules dendritiques), les fibroblastes et les cellules

endothéliales. Les cellules infectées par le HCMV présentent un effet cytopathique

caractéristique avec des inclusions nucléaires et cytoplasmiques. Les inclusions cytoplasmiques

sont associées à un compartiment distinct du complexe d'assemblage viral (Assembly Complex

ou AC) (Das, Vasanji et al. 2007). Les fibroblastes humains (par exemple, les cellules MRC5)

sont couramment utilisés pour l'isolement et la propagation du HCMV. L’utilisation de ces

cellules permissives a été essentielle pour comprendre les fonctions des gènes viraux et

comment ils contrôlent les différentes étapes de la réplication. La latence du HCMV s’établit

naturellement dans les cellules hématopoïétiques dérivées de la moelle osseuse, où l'ADN viral

est présent à très faible nombre de copies (Bego and St Jeor 2006).

C. Epidémiologie : prévalence et transmission

L’infection par le HCMV est ubiquitaire, endémique et survient tout au long de l’année sans

variations saisonnières. Des épidémies n’ont pas été décrites. Les taux de séropositivité dans la

population varient beaucoup selon des facteurs géographiques, ethniques et les conditions

socioéconomiques. La plupart des études épidémiologiques ont été faites sur les femmes en

âge de procréer, à cause de l’importance en Santé Publique des infections congénitales au

cours de la grossesse. Au niveau mondial, le taux de prévalence est plus élevé chez les femmes

que chez les hommes et il augmente avec l’âge. La prévalence globale de l'infection est aux

alentours de 50% dans les pays développés alors qu’elle arrive à 99% dans les pays en voie de

développement. Aux Etats-Unis et en Europe, la prévalence est plus grande dans la population

des couches socio-économiques basses (Mocarski, Shenk et al. 2013).

i. Transmission horizontale

Le HCMV est un virus enveloppé et de ce fait, fragile. La transmission du virus ne se produit pas

par voie respiratoire et elle demande un contact direct avec les sécrétions corporelles infectées

comme l’urine, le sperme, le lait, la salive, les secrétions cervicales ou les larmes. La

transmission est plus élevée à la suite de contacts étroits comme lors de rapport sexuels, entre

enfants ou au contact d’enfants. L’excrétion virale persiste des années. Suite à l'acquisition

initiale du HCMV, le virus se réplique et provoque une infection systémique ou virémie et diffuse

pour infecter les cellules épithéliales tubulaires des organes de sécrétion telle que les glandes

salivaires et les reins, qui secrètent les virus produits (Mocarski, Shenk et al. 2013). La

transmission horizontale se produit également par transfusion ou par greffe de moelle et surtout

par la transplantation d'organes de donneurs séropositifs asymptomatiques. Le risque de

transmission par transfusion sanguine est quasiment nul maintenant grâce à l’utilisation de

21

produits sanguins testés séronégatifs ou de sang filtré (déleucocyté) (Bowden, Slichter et al.

1995; Allain, Stramer et al. 2009).

ii. Transmission verticale

Le HCMV est la première cause d’infection congénitale avec un mode de transmission in utero à

travers le placenta qui entraine l'infection du fœtus pendant la grossesse. Le HCMV se propage

de trois manières : par voie transplacentaire, au cours de l’accouchement (intrapartum) et par le

lait maternel. L’infection par voie transplacentaire peut provoquer une maladie congénitale. La

transmission in utero peut se produire soit au cours d’une primo-infection soit au cours d’une

infection récurrente (Stagno and Britt 2006). Les infections récurrentes sont dues, dans la

plupart des cas, à la réinfection par une nouvelle souche ou rarement à la réactivation du virus

endogène (Boppana, Rivera et al. 2001; Kenneson and Cannon 2007).

Le taux de transmission est constant tout au long de la grossesse, il ne dépend pas de l'âge

gestationnel et il est accompagné d’un grand risque de développer des séquelles si la primo-

infection survient pendant le premier trimestre de la grossesse (Stagno, Pass et al. 1986; Adler

and Marshall 2007; De Paschale, Agrappi et al. 2009). En cas de réactivation ou de réinfection

par le HCMV, les anticorps maternels ne préviennent pas complètement la transmission virale

au fœtus, ce qui entraine une infection congénitale mais en général moins grave.

La transmission au moment de l’accouchement et par le lait maternel ne provoque pas de

malformations, mais l’infection peut être symptomatique, notamment chez les nouveau-nés

prématurés de très faible poids à la naissance (Mocarski, Shenk et al. 2013). Les conséquences

de l'infection fœtale par le HCMV et la fréquence de cette infection en font l’infection congénitale

la plus grave en France.

D. Structure du virus

Le HCMV a la structure caractéristique de tous les Herpesvirus : un génome sous forme d’ADN

bicaténaire linéaire se trouve à l'intérieur d’une capside icosaédrique hautement stable,

composée de 162 capsomères. La nucléocapside est entourée par une enveloppe dérivée des

membranes de la cellule hôte et contenant des glycoprotéines virales qui permettent

l’attachement et l’entrée du virus dans les cellules. Les Herpesvirus ont également un tégument.

C’est une couche bien épaisse entre l'enveloppe et la capside, constituée de phosphoprotéines

(Figure 1). Le virion du HCMV est le plus grand et le plus complexe structurellement de tous les

herpesvirus, avec un diamètre de 200 à 300 nm (Mocarski and Courcelle 2001).

22

Figure 1 : Structure du cytomégalovirus humain. Le HCMV est un virus à ADN double brin linéaire avec une capside icosaédrique. La capside est entourée d'un tégument, lui-même entourée de l'enveloppe virale.

i. Génome viral

Le HCMV a un génome linéaire de 236 kb qui contiendrait 751 cadres de lecture (Open Reading

Frames ORF) (Stern-Ginossar, Weisburd et al. 2012). Il est constitué de deux segments : L

(long) et S (short) (Figure 2). Chacun de ces segments comporte une partie unique long UL et

une partie unique short Us. Ces dernières sont encadrées par deux régions répétées terminales

(TRL et TRS) et internes (IRL et IRS). Au cours de la réplication, quatre formes isomères de cette

molécule d’ADN apparaissent, par changement d’orientation relative des deux segments UL et

US (Davison, Dolan et al. 2003) (Figure 2). Ce processus d’isomérisation n’est pas indispensable

pour la réplication (Sauer, Wang et al. 2010). Le génome viral contient une origine de réplication

d'ADN (ori Lyt) située entre les gènes UL57 et UL69, au milieu de la région UL. Cette position est

conservée chez tous les - herpesvirinae. L’Ori Lyt est nécessaire pour la réplication de l'ADN

viral (Anders, Kacica et al. 1992).

Figure 2 : Représentation schématique du génome du HCMV. UL (Unique Long), US (Unique Short), TRL (Terminal Repeat Long), TRS (Terminal Repeat Short), IRL (Internal Repeat Long), IRS (Internal Repeat Short). A, B, C et D correspondent aux quatre isomères.

23

ii. Capside

La capside d’HCMV est une capside icosaédrique composée de 162 capsomères (150 hexons

et 12 pentons). Elle est formée de quatre protéines : la protéine majeure de capside (MCP ou

UL86) composant les hexons et la plupart des pentons, la protéine mineure de capside (mCP ou

UL46), la protéine mineure de fixation de la capside (mC-BP ou UL85) et la petite protéine de

capside (SCP ou UL48A) (Mocarski, Shenk et al. 2013). Les protéines MCP et mCP sont les

éléments les plus abondants de la capside. Contrairement à HSV-1, où SCP n’est pas

indispensable, toutes les protéines de capside du HCMV sont essentielles pour la réplication

virale (Britt 2007). De nombreuses protéines interviennent dans l‘assemblage de la capside et

l‘encapsidation de l’ADN viral néo synthétisé. La protéine portale PORT ou UL104 constitue un

pore au niveau de la capside permettant l’encapsidation du génome et la libération de l'ADN

viral en se liant avec les protéines d'encapsidation ou terminases codées par UL89 et UL56

(Dittmer and Bogner 2005).

iii. Tégument

Le tégument est une couche épaisse de protéines virales qui se trouve entre la capside et

l’enveloppe. Il est composé d'au moins 32 protéines virales, dont beaucoup sont phosphorylées.

Ces protéines ont diverses activités, du conditionnement de la cellule hôte au début de

l'infection à l'orchestration de la phase finale de l'assemblage des virions (Kalejta 2008).

Au début de l'infection, des protéines comme UL47 et UL48 ont probablement un rôle dans le

transport des particules virales par les microtubules, l‘ancrage au niveau du pore nucléaire de la

nucléocapside, ainsi que dans la décapsidation et l‘entrée de l’ADN viral dans le noyau (Bechtel

and Shenk 2002) (Yu, Silva et al. 2003).

La protéine UL83 ou pp65 est la protéine de tégument la plus abondante et le constituant

principal des corps denses. Les corps denses sont des particules non infectieuses qui sont

formés d’une enveloppe virale et de protéines de tégument alors qu’ils ne contiennent ni

capside, ni génome. UL83 est hautement immunogène et sa détection dans les polynucléaires

circulants est utilisée dans un test de diagnostic (antigénémie pp65). Après l’entrée du virus,

pp65 se localise dans le noyau des cellules infectées, où elle joue un rôle d’immunomodulateur,

qui freine la réponse cellulaire à l’interféron (IFN) (Kalejta 2008). Bien qu’elle soit abondante et

ait un rôle potentiellement important lors de l'infection naturelle, pp65 n’est pas indispensable

pour la réplication dans les cellules en culture (Mocarski, Shenk et al. 2013). La protéine pp71

(UL82) est un homologue d’UL83 qui se localise aussi dans le noyau après l'entrée du virus. Elle

recrute la machinerie cellulaire de transcription pour activer la transcription des gènes très

précoces (Petrik, Schmitt et al. 2007) via la dégradation ou la relocalisation des répresseurs de

24

la transcription, tels que la protéine cellulaire Daxx (Penkert and Kalejta 2012). La protéine du

tégument pp150 reste liée à la capside (Yu, Shah et al.) et joue un rôle essentiel dans la stabilité

des nucléocapsides matures pendant la translocation du noyau vers le cytoplasme puis leur

transport dans le compartiment d’assemblage (Tandon and Mocarski 2008).

La protéine UL48, également liée à la capside (Yu, Shah et al.), semble stabiliser les

nucléocapsides. Quant à la protéine kinase ppUL97 (ou VPK ou UL97), elle semble jouer un rôle

central dans l’infection en agissant à différents niveaux, dans les étapes précoces de l'infection

et également dans la maturation et la sortie de la capside du noyau ou «nuclear egress»

(Prichard 2009). Certaines protéines du tégument, comme ppUL99 ou pp28, facilitent

l’assemblage et la sortie des virus de la cellule.

La famille US22 code pour les protéines de tégument UL23, UL24, UL25, UL26, UL29-28, UL36,

UL43, IRS1, US22, US23, US24, US26 et TRS1. Ces protéines seraient impliquées dans les

premières étapes qui suivent la pénétration du virus (Adair, Douglas et al. 2002).

iv. Enveloppe

Les virions, les corps denses et les NIEPs (particules enveloppés non-infectieuses) sont

entourés d’une bicouche lipidique dérivée du compartiment ERGIC (Endoplasmic Reticulum-

Golgi intermediate compartment) (Britt 2007; Tandon and Mocarski 2012). Plus de 20 différentes

glycoprotéines virales sont insérées dans cette enveloppe. Les plus connues sont les

glycoprotéines B, H, M/N, L, O et 48 (respectivement notées gB, gH, gM/N, gL, gO et gp48).

Elles sont relativement bien conservées chez les herpesvirus. Seulement 5 de cette vingtaine de

glycoprotéines sont essentielles pour la réplication virale in vitro. Il s’agit de gB (UL55), de

gM/gN (UL100/UL73) et de gH/gL (UL75/UL115). L’enveloppe confère au virion une sensibilité

particulière aux solvants des lipides, au pH bas et à la chaleur.

E. Cycle de réplication

La pathogenèse du HCMV implique une réplication productive dans une grande variété de types

cellulaires (Revello and Gerna 2010), tels que les cellules épithéliales, endothéliales,

neuronales, myéloïdes et fibroblastiques (Sinzger, Digel et al. 2008). Cependant, la plupart des

études in vitro effectuées pour comprendre les fonctions des gènes lors de la réplication virale

ont été faites dans des fibroblastes. La réplication virale dans des cellules autres que les

fibroblastes nécessite l'utilisation de souches virales spécifiques qui conservent les

caractéristiques des isolats cliniques. Généralement, les isolats cliniques sont plus difficiles à

cultiver que les souches de laboratoire, qui ont été adaptées dans les fibroblastes. Le cycle de

réplication du HCMV est long dans les fibroblastes et demande de 48h à 72h pour arriver à

25

l’étape finale de la maturation et la libération du virus. Après l’entrée du virus, trois classes de

gènes, très précoces (IE ou ), précoces (DE ou ) et tardives (L ou ) sont exprimées

séquentiellement de manière coordonnée au cours du cycle viral.

Le cycle de réplication comprend plusieurs étapes (Figure 3) :

i. L’attachement et l’entrée du virus dans la cellule

ii. La réplication du génome

iii. L’assemblage des particules virales et la sortie des virions

Figure 3 : Cycle de réplication du HCMV. 1-Après la fixation sur les héparanes sulfates à la membrane plasmique, le virus interagit avec des récepteurs spécifiques, ce qui entraine la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane et la libération de la nucléocapside et les protéines de tégument dans le cytoplasme. 2- La nucléocapside migre le long des microtubules vers le noyau où l’ADN virale est libéré. 3- La synthèse séquentielle des protéines très précoces et précoces. 4- La réplication virale puis synthèse des protéines tardives et formation de nouvelles nucléocapsides. 5- Les nucléocapsides acquerront leur enveloppe au niveau de la membrane nucléaire ou du TGN (Trans-Golgi Network). 6-Les virions sont libérés par exocytose au niveau de la membrane plasmique.

i. L’attachement et l’entrée du virus sur la cellule

En général, l’entrée du virus se produit en plusieurs étapes :

1) La liaison à des récepteurs spécifiques à la surface cellulaire.

26

2) La fusion de l'enveloppe virale avec les membranes cellulaires pour libérer la nucléocapside

dans le cytoplasme, soit directement au niveau des membranes plasmiques (dans les

fibroblastes) ou après endocytose (dans les cellules endothéliales et épithéliales).

3) La translocation de la nucléocapside vers le noyau grâce au cytosquelette. La nucléocapside

va ensuite interagir avec les pores nucléaires, ce qui permet la libération du génome dans le

noyau. Simultanément mais indépendamment de la translocation de la nucléocapside vers le

noyau, les protéines du tégument sont libérées dans le cytosol et elles assurent différentes

fonctions, comme la modulation de la réponse innée de l'hôte et l'orchestration de la

transcription des gènes très précoces IE (Immediate Early). La plupart des cellules semblerait

être permissives à l‘infection par le HCMV, étant donné que l‘on peut détecter le virus dans la

quasi-totalité des organes d‘un individu infecté.

Le HCMV interagit avec plusieurs récepteurs de manière successive avant de pénétrer dans la

cellule (Compton 1995). Le contact initial du virion avec les cellules fait intervenir des

protéoglycanes héparanes sulfates (PGHS) (Figure 4) (Compton, Nowlin et al. 1993), un

phénomène relativement conservé dans la voie d'entrée des herpesvirus. Le HCMV complète

l’attachement ainsi que l'étape de la fusion à l’aide des glycoprotéines gB et gH/gL (Lopper and

Compton 2004). D'autre complexes glycoprotéiques sont impliqués dans l’entrée du virus,

comme le trimère gB/gH/gO et le pentamère composé de gH/gL/UL128/UL130/UL131A, qui

facilite l'entrée dans les cellules épithéliales et les cellules endothéliales (Ryckman, Chase et al.

2008). Dans les fibroblastes, le HCMV pénètre par fusion directe avec la membrane plasmique,

de manière indépendante du pH (Compton, Nepomuceno et al. 1992). Cependant, il pénètre

dans les cellules endothéliales et les cellules épithéliales par un mécanisme d’endocytose

dépendant du pH (Bodaghi, Slobbe-van Drunen et al. 1999; Ryckman, Rainish et al. 2008).

L'entrée du HCMV ne se produit pas au hasard sur la membrane plasmiques mais

spécifiquement au niveau des radeaux lipidiques (Wang, Huang et al. 2005).

Les récepteurs cellulaires impliqués dans l’entrée du HCMV ne sont pas encore parfaitement

connus. A cet égard, la 2-microglobuline, l’annexine II et l’aminopeptidase neutre (CD13),

initialement identifiés comme étant des récepteurs du HCMV, ne sont en fait pas ou peu

impliqués dans l'entrée virale (Pietropaolo and Compton 1999). Il a été rapporté que le HCMV

est capable d’infecter les fibroblastes en se liant à l’EGFR (epidermal growth factor receptor) et

que cette interaction se fait par l’intermédiaire de gB (Wang, Huong et al. 2003). Plus

récemment, il a été montré que le HCMV se lie à l’EGFR exprimé à la surface des cellules

endothéliales, induisant ainsi une cascade de signalisation impliquant la phosphatidylinositol 3-

27

kinase (PI3K) et des MAPK (Bentz and Yurochko 2008). En 2009, son rôle en tant que récepteur

du HCMV a été également étendu aux monocytes (Chan, Nogalski et al. 2009). Cependant, il

reste controversé car le groupe de T. Compton a montré que l’EGFR n’est pas impliqué dans

l’entrée du HCMV dans les fibroblastes et dans une lignée de cellules endothéliales (Isaacson,

Feire et al. 2007). Son rôle pourrait ainsi dépendre du type cellulaire.

Les intégrines cellulaires 2β1, 61 et αVβ3 fonctionneraient aussi comme récepteurs du

HCMV, via un domaine hautement conservé de type « désintégrin-like » (Feire, Koss et al.

2004). L’intégrine αVβ3 pourrait également être un co-récepteur du HCMV et se lier à l’EGFR de

façon synergique (Wang, Huang et al. 2005). Les intégrines pourraient donc soit interagir seules

avec le HCMV comme un récepteur primaire, soit jouer un rôle de co-récepteur et interagir avec

un autre récepteur (Isaacson, Feire et al. 2007). Il a été montré que l’interaction entre gB et la

β3 intégrine après l’attachement du virus à la surface de la cellule est un processus déterminant

de la réponse interféron (IFN) et que le blocage de cette interaction en utilisant une gB

incapable d’interagir avec la β3 intégrine, diminue le signal IFN, mais pas l’activation des

cytokines inflammatoires (Juckem, Boehme et al. 2008). Il a été rapporté plus récemment que le

PDGFR (platelet-derived growth factor-α receptor) pourrait jouer le rôle de récepteur pour le

HCMV (Soroceanu, Akhavan et al. 2008).

En revanche, il semble que le TLR2 (Toll like receptor 2) ne soit pas impliqué dans l’entrée du

HCMV (Juckem, Boehme et al. 2008) mais son interaction avec gB induit la sécrétion de

cytokines inflammatoires (Compton, Kurt-Jones et al. 2003).

Figure 4 : Mécanisme d’entrée du HCMV au niveau de la membrane cellulaire Le virus se fixe initialement sur la cellule grâce aux héparanes sulfates via la glycoprotéine d’enveloppe gB, ce qui facilite la fixation à des récepteurs plus spécifiques. Le PDGFR semblerait être le récepteur du HCMV le plus probable, permettant l’entrée du virus dans la cellule. L’intégrine αvβ3 joue le rôle de corécepteur. Les TLR ne sont pas impliqués dans l’entrée mais leur activation entraine la production des

28

cytokines inflammatoires. D’autres récepteurs cellulaires avaient été proposés comme le CMH de classe I, l’annexine II, mais leur rôle en tant que récepteurs est remis en cause. Le rôle d’EGFR en tant que récepteur est controversé et dépend du type cellulaire.

ii. La réplication du génome

La transcription et la traduction du génome viral du CMV se déroulent en trois étapes

séquentielles et coordonnées. La première ou la phase très précoce (Immediate Early, IE)

permet de détourner le métabolisme cellulaire au profit de la réplication virale, d’inhiber la

réplication de l’ADN cellulaire et de déclencher la phase précoce. Les gènes très précoces sont

soit exprimés pour initier une cascade d’expression des gènes pour une infection lytique, soit

réprimés pour établir la latence. L'initiation de la transcription des gènes IE débute en l’absence

de l’expression de novo de protéines virales. La transcription des gènes IE1 et IE2 (immediate

early protein 1 et 2), qui sont les gènes les plus abondants parmi les gènes très précoces, est

sous le contrôle du promoteur MIEP (Major Immediate Early Promoter). Grâce à des sites

d’interaction avec le NF-κB (nuclear factor-kappa B) dans le MIEP, une signalisation pro-

inflammatoire induite par l'entrée du virus est effectivement exploitée pour activer l’expression

des gènes IE1/IE2 (Caposio, Luganini et al. 2007; Isaacson, Juckem et al. 2008; Isern, Gustems

et al. 2011). Le MIEP est activé par des protéines cellulaires et virales, comme la protéine du

tégument pp71 (pUL82) qui entre avec la particule virale. En l’absence de pp71, un blocage

général de la transcription des gènes IE peut se produire (Bresnahan and Shenk 2000) et

contribue à la mise en place de la latence virale (Saffert and Kalejta 2007).

A la suite du pic d’expression des protéines très précoces régulatrices et avant la réplication du

génome, la phase précoce débute. Les protéines précoces comprennent les enzymes et

protéines nécessaires à la synthèse de l’ADN viral. Ces gènes ont plusieurs fonctions dans la

maturation et la sortie des virions. (Browne and Shenk 2003; Abate, Watanabe et al. 2004). La

réplication de l‘ADN viral dépend de plusieurs protéines, notamment de l‘ADN polymérase virale

UL54 et de sa protéine accessoire UL44. L'expression des gènes tardifs est maximale après la

réplication de l'ADN viral. Les gènes tardifs codent principalement pour des protéines

structurales et contrôlent la maturation de la capside, l'assemblage de l’ADN, la maturation du

virion et des corps denses et finalement la sortie du virus de la cellule. La synthèse de l'ADN a

lieu dans le noyau des fibroblastes infectés, en commençant entre 14 et 16h pi, et peut atteindre

plus de 10000 copies par cellule au moment où les virions commencent à se former (Mocarski,

Shenk et al. 2013).

29

iii. L’assemblage des particules virales et la sortie des virions

Les caractéristiques de base de la formation de la capside et la maturation sont communes chez

les herpesvirus. Le processus commence lorsque cinq composants de la capside conservés

chez les herpesvirus, (MCP, TRI1, TRI2, SCP- UL48A -, et PORT UL104) forment une coquille

de procapside autour d'un précurseur de la protéine d'assemblage (AP ou UL80.5) qui est

responsable à la fois de la translocation de MCP vers le noyau et de l’initiation de l’assemblage

de la capside (Gibson 2008). Les protéines du tégument sont ajoutées aux nucléocapsides

séquentiellement dans le noyau et cet assemblage se poursuit dans le cytoplasme. Ceci assure

la stabilité de la nucléocapside au cours de sa translocation vers le cytoplasme et contrôle son

trafic vers des sites d'enveloppement dans le cytoplasme. Sept structures virales différentes

sont libérées par les cellules infectées. Parmi elles, on trouve des virions complets, des NIEPs

et des corps denses (Topilko and Michelson 1994).

L’ADN viral produit a une forme de concatémères qui sont de longues molécules d'ADN

constituées d'un même monomère répété séparé par des séquences pac (Cis-acting packaging

element). Ensuite, une étape d’encapsidation se déroule où les concatémères seront clivés et

empaquetés dans les capsides. Ce processus fait intervenir des protéines d'encapsidation ou

terminases (UL51, UL52, UL56, UL77, UL89 et UL104 ou PORT).

Un complexe terminase, comprenant les protéines UL89 et UL56, s‘associe à un pentamère de

la protéine portale UL104, qui forme un pore au niveau de la capside permettant l‘introduction de

l‘extrémité libre du concatémère d‘ADN viral néoformé. La protéine UL56 se fixe sur les

séquences pac, ce qui active le premier clivage de l‘ADN et la fixation du complexe UL56/ADN à

UL89. Puis le complexe UL56/UL89/ADN se fixe à UL104, permettant le transfert de l‘ADN dans

la capside (Mocarski, Shenk et al. 2013).

Pour expliquer la sortie dans le milieu extracellulaire du virion, deux hypothèses co-existent.

L’hypothèse la plus ancienne est qu’une fois dans le réticulum endoplasmique (RE), le virion

conserverait son enveloppe acquise après bourgeonnement au niveau de la membrane interne

nucléaire et qu’il se dirigerait vers l’extérieur de la cellule, via l’appareil de Golgi et le TGN. La

deuxième hypothèse, la plus acceptée aujourd’hui, est que les capsides acquièrent une

première enveloppe transitoire en traversant la membrane nucléaire interne. La fusion de cette

enveloppe virale avec la membrane nucléaire externe a pour résultat le désenveloppement de la

nucléocapside et sa translocation dans le cytoplasme. La majorité des protéines du tégument

sont alors ajoutées aux nucléocapsides, qui obtiennent leur enveloppe finale par

bourgeonnement dans des vésicules dérivées de l’appareil de Golgi (Mettenleiter, Klupp et al.

30

2006). Quand les virions sont formés, ils sont ensuite transportés vers la surface cellulaire dans

des petites vésicules à l'aide de la machinerie cellulaire d'exocytose.

F. Manifestations cliniques

Au cours de l’infection par le HCMV, la physiopathologie dépend du stade de l’infection ; la

primo-infection, la réinfection et la réactivation (Figure 5).

Figure 5 : Physiopathologie de l’infection par le HCMV (Alain, Hantz et al. 2008).

i. Infection chez les adultes immunocompétents

En règle générale, la primo infection par le HCMV chez les sujets immunocompétents est

cliniquement asymptomatique. L’infection symptomatique donne parfois de la fièvre ou un

syndrome mononucléosique, qui est caractérisé par une fièvre élevée (entre 39 et 40°C)

pendant plus de 10 jours, des malaises, des myalgies, des céphalées et de la fatigue. Le

syndrome mononucléosique peut se produire également chez les enfants. Les enfants sont

moins susceptibles d'être fébriles mais plus susceptibles d'avoir une hépatomégalie ou une

splénomégalie (Pannuti, Vilas Boas et al. 1985). La primo-infection peut cependant aboutir à des

manifestations cliniques diverses mais peu fréquentes telles que des arthralgies et arthrites,

colites ulcératives, pneumopathies, méningites aseptiques et myocardites.

ii. Infection au cours de la grossesse et maladie congénitale

L’infection congénitale par le HCMV est la plus fréquente des infections congénitales en France

et toucherait environ 0,5% des naissances. Cependant l’atteinte sévère n’est symptomatique à

31

la naissance que chez 10 % à 15 % des fœtus infectés. Dans ces cas, il existe une atteinte de

plusieurs organes, et en particulier des atteintes neurologiques et sensorielles. L’infection chez

les enfants symptomatiques est associée de façon variable à une hypotrophie, une hépatite, une

hépatosplénomégalie, et des signes d’atteinte du système nerveux central (SNC) qui peuvent

aboutir, dans les cas les plus graves, à des séquelles neuro-sensorielles et à un retard

psychomoteur sévère. Cette forme grave est létale dans 30 % des cas (Malm and Engman

2007). Que l’enfant soit symptomatique initialement ou pas, il peut apparaître ultérieurement des

anomalies notamment cérébrales et sensorielles, comme la surdité (Fowler, McCollister et al.

1997; Ivarsson, Lernmark et al. 1997).

L’incidence de la primo-infection maternelle pendant la grossesse est de 1% à 4% et le taux de

transmission mère-fœtus est alors de 30 % à 40% contre 1% au cours d’une infection récurrente

(Boppana, Rivera et al. 2001).

Le HCMV a un tropisme particulier pour le SNC, entraînant des atteintes plus ou moins sévères

selon la date de l’infection en anténatal. Si l’infection du fœtus survient durant le premier

trimestre de la grossesse, les lésions cérébrales retrouvées seront plus fréquemment des

anomalies de structuration (Fowler, Stagno et al. 1992). Les nouveau-nés infectés

congénitalement excrètent du HCMV dans l'urine et d'autres fluides corporels à des niveaux

élevés. Cependant, des niveaux élevés de virus ne sont pas toujours corrélés à une maladie

congénitale grave, même s’il existe un lien entre la charge virale sanguine élevée à la naissance

et la surdité (Boppana, Fowler et al. 2005; Lanari, Lazzarotto et al. 2006).

iii. Infections opportunistes chez les sujets immunodéprimés

Le HCMV est un important agent pathogène opportuniste affectant les patients

immunodéprimés. L'infection est fréquente suite à la réactivation du virus latent, ou lors d’une

réinfection des patients qui ont eu une infection passée ou encore à l'initiation d'une primo-

infection.

Au cours du SIDA

Avant l'utilisation de la thérapie antirétrovirale hautement active, environ 20 à 40% des adultes

atteints du SIDA développait une maladie due au HCMV. Chez les personnes infectées par le

VIH (virus de l’immunodéficience humaine), le risque de maladie à HCMV est lié à un faible taux

de lymphocytes T CD4+. L'utilisation des HAART (Highly active antiretroviral therapy), qui

entrainent une meilleure reconstitution ou préservation des cellules T CD4 immunitaires, a

considérablement réduit l'occurrence de la virémie et de la maladie à HCMV (Deayton, Mocroft

et al. 1999; O'Sullivan, Drew et al. 1999). Cependant, dans les pays en voie de développement,

32

cette infection continue d’être problématique, du fait d’un accès limité aux thérapies efficaces.

Les manifestations cliniques les plus importantes sont les rétinites suivies par des atteintes du

tube digestif, comme l’œsophagite et la colite. On peut retrouver des présentations cliniques

moins courantes comme des encéphalites, des neuropathies périphériques, des

pneumopathies, des gastrites et des hépatites.

Après transplantation d’organe solide ou de moelle osseuse

Les patients transplantés reçoivent un traitement immunosuppresseur qui limite le risque de

rejet du greffon. Ce traitement favorise la réplication du HCMV à partir d’une contamination par

le greffon ou d’une réactivation d’une souche latente. L’infection à cytomégalovirus constitue

ainsi une cause majeure de morbidité et de mortalité chez les patients transplantés d’organes

solides, de moelle osseuse ou de cellules souches hématopoïétiques. La gestion de l'infection

par le HCMV reste un problème majeur et constitue un composant important du coût global de la

transplantation. Le plus haut risque d’infection s’observe lorsqu'un receveur séronégatif est

transplanté avec un organe séropositif. L’infection est associée à une diminution de la survie du

patient et au rejet du greffon.

Les manifestations cliniques sont les résultats de la lyse cellulaire suite à la réplication virale ou

sont dues aux effets indirects de cytokines et de chimiokines produites au cours de la réponse

immunitaire déclenchée par l’infection (Nordoy, Muller et al. 2000). L’infection sévère chez un

patient transplanté se manifeste notamment par de la fièvre ≥ 38°C et l’un des signes suivants :

malaise, leucopénie, une arthralgie, lymphocytose atypique, thrombocytopénie, élévation des

transaminases, occasionnellement par une éruption cutanée. La maladie est dite invasive

lorsqu’il y a une dysfonction d’organe avec preuve de la présence virale dans cet organe. Bien

que les traitements antiviraux arrivent à prévenir les formes sévères, des effets indirects de

l’infection peuvent se produire chez ces patients, y compris un risque accru d’infections

opportunistes par des champignons, des bactéries et des virus. D’autres conséquences peuvent

survenir comme le rejet d’organe solide ou un retard à la prise de greffe en cas d’allogreffe de

moelle (Fishman, Emery et al. 2007).

G. Traitements antiviraux

Plusieurs molécules sont disponibles pour les traitements curatifs et préventifs des infections : le

ganciclovir ou GCV (Cymevan®), le Valganciclovir Val-GCV (Rovalcyte®), le cidofovir ou CDV

(Vistide®, non commercialisé actuellement), le foscarnet ou PFA (Foscavir®). Toutes ces

molécules inhibent l’activité de l’ADN polymérase virale UL54 (Figure 6) et sont donc sans

action sur le virus latent. Ces molécules possèdent une toxicité non négligeable qui limite leur

utilisation.

33

Les personnes transplantées et immunodéprimées obtiennent de bons résultats après

l’utilisation de GCV. Cependant l’apparition de résistance est assez fréquente chez ces patients.

Le GCV subit une première phosphorylation par la phosphotransférase UL97 puis deux autres

phosphorylations par des kinases cellulaires pour arriver à son état actif. Le Val-GCV, une pro-

drogue du GCV, est aussi couramment utilisée et a une biodisponibilité 10 fois supérieure à

celle du GCV. Ces deux molécules ont une toxicité hématologique, essentiellement

neutropénique. L’Aciclovir (Zovirax®) et son ester le Valaciclovir (Zelitrex®), bien que moins

actifs sur le HCMV que le GCV, sont utilisés en prophylaxie après greffe d'organe, chez des

patients séropositifs pour le HCMV.

Figure 6 : Mode d’action des inhibiteurs de l’ADN polymérase virale UL54 (Hantz, Mazeron et al.

2009).

Le PFA est capable, sans aucune modification supplémentaire, d’inhiber sélectivement le site de

liaison au pyrophosphate sur l'ADN polymérase virale UL54. Son utilisation est associée avec

une toxicité rénale et des troubles digestifs.

De nouvelles molécules antivirales sont actuellement en développement. Il y avait une nécessité

pour deux raisons : 1), il est nécessaire de trouver des alternatives moins toxiques, notamment

en prophylaxie et en traitement d’entretien, après la baisse de la charge virale. 2) en raison de

l’apparition de résistance du HCMV aux molécules actuelles, résistances qui peuvent être

croisées car ces antiviraux ciblent tous l’ADN polymérase, il est nécessaire de trouver des

antiviraux qui ont des cibles différentes (Figure 7).

34

Figure 7 : Antiviraux en développement contre le HCMV d’après (Hantz, Mazeron et al. 2009).

L’Artésunate, un traitement antipaludéen à l’origine, est efficace contre les souches sauvages

d’HCMV et celles résistantes au GCV (Kaptein, Efferth et al. 2006). Il semblerait qu’il inhibe les

protéines très précoces du HCMV. Il a été rapporté qu’après un traitement de 7 jours

d’artésunate, la charge virale est significativement diminuée chez un receveur de moelle

présentant une infection résistante au GCV et au PFA (Shapira, Resnick et al. 2008; Wolf,

Shimoni et al. 2011). Une étude récente rapporte que l’artésunate a également donné de bons

résultats chez trois patients transplantés en échec thérapeutique sur cinq (Germi, Mariette et al.

2014). Actuellement, l’artésunate est en autorisation temporaire d’utilisation (ATU) et, comme la

forme orale n’est plus disponible en ATU, il s’administre par voie intraveineuse. Il est bien toleré,

avec une toxicité modérée in vivo. Il serait plutôt à utiliser en prophylaxie, mais comme il est

efficace sur les souches résistantes, il pourrait être utile en cas d’impasse thérapeutique.

Des recherches sont également en cours sur le leflunomide, un inhibiteur de la synthèse des

pyrimidines utilisé dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Il est efficace sur le HCMV in

vitro et sur modèle animal. Il inhibe les étapes tardives du cycle viral et notamment l’acquisition

du tégument du virion. Il pourrait être utile en seconde intention (« rescue therapy »), chez des

patients infectés par des souches résistantes au GCV (Ciszek, Mucha et al. 2014).

Le Maribavir (MBV) est une molécule inhibitrice spécifique de la kinase virale UL97. Il inhibe la

sortie des capsides virales du noyau. Le MBV a très peu d’effets secondaires et il n’y a pas de

résistance croisée avec les autres inhibiteurs. Son efficacité clinique en prophylaxie n’est pas

totalement convaincante et nécessite des doses élevées. Il reste actif contre les souches

résistantes au GCV, laissant penser que cette molécule pourrait être utile dans le traitement des

35

infections à HCMV résistantes, en seconde intention. Des cas de résistance au MBV ont été

rapportés portant sur UL97. En revanche, il n’existe pas de résistance croisée entre le MBV et le

GCV, car ils ont des sites d’action différents sur UL97. Le MBV inhibe l’efficacité du GCV car il

cible UL97. Il ne faut donc pas faire de combinaison. Le MBV est disponible en ATU

actuellement (Hantz, Mazeron et al. 2009).

Le Brincidofovir (développé par la société Chimerix), est un ester du CDV, qui a un bien meilleur

potentiel antiviral in vitro que la molécule d’origine. Cet analogue conserve son activité contre

les isolats cliniques présentant des mutations de résistance au GCV sur les gènes UL97 et

UL54. Il n’a pas de toxicité rénale, contrairement au CDV et est bien toléré. Le brincidofovir est

disponible en ATU actuellement, en cas de co-infection (Aldern, Ciesla et al. 2003; Hostetler

2009).

Le letermovir (AIC246) est une molécule anti-CMV en cours de développement. Il inhibe

spécifiquement la terminase UL56, bloquant ainsi le clivage des concatémères d’ADN au

moment de l’encapsidation. Ni la réplication de l'ADN du HCMV, ni l’expression des protéines

virales ne sont affectées par cette molécule (Goldner, Hewlett et al. 2011). Il est actuellement

testé en prophylaxie chez les patients transplantés de rein ou de cellules souches

hématopoïétiques (phase II) (Stoelben, Arns et al. 2013; Chemaly, Ullmann et al. 2014). En

préventif à doses élevées, il réduit significativement le nombre d'infections à HCMV chez les

porteurs d'une greffe de moelle. Il est administré par voie orale et possède une faible toxicité. Il

n’y a pas de résistance croisée avec les autres antiviraux. Il a montré des résultats

encourageants en seconde intention chez un patient transplanté pulmonaire (Kaul, Stoelben et

al. 2011).

H. Echappement aux mécanismes de défense antivirale

Au cours de l’infection, le HCMV est susceptible de rencontrer une large gamme de réponses

immunitaires acquises et innées qui sont mises en place par les cellules hôtes pour contrôler

l'agent pathogène. Pratiquement tous les virus ont développé des mécanismes pour

contrecarrer les défenses cellulaires. Un certain nombre des stratégies d’évasion développés

par le HCMV sont présentées ici.

i. Inhibition de l’apoptose

L’apoptose, ou mort cellulaire programmé de type I, est un mécanisme antiviral inné car il peut

jouer en défaveur du virus en induisant la mort des cellules infectées, limitant le temps

nécessaire à la production de nouveaux virions et en prévenant l'infection persistante. De

nombreux virus, y compris les herpesvirus, modulent l'apoptose afin de faciliter leur réplication.

36

Lors de l'infection, HCMV peut bloquer l'apoptose dans différents types cellulaires, telles que les

fibroblastes, les macrophages et les cellules endothéliales (Tanaka, Zou et al. 1999; Michaelis,

Kotchetkov et al. 2004). Le HCMV code pour plusieurs protéines qui interfèrent directement

avec les voies de signalisation apoptotique. Il s’agit notamment de deux protéines très précoces,

la protéine vICA (viral inhibitor of caspase-8-induced apoptosis) ou pUL36 et la protéine vMIA

(mitochondria-localized inhibitor of apoptosis) ou pUL37×1 (Goldmacher 2005). Une protéine

virale codée par le gène UL38 a également été identifiée (Terhune, Torigoi et al. 2007). Ces

protéines ont des mécanismes d’action différents. La protéine vMIA inhibe l'apoptose en

perturbant le réseau mitochondrial ainsi qu’en séquestrant la protéine pro-apoptotique Bax dans

la mitochondrie (Arnoult, Bartle et al. 2004). La protéine vICA, qui est indispensable pour la

réplication du HCMV, a la capacité d’empêcher l’activation de la caspase-8. La protéine UL38

est un inhibiteur de la caspase 3 et de l'apoptose dépendante du stress du réticulum

endoplasmique (UPR) (Miszczak and Cymerys 2014).

ii. Modulation de l’immunité innée

Le HCMV, malgré un nombre considérable de protéines dédiées à l’échappement immunitaire,

est un virus qui induit une réponse immune spécifique de l’hôte très importante. L’immunité

antivirale innée est mise en place très rapidement, dès les phases d’attachement et de fusion du

virus au niveau des membranes cellulaires. La réponse immunitaire innée va jouer un rôle

important dans la défense anti-HCMV et permettra par la suite d’activer la réponse immunitaire

adaptative.

Il a été montré que le contact entre le HCMV et la surface cellulaire déclenche des voies de

signalisation conduisant à la production de cytokines inflammatoires (IC) et de l’IFN de type I,

deux marqueurs de l’immunité innée (Compton, Kurt-Jones et al. 2003). Des ISGs (Interferon-

stimulated genes) et des gènes inflammatoires, tels que l'interleukine 6 (IL-6), IL-7, IL-11, sont

tous fortement induits dans des fibroblastes infectés par le HCMV (Simmen, Singh et al. 2001).

En fait, cette induction est dépendante du TLR2 (Toll-Like Receptor 2) et de CD14. Ces

réponses permettent de limiter la réplication virale et la dissémination aux étapes précoces et

aussi d’activer les réponses immunes adaptatives qui pourront éliminer l’infection. Toutefois, la

protéine du tégument pp65 protège les cellules infectées du système immunitaire inné. Il a été

montré que la réponse à l’interféron est atténuée par pp65 et que le niveau d'expression des

ISGs sont élevée après infection par un virus Δpp65 (Kalejta 2008).

Parmi les gènes ISGs, on trouve ceux qui codent pour la protéine kinase R (PKR) dépendante

de l’ARN double brin (ARNdb) et le 2’-4’ oligoadénylate synthase (2’-5’ OAS) (Randall and

37

Goodbourn 2008). L’infection virale produit de l’ARNdb qui, avec l’IFN, vont déclencher des

cascades de signalisation aboutissant à plusieurs mécanismes antiviraux au niveau cellulaire

dont l’activation de PKR et l’arrêt de la synthèse protéique afin d’inhiber la réplication virale

(Katze 1995). Étant donné que la réplication virale nécessite la synthèse des protéines virales,

beaucoup de virus codent des gènes qui bloquent l’activation de PKR. Le HCMV possède au

moins deux gènes qui régulent négativement cette voie, TRS1 et IRS1. Cette partie sera

discutée en détail plus loin (voir chapitre 2).

iii. Modulation de l’immunité adaptative

Modulation du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de classe I (CMH-I) :

Un de mécanismes principaux d’échappement à l’immunité adaptative se fait par l’inhibition de

la présentation aux lymphocytes T cytotoxiques des antigènes via le CMH de classe I. Les

molécules du CMH-I vont présenter des peptides endogènes provenant du cytoplasme

(typiquement les antigènes viraux). Elles forment un complexe avec les molécules TAP

(Transporter associated with antigen processing) présentes dans la membrane du réticulum et

des peptides de 8 à 10 acides aminés. Ces peptides de petite taille proviennent du clivage des

protéines par le protéasome (Figure 8). Ce complexe pourra ensuit migrer vers la membrane

plasmique via l’appareil de Golgi et être présenté aux lymphocytes T CD8.

Le HCMV interfère avec la présentation des antigènes pour échapper au contrôle immunitaire. Il

code pour 4 glycoprotéines immunomodulatrices US2, US3, US6 et US11 capables de diminuer

l’expression à la surface des cellules des protéines du CMH de classe I via des mécanismes

post-traductionnels (Jackson, Mason et al. 2011) (Figure 8). Chacune de ces protéines est

suffisante pour empêcher la translocation des protéines du CMH de classe I à la surface

cellulaire (Basta and Bennink 2003). La combinaison d’US2 et US11 entraine l’adressage de

différentes chaines lourdes du CMH-I vers le protéasome pour être dégradées. La protéine US3

empêche le passage des molécules du CMH de classe I du RE à l’appareil de Golgi. La protéine

US6 se lie au transporteur TAP, empêchant la translocation des peptides dans le RE.

38

Figure 8 : Modulation de la présentation des antigènes via le CMH de classe I et II par le HCMV :

D’après (Villadangos and Schnorrer 2007).

Modulation du CMH classe II :

Les molécules du CMH-II, un autre élément de l’immunité, permet l’activation des lymphocytes T

CD4+ au cours de la présentation des antigènes. Les CMH-II sont exprimées sur les cellules

présentatrices d’antigènes, tels que les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques

et les lymphocytes B. Elles présentent les peptides exogènes provenant du milieu extracellulaire

et internalisés par endocytose. L’antigène sera cette fois-ci dégradé par le système endo-

lysosomal en peptides de tailles variables (entre 12 et 25 acides aminés).

Le HCMV semble en mesure de bloquer la présentation des antigènes via le CMH de classe II

via plusieurs mécanismes. Il est capable d’échapper à la réponse T CD4 en diminuant

l’induction par l’IFN d’un facteur de transcription du CMH de classe II (CIITA) (Figure 9). Le

HCMV empêche l'activation par l’IFN-γ en bloquant la voie Jak/Stat, un phénomène associé à la

dégradation de la protéine Jak1 (Janus Activated Kinase) (Miller, Rahill et al. 1998).

39

Figure 9 : Inhibition de l’expression du CMH de classe II par le HCMV

Le virus entraine la dégradation de la protéine JAK1 qui intervient dans la signalisation de l’IFN-γ. Cela inhibe l’induction de l’expression des molécules du CMH-II. D’après (Miller, Rahill et al. 1998).

Les glycoprotéines virales US2 et US3 jouent également un rôle dans la modulation du CMH-II

(Hegde and Johnson 2003) (Figure 8). US2 agit en redirigeant les chaines HLA-DR et HLA-

DM vers le cytosol pour être dégradées. La glycoprotéine US3 empêche une bonne

présentation des peptides via le CMH-II car elle se lie aux hétérodimères de classe II, ce qui

diminue l’association à la chaine invariable li. Cette chaine joue un rôle dans l'expression des

molécules du CMH-II à la surface cellulaire et dans leur transport cellulaire (Hegde, Tomazin et

al. 2002; Hegde and Johnson 2003).

Le HCMV possède aussi un homologue de l’interleukine 10 (cmvIL-10) qui est capable de

réduire l’expression en surface des molécules du CMH (I et II) et d’empêcher la production de

cytokines pro-inflammatoires (Kotenko, Saccani et al. 2000; Slobedman, Barry et al. 2009).

iv. Les cellules NK "Natural Killer":

La spécificité de ces cellules est d’être capable de lyser les cellules infectées sans nécessiter

d’activation préalable et sans rentrer en contact avec l’agent pathogène. Elles tuent les cellules

cibles en faisant intervenir les molécules du CMH de classe I. La régulation négative du CMH-I

par le HCMV rend les cellules plus sensibles à la lyse par les cellules NK (Jackson, Mason et al.

2011).

Six gènes du HCMV codant pour les protéines virales UL16, UL18, UL40, UL83, UL141 et

UL142 et un microARN (miR-UL112) ont été identifiés comme capables de supprimer la

reconnaissance par les cellules NK (Figure 10). L’infection par le HCMV stimule l'expression de

ligands pour le récepteur NKG2D (Natural-killer group 2, member D) des cellules NK. Les

40

protéines UL16, UL142 et le miR-UL112 sont capables de supprimer la présentation de ces

ligands à la surface cellulaire. En effet, UL16 se lie à ces molécules et les séquestre dans le

cytosol, ce qui empêche l’activation des cellules NK (Wilkinson, Tomasec et al. 2008). Le HCMV

exprime aussi la protéine UL18, un homologue du CMH-I. UL18 peut former un complexe

trimérique avec le β2-microglobuline et le peptide endogène qui mime le CMH-I (Fahnestock,

Johnson et al. 1995). Le récepteur LIR-1 (leucocytes Ig-like 1) reconnaît le CMH-I et est

également capable d'interagir avec UL18 (Cosman, Fanger et al. 1997). Cependant, LIR-1 a une

affinité plus élevée (1000 fois) pour UL18 que pour les molécules du CMH de classe I

(Chapman, Heikeman et al. 1999). La liaison de LIR-1 à UL18 prévient l’activation des cellules

NK (Natural Killer) (Prod'homme, Griffin et al. 2007).

La protéine UL40 régule positivement l'expression de HLA-E, une molécule du CMH-I qui inhibe

la fonction des cellules NK. Cette molécule est transportée à la surface cellulaire et ensuite elle

se fixe à un récepteur inhibant les cellules NK (CD90/NKG2A).

Le miR-UL112 diminue l’expression à la surface cellulaire d’une protéine non classique du CMH,

MICB (MHC class I-related chain B). Cette protéine se lie au récepteur NKG2B, ce qui active les

cellules NK (Stern-Ginossar, Elefant et al. 2007).

Les protéines UL141 et UL142 ont une fonction d’évasion aux cellules NK. UL141 est capable

de séquestrer le CD155 dans le RE. Lors de l’infection par le HCMV, le CD155 est exposé à la

surface des cellules infectées, où il peut être reconnu par les récepteurs des cellules NK, CD226

et CD96 (Tomasec, Wang et al. 2005). UL142 a une similarité avec la protéine UL18,

l’homologue du CMH-I. De plus, il a été démontré qu’elle régule négativement l'expression à la

surface cellulaire du récepteur des cellules NK, NKG2DL MICA (Wilkinson, Tomasec et al.

2008). La protéine pp65 (UL83) est aussi capable de se lier à un récepteur activant des cellules

NK, NKp30, afin de bloquer l'activation des cellules NK (Arnon, Achdout et al. 2005; Wilkinson,

Tomasec et al. 2008).

41

Figure 10 : Modulation de la réponse des cellules NK par le HCMV. Plusieurs protéines virales inhibent la reconnaissance par les cellules NK. UL16 se lie au CMH-I et II et bloque leur interaction avec le récepteur NKG2D, ce qui empêche l’activation des cellules NK. Le récepteur inhibant les cellules NK, LIR-1 se lie à UL18, ce qui prévient l’activation des cellules NK. UL40 régule positivement l'expression de HLA-E, qui se fixe à un récepteur inhibant les cellules NK (CD90/NKG2A). La protéine pp65 se lie et bloque le récepteur NKp30, un récepteur activateur des cellules NK. D’après (Michel-Sohn 2011).

I. Latence

Comme pour tous les Herpesvirus, la latence du HCMV est maintenue à vie chez tous ceux qui

ont contracté une infection primaire. Lors de l'infection latente, le génome viral est présent dans

les cellules mononuclées, avec environ une dizaine de copies de génome par cellule infectée

(Slobedman and Mocarski 1999). Lors de la latence, l’ADN viral peut être détecté dans de

nombreux types cellulaires, y compris les cellules souches hématopoïétiques (Reeves, MacAry

et al. 2005), les monocytes, les macrophages (Taylor-Wiedeman, Sissons et al. 1991;

Soderberg, Larsson et al. 1993), les lymphocytes (Schrier, Nelson et al. 1985), les cellules

dendritiques immatures (DC) (Senechal, Boruchov et al. 2004), et les cellules endothéliales

(Sinzger, Grefte et al. 1995). Suite à des stimuli extérieurs, conduisant par exemple à la

différenciation des cellules, le virus peut entrer dans une phase productive qui conduira à la

synthèse de nouveaux virions (Sinclair 2010).

De nombreuses études ont montré que l’infection latente est associée à une modulation majeure

de la transcription des gènes cellulaires, de la signalisation cellulaire, ainsi qu’à l’inhibition de la

réponse immune et de la mort cellulaire. Cependant, seule l’expression de quelques produits de

gènes a été associée avec la latence d’HCMV. Parmi ces gènes, on trouve un homologue de

l'interleukine-10 codée par le virus, le LAcmvIL-10. En fait, le HCMV exprime deux isoformes

42

homologues d’IL10, l’un spécifique de la latence LAcmvIL-10, et l’autre exprimé durant le cycle

lytique cmvIL10. L’expression de LAcmvIL-10 permet au virus d’éviter la reconnaissance

immunitaire et l’élimination du virus au cours de la latence (Jenkins, Abendroth et al. 2004). La

protéine virale appelée LUNA (latency unique nuclear antigen), qui s’accumule durant la latence,

a un rôle dans la réactivation et dans la régulation positive du transcrit viral UL138 (Bego,

Maciejewski et al. 2005; Keyes, Hargett et al. 2012). La protéine UL138 également exprimée au

cours de la latence, est un inducteur de l’expression du TNFR1 (Tumor Necrosis Factor

Receptor 1), et est nécessaire pour que le virus établisse et maintienne une infection latente

dans les cellules hématopoïétiques infectées in vitro (Goodrum, Reeves et al. 2007).

De nombreuses modifications du transcriptome cellulaire se produisent au cours de la latence. Il

a été montré récemment que des microARN (miRNA) cellulaires et viraux sont impliqués dans la

régulation de l’expression des gènes. Beaucoup d’herpesvirus codent des miRNA et la majorité

des miRNA viraux connus à ce jour ont été identifiés chez des herpesvirus (Grey 2015).

Actuellement, 24 miRNA ont été identifiés chez le HCMV (Tuddenham and Pfeffer 2011) et 8

d’entre eux seraient exprimés au cours de la latence (Fu, Gao et al. 2014). L’expression du

miRUL112-1 permet la diminution de l’expression d’IE72, une protéine virale très précoce

transactivatrice, et pourrait avoir ainsi un rôle dans l’établissement de la latence (Grey, Meyers

et al. 2007). Le miRNA 112-1 entraine aussi la dégradation de l’ARNm de la molécule MICB

(c’est un ligand, induit par le stress, du récepteur NKG2D des cellules NK) réduisant ainsi l’effet

toxique des cellules NK (Stern-Ginossar, Elefant et al. 2007). Une autre étude a mis en évidence

une coopération possible entre ce miRNA viral et un miRNA cellulaire pour inhiber plus

efficacement l’expression de MICB (Nachmani, Lankry et al. 2010).

De nombreux miRNA cellulaires sont également modulés au cours de la latence, probablement

plus d’une cinquantaine (Fu, Gao et al. 2014). La protéine virale LAcmvIL-10 augmente la

sécrétion de l’IL-10 cellulaire et de la chimiokine CCL8 (chemokine (C-C Motif) Ligand 8), en

diminuant l’expression du miRNA cellulaire hsa-miR-92a (Poole, Avdic et al. 2014). L’expression

d’IL-10 pourrait contribuer au maintien du génome viral dans les cellules CD34+ et protéger les

cellules de l’apoptose. La famille du miR-200 cellulaire a également été impliquée dans la

latence, en interagissant avec l’ARNm d’IE86 et en diminuant son expression au cours de

l’infection (O'Connor, Vanicek et al. 2014). Elle pourrait aussi intervenir dans la réactivation.

43

2. LES PROTEINES IRS1 ET TRS1 DU HCMV

A. Généralités

Les protéines IRS1 et TRS1 sont les produits de deux gènes très précoces ; respectivement

IRS1 et TRS1. Elles sont présentes dans le tégument du virion et sont donc libérées dans la

cellule immédiatement après l'infection (Romanowski, Garrido-Guerrero et al. 1997). Elles

peuvent être détectées dans les cellules infectées dès 2 h après l'infection. Elles s’accumulent

et atteignent un niveau maximal durant la phase tardive de l’infection (Romanowski and Shenk

1997).

B. Structure

Les deux gènes IRS1 et TRS1 codent respectivement pour deux protéines de 847 et 795 acides

aminés. IRS1 s’étend depuis une séquence répétée interne vers le domaine unique short et

TRS1 s’étend depuis une séquence répétée terminale vers le même domaine unique short

(Figure 11). L’expression de leur ARNm est contrôlée par deux promoteurs identiques localisés

dans le domaine répété, et activés pendant la phase très précoce du cycle viral.

A.

B.

Figure 11 : Organisation et structure d’IRS1/TRS1.

A. Localisation des gènes dans le génome du HCMV. B. Organisation des protéines. dsRNA BD :

double-stranded RNA binding domain. PKR BD : PKR binding domain.

Elles sont identiques dans leurs 549 premiers acides aminés situés dans la région N-terminale,

codée par les domaines répétés. En revanche, elles sont différentes dans leur région C-

terminale, encodée par le domaine unique court. Bien que leurs régions C-terminales soient

différentes, elles restent néanmoins identiques à 55% dans la région divergente (Romanowski

and Shenk 1997). Les protéines sont localisées dans le noyau et le cytoplasme des cellules

44

infectées durant la phase très précoce et principalement dans le cytoplasme durant la phase

tardive du cycle viral. Les deux protéines possèdent un domaine de liaison à l’ARNdb dans leur

région N-terminale et un domaine d’interaction avec la kinase PKR dans leur région C-terminale

(Figure 11). Un transcrit alternatif d'IRS1, IRS1263, codé par les 263 acides aminés de l'extrémité

carboxyl d’IRS1, est également présent dans la cellule infectée. Le transcrit du gène IRS1263 agit

comme un répresseur de l'expression des gènes dans des essais de transfection transitoire. Il

serait un antagoniste de plusieurs transactivateurs transcriptionnels viraux (Romanowski and

Shenk 1997).

C. Fonctions

i. Inhibition de la kinase PKR

La kinase PKR peut être activée soit par l’ARNdb, soit par la protéine PACT (PKR-Activating

Protein) (Figure 12). Une fois activée, PKR se dimérise, s’autophosphoryle puis elle phosphoryle

le facteur d’initiation de la traduction eIF2 ( subunit of the eucaryotic translation initiation

factor 2), le rendant inactif ce qui entraîne l'inhibition de la synthèse protéique au niveau de

l'initiation de la traduction. L’activation de PKR a également été décrite comme impliquée dans

l’induction de l’apoptose et l’activation de l’autophagie (voir chapitre 3). HSV-1 code deux

protéines virales pouvant bloquer la phosphorylation d’eIF2, afin de rétablir la synthèse

protéique (Figure 12). Le HCMV utilise les protéines IRS1 et TRS1 pour bloquer directement

PKR.

Figure 12 : Voie de signalisation PKR et sa régulation par HCMV et HSV-1 Au cours de l’infection, l’ARN double brin et les IFN de type I vont activer la kinase PKR. L’activation de

PKR entraine la phosphorylation d’eIF2, un facteur d’initiation de la traduction, ce qui est responsable d’un arrêt de la synthèse protéique et d’un déclenchement de l’apoptose et de l’autophagie. Plusieurs

45

protéines virales d’HSV-1 et de HCMV sont capables de bloquer cette voie : les protéines IRS1 et TRS1

du HCMV et US11 d’HSV-1 bloquent directement PKR. ICP4.5 se lie à la phosphatase 1 alpha (PP1), ce

qui entraine la déphosphorylation d’eIF2.

Il a été montré que chez un virus mutant de la vaccine qui n’exprime pas la protéine E3L (qui a

la propriété d’inhiber la voie PKR-eIF2α chez le virus de la vaccine), l’expression d’IRS1 ou de

TRS1 rétablit sa réplication. Au cours de l’infection par HSV-1, ICP34.5 se lie à la phosphatase

1 alpha (PP1), ce qui entraine la déphosphorylation d’eIF2 (Figure 12). L’expression de TRS1

ou d’IRS1 dans les premières heures de l'infection peut également rétablir l’infection productive

d’un virus mutant HSV-1 Δγ134.5 (Cassady 2005). TRS1 et IRS1 vont empêcher la

phosphorylation d’eIF2α, l'arrêt de la synthèse protéique et l’activation de la RNase L. Ce

mécanisme nécessite, en plus du domaine de liaison à l’ARNdb, le domaine de liaison à PKR

situé dans le domaine C-terminal de TRS1 et d’IRS1 (Child, Hakki et al. 2004; Hakki and

Geballe 2005). Les deux protéines agissent indépendamment l’une de l’autre.

L’expression de ces deux protéines au cours de l’infection semble également entrainer une

accumulation de PKR dans le noyau, sous forme inactive non phosphorylée. Comme elles

interagissent directement avec PKR, elles inhiberaient son activation, en séquestrant PKR dans

le noyau, loin de son activateur, l’ARNdb et de son substrat, eIF2α (Hakki, Marshall et al. 2006).

Chez le CMV murin (MCMV), les protéines m142 et m143 ont des fonctions similaires à TRS1 et

IRS1 et permettent aussi le rétablissement de la réplication du virus de la vaccine VVΔE3L. Les

deux protéines agissent cette fois-ci ensemble en se liant à l’ARNdb et en bloquant l’activation

de PKR. Elles sont toutes les deux essentielles pour la réplication virale. Il a été montré qu’un

virus mutant qui n’a pas l’une de ces deux protéines induit l’activation de la voie PKR et la

phosphorylation d’eIF2α, ce qui a pour résultat l’inhibition de la réplication virale (Child, Hanson

et al. 2006; Valchanova, Picard-Maureau et al. 2006; Child and Geballe 2009).

Contrairement à ces deux protéines murines, ni IRS1 ni TRS1 ne sont essentielles pour la

réplication du HCMV. Le virus mutant qui n’exprime pas IRS1 (IRS1) se multiplie de la même

façon que le virus sauvage (Jones and Muzithras 1992; Dunn, Chou et al. 2003). Les résultats

sont discordants concernant la multiplication du virus mutant TRS1 mais il semble que TRS1

soit impliqué dans l'assemblage du virion (Adamo, Schroer et al. 2004). Le virus mutant HCMV

I/T, n’exprimant ni TRS1 ni IRS1, ne se réplique pas car il n’est pas capable d’empêcher

l’arrêt de la synthèse protéique et l’activation de la voie PKR (Marshall, Bierle et al. 2009).

46

La propriété de TRS1 comme antagoniste de PKR est dépendante de l’espèce. Child et al ont

montré que la protéine TRS1 du HCMV (HuTRS1) ne bloque pas PKR dans des cellules de

singe (Child, Brennan et al. 2012). Inversement, le TRS1 du cytomégalovirus de singe rhésus

(RhTRS1) remplit ces fonctions dans des cellules de singe vert Africain, mais pas dans des

cellules humaines. Les deux protéines TRS1 (humain et rhésus) se lient à l'ARNdb et peuvent

restaurer la réplication du virus de la vaccine VVΔE3L. Elles se lient aussi à PKR mais, alors

que HuTRS1 se lie à PKR humain et empêche son autophosphorylation, RhTRS1 se lie

uniquement à PKR phosphorylée du singe vert africain. Ces résultats suggèrent que le blocage

de l’activité de PKR contribue à la spécificité d’espèces des cytomégalovirus (Child, Brennan et

al. 2012).

ii. Activité transactivatrice

Il a été rapporté qu’IRS1 et TRS1 activent la transcription, en coopération avec d'autres

activateurs viraux. Au cours de transfections transitoires, il a été montré que les deux protéines

stimulent l'expression d’UL54 (l’ADN polymérase) en association avec les protéines très

précoces IE1 et IE2 (Stasiak and Mocarski 1992; Kerry, Priddy et al. 1996).

Les protéines IRS1 et TRS1 interagissent avec UL44 (la protéine accessoire de l’ADN

polymérase), via leur région identique N-terminale. Toutefois, l’extrémité de cette région (résidus

1-73) n’est pas nécessaire pour cette liaison. IRS1 et TRS1 ne s’associent pas simultanément

avec UL44, suggérant qu’elles entrent potentiellement en compétition pour cette interaction.

Etant donné que TRS1, IRS1 et UL44 sont tous impliqués dans l’expression des gènes viraux,

IRS1 ou TRS1 pourrait agir comme co-facteur de transcription avec UL44 (Strang, Geballe et al.

2010). Stasiak et al ont montré qu’une des deux hypothèses pour expliquer cette activité

transactivatrice de TRS1 sur UL44 est que les protéines IE1 et IE2 activent l'expression du gène

TRS1 dans une quantité suffisante pour influencer l'expression d’UL44. L’autre hypothèse serait

qu’il existe une interaction entre les trois protéines dans l'activation du promoteur d'UL44

(Stasiak and Mocarski 1992).

Il a été montré récemment que la protéine TRS1 est capable de se lier à la coiffe des ARNm

pour faciliter leur traduction. En effet, elle augmente le niveau total de la synthèse protéique, et

elle s’associe avec les complexes actifs de l’initiation de la traduction dans les cellules infectées

par le HCMV. Cette activité de TRS1 est dépendante ou indépendante de la kinase PKR (Ziehr,

Lenarcic et al. 2015).

47

3. L’AUTOPHAGIE

A. Généralités sur l’autophagie : historique et définition

Le terme autophagie vient du grec et signifie se manger soi-même : “phagos”: manger “auto”

soi-même. L’autophagie englobe un ensemble de processus aboutissant à la dégradation de

constituants cellulaires, organites et macromolécules, par le lysosome. Ce processus est une

voie de catabolisme des protéines à longue durée de vie, complémentaire de la voie du

protéasome, impliquée dans la dégradation de protéines à demi-vie courte. Par sa fonction de

dégradation et de recyclage, l’autophagie joue un rôle important dans l’homéostasie des

cellules.

Ce mécanisme a été découvert par Christian de Duve et Robert Wattiaux dans les années 1960,

dans la continuité de la découverte du lysosome (Codogno 2004). Christian de Duve a observé

en microscopie électronique des vésicules à simple ou double membranes, contenant des

éléments du cytoplasme, incluant des organites telles que des mitochondries, à différents stades

de digestion (Klionsky 2007). Il a été le premier, en 1963, à utiliser le mot autophagie, afin de

décrire ce phénomène (Klionsky 2007). Le terme hétérophagie, qui regroupe les mécanismes

d’endocytose et de phagocytose, mécanismes qui prennent en charge la dégradation du

matériel extracellulaire et des protéines de la membrane plasmique, s’oppose à celui

d’autophagie.

Dès 1962, il a été montré que des changements morphologiques se produisent dans la cellule,

en réponse aux hormones. En effet, des organites séquestrés dans des vésicules ont été

observés dans le foie de rats, suite à leur exposition au glucagon (Ashford and Porter 1962).

Christian de Duve confirmera, plusieurs années après, que le glucagon induit l’autophagie

(Deter, Baudhuin et al. 1967). Dix ans après, on met en évidence que l’insuline et les acides

aminés ont des effets inhibiteurs de l’autophagie (Mortimore and Schworer 1977; Pfeifer 1977).

La 3-méthyladénine (3-MA) a été identifiée en 1982 comme inhibiteur pharmacologique de

l’autophagie (Seglen and Gordon 1982) et l’implication des protéines kinases et phosphatases

dans la régulation de l’autophagie sera montré par la même équipe dix ans plus tard (Holen,

Gordon et al. 1992). Le gène codant pour la kinase TOR (Target Of Rapamycin) a été isolé chez

les levures en 1993 (Kunz, Henriquez et al. 1993) et chez les mammifères en 1994 (mTOR pour

mammalian Target Of Rapamycin). L’observation que la rapamycin, un inhibiteur de mTOR,

stimule l’autophagie a permis de montrer que mTOR est impliquée dans la régulation de

l’autophagie (Blommaart, Luiken et al. 1995). Le même groupe découvrira que la wortmannine,

un inhibiteur de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), inhibe l’autophagie (Blommaart, Krause

48

et al. 1997). Le groupe de Patrice Codogno montrera l’existence de deux différentes classes de

PI3K ; la PI3K de classe I, qui inhibe l’autophagie et la PI3K de classe III, qui la stimule (Petiot,

Ogier-Denis et al. 2000).

C’est chez la levure Saccharomyces cerevisiae que l’on va initialement identifier les gènes ATG

(AuTophaGy-related genes) de l’autophagie dans les années 1990, ce qui a permis de faire

décoller la recherche dans ce domaine. Cette découverte a apporté une meilleure

compréhension de la fonction physiologique et physiopathologique de ce processus (Tsukada

and Ohsumi 1993; Klionsky, Cregg et al. 2003). Une quarantaine de ces gènes régulateurs de

l’autophagie sont actuellement connus et les homologues des gènes ATG de la levure ont été

identifiés chez les mammifères. Ces gènes sont conservés au sein des cellules eucaryotes

(Rubinsztein, Shpilka et al. 2012).

Il existe trois types d’autophagie, conduisant à la dégradation de portions du cytoplasme : la

macroautophagie, la microautophagie et l’autophagie médiée par les protéines chaperonnes

(CMA) (Figure 13). La macro- et la microautophagie sont conservées de la levure à l'homme,

alors que la CMA a été seulement retrouvée chez les mammifères (Okamoto 2014).

Figure 13 : Les différentes formes d’autophagie. (a) Durant la macroautophagie, des vésicules à double membrane appelées autophagosomes se forment pour transporter des composants cellulaires vers le lysosome afin d’être dégradés. (b) Au cours de l’autophagie dépendante des protéines chaperonnes (CMA), les protéines présentant des motifs spécifiques sont reconnues par des protéines chaperonnes et ensuite transportées vers le lysosome par

49

la protéine lysosomale Lamp2a. (c) Au cours de la microautophagie la membrane lysosomale s’invagine pour séquestrer une partie du contenu du cytoplasme des cellules (Boya, Reggiori et al. 2013).

La macroautophagie, appelée communément, et dans la suite de ce document, autophagie,

entraine la formation de vésicules à double membrane, les autophagosomes, qui séquestrent

une portion de cytoplasme. Plus tard, l’autophagosome fusionne avec l’endosome ou le

lysosome, pour former respectivement un amphisome ou un autolysosome dans lequel le

contenu intracellulaire et la membrane interne de l’autophagosome sont dégradés par des

hydrolases lysosomales (Feng, He et al. 2014).

La microautophagie est une séquestration directe de portions du cytoplasme ou d’organites à

l’intérieur des lysosomes. Cette séquestration se produit grâce à des invaginations aléatoires de

la membrane du lysosome (Li, Li et al. 2011; Mijaljica, Prescott et al. 2011; Li, Li et al. 2012).

Les vésicules contenant les substrats autophagiques seront enfermées dans la lumière

lysosomale afin d’être dégradées par les hydrolases lysosomales (Cuervo and Wong 2014).

La macro et la microautophagie ont été considérées pendant longtemps comme des processus

de dégradation non sélectifs (bulk autophagy) emprisonnant au hasard des portions du

cytoplasme. Cependant, les deux formes peuvent être très sélectives, ce qui permet d’éliminer

spécifiquement des organites endommagés ou des agrégats protéiques (Okamoto 2014; Rogov,

Dotsch et al. 2014). On parle alors d’organellophagie. Parmi les autophagies sélectives, on

distingue la mitophagie (Ding and Yin 2012; Ashrafi and Schwarz 2013; Feng, Liu et al. 2013),

qui désigne la dégradation sélective des mitochondries, la pexophagie, pour dégrader les

peroxysomes (Manjithaya, Nazarko et al. 2010; Oku and Sakai 2010), la ribophagie pour les

ribosomes (Kraft, Deplazes et al. 2008) ou encore la réticulophagie, pour cibler le RE (Bernales,

Schuck et al. 2007). Il existe aussi l’agréphagie, qui dégrade sélectivement les agrégats

protéiques. La lipophagie intervient dans le métabolisme des lipides contenus dans les

gouttelettes lipidiques (Ding, Li et al. 2010; Liu and Czaja 2013). Il existe d’autres formes

d’autophagie selective comme la lysophagie pour dégrader des lysosomes (Hung, Chen et al.

2013; Maejima, Takahashi et al. 2013), la nucleophagie pour les noyaux (Mijaljica and Devenish

2013) et la xénophagie qui désigne la dégradation spécifique d’éléments « étrangers » à la

cellule que sont les micro-organismes intracellulaires (Levine 2005; Rogov, Dotsch et al. 2014).

Les composants intracellulaires qui seront sélectivement dégradés par autophagie sont

identifiés et reconnus par l’intermédiaire de protéines adaptatrices, comme les protéines

p62/SQSTM1, NBR1, NDP52 et BNIP3L. (Okamoto 2014; Rogov, Dotsch et al. 2014; Stolz,

Ernst et al. 2014). Ces protéines cargo reconnaissent sélectivement leurs substrats et les

50

emmènent dans les autophagosomes. Par exemple, la protéine p62 se lie d’un côté à des

bactéries ubiquitinylées et de l’autre à la protéine LC3.

La CMA est aussi une forme sélective d'autophagie (Kaushik and Cuervo; Kaushik and Cuervo

2012). Les substrats protéiques se lient à la protéine hsc70 (Heat Shock Cognate protein 70),

une protéine chaperonne cytosolique, puis à une protéine lysosomale transmembranaire

LAMP-2A (Lysosome-Associated Membrane Protein type 2A). La reconnaissance des substrats

de la CMA par Hsc70 nécessite la présence d’un motif KFERQ dans la protéine substrat.

Ensuite ils s’acheminent jusqu’au lysosome où ils se lient à la queue cytoplasmique de

LAMP-2A. Le complexe est ensuite transporté dans la lumière du lysosome, où la protéine

substrat va être dégradée (Arias and Cuervo 2011; Li, Yang et al. 2011; Cuervo and Wong

2014).

Je vais me focaliser dans le reste du document sur la macroautophagie, que j’appellerai donc

simplement autophagie.

B. Mécanisme moléculaires de l’autophagie

Il y a trois étapes importantes dans la machinerie autophagique: i. l’initiation et la nucléation (ou

la formation du phagophore); ii. l’élongation de l’autophagosome et sa fermeture; iii. la

maturation (Figure 14).

Figure 14 : Les différentes étapes de l’autophagie: L’autophagie se déroule en 3 étapes : initiation avec biogénèse de la membrane et mise en place des complexes, élongation du phagophore et fermeture des bords de la membrane pour former l’autophagosome, maturation avec fusion de l’autophagosome avec le lysosome, pour dégrader le contenu

51

i. Initiation et formation du phagophore

Origine du phagophore

Lors de l’étape initiale, les composants cytoplasmiques sont enveloppés par une membrane,

appelée phagophore très riche en phosphatidylinositol-3-phosphate (PI3P). L’origine de la

membrane du phagophore fut un sujet de discussion pendant longtemps. Il semblerait que cette

membrane ne soit pas synthétisée de novo mais provienne d’organites préexistants. Il existe un

certain nombre de candidats, ce qui supporte l'hypothèse de l’origine multiple de cette

membrane, comme le RE, les mitochondries, l’appareil de Golgi, les endosomes, ou encore la

membrane plasmique (Shibutani and Yoshimori 2014) (Figure 15).

Figure 15. Origine du phagophore ou la membrane d’isolation Diverses organites, y compris le réticulum endoplasmique (ER), les mitochondries, les membranes associées aux mitochondries (MAMs), l'appareil de Golgi, la membrane plasmique et les endosomes de recyclage sont impliqués dans la formation de l’autophagosome (dans la nucléation du phagophore, appelé aussi isolation membrane) (Lamb, Yoshimori et al. 2013).

L’hypothèse la plus probable est qu’elle dérive d’une région particulière du RE, enrichie en PI3P.

Axe et al ont caractérisé ces structures riches en PI3P qui bourgeonnent à partir des

membranes du RE, les omégasomes (Figure 16). Ils ont montré que, suite à une carence en

acides aminés, la protéine DFCP1 (double FYVE domain-containing protein 1), localisée dans le

RE et capable de se lier au PI3P, colocalise avec ces anneaux en forme de Ω riche en PI3P

(Axe, Walker et al. 2008). La protéine WIPI (WD-repeat protein interacting with

phosphoinositides), l’orthologue d’Atg18, est aussi recrutée et se lie avec le PI3P (Polson, de

Lartigue et al. 2010). Ces omégasomes forment comme un berceau pour la naissance du

phagophore (Shibutani and Yoshimori 2014) (Figure 16). Des études tomographiques en

52

microscopie électronique ont confirmé la relation entre RE, omégasome et phagophore

(Hayashi-Nishino, Fujita et al. 2009; Yla-Anttila, Vihinen et al. 2009).

La mitochondrie pourrait elle aussi être à l’origine du phagophore. Il a été observé que, suite à la

carence, des membranes positives en LC3 colocalisent avec une protéine de la membrane

externe de la mitochondrie et que des lipides sont transférés des mitochondries aux

autophagosomes (Hailey, Rambold et al. 2010).

L’équipe de Rubinsztein a proposé que la membrane plasmique puisse également intervenir

dans la biogénèse des autophagosomes, et plus précisément dans la formation des structures

pré-autophagosomales, par un mécanisme d’endocytose dépendant de la clathrine (Ravikumar,

Moreau et al. 2010) (Figure 15). Une autre étude a montré que la protéine VAMP7 et ses

partenaires SNAREs (syntaxine 7, 8 et Vti1b) sont localisés dans des vésicules marquées par

Atg16L, et contrôlent la fusion homotypique de ces vésicules.

Enfin, l’appareil de Golgi serait une source de membrane pour la formation des

autophagosomes chez la levure (van der Vaart, Griffith et al. 2010) et chez les mammifères

(Guo, Chang et al. 2012). L’ERGIC est aussi un autre candidat pour la formation de

l’autophagosome (Ge, Melville et al. 2013).

La protéine Atg9 intervient aussi au cours des premières étapes de la formation de

l’autophagosome chez les levures (Yamamoto, Kakuta et al. 2012). (Orsi, Razi et al. 2012). Puri

et al. ont montré que les vésicules d’Atg9 se déplacent de la membrane plasmique à l'endosome

de recyclage. Elles s’associent avec ATG16L1 dans les endosomes avant la formation de

l’autophagosome lors de l’induction d l’autophagie (Puri, Renna et al. 2013).

Il existe deux complexes qui régulent l’étape d’initiation : le complexe ULK, sous la dépendance

de mTORC1, et le complexe Beclin 1/PI3K de classe III (Figure 16).

53

Figure 16 : Formation de l’omégasome et de l’autophagosome. En conditions basales, le complexe mTORC1 régule négativement l’autophagie. Lors d’une carence nutritionnelle, le complexe ULK1 (composé de ULK1-Atg13-FIP200-Atg101) se relocalise au niveau du RE pour activer le complexe PI3K de classe III (composé de Beclin 1-Atg14-AMBRA1-Vps15-Vps34 (PI3K de classe III). Cette étape entraîne la génération de PI3P et le recrutement des protéines effectrices de PI3P, WIPI1 et DFCP1 au niveau de l’omégasome. Les complexes Atg12-Atg5-Atg16L et LC3-PE interviennent ensuite dans la formation de l’autophagosome. Atg9L participe également à l’initiation de la formation de l’autophagosome. D’après (Mizushima and Komatsu 2011).

Complexe initiateur de l’autophagie

Chez les mammifères, le complexe initiateur de l'autophagie est composé d’ULK1/2 (homologue

d’Atg1 chez la levure), FIP200 (Atg17), Atg13 et Atg101 (Mercer, Kaliappan et al. 2009). ULK1

est une sérine-thréonine kinase contrôlé par la protéine mTOR. Cette dernière, et plus

précisément le complexe 1 (mTORC1), est impliquée dans la régulation négative de

l’autophagie et est sensible à l’état nutritionnel de la cellule. Le complexe ULK1-Atg13-FIP200-

Atg101 est constitutivement formée dans le cytosol, indépendamment des conditions

nutritionnelles. En conditions riches en nutriments, mTORC1 est associée à ce complexe.

mTORC1 phosphoryle et inhibe ULK1/2 et Atg13 et empêche l'initiation de l'autophagie

(Ravikumar, Sarkar et al. 2010). En condition de carence nutritionnelle ou en présence de

rapamycin (inhibiteur de mTOR), mTORC1 se dissocie du complexe, ce qui permet la

déphosphorylation d’Atg13 et d’ULK1. Cette étape induit l’autophosphorylation et l’activation

54

d’ULK1 (Hosokawa, Hara et al. 2009). ULK1 va à son tour phosphoryler Atg13, FIP200 (Yeh,

Wrasman et al. 2010) et activer l'initiation de l'autophagie (Mizushima 2010) (Figure 17). La

protéine Atg101 interagit avec Atg13 et permet sa stabilisation. Récemment, il a été montré que

ULK1 activée, suite à la carence nutritionnelle et l'inhibition de mTOR, se lie à Atg14L et

phosphoryle Beclin-1 à la position Ser 14, augmentant ainsi l'activité du complexe Beclin 1/PI3K

de classe III/ ATG14L. Cela indique qu’ULK1 forme un lien entre l'activation du complexe

autophagique Vps34 et l’induction de l’autophagie (Russell, Tian et al. 2013). La protéine

AMBRA1 (Activating Molecule in Beclin 1 Regulating Autophagy) régule l’activité et la stabilité

de ULK1, en plus de se lier à Beclin 1 et de réguler sa localisation (Nazio, Strappazzon et al.

2013; Russell, Tian et al. 2013).

Figure 17 : Régulation du complexe ULK par mTOR Quand les nutriments sont présents, mTOR est responsable de la phosphorylation d’ULK1/2 et sa séquestration, inhibant donc l’autophagie. En cas de carence nutritionnelle, l’inhibition de mTOR libère et déphosphoryle ULK1/2 et Atg13. Ensuite, ULK1 phosphoryle lui-même, Atg13 et FIP200 et l’autophagie est stimulée comme résultat.

Chez les mammifères, ULK1 a un homologue proche, ULK2, mais leurs rôles relatifs ne sont

pas clairement établis. Il semble qu’ULK1 et ULK2 soient tous deux impliqués dans l’induction

de l’autophagie par la carence nutritionnelle (McAlpine, Williamson et al. 2013). La formation des

autophagosomes est inhibée uniquement en l'absence combinée d’ULK1 et ULK2.

Complexe Beclin 1/PI3K de classe III.

Ce complexe dénommé complexe « core » est constitué des protéines Vps34, Vps15 (Vacuolar

protein sorting 15 et 34) (Furuya, Yu et al. 2005), Beclin 1 (l’orthologue de la protéine Atg6 chez

la levure), et Atg14L (Itakura and Mizushima 2010).

La protéine Beclin 1 joue un rôle primordial dans l’autophagie en formant une sorte de

plateforme d’assemblage. L'invalidation de Beclin-1 par siRNA conduit à une inhibition de la

Actif

Nutriments

Inactif

En absence de nutriments

55

formation des autophagosomes (Liang, Lee et al. 2008). Cette protéine de 450 acides aminés

contient un domaine de liaison à Bcl-2 (BBD ou domaine BH3), un domaine en super hélice

coiled coil (CCD), un domaine conservé au cours de l’évolution (ECD) et un signal d’exportation

nucléaire (NES) (Figure 18). Le domaine NES de Beclin 1 permet son transport du noyau vers le

cytosol, la fraction cytosolique étant la seule régulant l’autophagie (Liang, Yu et al. 2001; Levine,

Liu et al. 2015). Beclin 1 recrute beaucoup de protéines et forme différents complexes et selon

les protéines associées, les complexes vont réguler l’autophagie de différentes façons. Cette

partie sera discutée en détail dans le paragraphe régulation de l’autophagie.

Beclin 1 (1-450 aa)

Figure 18 : Structure de la protéine Beclin 1. Représentation schématique de Beclin 1 et de ses différents domaines. BH3 (Bcl-2 homology 3).CCD (coiled coil domain) ECD (evolutionary conserved domain).

ii. Elongation et fermeture de l’autophagosome

L’élongation des membranes du phagophore nécessite deux systèmes de conjugaison

«ubiquitin-like» car ils s’apparentent au système d’ubiquitinylation des protéines. Le premier

étant composé des protéines Atg12–Atg5-Atg16L et le deuxième de la protéine LC3

(Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 ou MAP1LC3). L’élongation requiert aussi la

présence de la protéine Atg9 (Green and Levine 2014) (Figure 19).

Le premier système de conjugaison aboutit à la formation d’un complexe multimérique composé

des protéines Atg12–Atg5-Atg16L. Atg12 est conjuguée à Atg5 via l’action d’Atg7 (enzyme

ubiquitin-E1-like) et Atg10 (enzyme ubiquitin-E2-like). Le complexe Atg12-Atg5 est ensuite

associé à Atg16L pour former un large complexe Atg12-Atg5-Atg16L à la membrane de

l'autophagosome en élongation (Mizushima, Kuma et al. 2003). Le complexe Atg12–Atg5-

Atg16L1 recrute le deuxième système ubiquitin-like de LC3 à la membrane de l'autophagosome

et agit comme une enzyme E3-like (Romanov, Walczak et al. 2012).

Le deuxième système est celui de la protéine LC3, homologue d’Atg8. LC3 est une protéine

ubiquitin-like qui est d'abord clivée par Atg4 pour donner la forme LC3-I cytosolique. LC3-I est

ensuite conjuguée à un lipide, le phosphatidyl-éthanolamine (PE) grâce à Atg7 (enzyme E1-like)

et Atg3 (enzyme E2-like), ce qui donne la forme lipidée LC3-II. LC3-II est localisée au niveau

des membranes autophagosomales (Kabeya, Mizushima et al. 2000; Kabeya, Mizushima et al.

56

2004) et est largement utilisée comme marqueur de l'autophagie car elle reste associée aux

autophagosomes après la fermeture du phagophore (Kabeya, Mizushima et al. 2000).

Figure 19 : Le système de conjugaison de l’ubiquitine et les deux systèmes de conjugaison autophagique. a) L’enzyme E1 active l’ubiquitine qui passe d’E1 à E2. Un complexe formé entre la protéine de conjugaison E2 couplée à l’ubiquitine et la ligase E3 liée à la cible. Les chaines de polyubiquitine sont reconnues par le protéasome comme signal pour dégrader la cible. B) Dans le cas de l’autophagie il y a deux complexes le complexe Atg12–Atg5-Atg16L1 est formé par l’action des ligases E1 (Atg7) et E2 (Atg10). La forme conjuguée de LC3 à la phosphatidyléthanolamine (LC3-PE) est générée par le clivage de LC3 par Atg4, et l'action de la ligase E1 (Atg7) et la ligase E2 (ATG3) (Beau, Esclatine et al. 2008).

Chez les mammifères, au moins huit orthologues d’Atg8 ont été identifiés, répartis en trois sous

familles ; La famille LC3, constituée de LC3A, LC3B et LC3C ; la famille GABARAP, constituée

de GABARAP1, 2 et GABARAPL1 et la famille GATE-16 (GABARAPL2).

Ces sous-familles agissent à différents stades dans la biogenèse des autophagosome. Les

protéines LC3 sont impliquées dans l’élongation du phagophore alors que la sous-famille

GABARAP/GATE-16 est essentielle à un stade ultérieur, dans la maturation de

l’autophagosome (Weidberg, Shvets et al. 2010; Shpilka, Weidberg et al. 2011; Nath, Dancourt

et al. 2014).

57

iii. Maturation de l’autophagosome

L'autophagie se termine par une étape de maturation où les autophagosomes nouvellement

formés vont fusionner avec les endosomes précoces ou tardifs pour former des amphisomes

puis fusionner avec les lysosomes pour former les autolysosomes.

Plusieurs protéines interviennent dans la régulation de la fusion, comme les protéines ESCRT

(Endosomal Sorting Complex Required for Transport). Les protéines ESCRT ont été initialement

identifiées pour leur rôle dans le trafic et la biogenèse endosomale (Metcalf and Isaacs 2010).

Chez les mammifères et la drosophile, les mutants cellulaires pour ESCRT présentent une

accumulation des autophagosomes, causée par un blocage de la fusion des autophagosomes

avec le système endolysosomal (Manil-Segalen, Culetto et al. 2014). Chez C. elegans, en

revanche, l’absence d’ESCRT entraine une augmentation du flux autophagique. Certaines

protéines de la famille SNAREs (Soluble Nethylmaleimide sensitive factor Attachment protein

Receptor) et des protéines de la famille RAB sont aussi impliquées dans la fusion (Ganley,

Wong et al. 2011; Itakura, Kishi-Itakura et al. 2012). La protéine SNARE Syntaxin 17 (STX17)

est localisée au niveau de la membrane externe de l’autophagosome et interagit avec VAMP8

(vesicle-associated membrane protein 8), localisée sur le lysosome, par l’intermédiaire de

SNAP29, déclenchant ainsi la fusion des deux membranes (Figure 20). En plus de sa fonction

dans la biogenèse des autophagosomes, Atg14L apparaît dans les autophagosomes matures

où il interagit avec les protéines STX17 et SNAP29 pour promouvoir la liaison et la fusion

autophagosome-lysosome (Diao, Liu et al. 2015).

Figure 20 : La protéine SNARE STX17 permet la fusion autophagosome-lysosome. STX17 est recrutée au niveau des autophagosomes matures et interagit avec SNAP29 et VAMP8, ce qui conduit à la fusion entre la membrane autophagosomale externe et la membrane lysosomale (Itakura and Mizushima 2013).

58

Les protéines LAMP-1 et LAMP-2 jouent également un rôle dans la maturation des

autophagosomes. Le double knock-out de ces protéines empêche le transport via les

microtubules des lysosomes vers les régions périnucléaires où se produit la fusion (Eskelinen

2005; Saftig, Beertsen et al. 2008).

Le complexe Beclin 1-Vps34-Vps15-UVRAG intervient positivement dans l’étape de maturation

des autophagosomes. Lorsqu’UVRAG (UV irradiation resistance associated gene) se lie à Bif 1

(Bax-Interacting Factor 1), le complexe Beclin 1-Vps34-Vps15-UVRAG-Bif 1 stimule la

maturation de l’autophagosome. UVRAG est également capable de se lier à la protéine Rubicon

(Run domain cystein rich domain containing Beclin 1 Interacting protein) et dans cette situation

le complexe Beclin-1-Vps34-Vps15-UVRAG-Rubicon inhibe la maturation des autophagosomes

(Matsunaga, Noda et al. 2009; Matsunaga, Saitoh et al. 2009; Zhong, Wang et al. 2009). La

protéine UVRAG a également un rôle indépendant de son interaction avec Beclin 1. En effet,

elle est capable d’interagir avec la Vps de classe C, une protéine impliquée dans la fusion des

endosomes. Le complexe UVRAG-Vps-C stimule l’activité GTPase de Rab7 et promeut la fusion

des autophagosomes avec des endosomes tardifs ou des lysosomes (Liang, Lee et al. 2008).

C. Régulation de l’autophagie

L'autophagie est constitutivement active dans la cellule et l'activité autophagique dépend de

différents stimuli de stress tels que la privation d’éléments nutritifs comme les acides aminés ou

les facteurs de croissance, le stress consécutif aux organites endommagés, à une infection, une

hypoxie ou une contrainte mécanique. Ces signaux sont intégrés et régulés par différentes voies

de signalisation cellulaires.

i. Régulation de l’autophagie via la voie de signalisation mTOR

La voie mTOR est la principale voie inhibitrice de l’autophagie et aussi la voie la plus étudiée

(Figure 21). mTOR contrôle plusieurs voies de signalisation qui sont sensibles à la présence des

acides aminés, d’ATP, des facteurs de croissance, et le niveau d‘espèces réactives de l'oxygène

(ROS) et régule négativement l'autophagie (Singh and Cuervo 2011).

Il existe deux complexes de mTOR, le complexe mTORC1 sensible à la rapamycin et le

complexe mTORC2 insensible à la rapamycin. mTORC1 est le principal régulateur de

l'autophagie et comprend les protéines mTOR, Raptor (regulated associated protein mTOR),

PRAS40 (proline-rich Akt substrate of 40kDa), GL (G protein –subunit-like protein) et PRAS40

(proline-rich Akt substrate of 40 kDa) (Meijer, Lorin et al. 2014).

59

mTOR est régulé en amont par différentes voies de signalisation comme les acides aminés, la

protéine AMPK, les facteurs de croissances et l’insuline.

En présence de nutriments, mTORC1 est responsable de la phosphorylation d’ULK1 et de sa

séquestration, ce qui inhibe l’autophagie. L'activation de mTORC1 par des acides aminés fait

intervenir les petites GTPases de la famille Rag (Ras-related GTPases) qui interagissent

directement et spécifiquement avec ce complexe (Meijer and Codogno 2011). La protéine AMPK

(AMP-activated kinase) est un régulateur positif de l’autophagie agissant à différents niveaux.

Elle est sensible aux changements de rapport AMP/ATP dans la cellule. (Kahn, Alquier et al.

2005; Shaw 2009). En cas de carence, une diminution de la production d'ATP active l’AMPK, ce

qui entraine l’activation d’ULK1, l’inhibition de mTOR par phosphorylation (Kim, Kundu et al.

2011) et l’activation de TSC2 qui inhibe mTORC1 (Hardie 2004), ce qui provoque l’induction de

l’autophagie.

Figure 21 : Régulation de l’autophagie par la voie mTOR. Lors de la stimulation du récepteur de l’insuline par des facteurs de croissance, la voie de la PI3K de classe I est activée. Cette étape déclenche le recrutement de cette dernière à la membrane plasmique et entraîne la phosphorylation de PDK1 puis d’Akt, conduisant à la séparation du complexe TSC1/TSC2. Dans ce cadre, Rheb se libère de son interaction avec TSC2 et se fixe à mTORC1, induisant ainsi son activation. L’activation de mTORC1 a pour effet d’inhiber ULK1 et l’autophagie. Au contraire, l’activation de l’AMPK entraîne la phosphorylation de TSC2 et a pour conséquence une inhibition de mTORC1 et finalement une activation d’ULK1 et de l’autophagie (Ravikumar, Sarkar et al. 2010).

Les facteurs de croissance et l’insuline agissent par l’intermédiaire de la voie de signalisation de

la PI3K de classe I. Leur fixation à des récepteurs à la surface cellulaire entraîne la

60

phosphorylation de PDK1 et active Akt. Ce dernier va ensuite induire la séparation du complexe

TSC1/TSC2, ce qui inhibe l’autophagie (Ravikumar, Sarkar et al. 2010). Les voies suppresseur

de tumeur PTEN (phosphatase and TENsin homolog deleted on chromosome ten) inhibent la

PI3K de classe I et stimulent l’autophagie.

La rapamycin est une molécule très utilisée comme activateur de l’autophagie, car elle inhibe

l’activité kinase de mTORC1. Cette inhibition est médiée par la diminution de la phosphorylation

de ses substrats p70S6K et 4EBP1, ce qui libère ULK1, qui va ensuite phosphoryler FIP200

dans le complexe ULK1-Atg13-FIP200 (voir plus haut) (Jung, Jun et al. 2009).

ii. Le complexe Beclin 1/PI3K de classe III

Le complexe Beclin 1/PI3K de classe III est impliqué dans la régulation positive de l’autophagie,

et il est nécessaire pour la formation du phagophore, sa nucléation et son élongation. La

protéine Beclin 1 joue le rôle de plateforme, recrutant des protéines activatrices ou inhibitrices

de l’autophagie dans différents complexes qui agissent au niveau de la biosynthèse et de la

maturation des autophagosomes (Figure 22).

Figure 22 : Différents complexes Beclin 1-Vps34 et leurs fonctions (Funderburk, Wang et al. 2010).

Le complexe Beclin 1-Vps34-Vps15-Atg14L permet de générer le PI3P par phosphorylation du

phosphatidylinositol (PI). La production de PI3P est induite dans l’omégasome qui sert de

plateforme pour l’élongation du phagophore et la biogenèse de l’autophagosome (Shibutani and

Yoshimori 2014). PI3P est nécessaire pour le recrutement d’autres protéines comme DFCP1 et

WIPI1/2. Atg14L, ou Barkor (Beclin 1 interacting autophagy related key regulator), est essentiel

61

pour les étapes précoces de la formation des autophagosomes (Itakura and Mizushima 2010;

Matsunaga, Morita et al. 2010).

La protéine UVRAG, qui se lie au domaine CCD de Beclin 1 et à BIF 1 (Liang, Feng et al. 2006),

régule positivement l’activité de Vps34 dans les endosomes et les lysosomes (Itakura and

Mizushima 2009). Le complexe contenant UVRAG-Beclin 1-Vps34 a un rôle dans la maturation

autophagosomale (Matsunaga, Saitoh et al. 2009; Zhong, Wang et al. 2009). La protéine

RUBICON régule négativement l’autophagie (Zhong, Wang et al. 2009). Elle entre en

compétition avec la protéine Atg14L pour interagir avec Beclin 1. La protéine NRBF2 (nuclear

receptor binding factor 2), l'homologue mammifère d’Atg38, relie l'interaction entre Vps34 Vps15

et Beclin-1-Atg14 (Cao, Wang et al. 2014; Lu, He et al. 2014).

De nombreuses autres protéines régulent l’autophagie en se liant à Beclin 1 (Figure 23). Par

exemple, la protéine anti-apoptotique Bcl-2 régule négativement l’autophagie. Elle se lie

directement au domaine BH3 de Beclin 1, entrainant son inactivation (Pattingre, Tassa et al.

2005). Suite à une carence nutritive, la kinase JNK1 (c-Jun N-terminal protein kinase 1) est

activée et elle phosphoryle Bcl-2, conduisant à sa dissociation de Beclin 1 et à l’induction de

l’autophagie (Wei, Pattingre et al. 2008; Mizushima, Yoshimori et al. 2011).

D’autres protéines, comme VMP-1 (Vacuole Membrane Protein 1), se lient à Beclin 1 afin de

réguler positivement l’autophagie (Ropolo, Grasso et al. 2007). La protéine AMBRA1 est

également un régulateur positif du complexe Beclin 1/PI3K de classe III (Fimia, Stoykova et al.

2007). Suite à l’induction de l’autophagie, AMBRA1 est phosphorylée par ULK1, ce qui conduit à

la libération du complexe Beclin1 Vps34-Vps15-AMBRA1 du moteur dynéine dans les

microtubules au RE où les autophagosomes sont formées (Cianfanelli, De Zio et al. 2015).

Il a été montré qu’AMBRA1 régule la stabilité et l'activité kinase d’ULK1. En plus de la régulation

négative de mTOR sur ULK1 par phosphorylation directe, AMBRA1 peut également inhiber

indirectement la stabilité et l'activité d’ULK1. mTOR est capable ainsi d’inhibe spécifiquement la

phosphorylation d’AMBRA1, ce qui peut être levé lors de l’induction de l’autophagie (Nazio,

Strappazzon et al. 2013).

Certaines protéines virales sont aussi capables de réguler négativement l’autophagie en se liant

à Beclin 1, comme les homologues viraux de Bcl-2. En effet, les vBcl-2 des -herpesvirus se

lient, avec une affinité plus forte que le Bcl-2 cellulaire, à Beclin 1 au niveau du domaine BH3

(Liang, E et al. 2008; Sinha, Colbert et al. 2008). D’autres protéines virales interagissent avec

Beclin 1 afin d’inhiber l’autophagie, soit à l’étape de la formation des autophagosomes ou à

62

l'étape de maturation (Levine, Liu et al. 2015). La protéine virale ICP34.5 d’HSV-1 se lie

également à Beclin 1 pour inhiber l’autophagie mais en dehors du domaine BH3 (Orvedahl,

Alexander et al. 2007). Dans les cellules dendritiques ICP34.5 ne bloque pas l'induction de

l'autophagie mais plutôt la maturation des autophagosomes (Gobeil and Leib 2012). La protéine

Nef du VIH-1 interagit également avec Beclin 1 et bloque la maturation des autophagosomes

(Kyei, Dinkins et al. 2009). Cette fonction de Nef rentre dans le contexte de la prévention de la

dégradation des composants du VIH dans les autolysosomes. La protéine M2 du virus de la

grippe bloque aussi la maturation des autophagosomes par interaction avec Beclin 1, ce qui

permet la survie des cellules infectées sans avoir une influence sur la réplication virale

(Gannage, Dormann et al. 2009). D’autres protéines virales sont capables d’interagir avec

Beclin 1 pour réguler positivement l’autophagie comme l’oncoprotéine E1B19K de l’adénovirus.

En effet, elle interagit avec le domaine BH3 de Beclin 1 et déplace Bcl-2 du complexe Beclin 1

(Piya, White et al. 2011).

Figure 23 : Différents partenaires de Beclin 1. Les protéines en bleu sont des activateurs (VMP1, AMBRA1, UVRAG, Bif-1, Atg14, NRBF2 et la protéine virale E1B19K), et les inhibiteurs sont en rouge (les protéines cellulaires Bcl-xL et Bcl-2, Rubicon et les protéines virales ICP34.5, vBcl-2, M2 et Nef). (B) Adapté de (Levine, Liu et al. 2015).

En plus de son rôle dans l'autophagie, Beclin 1 et ses partenaires du complexe core participent

également à un processus appelé «phagocytose associée au LC3», qui implique la maturation

de phagosomes contenant des agents pathogènes intracellulaires ou des cellules apoptotiques

(Green and Levine 2014).

63

iii. Régulation de l’autophagie par des voies de signalisation indépendantes de

mTOR et du complexe PI3K de classe III

Les voies des kinases eIF2α

Les kinases eIF2α sont des protéines phosphorylant le facteur eucaryote d’initiation de la

traduction eIF2α sur la sérine 51, ce qui a pour conséquences l’inhibition de la traduction

protéique.

Chez les mammifères, il existe quatre kinases d’eIF2α : PERK qui est activée par le stress du

RE et l’hypoxie, HRI (Heme-Regulated Inhibitor) activée par une déplétion en hème, PKR

activée par les ARN double brin, et GCN2 (General Control Non-derepressible-2) activée par les

ARN de transfert (ARNt) non chargés en acides aminés. La phosphorylation d’eIF2α, semble

jouer un rôle majeur dans la régulation positive de l’autophagie, puisque les cellules possédant

une protéine eIF2α mutée non phosphorylable, n’induisent pas d’autophagie en réponse à une

carence (Talloczy, Jiang et al. 2002). Le mécanisme impliqué n’est pas très bien connu

(Kroemer, Marino et al. 2010). Il semble que la phosphorylation d’eIF2α soit impliquée dans la

traduction sélective de certains gènes de l’autophagie comme LC3 et Atg5 (Kroemer, Marino et

al. 2010; Rouschop, van den Beucken et al. 2010). La phosphorylation d’eIF2 entraine aussi

une traduction préférentielle d’ATF4, un régulateur transcriptionnel important. En réponse au

stress du RE et à la carence en acides aminés, la stimulation de PERK ou de GCN2 active la

voie eIF2α/ATF4, ce qui stimule la transcription des gènes de l'autophagie impliqués dans la

formation, l'élongation et la fonction de l’autophagosome (B'Chir, Maurin et al. 2013).

L’activation de PKR par des facteurs viraux fait de la voie PKR/eIF2α une voie potentielle de

stimulation de l’autophagie par les virus.

Le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l'autophagie

Un stress du RE fait généralement suite à une accumulation de protéines mal repliées. La

cellule déclenche alors une réponse adaptative, la réponse UPR (Unfolded Protein Response)

qui a pour finalité d’augmenter la capacité de repliement du RE. De nombreux travaux montrent

qu’il existe un lien entre l’activation de l’UPR et l'autophagie (Deegan, Saveljeva et al. 2013;

Senft and Ronai 2015). L'utilisation des inducteurs pharmacologiques du stress du RE comme la

tunicamycine et la thapsigargine induisent la formation d'autophagosomes (Criollo, Vicencio et

al. 2007; Gozuacik, Bialik et al. 2008). Le stress du RE peut contribuer à la stimulation de

l’autophagie via l’activation de JNK, XBP-1, CHOP et ATF4. La voie IRE1α/JNK est la première

à avoir été impliquée dans l'induction de l'autophagie par le stress du RE (Ogata, Hino et al.

2006; Haberzettl and Hill 2013). L'autophagie peut également être induite par la voie

64

PERK/eIF2α/ATF4. Le facteur de transcription ATF4 active l’autophagie d’une part en

augmentant l’expression d’Atg12 ce qui permet la conversion de LC3 (Kouroku, Fujita et al.

2007) et d’autre part en activant directement la transcription de LC3 (Rzymski, Milani et al.

2010).

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS)

Des travaux mettent en évidence l’induction de l’autophagie par les ROS lors de la carence en

nutriments. Cependant, à ce jour, il est encore difficile de savoir quelles espèces entraînent

précisément ce processus car les ROS stimulent l’autophagie par différentes voies de

signalisation. Certains proposent que l’anion superoxyde O2- soit impliqué dans l'autophagie

induite par la carence en glucose, en glutamine, ou la privation de sérum (Chen, McMillan-Ward

et al. 2008). D'autres éléments indiquent, que le peroxyde d’hydrogène H2O2 est la molécule

produite immédiatement après la carence et qu’il oxyde Atg4, une enzyme impliquée dans la

maturation de LC3 (Poillet-Perez, Despouy et al. 2015). L’augmentation des ROS va stimuler

l’autophagie, et plus particulièrement la mitophagie, comme un mécanisme de survie en

favorisant la lipidation de LC3 via l’oxydation d’Atg4 ou en augmentant la transcription de Beclin

1. Les ROS peuvent aussi réguler l’autophagie en activant des facteurs de transcription comme

NF-κB, conduisant à l’expression de certains gènes de l’autophagie, comme Beclin 1 ou

SQSTM1.

iv. Régulation de l’autophagie par des voies de signalisation impliquant des

facteurs de transcription

La protéine STAT3 (signal tranducer and activator of transcription 3)

STAT3 est un facteur de transcription impliqué dans l’inflammation, l’oncogenèse et

l’immunodépression. STAT3 peut être localisé dans le noyau mais c’est sa fraction

cytoplasmique qui régule l’autophagie. Il se lie à PKR, formant un complexe qui empêche PKR

de phosphoryler son substrat. En présence d’inhibiteur de STAT3, le complexe va se dissocier,

et l’autophagie va être activée, de façon dépendante d’eIF2α. L’utilisation des activateurs de

PKR ou l’ajout d’acides gras peut aussi entrainer la dissociation du complexe (Shen, Niso-

Santano et al. 2012).

Les protéines p53

La protéine p53 est un suppresseur de tumeur dont le gène est fréquemment muté dans les

cancers. Cette protéine est impliquée dans plusieurs processus cellulaires importants comme

l’apoptose et le métabolisme. La protéine p53 régule l’autophagie dans les deux directions en

65

fonction de sa localisation cellulaire. Dans le noyau, p53 permettrait, par son rôle de facteur de

transcription, l’expression de gènes impliqués dans l’autophagie alors que p53 cytoplasmique

serait un puissant inhibiteur de cette voie (Levine and Abrams 2008). p53 régulerait aussi

l’autophagie indirectement en agissant sur la transcription d’un gène codant une protéine

lysosomale : DRAM (Damage-Related 79Autophagy Modulator) (Criollo, Dessen et al. 2009;

Lorin, Pierron et al. 2010). La kinase mTOR agirait en tant que régulateur négatif de p73 (une

protéine proche de p53) alors que p53 peut agir en amont de cette kinase en activant l’AMPK

(Rosenbluth and Pietenpol 2009). Il a été montré récemment que lors de la privation de sérum,

p53 régule positivement l’autophagie afin de bloquer la sénescence cellulaire induite par le

stress (Sui, Fang et al. 2015).

D. Fonctions biologiques de l’autophagie : physiologique et pathologique

Figure 24 : Rôles physiologiques et pathologiques de l'autophagie. (Beau, Mehrpour et al. 2011).

i. Rôles physiologiques

L’autophagie basale : contrôle qualité

L’autophagie est un mécanisme de dégradation des constituants cellulaires. Elle peut être

stimulée en situation de stress, comme un changement du volume cellulaire, une carence des

acides aminés, un stress oxydatif et des signaux hormonaux (Meijer and Codogno 2004). Elle

est active à un niveau basal dans la plupart des organismes. Elle contrôle la qualité et la

quantité de la biomasse intracellulaire par l’autodigestion des composants cytoplasmiques qui

66

peuvent être des protéines à longue durée de vie ou certains organites comme les

mitochondries et les peroxysomes (Deretic and Levine 2009). La dégradation des protéines et

de matériels cytoplasmiques par l'autolysosome génère des acides gras et des acides aminés

qui seront réutilisés pour produire de nouvelles protéines, maintenir le niveau d'ATP et

augmenter la survie cellulaire (Levine and Yuan 2005; Yin, Ye et al. 2009). Lors de la naissance,

l’autophagie s’active permettant au nouveau-né de subvenir à ses besoins, suite à la rupture de

l’approvisionnement placentaire (Kuma, Hatano et al. 2004).

De plus, l’autophagie permet d’éviter l’accumulation de substances pouvant être toxiques. Il a

été montré que la délétion des gènes atg5 ou atg7 dans le cerveau de souris induit la mort des

neurones suite à une accumulation de protéines polyubiquitinées (Hara, Nakamura et al. 2006;

Komatsu, Waguri et al. 2006). Cette mort ne serait pas uniquement due à une faillite dans

l'homéostasie énergétique mais serait également due à un défaut d’élimination des corps

apoptotiques, en particulier dans les poumons et la rétine (Qu, Zou et al. 2007).

Le Développement

Plusieurs études montrent l’implication de l’autophagie dans le développement, qui est un

mécanisme indispensable tout au long de la vie d’un organisme. L’absence de certains gènes

essentiels de l’autophagie affecte le développement. En effet, chez la levure (Saccharomyces

cerevisiae) (Tsukada and Ohsumi 1993), la drosophile, l’amibe (Dictyostelium discoideum) et

chez le nématode Caenorhabditis elegans, l’inactivation de certains gènes ATG provoquent des

troubles du développement, tels que troubles de la sporulation, mort à la troisième étape larvaire

ou pendant le stade nymphal; troubles de l’étape de transition de la larve vers le stade «dauer»

(Melendez, Talloczy et al. 2003; Tekinay, Wu et al. 2006; Melendez and Neufeld 2008). Chez les

mammifères, l’autophagie est primordiale lors de l’embryogénèse, notamment lors de la

transition de l’ovocyte en embryon et dans le développement neural, du cœur ou du foie, en

fonction des gènes de l’autophagie invalidés. Chez la souris, la mutation du gène ATG6/Becline-

1 entraine une létalité embryonnaire précoce (Yue, Jin et al. 2003).

Le vieillissement

L’autophagie participe à la lutte contre le vieillissement par son action d’élimination des

protéines et structures endommagées comme les mitochondries et les radicaux libres oxygénés

(Levine and Klionsky 2004). Plusieurs études chez les vers ont révélé que le blocage de

l’autophagie par des siRNA dirigés contre des gènes autophagiques essentiels, réduit leur durée

de vie alors que la stimulation de l’autophagie va allonger la vie de cet organisme (Cuervo

2008). Il est généralement admis que la dégradation des protéines chez la quasi-totalité des

67

organismes vivants diminue avec l'âge. Cette baisse a pour conséquence l’accumulation

progressive de protéines et de structures cellulaires altérées (Ward 2002). Cependant, des

observations expérimentales suggèrent que l'âge peut avoir des effets importants sur la

macroautophagie et la CMA. En effet, avec l’âge, il y a une diminution progressive des protéines

de l’autophagie comme LAMP2a. Cette baisse réduit la maturation des autophagosomes, ce qui

a pour conséquence une accumulation de protéines et d’organites endommagés dans le

cytoplasme des cellules âgées. Une sorte de compensation se met en place et passe par

l’augmentation des protéines chaperonnes intervenant dans la CMA. Toutefois, à un âge

avancé, la compensation n’est plus possible (Cuervo and Dice 2000; Donati, Cavallini et al.

2001; Terman, Gustafsson et al. 2007). La surexpression de LAMP2a dans le foie de souris

âgées permet de restaurer la CMA ainsi que la macroautophagie et d’accroître la survie (Zhang

and Cuervo 2008). L’espérance de vie peut être prolongée par limitation de l’apport calorique ou

par des agents pharmacologiques qui miment cet effet. Dans une revue récente, Madéo et al ont

rapporté que les différentes manipulations pharmacologiques, génétiques ou nutritionnelles qui

entrainent une extension de la durée de vie stimulent le plus souvent l’autophagie, et que ce flux

autophagique contribuerait à l'extension de la longévité (Madeo, Zimmermann et al. 2015). Ceci

suggère donc que l’autophagie est nécessaire et serait même, dans certains cas, suffisante pour

accroitre la longévité.

L’autophagie : un processus de survie ou de mort cellulaire ?

A côté de son rôle dans le maintien de l’homéostasie et le métabolisme cellulaire, l’autophagie

peut aussi contribuer à la mort cellulaire. C’est la mort autophagique ou la mort cellulaire

programmée de type II (Clarke 1990; Kroemer, Galluzzi et al. 2009). Shen et Codogno ont

proposé une définition précise de la mort autophagique, qui se caractérise par 1) l’absence

d’implication de l’apoptose, 2) l’augmentation du flux autophagique et 3) le fait que l’invalidation

de l’autophagie permet de prévenir la mort cellulaire (Shen and Codogno 2011). Le rôle

physiologie de la mort cellulaire autophagique a été principalement décrits chez les eucaryotes

inférieurs et les invertébrés comme Drosophila melanogaster (Denton, Shravage et al. 2009) et

Dictyostelium discoideum. Chez les mammifères, la morte autophagique a été seulement

observée dans des cultures cellulaires in vitro. En effet, dans un modèle animal, la privation en

insuline déclenche une morte autophagique dans des cellules souches neuronales (Yu, Baek et

al. 2008).

68

L’autophagie pourrait agir comme un mécanisme de mort cellulaire dépendant de l’espèce, du

type cellulaire et de la nature du stimulus. L’autophagie peut également conduire à la mort

cellulaire par apoptose ou elle peut fonctionner en tant que partenaires avec l’apoptose ayant

pour but commun la mort de la cellule. La fonction protectrice de l’autophagie se fait, dans de

nombreuses circonstances, par modulation négative de l'apoptose. La signalisation apoptotique,

à son tour, sert à inhiber l'autophagie. Bien que les mécanismes de cross-talk entre autophagie

et apoptose ne sont pas encore entièrement compris, il existe des médiateurs communs comme

Beclin1 et Bcl-2 / Bcl-xL (Pattingre, Tassa et al. 2005; Cho, Jo et al. 2009; Luo and Rubinsztein

2010; Wirawan, Vande Walle et al. 2010).

Immunité

Puisque l’autophagie est un mécanisme de « ménage » important qui répond rapidement à des

contraintes environnementales, il n’est pas surprenant que l'autophagie joue un rôle clé dans

l'immunité. Les grands rôles immunologiques de l'autophagie concernent aussi bien l'immunité

innée qu’adaptative et se manifestent souvent dans les maladies inflammatoires. Les effets

immunitaires de l'autophagie chevauchent partiellement ses rôles dans le métabolisme et le

contrôle de la qualité cytoplasmique (Deretic, Kimura et al. 2015). L’autophagie joue directement

un rôle dans l’immunité innée en éliminant des agents pathogènes par xénophagie (Levine

2005; Sumpter and Levine 2010). Elle est capable d’éliminer certaines bactéries comme

Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus (Deretic and Levine 2009). L’immunité

adaptative peut être modifiée par l’autophagie. Elle participe à la production de peptides

antigéniques microbiens ou endogènes via les lysosomes et favorise leur prise en charge par

les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I et II (CMH-I et CMH-II) (Schmid and

Munz 2007). Par exemple, l’antigène nucléaire 1 du virus d’Epstein-Barr EBNA1 est reconnu par

la machinerie autophagique. Cet antigène est ensuite présenté par le CMH-II à la surface des

lymphocytes T CD4+ (Paludan, Schmid et al. 2005). Il a été montré que l’inhibition de

l’autophagie diminue la présentation antigénique aux molécules du CMH de classe II (Levine

and Deretic 2007).

Des études génétiques récentes ont identifié trois gènes impliqués dans l'autophagie, qui sont

associés à la maladie de Crohn, une maladie intestinale inflammatoire chronique (Gomes and

Dikic 2014). Il s’agit d’IRGM (immunity-related GTPase M), de NOD2 (nucleotide-binding

oligomerization domain-containing-2), et d’Atg16L. Ces protéines ont également été décrites

pour avoir un rôle dans l'induction de l'autophagie en réponse à des agents pathogènes. Il a, par

69

exemple, été montré qu’IRGM joue un rôle dans l’élimination de mycobactéries par stimulation

de l’autophagie.

ii. Rôles pathologiques

L’autophagie intervient dans plusieurs types de pathologies. Elle peut avoir un rôle protecteur

dans certaines pathologies ou son dysfonctionnement peut être impliqué dans d’autres.

L’autophagie pourrait donc constituer une cible thérapeutique intéressante (Rubinsztein,

Codogno et al. 2012).

Autophagie et cancer

L’un des premiers travaux qui a mis en évidence l’implication des gènes de l’autophagie dans la

suppression tumorale a été réalisée par Liang et al sur Beclin 1 (Liang, Jackson et al. 1999). Ce

gène est retrouvé muté dans de nombreux cancers (cancer des poumons, des ovaires, du sein

ou encore de la prostate). Ils ont montré qu’une expression ectopique de ce gène a pour

conséquence, outre l’induction de l’autophagie, une baisse de la prolifération des cellules

cancéreuses in vitro et une réduction des masses tumorales in vivo (Liang, Jackson et al. 1999).

D’autres gènes codant des protéines impliquées dans l’autophagie ont été décrits comme

suppresseurs de tumeurs : Atg5 (Iqbal, Kucuk et al. 2009), UVRAG (Ionov, Nowak et al. 2004;

Liang, Feng et al. 2006; Kim, Hwang et al. 2008), Bif-1 (Coppola, Oliveri et al. 2008) ou encore

Atg4c (Marino, Salvador-Montoliu et al. 2007).

Différents régulateurs du processus ont été décrits comme étant modifiés au cours de la

tumorigénèse. De nombreux oncogènes comme PTEN, TSC1 et TSC2 activent mTOR (Arico,

Petiot et al. 2001; Lu, Luo et al. 2008; Yecies and Manning 2011). Un autre régulateur de

l’autophagie est le suppresseur de tumeur p53 (Crighton, Wilkinson et al. 2006; Budanov and

Karin 2008). La suppression des gènes de l’autophagie comme Beclin 1, Atg5, ou Atg7 favorise

l’apparition des tumeurs (Morselli, Galluzzi et al. 2011).

Cependant, l’autophagie peut contribuer à la survie des cellules tumorales. Il a été montré que

l’autophagie joue un rôle protecteur car elle inhibe la croissance des tumeurs (White 2012). Le

mécanisme exact de ce rôle n’est pas bien connu. Il semble que l’élimination d’organites

endommagés et des substrats protéiques toxiques par l’autophagie favorise la croissance

tumorale. De plus, une de protéines adaptatrices spécifiques de l’autophagie, la protéine p62 a

une activité pro-tumorale (Rubinsztein, Codogno et al. 2012; White 2012).

Il a, par exemple, été montré récemment que l’autophagie a un double rôle dans le cancer

buccal (Patil, Rao et al. 2015). L’autophagie inhibe l’initiation de la tumeur en dégradant les

organites endommagés qui s’accumulent. Inversement, lors de la progression du cancer

70

avancé, l’autophagie rend les cellules cancéreuses résistantes à des agents thérapeutiques.

L’inhibition de l'autophagie par des modulateurs pharmacologiques induit la mort des cellules

cancéreuses par apoptose.

Autophagie et maladies neurodégénératives

Les neurones sont des cellules post-mitotiques particulières. Le maintien de la protéostasie est

crucial pour ces cellules. L’autophagie intervient dans la protection des cellules neuronales, en

complément du système ubiquitine-protéasome, en dégradant les agrégats protéiques

cytosoliques. En cas de déficit de l’autophagie, on peut s’attendre à une accumulation de

protéines anormales (oxydées, mal conformées) toxique pour les neurones. Ces phénomènes

peuvent conduire à la dégénérescence neuronale ou à des maladies neurodégénératives.

D’ailleurs, des souris déficientes pour l’autophagie développent de graves maladies

neurodégénératives, montrant l’importance de ce mécanisme catabolique dans l’homéostasie

neuronale (Hara, Nakamura et al. 2006; Komatsu, Waguri et al. 2006). Plusieurs protéines

pathologiques (Huntingtine, -Synucléine et Tau par exemple) sont spécifiquement dégradées

par autophagie (Ravikumar, Duden et al. 2002).

La maladie de Huntington, également dénommée chorée de Huntington, est une affection

génétique et héréditaire conduisant à la destruction des neurones de certaines régions

cérébrales. Elle se traduit principalement par des mouvements anormaux et des troubles du

comportement. Elle est due à l’accumulation de polyglutamine au niveau de l’extrémité N-

terminale de la protéine huntingtine. L’utilisation de la rapamycin pour induire l’autophagie dans

des neurones défectueux aide à mieux éliminer les agrégats toxiques accumulés et à réduire la

dégénérescence de ces cellules (Ravikumar, Vacher et al. 2004). Il y a une diminution de

l’autophagie au cours de cette maladie. L’utilisation des modèles expérimentaux, à la fois chez

la drosophile et chez les mammifères, a permis de montrer que la huntingtine a une fonction

essentielle dans l'autophagie sélective où elle sert d’échafaudage en interagissant avec la

protéine cargo SQSTM1/p62 et la kinase ULK1 (Rui, Xu et al. 2015).

La maladie d’Alzheimer se caractérise par une perte neuronale associée à l’accumulation

extracellulaire de peptides β-amyloides. Elle se caractérise également par l’accumulation

intracellulaire de la protéine tau sous forme phosphorylée. Dans cette maladie, il y a une

accumulation précoce de vacuoles autophagiques immatures dans les neurones atteints, due au

blocage de la maturation des autophagosomes, ce qui favorise la dégénérescence (Meijer

2009). Il a été montré que la protéine PS1 (prénésiline) est impliquée dans le trafic d’une

71

certaine catégorie de protéines membranaires et qu’elle pourrait intervenir dans le turn-over de

certaines protéines (télencéphaline) par un mécanisme d’autophagie (Esselens, Oorschot et al.

2004). De façon plus générale, l’activité de la PS1 est requise pour la maturation des vésicules

autophagiques. Chez la souris, Beclin 1 protège contre la pathologie amyloïde et à l’inverse sa

perte la potentialise (Lee and Gao 2008; Pickford, Masliah et al. 2008; Jaeger, Pickford et al.

2010). Il existe des preuves que la stimulation de l’autophagie dans les neurones est capable de

les protéger des effets toxiques du peptide -amyloïde (Hung, Huang et al. 2009). La protéine

tau endogène est dégradée normalement par la CMA (Wang, Martinez-Vicente et al. 2009). Ses

formes pathologiques (hyperphosphorylées, clivées et/ou agrégées) sont dégradées par

macroautophagie (Berger, Ravikumar et al. 2006; Wang, Martinez-Vicente et al. 2009; Dolan

and Johnson 2010). Dans des modèles animaux de tauopathie, l’induction de l’autophagie

permet la dégradation de cette protéine, ce qui semble avoir un effet neuroprotecteur (Berger,

Ravikumar et al. 2006).

La maladie de Parkinson (PD) est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente,

après Alzheimer. Elle est caractérisée par une destruction des neurones dopaminergiques. La

présence de corps de Lewy (des inclusions dans les noyaux des neurones), dans la substance

noire et dans d’autres zones du cerveau induit la dégénérescence de ces neurones. Ils

correspondent à des amas pathogènes formés par la protéine α-synucléine. Cette protéine est

dégradée par macroautophagie et par CMA (Lynch-Day, Mao et al. 2012). L’α-synucléine active

la voie (Vacuolar protein sorting-35) VPS35-Lamp2a, qui a un rôle crucial dans la CMA, pour

empêcher la PD. La suppression ou la mutation de la protéine VPS35 favorise la pathogenèse

de la PD (Tang, Erion et al. 2015). Il a en effet été rapporté que l’expression de la protéine

Lamp2a dans les neurones dopaminergiques déficients de la protéine VPS35 réduit

l’accumulation de α-synucléine, montrant que Lamp2a est important pour la dégradation de l’α-

synucléine par la CMA. Les deux formes mutées de la protéine α-synucléine, A53T et A30P,

empêche sa dégradation par la CMA et donc la protéine s’accumule sous forme d’agrégats

toxiques dans le cytoplasme (Martinez-Vicente, Talloczy et al. 2008). L'autophagie peut

partiellement compenser l'absence de dégradation par la CMA, mais peut provoquer la mort

cellulaire autophagique dans des conditions de stress.

Il a été montré que PINK 1 (PTEN-induced putative kinase 1) est capable d’interagir avec Beclin

1 pour induire l’autophagie et que son mutant perd cette interaction conduisant ainsi à une

activité autophagique inefficace ou insuffisante (Michiorri, Gelmetti et al. 2010).

72

Maladies cardiovasculaires

L’autophagie basale joue un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie cardiaque. La

croissance des cellules musculaires cardiaques est associée avec des changements cellulaires

afin de permettre la formation de nouveaux cardiomyocytes. L’autophagie a un rôle important

dans certaines pathologies cardiaques comme les cardiomyopathies, l’hypertrophie cardiaque et

au cours de l’ischémie/reperfusion. Elle peut être protectrice ou délétère vis-à-vis de pathologies

cardiaques.

L’autophagie a un rôle important dans la protection des cardiomyocytes contre le stress

protéotoxique (Wang and Wang 2015). L’autophagie défectueuse est responsable de la maladie

de Danon (lysosomal glycogen storage disease with normal acid maltase), une cardiomyopathie.

L’autophagie est inhibée chez les souris atteintes de cette maladie car déficientes en LAMP2.

Elles souffrent de sévères dysfonctionnements cardiaques (Saftig, Tanaka et al. 2001). De plus,

l'induction de l'autophagie pourrait être une forme d’adaptation afin de limiter l'hypertrophie

cardiaque. La déficience en Atg5 dans les cellules cardiaques de souris provoque à l’âge adulte

une hypertrophie cardiaque associée à une dilatation du ventricule gauche et à un

dysfonctionnement de l’activité contractile associée à l'accumulation de protéines ubiquitinées et

d’agrégations de mitochondries altérées (Nakai, Yamaguchi et al. 2007).

L’autophagie joue aussi un rôle essentiel dans la prévention des maladies cardiaques car elle

permet la différenciation des cardiomyocytes (Zhang, Liu et al. 2012). Au cours de l’ischémie,

l’apport en nutriments et en oxygène au myocarde est limité, ce qui va déclencher l’autophagie

afin de recycler les acides aminés et les acides gras nécessaires pour maintenir le niveau

énergétique (Nair and Ren 2012). Dans ce contexte, l'induction de l’autophagie semble être

protective car elle fournit les besoins métaboliques et elle élimine les mitochondries

endommagées qui peuvent libérer des ROS (Zhang, Bosch-Marce et al. 2008). Toutefois, au

cours de la reperfusion après une ischémie lorsque l'oxygène et les nutriments sont restaurés

au tissu précédemment ischémique, l'autophagie est suractivée de manière indépendante de

l’AMPK et probablement via Beclin 1. Quand elle dépasse un seuil critique, la dégradation

excessive de protéines et organites peut endommager le myocarde (Mizushima and Komatsu

2011) ce qui contribue à l'apparition et la progression de pathologies telles que l'insuffisance

cardiaque (Rothermel and Hill 2008; Gottlieb and Mentzer 2010).

73

4. AUTOPHAGIE ET VIRUS

Le contenu des autophagosomes à dégrader peut comprendre des agents pathogènes dont la

cellule veut se débarrasser. En cela l’autophagie participe aux mécanismes de défense de la

cellule infectée. Dans le cas des virus, comme on peut s’y attendre, ce mécanisme tend à

provoquer des réactions de détournement ou de neutralisation de cette défense. Par ailleurs,

certains virus ont évolué pour prendre appui sur l’autophagie dans le but d’optimiser leur

potentiel de multiplication. L'autophagie agit certainement à la fois comme une voie antivirale et

pro-virale, et les rôles de l'autophagie dépendent du virus, du type et de l'environnement

cellulaire.

A. Modulation de l’autophagie par les virus

i. Rôle antiviral de l’autophagie

Outre ses fonctions dans le maintien de l’homéostasie cellulaire, l’autophagie occupe une place

importante dans la défense cellulaire. En effet, c’est un mécanisme de défense universel, qui

permet aux cellules de lutter contre des infections par des agents pathogènes intracellulaires, en

permettant notamment leur dégradation directe dans des autophagosomes. De plus,

l’autophagie participe à la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives.

L’identification précise des mécanismes autophagiques dans la défense cellulaire contre les

agents infectieux est donc importante pour l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques

au cours des maladies infectieuses.

La xénophagie désigne la dégradation spécifique par autophagie d’éléments « étrangers » à la

cellule dont les micro-organismes; et joue un rôle majeur dans le contrôle des infections par des

agents pathogènes intracellulaires. Plusieurs bactéries ont été décrites pour être dégradées par

xénophagie dont le streptocoque de groupe A Streptococcus pyogenes, Mycobacterium

tuberculosis, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri et Listeria monocytogenes. A l’inverse, la

dégradation de particules virales entières par autophagie ne semble pas être un mécanisme très

fréquent de lutte contre les infections virales. Une étude a observé la présence de virions de

HSV-1 mutants pour le facteur de virulence ICP34.5 à l’intérieur des autophagosomes dans des

cellules murines (Talloczy, Virgin et al. 2006). HSV-1 induit l’autophagie et ensuite il l’inhibe

grâce à la protéine ICP34.5 qui se lie à Beclin 1. Le virus sauvage n’est probablement pas

dégradé par xénophagie. Le VIH-1 est également retrouvé dans des amphisomes juste après

son entrée dans les cellules dendritiques, mais le virus met rapidement en place une inhibition

de l’autophagie pour contrecarrer ce mécanisme de défense (Blanchet, Moris et al. 2010).

74

L’autophagie semble être plus adaptée à la dégradation de composants viraux individuels tels

que des protéines virales nécessaires au cycle de réplication du virus. Par exemple, il a été

montré que le virus Sindbis induit l’autophagie dans les cellules infectées et que cette

autophagie est essentielle pour éviter la neurovirulence causée par le virus, grâce à la

dégradation de la protéine virale de capside. En effet, la protéine p62 interagit avec les protéines

de la capside et cela entraine la localisation des protéines virales dans les autophagosomes et

leur dégradation (Orvedahl, MacPherson et al. 2010). L’inhibition de l’autophagie dans les

neurones augmente le taux de mortalité des souris en augmentant la neurovirulence.

L’autophagie est impliquée dans la plupart des voies de signalisation conduisant à l’activation de

réponses immunitaires innées, telles que la réponse à l’interféron (Richetta and Faure 2013). La

production de l’IFN de type I (IFN et IFN) joue un rôle crucial pour lutter contre les infections,

en particulier les infections virales. Les autophagosomes peuvent séquestrer et délivrer des

PAMPs (motifs moléculaires associés aux pathogènes), tels que des ARN viraux aux TLRs

(Toll-like receptors) endosomaux pour promouvoir l’activation d’une réponse IFN I. Il a été

montré que les cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) murines présentent une activité

autophagique basale très élevée, qui n’est pas augmentée suite à l’infection par le virus de la

stomatite vésiculaire (VSV) mais qui permet la séquestration d’éléments viraux et la production

de l’IFN I. En effet, les autophagosomes séquestrent des ARN viraux issus de la réplication du

VSV et les délivrent au TLR7 après fusion avec des endosomes, ce qui induit la production

d’IFN (Lee, Lund et al. 2007).

Dans un modèle de drosophile et après l’infection par le VSV, l’induction de l'autophagie suite à

la reconnaissance de la glycoprotéine du virus VSV-G, est essentielle pour la défense antivirale

chez les mouches adultes (Shelly, Lukinova et al. 2009). Une fois activée, l'autophagie diminue

la réplication virale, et l’inhibition de l'autophagie permet l’augmentation de la réplication virale et

de la pathogenèse. Il a été montré que le VSV est reconnu par TLR7, ce qui limite la réplication

virale et ainsi protège les mouches d'une infection létale (Nakamoto, Moy et al. 2012).

L’autophagie contrôle aussi la réplication du virus de la fièvre de la vallée du rift (VRVF) dans les

mouches et les mammifères, de manière dépendante du TLR7. Les mouches déficientes en

TLR7 sont plus sensibles à l'infection par le VRVF, en raison d’un défaut d’activation de

l’autophagie, ce qui est essentiel pour contrôler la réplication virale et assurer la survie des

mouches. L’absence de gènes essentiels pour l’autophagie améliore la réplication virale alors

75

que l’activation pharmacologique de l’autophagie inhibe l’infection dans les cellules cibles (Moy,

Gold et al. 2014).

Delorme-Axford et al ont montré que la protection antivirale de l’autophagie peut se transmettre

par un signal d’une cellule à une autre (Delorme-Axford, Donker et al. 2013). En effet, les

trophoblastes humains (des cellules spécialisées qui composent le placenta) sont naturellement

résistants à l'infection par différents virus et présentent des niveaux élevés d'autophagie, ce qui

pourrait contribuer à leur résistance aux infections virales. Mais surtout, ils sont capables de

conférer une résistance virale à des cellules voisines. En effet, il semble que ces cellules

sécrétent des exosomes, qui contiennent des microARN capables d'induire l'autophagie dans

les cellules environnantes. Cela permet d’induire l’autophagie et d’atténuer la réplication virale

dans les cellules non placentaires, suggérant un modèle original de protection du fœtus contre

les virus (Delorme-Axford, Donker et al. 2013).

L’autophagie contribue également à la défense antivirale en améliorant la présentation des

peptides dérivés des agents infectieux par les CMH, nécessaire au déclenchement d’une

réponse immunitaire adaptative efficace. Un certain nombre de protéines virales sont prises en

charge par l’autophagie pour être présentées aux lymphocytes T. La fusion de la protéine de

matrice du virus de la grippe à la protéine LC3 permet d’augmenter fortement la présentation de

cette protéine au CMH II et d’activer les lymphocytes T CD4 (Schmid, Pypaert et al. 2007). Dans

les macrophages et les cellules dendritiques infectées par Mycobacterium tuberculosis,

l’induction de l’autophagie augmente la présentation de l’antigène bactérien Ag85 au CMH II et

induit la localisation des mycobactéries dans les autophagosomes (Jagannath, Lindsey et al.

2009). L’autophagie joue aussi un rôle dans la présentation des antigènes de la famille des

Herpesviridae aux CMH de classe I et II, mais nous allons voir cette partie en détail dans le

chapitre suivant.

ii. Rôle pro viral de l’autophagie au cours de l’infection virale

Bien que les virus aient évolué pour contrecarrer les voies de l'autophagie, certains ont

également mis au point des mécanismes pour manipuler la machinerie autophagique au profit

de leurs cycles de réplication (Lennemann and Coyne 2015). Plusieurs virus à ARN de polarité

positive ont été décrits pour utiliser les autophagosomes comme plateformes de réplication. Les

entérovirus comme le poliovirus (PV) et le virus Coxsackie B3 (CVB3), qui sont des virus à ARN,

ont été largement étudiés pour le rôle bénéfique que l'autophagie joue dans leur cycle de

réplication. L'infection induit la formation de vésicules à double membrane (autophagosome-

76

like), qui sont LC3 positives et qui servent d'échafaudage pour la réplication de l'ARN viral. Ainsi,

ces virus utilisent l’autophagie pour générer les membranes nécessaires pour les sites de

réplication (Schlegel, Giddings et al. 1996; Jackson, Giddings et al. 2005; Wong, Zhang et al.

2008). Dans le cas du PV, l’induction de l’autophagie se fait par la coexpression de deux

protéines virales, appelé 2BC et 3A (Figure 25). La protéine 2BC augmente la lipidation de LC3,

et la protéine 3A inhibe le mouvement des autophagosomes le long des microtubules afin de

bloquer la fusion autophagosome-lysosome (Suhy, Giddings et al. 2000; Taylor and Kirkegaard

2007). Il a été montré que l’induction de l’autophagie augmente la production virale du PV, et

que son inhibition la diminue (Jackson, Giddings et al. 2005). De plus, l'acidification des

vésicules « autophagosome-like » lors de l'infection favorise la maturation des virions en

particules infectieuses (Richards and Jackson 2012). Le clivage de la protéine virale structurale

VP0 en VP2 et VP4, qui a lieu après l’assemblage des virions contenant le génome, est

nécessaire pour générer les virus infectieux. Cet événement est inhibé si l’acidification de ces

vésicules est bloquée (Richards, Soares-Martins et al. 2014). Cependant, la propriété

dégradative de l’autophagie n’est pas nécessaire pour promouvoir la réplication du PV (Richards

and Jackson 2012).

L’autophagie pourrait représenter également une voie de sortie non lytique du PV à la fin de son

cycle de multiplication, un processus appelé AWOL (Autophagic exit WithOut Lysis) qui permet

une libération des virus avant la lyse des cellules infectées (Bird, Maynard et al. 2014).

Il a été montré que le virus Coxsackie B3 (CVB3) induit la formation des autophagosomes, mais

qu’il y a peu ou pas de dégradation du contenu des autophagosomes au cours de l'infection

(Wong, Zhang et al. 2008; Kemball, Alirezaei et al. 2010). Contrairement au PV, qui induit le flux

autophagique, le CVB3 l’inhibe. En effet, le PV induit une autophagie complète, où la protéine

p62/SQSTM1 est clivée par une protéase virale ou elle reste intacte dans d’autres types

cellulaires. Il semblerait que le CVB3 inhibe la formation des autolysosomes pour échapper à la

dégradation lysosomale (Wong, Zhang et al. 2008). La cible cellulaire utilisée par le CVB3 pour

inhiber la dégradation est la protéine BPIFB3 (bactericidal/permeability-increasing protein (BPI)

fold-containing family B, member 3), qui a été récemment identifiée (Coyne, Bozym et al. 2011).

L’extinction de BPIFB3 augmente à la fois la dégradation autophagique et la réplication du

CVB3, mais n’affecte pas la réplication virale du PV (Delorme-Axford, Morosky et al. 2014). Le

CVB3 a aussi la capacité de bloquer l’autophagie sélective (Shi, Wong et al. 2013). En effet, une

protéase du CVB3 va cliver la protéine p62/SQSTM1 et la rendre inactive, ce qui entraine un

blocage de l'autophagie sélective mais n'a pas d'effet direct sur la réplication virale. Une étude

récente a montré que le CVB3 est libéré dans des microvésicules extracellulaires (EMVS pour

77

Extracellular Microvesicles) contenant la forme lipidée de la protéine LC3, indiquant que ces

EMVS proviennent de la voie autophagique (Robinson, Tsueng et al. 2014).

Figure 25 : Régulation de l’autophagie par les virus. Plusieurs virus sont connus pour inhiber la signalisation ou la maturation autophagique. Les protéines 3A et 2BC du PV, le VHC ou la protéine HBx du VHB induisent les étapes précoces de l’autophagie. Les virus de la grippe A, CVB3, HPIV3 et EBV induisent la formation des autophagosomes, mais ils bloquent leur maturation et la dégradation autophagique. La protéine M2 se lie à LC3 pour inhiber formation.de l’amphisome. La protéine P d’HPIV3 se lie à SNAP29 afin d’inhiber la fusion endosome-autophagosome. Dans le cas de CVB3, le virus nécessite BPIFB3 cellulaire pour inhiber la maturation des autophagosomes (Jackson 2015)

Contrairement à CVB3, le flux autophagique est bénéfique pour la réplication du virus de la

rougeole (MeV). Lors de l’étape précoce de l’infection, ce virus induit une première vague

d’autophagie très précoce mais transitoire par l’engagement de son récepteur d’entrée CD46

(Joubert, Meiffren et al. 2009). Cependant, après un bref retour à l’état basal, une deuxième

vague d’autophagie est induite suite à l’interaction de la protéine virale non structurale C avec

IRGM, un régulateur cellulaire connu de l'autophagie (Gregoire, Richetta et al. 2011). Bien que

la machinerie autophagique soit fonctionnelle, les protéines virales ne sont pas ciblées pour être

dégradées dans les autolysosomes. Cette autophagie est bénéfique et favorise la production de

particules virales infectieuses. En effet, l’autophagie est exploitée afin de limiter la mort des

78

cellules infectées, ce qui améliore la production de particules virales (Richetta, Gregoire et al.

2013).

L'autophagie est également bénéfique pour la maturation du virus de la dengue (DENV) (Mateo,

Nagamine et al. 2013). Après la réplication du génome viral dans des vésicules associées au

RE, les particules virales sont assemblées dans le RE et transportées par la voie de sécrétion

avant leur libération dans l'espace extracellulaire. Dans l’appareil de Golgi, le précurseur de la

protéine membranaire prM est clivé par la furine, une protéase cellulaire, ce qui rend les

particules virales infectieuses (Yu, Zhang et al. 2008). L'inhibition de l'autophagie diminue le

clivage de la protéine prM entrainant une diminution de l’infectivité des virus extracellulaires.

DENV est également capable de stimuler spécifiquement la lipophagie. La lipophagie

correspond à la dégradation par autophagie de gouttelettes lipidiques et représente une voie

alternative du métabolisme des lipides. Il a été montré que pendant l’infection par le DENV, des

gouttelettes lipidiques sont présentes dans les autolysosomes (Heaton and Randall 2010) et que

leur dégradation fournit l’énergie nécessaire pour faciliter la réplication virale.

Certains paramyxovirus induisent l'autophagie pour favoriser la production de virus (Manuse,

Briggs et al. 2010). Le virus parainfluenza de type 3 (HPIV3) induit une autophagie incomplète

en bloquant la fusion autophagosome-lysosome, ce qui entraine une augmentation de la

production virale. La phosphoprotéine virale (P) est nécessaire et suffisante pour bloquer les

étapes tardives de l’autophagie (Ding, Zhang et al. 2014). La fusion des autophagosomes avec

les lysosomes est dépendante de la liaison de la protéine SNARE adaptatrice SNAP29 avec,

d’un côté la protéine STX17, situé sur la membrane autophagosomale et de l’autre la protéine

VAMP8, qui se trouve sur la membrane de l’endosome/lysosome (Itakura, Kishi-Itakura et al.

2012). La protéine P se lie à SNAP29 et inhibe son interaction avec STX17, ce qui empêche les

deux protéines SNARE de jouer leur rôle dans la fusion. Cette autophagie incomplète et

l'accumulation des autophagosomes augmentent la production virale extracellulaire, par un

mécanisme actuellement inconnu, mais n’affectent pas la synthèse de protéines virales (Ding,

Zhang et al. 2014).

Une accumulation des autophagosomes est également observée lors de l’infection par le virus

de la grippe A (IAV) (Beale, Wise et al. 2014). La protéine virale M2 est capable de bloquer la

maturation des autophagosomes par interaction avec Beclin 1. Ce blocage tardif favorise la mort

cellulaire et il n'a pas d'influence sur la réplication virale (Gannage, Dormann et al. 2009). Au

cours de l'infection, la protéine M2, par sa région d’interaction avec la protéine LC3 (LIR pour

79

LC3-interacting region), entraine la relocalisation de LC3 au niveau de la membrane

plasmatique. La perturbation de l’interaction M2-LC3 diminue le bourgeonnement filamenteux et

la stabilité des virions. La protéine virale NS1 (Non-structural protein 1) stimule indirectement

l’autophagie en régulant positivement la synthèse de deux protéines virales, elles-mêmes

capables d’induire l’autophagie, l’hémagglutinine et la protéine M2 (Zhirnov and Klenk 2013).

Dans le cas du VHC, la machinerie autophagique semble être nécessaire pour l'initiation, mais

pas pour le maintien de la réplication virale. L'autophagie améliore la traduction de l'ARN viral

(Dreux, Gastaminza et al. 2009). L’induction de l’autophagie a aussi pour bénéfice d’inhiber

l’activation d’IFN par RIG-I (Ke and Chen 2011). Des modulateurs de l'UPR semblent jouer un

rôle dans l’induction de l’autophagie par le VHC (Dreux and Chisari 2011). Il a été proposé que

les membranes autophagiques puissent être utilisées comme un compartiment pour la

réplication de l’ARN viral car les protéines virales NS5A, NS5B et l’ARN viral colocalisent avec

l’autophagosome. En plus de son rôle essentiel dans la réplication, l’autophagie régule

l'assemblage et/ou la sortie des virions infectieux et ainsi la protection des cellules infectées de

la mort (Dreux and Chisari 2011; Ke and Chen 2014). Plusieurs protéines autophagiques,

comme Beclin 1, LC3, Atg4B, Atg5, Atg7 et Atg12, sont jugées nécessaires pour une infection

productive par le VHC (Jordan and Randall 2012). HCV induit également la mitophagie et il est

capable d’atténuer l'apoptose, ce qui peut éventuellement faciliter la persistance virale (Kim,

Syed et al. 2014).

Il a été récemment montré que l’autophagie peut avoir un rôle proviral chez certains virus à ADN

comme le virus de l’hépatite B (VHB). Il semble que l'autophagie induite améliore la réplication

de l'ADN viral et facilite l’enveloppement. La protéine virale HBx, essentielle dans la

pathogénèse et la carcinogénèse virale, est capable d’induire l’autophagie par une régulation

positive de la PI3K de classe III ou de Beclin 1 (Tang, Ducroux et al. 2012). HBx induit

également l’autophagie par activation de la protéine kinase DAPK (death-associated protein

kinase) (Zhang, Chen et al. 2014). Elle inhibe la dégradation autophagique par altération de la

maturation lysosomale (Liu, Fang et al. 2014). Les membranes autophagiques générées sont

utilisées pour l’enveloppement viral (Li, Liu et al. 2011). Des études récentes ont révélé un rôle

de l'autophagie dans la pathogenèse du VHB. En effet, l'autophagie favorise la dégradation du

microARN-224 cellulaire, dont la surexpression est associée au carcinome hépatocellulaire

(Lan, Wu et al. 2014).

80

iii. VIH (Virus de l'immunodéficience humaine) et l’autophagie

L’autophagie est l’un des mécanismes majeurs gouvernant l’infection par le VIH-1, mais elle est

régulée différemment en fonction du type cellulaire. De plus, deux rôles de l’autophagie pro- et

antiviral ont été proposés.

Dans les macrophages, il détourne l’autophagie pour faciliter la formation de nouveaux virions

(Kyei, Dinkins et al. 2009). En effet, l’infection induit une autophagie incomplète uniquement

dans les cellules infectées et pas dans les cellules voisines (Espert, Varbanov et al. 2009). La

protéine virale Nef bloque la maturation autophagique par son interaction avec Beclin 1,

protégeant ainsi le virus de la dégradation. Le VIH nécessite l'induction de l'autophagie, pour

faciliter la maturation de la protéine structurale Gag. Il inhibe ensuite la capacité dégradative de

l’autophagie, afin d’éviter la dégradation virale et d’augmenter la production des virions. (Borel,

Espert et al. 2012). L’accumulation des autophagosomes dans le cytoplasme dépend aussi de

l’interaction de Nef avec IRGM (Gregoire, Richetta et al. 2011; Gregoire, Rabourdin-Combe et

al. 2012).

Dans les cellules dendritiques (DC) immatures dérivées de monocytes, il semble que les virions

puissent être dégradés par xénophagie tout de suite après leur entrée dans la cellule. En effet, il

a été observé en microscopie confocale, une colocalisation de Gag du VIH-1 avec des vésicules

GFP-LC3. Cependant, le VIH-1 inhibe l’autophagie dans les DC, ce qui bloque l’induction des

réponses immunitaires (Blanchet, Moris et al. 2010).

Dans les lymphocytes T CD4+, l’autophagie est inhibée dans les cellules infectées afin d'éviter

l’effet antiviral de l’autophagie (Espert, Varbanov et al. 2009) alors qu’elle est induite dans les

cellules voisines non infectées (Espert, Denizot et al. 2006). Les interactions directes entre les

glycoprotéines d’enveloppe gp120/gp41, qui se trouvent à la surface cellulaire des lymphocytes

infectés, et le récepteur CD4 et le corécepteur CXCR4 induisent l’autophagie dans les

lymphocytes T non infectés et activent la mort cellulaire par apoptose. Ce mécanisme contribue

à la destruction progressive des lymphocytes T CD4 aboutissant à la phase SIDA.

Il a été montré récemment que la protéine transactivatrice du VIH Tat, une protéine essentielle

pour la transcription virale et la production de virions est spécifiquement dégradée par

autophagie sélective. Cette dégradation sélective est dépendante de l’interaction de Tat avec la

protéine adaptatrice p62/SQSTM1. Néanmoins, ce processus est rapidement neutralisé par le

virus pour favoriser sa réplication et propagation (Sagnier, Daussy et al. 2014).

81

L’autophagie protège les patients contrôleurs ou «nonprogressor » infectés par le VIH-1 qui

restent cliniquement stables pendant des années en absence de thérapie antirétrovirale. Elle

cible des composants viraux afin de les dégrader. Des cellules mononuclées du sang

périphérique provenant de ces patients présentent une quantité plus élevée de vésicules

autophagiques, associé à une expression accrue des marqueurs autophagiques par rapport aux

patients avec une infection normale. Il faut noter que le traitement de ces cellules avec la

rapamycin, inhibiteur mTOR, amène à une réponse autophagique plus efficace, ce qui conduit à

une réduction de la production virale (Nardacci, Amendola et al. 2014).

B. Interaction entre les infections herpétiques et l’autophagie

Les virus de la famille des Herpesviridae ont développé différentes stratégies pour manipuler

l’induction de l’autophagie ou l’inhibition de ce processus et cela peut dépendre du type

cellulaire et du stade de l'infection. Les recherches menées durant les 10 dernières années ont

démontré l'impact des virus de cette famille sur l'autophagie non seulement au cours des

infections productives, mais aussi dans les infections latentes.

i. Cytomégalovirus humain (HCMV)

L’étude de la modulation de l’autophagie par le HCMV dans notre laboratoire et celui de Chris

Preston a montré que celui-ci induit la formation des autophagosomes dès 2 heures post

infection dans les fibroblastes humains (Figure 26) (McFarlane, Aitken et al. 2011; Chaumorcel,

Lussignol et al. 2012). Le mécanisme par lequel le HCMV stimule l'autophagie n’est pas

clairement établi. Nous avons montré que la synthèse des protéines virales n’est pas nécessaire

à cette induction (Chaumorcel, Lussignol et al. 2012). Mac Farlane et al. ont proposé que

l'autophagie soit stimulée en réponse à la présence d'ADN viral dans le cytosol (McFarlane,

Aitken et al. 2011). Cependant, l’interaction du HCMV avec les protéoglycanes héparane sulfate

à la surface cellulaire est nécessaire pour stimuler l'autophagie et la liaison entre TLR2 et le

HCMV semble également jouer un rôle (résultats du laboratoire non publiés). Il se peut donc que

l’interaction du virus avec des récepteurs cellulaires soit suffisante pour déclencher l’autophagie.

L'importance de l'induction précoce de l'autophagie par le HCMV reste à déterminer. Il peut

s’agir d’une réponse au stress de la cellule à l'infection qui contribuerait à une réponse

immunitaire innée et adaptative.

Quel que soit le mécanisme responsable de l'induction de l'autophagie, le HCMV est ensuite

capable d'inhiber l'autophagie à partir de 18-24h p.i. (Figure 26) (Chaumorcel, Souquere et al.

2008; Chaumorcel, Lussignol et al. 2012). L’expression des protéines virales est nécessaire à

82

l’inhibition de l’autophagie. Nous avons observé que la protéine virale TRS1 est capable

d’inhiber l’autophagie (Chaumorcel, Lussignol et al. 2012). Bien qu’elle interagisse avec PKR

(Hakki, Marshall et al. 2006), l’activité antiautophagique de TRS1 est dépendante de son

interaction avec Beclin 1 (Chaumorcel, Lussignol et al. 2012). Il a été proposé récemment, basé

uniquement sur des résultats in silico, que le miRNA du HCMV miR UL148D puisse participer à

l’inhibition de l’autophagie, en reconnaissant la région 3’ non codante d’ERN1, un gène de

réponse au stress du RE activateur de l’autophagie (Babu, Pandeya et al. 2014).

Figure 26 : Modulation de l’autophagie par le HCMV au cours du cycle viral. Une stimulation de l’autophagie a été observée au cours des étapes précoces de l’infection par le HCMV. La liaison du virus aux PGHS est nécessaire à la stimulation précoce de l’autophagie. Le génome viral semble être également impliqué dans cette stimulation, mais la fixation du virus sur TLR2 pourrait également jouer un rôle. Le HCMV inhibe l’autophagie aux étapes tardives de l’infection. La protéine précoce TRS1 est impliquée dans cette inhibition par interaction avec Beclin 1.

L'impact de l'autophagie sur l’infection par le HCMV n’est pas très bien connu. Une étude a

montré que l’autophagie pourrait participer à la présentation des antigènes UL138 et pp65 du

HCMV par le CMH de classe I, par une voie indépendante du protéasome et de TAP

(transporter associated with antigen processing) (Tey and Khanna 2012). Ce processus peut

83

permettre à la cellule de contrecarrer les mécanismes d’évasion que le HCMV a développée

pour échapper à la présentation par le CMH de classe I (voir chapitre 1).

L’interleukine-10 (IL-10) est induite au cours de l’infection par le HCMV et elle joue un rôle

protecteur contre le virus. Une étude récente a montré que dans les fibroblastes humains, l’ajout

d’IL10 dans les étapes précoces de l’infection par le HCMV inhibe la réplication virale,

probablement en bloquant l’induction de l’autophagie (Wang, Zhang et al. 2014). En effet, l’IL10

inhibe le flux autophagique induit par la carence ou par l’infection virale, et active la voie de

signalisation Akt/PI3K. Ceci suggère que la stimulation de l’autophagie par le HCMV est une

réponse de la cellule et constitue bien un mécanisme de défense aux étapes précoces de

l’infection.

ii. Herpesvirus type 1 (HSV-1)

HSV-1 a la capacité de moduler différemment l'autophagie en fonction des types cellulaires.

Dans des fibroblastes murins, HSV-1 sauvage n’induit pas l’autophagie (Talloczy, Jiang et al.

2002). En revanche, il a été montré qu’un virus mutant (HSV-134.5) dont la protéine ICP34.5

n’est pas exprimée, entraine une stimulation importante et rapide de l’autophagie. Il est

intéressant de noter que c’est un virus défectif in vivo. La voie PKR/eIF2 est nécessaire pour

l’induction de cette autophagie viro-induite (Talloczy, Jiang et al. 2002). Une autre étude a

montré qu’un virus mutant totalement défectif in vitro induit l'autophagie à la phase très précoce

de l'infection, indépendamment de la synthèse des protéines virales (McFarlane, Aitken et al.

2011).

HSV-1 induit la macroautophagie mais aussi une forme spéciale de l'autophagie qui utilise

l'enveloppe nucléaire en tant que source de membrane. Cette forme est appelée le NEDA

(nuclear envelope-derived autophagy) et elle a été initialement observée dans les macrophages

(English, Chemali et al. 2009) puis dans de nombreux types cellulaires (Radtke, English et al.

2013). En effet, en plus des structures habituelles à double membranes, des structures à quatre

couches de membrane décorées par LC3 provenant de l'enveloppe nucléaire s’accumulent dans

le cytoplasme vers 6-8h post l'infection. Ces structures contiennent de grandes quantités de la

glycoprotéine d’enveloppe gB et sont décorées spécifiquement par la forme LC3A. Elles ne sont

pas présentes dans les cellules non infectées traitées par la rapamycin, ce qui suggère qu'elles

sont dues à une réponse spécifique de l'hôte à l’infection par HSV-1 distincte de l’autophagie.

Une stimulation de l’autophagie a été observée dans des macrophages infectés par le virus

sauvage ou le virus mutant HSV1-134.5 mais la forme NEDA n’a été observée qu’après

infection par le virus sauvage (English, Chemali et al. 2009). L’expression de la glycoprotéine

84

d’enveloppe gH, une protéine tardive, suffit à induire le NEDA (Radtke, English et al. 2013). Il a

été montré que, dans les macrophages, la stimulation de l’autophagie par HSV-1 permet

d’améliorer la présentation de la glycoprotéine d’enveloppe gB par le CMH de classe I aux

lymphocytes T CD8 (English, Chemali et al. 2009).

Dans le cas de l’infection des cellules dendritiques (DC), HSV-1 induit une autophagie

incomplète (Gobeil and Leib 2012). En effet, une accumulation des autophagosomes et du

substrat autophagique p62/SQSTM1 a été observée. Contrairement à ce qui est observé dans

les fibroblastes et les neurones, la protéine ICP34.5 ne bloque pas l'induction de l'autophagie

dans ces cellules, mais elle empêche plutôt la maturation des autophagosomes. De plus, elle

interfère avec la capacité des DC à stimuler l'activation des lymphocytes T et leur prolifération

en réponse à des antigènes intracellulaires (Gobeil and Leib 2012).

HSV-1 induit l'autophagie dans les cellules myéloïdes (macrophages et DC) en réponse à l'ADN

viral cytosolique, indépendamment de l'expression des gènes viraux. Contrairement à ce qui est

observé dans les fibroblastes, l’autophagie est déclenchée d'une manière indépendante de

PKR/eIF2. L’activation de l’autophagie dépend en fait de STING (stimulator of interferon

genes), une protéine cellulaire transmembranaire nécessaire à l’induction de cytokines

proinflammatoires et d’IFN de type I (Rasmussen, Horan et al. 2011).

HSV-1 est donc capable de stimuler l’autophagie dans différents types cellulaires par des

mécanismes différents selon le type cellulaire. Toutefois, HSV-1 a aussi mis en place des

systèmes d’échappement de l’autophagie, grâce à l’expression de certaines protéines virales.

Les premiers travaux sur la modulation de l’autophagie par HSV-1 ont montré l’implication du

facteur de virulence ICP34.5 dans l’inhibition de l'autophagie dans les fibroblastes (Talloczy,

Jiang et al. 2002).

La protéine ICP34.5 inhibe la voie PKR/eIF2 en recrutant la protéine phosphatase 1α (pp1α)

qui déphosphoryle eIF2α−P, empêchant ainsi l’inhibition de la traduction protéique (He, Gross et

al. 1997). Cette voie est également connectée à l’activation de l’autophagie (voir paragraphe

3.C.ii). Cependant, ICP34.5 inhibe l’autophagie indépendamment de PKR (Orvedahl, Alexander

et al. 2007; Lussignol, Queval et al. 2013). Orvedahl et al. ont montré qu’ICP34.5 se lie

directement à Beclin 1, qu’il inhibe sa fonction et que la région 68-87 d’ICP34.5 ou BBD (pour

Beclin 1 binding domain) est indispensable à l’inhibition de l’autophagie (Orvedahl, Alexander et

al. 2007). Contrairement à HSV-134.5, un virus mutant HSV-1 34.5BBD dans lequel seul le

85

domaine de liaison d’ICP34.5 à Beclin 1 a été supprimé, n’est pas un virus défectif. Il inhibe la

phosphorylation d’eIF2 et lève le blocage de la synthèse protéique mais il n’est en revanche

pas capable d’inhiber l’autophagie dans des fibroblastes et dans des neurones. Ceci démontre

que c’est bien la liaison à Beclin 1 qui permet à ICP34.5 d’inhiber l’autophagie. ICP34.5 a aussi

la capacité de bloquer la maturation des autophagosomes dans les DC en se liant à Beclin 1

(Gobeil and Leib 2012).

L’inhibition de l’autophagie par ICP34.5 joue un rôle important dans la pathogenèse et la

neurovirulence d’HSV-1. Des études basées sur la souris ont démontré que le virus mutant

HSV-1 34.5BBD était neuroatténué chez les souris, puisque le virus mutant se multiplie moins

bien dans le cerveau et que les souris meurent moins. Ceci suggère un rôle important de

l’interaction ICP34.5/Beclin 1 dans le déroulement de l’encéphalite herpétique (Orvedahl,

Alexander et al. 2007). Le domaine de liaison à Beclin 1 joue aussi un rôle clé dans l'inhibition

de la présentation des antigènes viraux par le CMH II via l’autophagie. Le virus mutant HSV-1

34.5BBD n’est plus capable de contrôler l’immunité adaptative, car il induit une activation de la

production d'IFN et d'interleukine, ce qui induit une forte réponse des lymphocytes (Leib,

Alexander et al. 2009). L’autophagie participe à la présentation de la glycoprotéine gB d’HSV-1

par le CMH I dans les macrophages (English, Chemali et al. 2009). Dans les DC, ICP34.34.5

inhibe la maturation des autophagosomes, la présentation des antigènes viraux par le CMH I et

l'activation des cellules T Récemment, nous avons mis en évidence dans notre laboratoire

qu’une deuxième protéine d’HSV-1 inhibe l’autophagie, de manière dépendante de la kinase

PKR (Lussignol, Queval et al. 2013). La protéine Us11, est une protéine tardive qui interagit

directement avec PKR et inhibe la formation des autophagosomes dans les fibroblastes et les

cellules HeLa. L’expression très précoce de Us11 est suffisante pour que HSV-1 puisse

s'échapper de la machinerie autophagique en l’absence d’ICP34.5 (Lussignol, Queval et al.

2013).

L'influence de l'autophagie sur la réplication d’HSV-1 est controversée et des résultats

contradictoires ont été publiés. Talloczy et al. ont rapporté que l’autophagie dégrade

efficacement les particules virales (Talloczy, Virgin et al. 2006), tandis qu’Alexander et al.

n’observent pas de différence dans le niveau de réplication dans des fibroblastes déficientes en

Atg5 (Alexander, Ward et al. 2007). Des études ultérieures ont montré que le rôle de

l'autophagie dans la réplication de HSV-1 dépend du type cellulaire. Par exemple, dans les

neurones, l’autophagie permet de limiter la réplication virale, alors qu’elle n’a pas de rôle dans

les cellules épithéliales et les autres cellules mitotiques (Yordy, Iijima et al. 2012; Yordy and

86

Iwasaki 2013). Une étude récente a montré que l’induction de l’autophagie par le MG132, un

inhibiteur du protéasome, entraine une diminution significative de la production virale dans

différents types cellulaires (Yakoub and Shukla 2015). Ceci est en faveur d’un effet antiviral de

l’autophagie vis-à-vis de HSV-1 et pourrait être utilisé potentiellement comme cible

thérapeutique.

Figure 27 : Manipulation de l’autophagie par les herpesvirus. Les membres de la famille des Herpesviridae ont mis en place diverses stratégies pour inhiber l'autophagie. Lors d'une infection, les protéines virales agissent sur différentes voies de signalisation qui régulent l'autophagie. La formation du phagophore peut être inhibée par l'interaction avec TSC2, Beclin 1 et Atg3. L’implication d’UL38 du HCMV, qui est capable de se lier à TSC2, dans l’inhibition de l’autophagie n’est pas établie. De plus, certaines protéines virales peuvent bloquer PKR mais seule la protéine Us11 entraine une inhibition de l’autophagie via PKR.

Il a été récemment mis en évidence des différences dans la régulation de l’autophagie en

fonction de l’âge, entre nouveau-né et adulte (Wilcox, Wadhwani et al. 2015). Le BBD d’ICP34.5

ne permet pas d’inhiber l’autophagie dans le cerveau des souriceaux nouveau-nés,

contrairement à ce qui se passe dans le cerveau des adultes, et l’autophagie y est induite par

une voie indépendante de l’IFN.

HSV-1 est un virus neurotrope qui persiste à vie dans les neurones, en se réactivant

régulièrement. Il a été proposé que HSV-1 puisse avoir une influence sur le développement de

la maladie d'Alzheimer, car une accumulation de la protéine α-amyloïde a été observée dans les

autophagosomes des cellules infectées (Santana, Recuero et al. 2012). Les autophagosomes

s’accumulent dans les cellules de neuroblastome infectées par HSV-1 par inhibition de la fusion

entre autophagosome et lysosome. Il a été proposé que le blocage de l’autophagie par HSV-1

participe à l’accumulation des agrégats protéiques dans la maladie d’Alzheimer, ce qui pourrait

87

expliquer l’association potentielle entre HSV-1 et pathologies neurodégénératives (Itzhaki,

Cosby et al. 2008; Itzhaki and Wozniak 2008) .

iii. Virus de la Varicelle et du Zona (VZV)

Le virus de la varicelle et du zona (VZV ou HHV3), qui appartient à la sous-famille des

Alphaherpesvirinae, induit une réponse autophagique au cours de l’infection dans des

fibroblastes et dans des cellules épithéliales de mélanome. Ces résultats ont été confirmés in

vivo en étudiant des vésicules de zona issues de la peau (Takahashi, Jackson et al. 2009).

L’induction de l’autophagie est due au stress du RE liée à la production excessive des

glycoprotéines virales (Carpenter, Jackson et al. 2011). Le niveau d'autophagie induit par le VZV

est similaire à celui des modulateurs chimiques de l'autophagie, tels que le tréhalose ou la

tunicamycine. Il a été initialement proposé que l’autophagie permette à la cellule d’atténuer le

stress causé par l'infection virale Cependant, il a été montré récemment que l’autophagie est

bénéfique pour le VZV et que l’inhibition de l’autophagie par la 3MA ou des siRNA diminue le

titre viral (Buckingham, Carpenter et al. 2014). En effet, l'autophagie améliore la biosynthèse et

le traitement de la glycoprotéine virale gE (Buckingham, Carpenter et al. 2014).

Contrairement au HSV-1, le VZV n’est pas capable d'inhiber l'autophagie. En effet, il ne possède

pas d’homologues d’ICP34.5 ou d’US11 et il induit un flux autophagique complet (Buckingham,

Carpenter et al. 2014). La constatation que le flux autophagique est maintenu dans les cellules

infectées par le VZV suggère que ce processus a un effet proviral important in vivo

(Buckingham, Carpenter et al. 2015).

iv. Epstein-Barr virus (EBV)

Le virus d'Epstein-Barr (EBV ou HHV-4) appartient à la sous-famille des Gammaherpesvirinae. Il

se réplique dans les cellules buccales et établit sa latence dans les lymphocytes B. Les données

sur l’implication de l’EBV dans l’autophagie au cours de la latence sont limitées à deux

antigènes viraux, EBNA1 (Epstein-Barr nuclear antigen 1) et LMP1 (Latent Membrane Protein

1). EBV, comme d'autres membres de cette sous-famille, possède deux homologues viraux de

Bcl-2, EB2 et BHRF1, dont on ne sait pas encore s’ils sont capables de contrecarrer

l'autophagie (Esclatine and Lussignol 2014).

La protéine LMP1 est une oncoprotéine qui modifie la physiologie des cellules B en raison de sa

capacité à contrôler l’autophagie. Des niveaux modérés de LMP1 induisent la prolifération des

cellules B, alors que des niveaux élevés contribuent à l’inhibition de la synthèse protéique.

88

L'activation de l'autophagie dépend du niveau de LMP1 ; les cellules avec un faible niveau de

LMP1 possèdent de nombreux autophagosomes tandis que les cellules avec des niveaux

élevés ont des autolysosomes (Lee and Sugden 2008; Lee, Lee et al. 2009). L’activation de

l’autophagie par LMP1 semble impliquer la kinase PERK, une des kinases d’eIF2 (Lee and

Sugden 2008). Il semble que la diminution de LMP1 par la dégradation autophagique induit la

prolifération des cellules B.

La protéine EBNA1 est un exemple d'antigène endogène présenté par le CMH de classe II, car

sa présentation par le CMH de classe I est bloquée. L’autophagie intervient dans cette

présentation (Paludan, Schmid et al. 2005). Paludan et al ont montré que le blocage de

l'acidification des lysosomes entraine l’accumulation d’EBNA1 dans les autophagosomes et que

l’inhibition de l'autophagie conduit à une diminution de la reconnaissance spécifique d’EBNA1

par les lymphocytes T CD4+. En revanche, la présentation par les molécules du CMH des deux

autres protéines nucléaires de latence, EBNA2 et EBNA3C, n’utilise pas l’autophagie (Taylor,

Long et al. 2006).

Plusieurs études ont récemment montré l’implication de l’autophagie au moment de la

réactivation de l’EBV dans les lymphocytes B. Elle a un effet proviral à ce moment-là. Il a été

montré que la réactivation de l’EBV entraine une accumulation de LC3 et d’autophagosomes et

que la protéine Rta, un facteur de transcription de l’EBV qui permet la transcription de gènes

nécessaires à la réactivation, semble impliquée dans cette induction de l’autophagie (Hung,

Chen et al. 2014). En effet, l'expression de Rta active aussi la transcription de gènes de

l’autophagie, y compris LC3A, LC3B, et ATG9B, ainsi que des gènes impliqués dans la

régulation de l'autophagie, comme TNF, IRGM, et TRAIL (Hung, Chen et al. 2014). Cependant,

alors que les autophagosomes se forment lors de la réactivation, ils ne fusionnent pas avec les

lysosomes, et par conséquent, l'autophagie est en fait inhibée (Granato, Santarelli et al. 2014). Il

a été montré que l’inhibition de l'autophagie diminue la réplication virale et que des particules

virales ont été observées à l’intérieur des vésicules autophagiques dans le cytoplasme des

cellules infectées (Granato, Santarelli et al. 2014). Ces données suggèrent que l'EBV exploite la

machinerie autophagique pour son transport en vue d'améliorer sa production virale.

L’expression de Zebra stimule l’autophagie dans les cellules EBV négatives mais bloque la

maturation des autophagosomes dans les cellules qui possèdent le génome de l’EBV (Granato,

Santarelli et al. 2014). Cependant, Huang et al n’avaient à l’inverse observé aucune modulation

de l’autophagie après expression de Zebra (Hung, Chen et al. 2014).

Nowag et al. ont confirmé récemment que l'EBV détourne l’autophagie en induisant une

autophagie incomplète et qu’il utilise les membranes autophagiques pour l'acquisition de son

89

enveloppe (Nowag, Guhl et al. 2014; Nowag and Munz 2015). L'inhibition de l’autophagie

diminue la production de particules infectieuses et conduit à l'accumulation d'ADN viral dans le

cytosol alors que la stimulation pharmacologique améliore la production des virus infectieux. La

protéine LC3 a été retrouvée dans les particules virales purifiées, ce qui suggère que l'EBV la

recrute pour former son enveloppe au niveau du cytosol (Nowag, Guhl et al. 2014; Nowag and

Munz 2015).

v. Herpesvirus associé au Sarcome de Kaposi (KSHV)

KSHV ou HHV-8 est un membre de la sous-famille des Gammaherpesvirinae. Ce virus a

développé des stratégies pour contrecarrer à la fois l'apoptose et l'autophagie en exprimant

deux protéines virales pendant la phase de latence ; un homologue viral de la protéine cellulaire

Bcl-2 (vBcl-2) qui se lie à Beclin 1, inhibant l'autophagie, et un homologue viral de FLIP (FLICE-

like inhibitor protein) (vFLIP) qui interagit avec Atg3 pour inhiber la conjugaison de LC3

(Cavignac and Esclatine 2010). La protéine vBcl-2 se lie au domaine BH3 de Beclin 1 pour

bloquer la formation des autophagosomes. Contrairement à l'interaction entre le Bcl-2 cellulaire

et Beclin 1, qui peut notamment être modulée par la carence nutritionnelle, l’association de vBcl-

2 à Beclin 1 est irréversible, entrainant une répression constante de l'autophagie dans les

cellules infectées.

L’inhibition de l’interaction entre vFLIP et Atg3 induit l’autophagie et la mort cellulaire associée à

l’autophagie dans les cellules infectées par KSHV in vitro. De la même façon, l’inhibition de

vFLIP in vivo induit la régression tumorale. Ceci suggère que vFLIP pourrait prévenir la mort

autophagique et cette protéine pourrait être une cible thérapeutique intéressante pour prévenir

la formation des tumeurs associées à KSHV.

L’autophagie semble avoir un rôle important dans la pathogénèse de KSHV, puisque pendant la

phase latente du KSHV, le stress oncogénique aigu active l'autophagie et bloque le cycle

cellulaire, ce qui déclenche un mécanisme de sénescence cellulaire, connu sous le nom d’OIS

(oncogene-induced senescence). L’expression de vFLIP bloque l’autophagie et par conséquent

limite l’OIS, ce qui facilite la prolifération cellulaire due à KSHV (Leidal, Cyr et al. 2012; Dong

and Levine 2013). L’OIS a été décrite comme un mécanisme important qui supprime les

tumeurs et limite l’effet des virus oncogènes. Contrairement à ce rôle de l'autophagie en tant

que mécanisme de défense anti-KSHV, une autre étude a révélé que l'autophagie peut avoir

une fonction pro-virale lors de l'infection par le KSHV. Au cours de la réactivation, l’autophagie

est cette fois-ci induite par la protéine RTA (replication and transcription activator), une protéine

90

essentielle pour la réactivation du KSHV (Wen, Yang et al. 2010). L’inhibition génétique ou

pharmacologique de l'autophagie affecte la réactivation du KSHV et entraine une diminution de

la réplication virale et de l'expression de RTA (Dong and Levine 2013).

En plus de vBcl-2 et de vFLIP, le KSHV code aussi la protéine K7 qui interagit avec la protéine

autophagique Rubicon et inhibe la maturation des autophagosomes en bloquant l’activité

enzymatique de la PI3K de classe III (Liang, Chang et al. 2013).

Deux études très récentes ont rapporté de manière concomitante l’importance de vBcl-2 au

cours de l’infection (Gelgor, Kalt et al. 2015; Liang, Chang et al. 2015). La protéine vBcl-2 est

essentielle pour le cycle lytique du KSHV, alors que les protéines vFLIP et K7 ne sont pas

indispensables. L’absence de vBcl-2 du génome de KSHV diminue la réactivation, l'expression

des gènes lytiques, la réplication de l'ADN viral, et évidemment la production de particules

infectieuses. Cependant, le rôle essentiel de vBcl-2 est indépendant de ses fonctions anti-

apoptotique et anti-autophagique. Ceci indique que vBcl-2 a au moins trois fonctions

importantes et séparées génétiquement pour moduler à la fois la signalisation cellulaire et le

cycle viral.

91

Présentation des

travaux

Article

92

93

Introduction de l’article

L’autophagie est un mécanisme vacuolaire constitutif. Elle aboutit à la dégradation des protéines

à durée de vie longue et des organites grâce à la propriété dégradative des enzymes

lysosomales. A côté de ce rôle physiologique, l’autophagie participe aux mécanismes de

défense de la cellule infectée en débarrassant directement la cellule des microorganismes

pathogènes, y compris les virus. Par ailleurs, certains virus ont développé des mécanismes pour

détourner ou neutraliser cette défense.

Le cytomégalovirus humain est un virus ubiquitaire responsable d’infections opportunistes chez

les personnes immunodéprimées qui appartient à la famille des Herpesviridae. Plusieurs virus

de cette famille expriment des protéines capables d’inhiber l’autophagie.

Il a été montré au laboratoire que le HCMV module l’autophagie dans les fibroblastes humains

dans deux directions opposées. Quelques heures après l’infection, le HCMV stimule

l’autophagie indépendamment de la synthèse des protéines virales, puis l’autophagie est inhibée

dans un second temps, grâce à l’expression de protéines virales néosynthétisées (Chaumorcel,

Souquere et al. 2008; Chaumorcel, Lussignol et al. 2012). Des propriétés anti-autophagiques

ont été identifiées par notre laboratoire chez la protéine virale TRS1 (Chaumorcel, Lussignol et

al. 2012).

La cellule va mettre en place des stratégies de défense, d’immunité innée ou acquise, pour lutter

contre les virus. Le HCMV a développé des mécanismes pour contrecarrer ces défenses mises

en place par la cellule, en inhibant l’apoptose, en limitant la présentation aux lymphocytes T des

antigènes via le CMH de classe I et II ou encore en supprimant la reconnaissance des cellules

infectées par les cellules NK. Parmi les mécanismes antiviraux mis en place par la cellule, on

trouve également l’arrêt de la synthèse protéique par activation de la voie PKR, suite à la

production d’ARNdb et d’IFN, qui aboutit à l’inhibition de la réplication virale. Le HCMV code

plusieurs protéines virales qui lui permettent d’échapper à l’ensemble de ces mécanismes.

Parmi ces protéines, il a été mis en évidence que les protéines IRS1 et TRS1 bloquent

directement PKR et empêchent l'arrêt de la synthèse protéique (Hakki, Marshall et al. 2006). Un

virus mutant HCMV n’exprimant ni TRS1 ni IRS1, ne se réplique pas, car la voie PKR est

toujours activée et aucune protéine virale n’est synthétisée.

94

L’autophagie est également considérée comme un mécanisme de défense et son activation est

régulée par de nombreuses voies de signalisation, comme la voie mTOR. L’activation de PKR

peut entrainer la stimulation de l’autophagie (Talloczy, Jiang et al. 2002).

Dans cet article, nous avons étudié la capacité d’IRS1 et de TRS1, qui partagent une homologie

importante de séquence, à inhiber l’autophagie viro-induite ou celle induite par la carence

nutritionnelle. Nous nous sommes intéressés aux mécanismes d’action de ces deux protéines,

et notamment à l’implication de PKR et de la protéine autophagique Beclin 1 dans l’inhibition de

l’autophagie. Nous avons aussi exploré le rôle de l'inhibition de l'autophagie par ces deux

protéines au cours de l’infection virale.

1

Analysis of the role of autophagy inhibition by two complementary human 1

cytomegalovirus BECN1/Beclin 1-binding proteins 2

Lina Mouna1, Eva Hernandez1, Dorine Bonte2, Rebekka Brost3, Larbi Amazit4, Laura R. Delgui5, 3

Wolfram Brune3, Adam P. Geballe6, Isabelle Beau4, ╝, and Audrey Esclatine1, ╝. 4

*Correspondence to: Audrey Esclatine; Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), 5 rue 5

Jean Baptiste Clément, Faculté de Pharmacie, 92296 Châtenay-Malabry cedex, France; Tel: 6

011 33 1 46 83 52 92; Email: audrey.esclatine@u-psud.fr 7

1. Institute for Integrative Biology of the Cell (I2BC), CEA, CNRS, Univ Paris-Sud, Université 8

Paris-Saclay, 91198 Gif-sur-Yvette cedex, France 9

2. CNRS UMR8200, Univ Paris-Sud, Institut Gustave Roussy, Villejuif, France 10

3. Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, Martinistr. 52, 20251 11

Hamburg, Germany 12

4. INSERM UMR-S-1185, Faculty of medicine, Univ Paris-Sud, France 13

5. Instituto de Histología y Embriología (IHEM), Universidad Nacional de Cuyo-CONICET, 14

Mendoza, Argentina 15

6. Fred Hutchinson Cancer Research Center and University of Washington, Seattle, USA 16

╝ these authors equally contributed 17

18

Running title 19

HCMV encodes two BECN1-binding proteins which inhibit autophagy 20

Keywords 21

Autophagy, BECN1, cytomegalovirus, EIF2AK2/PKR, IRS1, TRS1 22

Abbreviations: 3MA, 3 methyl adenine; ATG, autophagy-related; BAC, bacterial artificial 23

chromosome; BBD, BECN1 binding domain; CCD, coiled-coil domain; CQ, chloroquine; dsRNA, 24

double-stranded RNA; EIF2AK2/PKR, eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2; 25

EIF2S1, eukaryotic translation initiation factor 2 subunit 1 alpha; FCS, fetal calf serum; HCMV, 26

human cytomegalovirus; HSV-1, herpes simplex virus type 1; ICP34.5, infected cell protein 34.5; 27

IE1 and IE2, immediate early proteins; IRS1, internal repeat short protein 1; MAP1LC3/LC3, 28

microtubule-associated protein 1 light chain 3 ; M CD methyl beta cyclodextrin; MEF, mouse 29

embryonic fibroblast; MOI multiplicity of infection; ORF, open reading frame; pi, post infection; 30

2

PtdIns3K, phosphatidylinositol 3-kinase; SQSTM1/p62 , sequestosome 1; TRS1, terminal repeat 1

short protein 1; UVRAG, UV radiation resistance associated gene; WT, wild type. 2

Conflict-of-interest: The authors have no conflict-of-interest or financial disclosures to report. 3

4

3

Abstract 1

Autophagy is activated early after human cytomegalovirus (HCMV) infection, but later on the 2

virus blocks autophagy. Here we characterized 2 HCMV proteins, TRS1 and IRS1, which inhibit 3

autophagy during infection. Expression of either TRS1 or IRS1 was able to block autophagy in 4

different cell lines, independently of the EIF2S1 kinase, EIF2AK2/PKR. Instead, TRS1 and IRS1 5

interacted with the autophagy protein BECN1/Beclin 1. We mapped the BECN1-binding domain 6

(BBD) of IRS1 and TRS1 and found it to be essential for autophagy inhibition. Mutant viruses 7

that express only IRS1 or TRS1 partially controlled autophagy, whereas a double mutant virus 8

expressing neither protein stimulated autophagy. A mutant virus that did not express IRS1 and 9

expressed a truncated form of TRS1 in which the BBD was deleted, failed to control autophagy. 10

However, this mutant virus had similar replication kinetics as wild-type virus, suggesting that 11

autophagy inhibition is not critical for viral replication. In fact, using pharmacological modulators 12

of autophagy and inhibition of autophagy by shRNA knockdown, we discovered that stimulating 13

autophagy enhanced viral replication. Conversely, inhibiting autophagy decreased HCMV 14

infection. Thus, our results demonstrate a new proviral role of autophagy for a DNA virus. 15

16

4

Introduction 1

Autophagy is an evolutionary conserved degradation process, which has been described 2

as a self-defense mechanism against intracellular microorganisms.1, 2 Indeed, autophagy can 3

participate in the control of viral infection by direct degradation of viral components, by regulating 4

the intensity of the inflammatory response or by facilitating the processing of viral antigens for 5

presentation by major histocompatibility complex (MHC).3 Autophagy induction can therefore be 6

detrimental for viral infections, but also beneficial, when it is hijacked and regulated by viruses. 7

Indeed, besides its recognized role as a scaffold platform for replication of positive-strand RNA 8

viruses, autophagy contributes to viral infectivity through multiple mechanisms. This cellular 9

process can provide energy, lipid membranes, or a vehicle for the virus to get out the cell and 10

can also improve the survival of the infected cell and thereby increase viral production.4, 5 11

Viruses can also specifically redirect cellular signaling mediators to autophagosomal degradation 12

to dampen the inflammatory response.6 On the other hand, autophagy enhances the delivery of 13

viral antigens to MHC class I and II complexes and improves antigen presentation. For example, 14

presentation of 3 antigens of human cytomegalovirus (HCMV), classically processed in a 15

proteasome-dependent manner, has been described to also occur via a vacuolar pathway 16

involving autophagosomes, lysosomal proteases and recycling HLA-molecules.7 Interestingly, 17

we and others have previously demonstrated that HCMV modulates autophagy during its life 18

cycle, stimulating autophagic flux shortly after its entry.8, 9 Then, after 18 to 24 h of infection, 19

autophagosome formation is blocked by expression of viral proteins.8 20

HCMV is a ubiquitous opportunistic pathogen virus, which, like other viruses in the 21

Herpesviridae family, has the ability to persist in the host in an inactive state known as latency 22

after the primary infection subsides. HCMV infections in immunocompromised patients cause 23

substantial morbidity and mortality, especially among transplant recipients, while infection in 24

immunocompetent individuals is generally mild or asymptomatic. Studies of HCMV multiplication 25

5

in vitro showed that viral cycle occurs in a series of stages. After entry of the nucleocapsid into 1

the cell, the viral genome is delivered to the nucleus to be transcribed and replicated. 2

Transcription is a complex process with 3 classes of proteins that need to be made for 3

production of mature virions. Synthesis of immediate early proteins, which are nonstructural 4

proteins involved in transcriptional regulation, is followed by expression of early genes, encoding 5

proteins mainly involved in viral DNA replication. Synthesis of late proteins, structural 6

components of the virus, is initiated after replication of the viral genome. Viral nucleocapsids 7

assemble within the nucleus and bud across both the inner and outer nuclear membranes to 8

transit to the cytoplasm. Naked cytoplasmic nucleocapsids acquire their tegument and then their 9

final envelope from the trans-Golgi network or from the endocytic pathway.10 Mature virions are 10

transported inside vacuoles to the cell surface to be secreted. 11

HCMV has a linear 235-kbp double-stranded DNA genome with an estimated coding 12

capacity between 160 and 200 open reading frames (ORFs) or even possibly as many as ~750 13

ORFs, as predicted by recent ribosomal profiling studies.11 The genome consists of 2 regions of 14

unique sequences, flanked by 2 sets of inverted repeats (TRL-IRL) and (IRS-TRS). Partially 15

located in one set of inverted repeats, IRS1 and TRS1 ORFs encode 2 immediate early proteins 16

of 847 and 795 amino acids, respectively, with identical N-terminal domains and divergent C-17

terminal regions.12 IRS1 and TRS1 have been reported to inhibit the phosphorylation of the 18

translation initiation factor EIF2S1, preventing the shutoff of cellular protein synthesis that occurs 19

upon infection.13, 14 They are able to rescue the function of the vaccinia virus E3L protein, in 20

VV E3L infected cells, to prevent activation of the kinase EIF2AK2/PKR (eukaryotic translation 21

initiation factor 2-alpha kinase 2).13 When EIF2AK2 binds to double-stranded RNA (dsRNA), it 22

dimerizes and autophosphorylates and then, it phosphorylates its substrate EIF2S1. 23

Phosphorylated EIF2S1 inhibits guanine nucleotide exchange factor EIF2B, resulting in a 24

shutdown of protein synthesis that in turn hinders viral production. Herpesviruses produce 25

6

dsRNA during infection, likely as a result of hybridization of convergent overlapping mRNAs. 1

IRS1 and TRS1 bind to both dsRNA and EIF2AK2 to block EIF2AK2 and that these interactions 2

require their carboxy termini.15-17 Because TRS1 antagonized EIF2AK2 and the product of 3

activated EIF2AK2, phosphorylated EIF2S1, can activate autophagy 18, we tested the impact of 4

TRS1 and found that it inhibited autophagy.8 5

Here we explored the functions of TRS1 and IRS1 as regulators of autophagy by HCMV 6

using recombinant viruses. We show that each protein is able to block autophagy in the context 7

of HCMV replication and that an N-terminal domain that is identical in the 2 proteins is essential 8

for this function. Coexpression of both TRS1 and IRS1 is necessary to block autophagic flux. 9

However, blocking autophagy appears not to be essential for viral replication. In fact, analyses 10

employing pharmacological modulators of autophagy and depletion of ATG16L1 suggest that 11

autophagy plays a proviral role in the HCMV cell cycle. 12

7

Results 1

IRS1 and TRS1 both inhibit starvation-induced autophagy. 2

We used several assays to investigate the impact of the 2 HCMV proteins TRS1 and 3

IRS1 on autophagy. First, we transiently transfected HeLa cells that stably express GFP-LC3B 4

with an IRS1 or TRS1 expression vector or with an empty vector. After inducing autophagy by 5

starvation for 4 h prior to fixation, we quantified GFP-LC3 dots in cells expressing viral proteins. 6

Fig. 1A and B shows that the number of LC3 dots per cell was lower in HeLa cells expressing 7

IRS1 and TRS1 than in control cells. To confirm these findings, we optimized an automated 8

quantification of GFP-LC3 dots using a Cellomics ArrayScan microscope (Fig. 1C). We 9

measured several parameters including the number of GFP-LC3 dots per cell, the total intensity 10

per cell, and the total area in the cells that was covered by GFP-LC3 dots, and the average area 11

of individual GFP-LC3 dots. Cells transfected with IRS1 or TRS1 displayed reduction of these 3 12

former parameters, confirming a global decrease in the number of autophagosomes. Only the 13

size of the autophagosomes (GFP-LC3 spot average area) was not modified by IRS1 or TRS1 14

expression, indicating that the decrease in the average number of dots is not simply due to 15

fusion of several autophagosomes. 16

We also used immunofluorescence studies to measure the abundance of SQSTM1/p62 17

(sequestosome 1), an autophagic substrate located within autophagosomes (Fig. 1D and E). In 18

our system, we observed that starvation increased the number of SQSTM1 dots compared to 19

basal conditions, whereas 3-methyladenine, a classic autophagy inhibitor, diminished them (Fig. 20

1D). A reduction of SQSTM1 dots in HeLa cells expressing IRS1 or TRS1 confirmed that these 21

proteins inhibited autophagy. Finally, we monitored SQSTM1 and LC3-II by immunoblot in 22

normal conditions (complete medium) and after starvation (Fig. 1F). We observed an 23

accumulation of SQSTM1 and a decrease of LC3-II, by immunoblot after IRS1 or TRS1 24

expression, compared to starved cells and even to cells cultured in normal conditions, which 25

8

correspond to an inhibition of autophagy. We used the viral protein ICP34.5, an HSV-1 protein 1

that has been previously reported to block autophagy, as a positive control in this experiment.19 2

Taken together, these results demonstrate that IRS1 and TRS1 are each able to block the 3

formation of autophagosomes. 4

IRS1 and TRS1 inhibit autophagy independently of EIF2AK2. 5

In order to investigate the mechanism of the autophagy inhibition by these 2 proteins, we 6

investigated the role of the double-stranded RNA (dsRNA)-dependent kinase EIF2AK2. Indeed, 7

we have recently identified a viral protein encoded by HSV-1 that blocks autophagy by 8

interaction with EIF2AK2.20 Moreover, TRS1 and IRS1 bind to dsRNA and EIF2AK2 to prevent 9

the shutoff of protein synthesis.14-16 In order to explore whether the interaction between EIF2AK2 10

and the viral proteins is involved in the inhibition of autophagy, we performed assays in murine 11

embryonic fibroblasts (MEFs) that have or lack EIF2AK2. We transiently cotransfected Eif2ak2+/+ 12

and eif2ak2-/- MEFs with GFP-LC3 and either IRS1 or TRS1 expression vectors then induced 13

autophagy by starvation. Consistent with our previous analyses of TRS1, we observed that both 14

IRS1 and TRS1 decreased the number of autophagosomes, independently of the expression of 15

EIF2AK2 (Fig. 2A and B).8 We also monitored SQSTM1 accumulation by immunoblot assay of 16

lysates of Eif2ak2+/+ and eif2ak2-/- MEFs in normal conditions and after starvation (Fig. 2C). We 17

observed that expression of TRS1 or IRS1 induced accumulation of SQSTM1 in both cell lines. 18

These results suggest that IRS1, like TRS1, blocks autophagy independently of EIF2AK2. 19

IRS1 contains a EIF2AK2 binding domain located in the C-terminal domain (an essential 20

component of which lies between amino acids 669 and 692).16 We transiently transfected HeLa 21

cells stably expressing GFP-LC3, with full length or carboxy-terminal truncations of IRS1 22

(Fig. 2D). We observed that the truncated forms of IRS1 blocked LC3 dots accumulation (Fig. 23

2E and F). We also observed by immunoblot an accumulation of SQSTM1 and a decrease of 24

LC3-II in HeLa cells transfected with the different IRS1 constructs (Fig. 2G). Taken together, our 25

9

results showed that all C-terminally truncated IRS1 proteins inhibited starvation-induced 1

autophagy (Fig. 2E to G). Notably, the region of IRS1 between codon 655 and 692, which is 2

essential for EIF2AK2-binding, is not required for autophagy inhibition. We obtained similar 3

results with TRS1.8 4

IRS1 and TRS1 inhibit autophagy by interaction of their N-terminal domain with 5

BECN1. 6

With the finding that the EIF2AK2 binding domain of IRS1 and TRS1 is dispensable to 7

their inhibitory effects, we tested whether the autophagy machinery protein BECN1 is involved, 8

since several viral proteins interact with it. BECN1, the mammalian ortholog of yeast 9

Vps30/Atg6, along with PIK3C3 (mammalian ortholog of yeast Vps34), which is the catalytic 10

subunit of the class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K), and with other core autophagy 11

proteins, forms several complexes which are required for the initiation of autophagosome 12

formation and endocytic trafficking.21 The activity of BECN1 is modulated by diverse cellular 13

stimuli leading to phosphorylation and ubiquitination modifications or to relocalization of BECN1 14

or via protein-protein interactions.21 For example, the antiapoptotic BCL2 family members can 15

interact with BECN1 and inhibit autophagy.22 We analyzed by confocal microscopy the 16

distribution of the 2 viral proteins and BECN1 in MRC5 cells infected with HCMV for 24 h. The 17

staining pattern of IRS1 and TRS1 was widespread in the cytoplasm and BECN1 was labeled in 18

punctate structures (Fig. 3A). Importantly, TRS1 and IRS1 showed substantial overlap with 19

BECN1. 20

To investigate whether IRS1 interacts with BECN1, we performed a 21

coimmunoprecipitation experiments with 6×His-tagged IRS1 and BECN1 plasmids. We found 22

that IRS1 bound to BECN1 (Fig. 3C). In order to delineate the domain of IRS1 which interacts 23

with BECN1, we analyzed 2 truncations of IRS1 from the amino termini, IRS1(45 to 847) and 24

IRS1(93 to 847) (Fig. 3B). Coimmunoprecipitation experiments revealed that the 2 amino-25

10

terminal mutants of IRS1 did not bind to BECN1 (Fig. 3C). EGFP-His was used as a negative 1

control and full length IRS1 and TRS1 as positive controls. These results demonstrated that 2

deletion of the N-terminal domain of IRS1 abolishes the interaction with BECN1. BECN1 3

contains 3 major protein binding domains, an N-terminal BH3 (BCL2 homology 3) domain, a 4

central coiled-coil domain (CCD), and an evolutionarily conserved domain at the C terminus.21 5

Using different fragments of FLAG-BECN1 (Fig. 3B), we determined the BECN1 domain that 6

interacts with IRS1. IP assays showed that the (141 to 450) and (141 to 265) BECN1 fragments 7

immunoprecipitated IRS1, indicating that IRS1 interacts with the CCD domain of BECN1 (Fig. 8

3D). The (1 to 255) BECN1 fragment did not interact with IRS1, possibly because of effects of 9

the N terminus on the folding of the truncated CCD. 10

We then assessed the ability of the amino-terminal truncations mutants of IRS1 to inhibit 11

starvation-induced autophagy. HeLa cells stably expressing GFP-LC3 were transiently 12

transfected with full-length IRS1, TRS1 or with 2 IRS1 N-terminal-deleted fragments and GFP-13

LC3 dots were analyzed by immunofluorescence. TRS1 was used as positive control. We 14

observed that IRS1 mutants (45 to 847) and (93 to 847) failed to inhibit autophagy as efficiently 15

as full-length IRS1 or TRS1 (Fig. 3E). We also observed that cellular levels of SQSTM1 only 16

partially increased in cells transfected with the 2 IRS1 mutants compared to cells transfected 17

with full-length IRS1 or TRS1 (Fig. 3F). Thus, the inhibition of autophagy by IRS1 requires its 18

amino terminus. These results suggest that IRS1 and TRS1 inhibit autophagy as a result of their 19

interaction with BECN1 by this amino terminal domain. 20

21

IRS1 and TRS1 are both involved in the control of autophagy during infection. 22

In order to investigate the role of IRS1 and TRS1 in autophagy blocking in the context of 23

viral infection, we analyzed autophagy in cells infected with HCMV mutants lacking either IRS1 24

or TRS1 genes or both (Fig. 4A and B). In HCMV-infected cells, we observed, as previously 25

11

reported.8, 23 that the number of autophagosomes was significantly decreased. In contrast, the 1

number of autophagosomes was significantly increased after infection with mutant HCMV 2

lacking both IRS1 and TRS1 (HCMV [∆I-∆T]), compared to mock-infected cells and HCMV-3

infected cells. Furthermore, the IRS1 and TRS1 single mutant viruses each inhibited 4

autophagosome formation relative to HCMV [∆I-∆T], but not as strongly as the wild-type (WT) 5

virus. Accumulation of SQSTM1 confirmed that whereas HCMV [∆I-∆T] drastically stimulated 6

autophagy, WT HCMV blocked autophagy and the 2 single mutant viruses had an intermediate 7

phenotype (Fig. 4C). Autophagic flux can be measured by inferring LC3-II turnover by western 8

blot in the presence and absence of chloroquine (CQ). CQ neutralizes the lysosomal pH and by 9

inhibiting endogenous protein degradation causes the accumulation of LC3-II in either 10

autophagosomes or autolysosomes. 24 The relevant parameter in this assay is the ratio in the 11

amount of LC3-II in the presence and absence of CQ, which can be used to examine the transit 12

of LC3-II through the autophagic pathway. When autophagic flux is occurring, the amount of 13

LC3-II is higher in the presence of CQ. As is evident in Fig. 4D, HCMV infection leads to a 14

similar accumulation of LC3-II with and without CQ, whereas none of the mutant viruses was 15

able to do so. We previously reported the accumulation of LC3-II in WT HCMV-infected cells, 16

which is not correlated with the number of autophagosomes.8, 23 This result suggests that the 2 17

viral proteins are necessary to inhibit autophagic flux. In support of this hypothesis, we found 18

that cotransfection of IRS1 and TRS1 in HeLa cells clearly led to LC3-II accumulation and a 19

complete block of autophagic flux (Fig. 4E). Taken together, these results demonstrate that 20

IRS1 and TRS1 are both involved in a complementary manner in the regulation of autophagy by 21

HCMV. 22

23

The BECN1-binding-deficient TRS1 mutant virus is unable to control autophagy. 24

Next, we investigated the functional significance of TRS1 and IRS1 interaction with 25

BECN1 in the context of HCMV infection. Based on a previously described BAC-derived HCMV 26

12

strain AD169 lacking both TRS1 and IRS1 14, we constructed mutant viruses in which an HA-1

tagged version of the TRS1 gene was reintroduced either with a deletion of amino acids 1 to 44 2

(referred to as TRS1(45-795)- IRS1 HCMV) or the complete gene (referred to as TRS1HA-3

IRS1 HCMV) (Fig. 5A). TRS1(45-795)- IRS1 HCMV and TRS1HA- IRS1 HCMV express a 4

protein of the predicted molecular weight (80 kDa and 85 kDa, respectively) that reacts with an 5

anti-TRS1 and anti-IRS1 antibody (Fig. 5B). Whereas TRS1 coimmunoprecipitates with BECN1 6

in TRS1-HA- IRS1 HCMV infected cells, interaction between TRS1(45-795) and BECN1 is 7

greatly reduced (Fig. 5C). We evaluated the ability of this BECN1-binding-deficient TRS1 mutant 8

virus to control autophagy measuring accumulation of GFP-LC3 dots and SQSTM1 and LC3 9

immunoblots. We observed that infection with TRS1(45-795)- IRS1 HCMV did not decrease the 10

number of autophagosomes compared to mock-infected cells while the repaired virus, TRS1HA-11

IRS1 HCMV, partially inhibited autophagy (Fig. 5D). Moreover, TRS1(45-795)- IRS1-infected 12

cells accumulated less SQSTM1 protein and more LC3-II compared to TRS1HA- IRS1-infected 13

cells (Fig. 5E). Adding CQ showed that only the parental BAC-derived AD169 blocked 14

autophagic flux, in agreement with our previous results (Fig. 4). Taken together, these results 15

show that the BECN1-binding-deficient-TRS1 mutant virus is not able to inhibit autophagy. 16

17

An HCMV recombinant virus containing a mutation in TRS1 that abrogates binding 18

to BECN1 does not have a growth defect. 19

We sought to determine whether the interaction of TRS1 with BECN1 and the ability to 20

block autophagy is important for virus replication. We hypothesized that a virus that is unable to 21

control autophagy by virtue of deletion of all of IRS1 and the BBD of TRS1 would replicate less 22

efficiently. We therefore analyzed the growth kinetics of the different mutant viruses in human 23

fibroblasts (Fig. 6). The multiple step growth kinetics of wild-type (AD169-BAC) and deletion 24

mutant viruses were examined in cells infected at a low multiplicity of infection and virus titers 25

13

were determined. The TRS1(45-795)- IRS1 recombinant virus achieved titers comparable to 1

those of TRS1HA- IRS1 and AD169-BAC (Fig. 6A). When MRC5 cells were infected with 2

HCMV [∆I-∆T], no progeny virus was detected for the duration of the assay (20 days), consistent 3

with the previous report.25 For single-step growth analysis, the production of extracellular virus 4

and intracellular virus was studied at the indicated times after infection.26 The amount of 5

infectious virus produced at various times post infection (pi) was determined by using an 6

immunoenzymatic assay in which the number of immediate early antigen (IEA)-positive cells 7

was determined at 2 days pi (see Materials and Methods). Compared to the wild type (AD169-8

BAC), the TRS1(45-795)- IRS1 mutant virus produced similar amounts of infectious intracellular 9

and extracellular virus at 4 and 6 days pi (Fig. 6B). This set of experiments indicates that lack of 10

control of autophagy confers no growth disadvantage to the mutant virus. 11

HCMV transcribes its genes in a temporal manner, which is classified into 3 stages: 12

immediate-early, early, and late. We used immunoblot assays to monitor expression of the 13

immediate early (IE1 and IE2) proteins, TRS1 and IRS1 proteins and a late (pp28) protein in 14

cells infected for 1, 2 or 5 days with the various viruses (Fig. 6C). IE1 and IE2 proteins were 15

expressed at identical levels in cells infected with any of the viruses, at any time pi. We also 16

detected similar expression of the late protein pp28 5 days pi. We then examined viral genome 17

accumulation relative to cellular gene copies at different times pi (Fig. 6D). Viral DNA of 18

TRS1(45-795)- IRS1 mutant virus accumulated to similar levels as WT virus. Together, these 19

results suggest that the IRS1 and TRS1 autophagy modulating activity does not have a direct 20

role in promoting viral replication in terms of viral protein expression, viral DNA replication, viral 21

production or release in human fibroblasts. 22

23

Inhibition of autophagy decreases viral production. 24

14

Finally, with the aim of clarifying the impact of autophagy modulation on viral replication, 1

we sought to determine whether modulation of autophagy by pharmacological approaches could 2

impact the viral multiplication. We used serum starvation, rapamycin and methyl beta 3

cyclodextrin (M CD) treatment to induce the formation of autophagosomes.27 These treatments 4

stimulated autophagy in MRC5 cells (Fig. 7A).8,23 Then, we infected cells with HCMV at low 5

multiplicity of infection (MOI) and treated them from 18 h to 4 days pi. This protocol enabled us 6

to avoid nonspecific effects of the drugs on viral entry and early stages of the viral cycle. We 7

observed that extracellular and intracellular viral production was higher in starved cells and in 8

cells treated with M CD or rapamycin than in nontreated cells (Fig. 7B). Next, we evaluated the 9

effect of Spautin 1, a potent and specific inhibitor of autophagy (Fig. 7A), on viral production.28 10

As shown in Fig. 7C, we observed that Spautin 1-repressed autophagy inhibited viral replication. 11

In cells infected at low MOI and treated with Spautin 1, both intra and extra cellular viral 12

productions were strongly decreased compared to nontreated cells. These results suggest that 13

autophagy is able to modulate viral production but does not affect viral exit from infected cells, 14

since the effect is similar on extra and intracellular production. To investigate whether cellular 15

autophagy regulates HCMV at the replication level, we examined by qPCR the effects of these 16

drugs added 18 h pi on viral genome accumulation. Fig. 7D shows that Spautin 1 treatment 17

profoundly decreased viral DNA replication. No effect of starved-induced autophagy induction 18

was observed whereas M CD and rapamycin decreased DNA replication by 40%. Finally, 19

quantification of infected cells 4 days pi after different modulating treatments confirmed that 20

induction of autophagy increased the level of infection and conversely, inhibition strongly 21

reduced it (Fig. 7E). 22

To complement these studies using pharmacological modulation of autophagy, we also 23

conducted genetics experiments. ATG16L1 forms a complex with ATG5 and ATG12 that is 24

essential for autophagosome biogenesis. We therefore established human foreskin fibroblasts 25

15

stably expressing ATG16L1 shRNA or scrambled shRNA. We confirmed successful knockdown 1

of the ATG16L1 protein and analyzed its effects on autophagy by ATG16L1, SQTSM1 and LC3 2

immunoblot assays (Fig. 7F). Knocking down ATG16L1 with either of 2 shRNAs decreased 3

autophagy compared to scrambled shRNA control. After infection with WT HCMV at MOI 0.02, 4

we observed that viral DNA replication was decreased in both ATG16L1 knockdown cells 5

compared to the control cell line (Fig. 7G). We observed that expression of TRS1 and IRS1 was 6

similar in the 3 cell lines. We examined the effect of shRNA-mediated downregulation on 7

expression of immediate early proteins 4 days pi, which reflect level of infection. Blocking 8

autophagosome formation significantly reduced HCMV infection (Fig. 7G). These results provide 9

additional evidence that inhibition of autophagy reduces HCMV infection. 10

16

Discussion 1

In this report, we demonstrated that HCMV blocks both autophagosome formation and 2

maturation, dependently of viral protein synthesis. We previously identified an antiautophagic 3

function of the viral protein TRS1 and we report here that IRS1, which has homologous regions 4

with TRS1, is also able to decrease the accumulation of autophagosomes.8, 9 Based on several 5

readouts to monitor autophagic activity, we demonstrated that autophagy is inhibited by both 6

TRS1 and IRS1 proteins in starved and in infected cells.24 The use of a high throughput 7

microscopy approach, previously developed by McKnight et al.,29 allowed us to precisely 8

quantify the ability of TRS1 or IRS1 expression to decrease not only the number of GFP-LC3 9

dots but also the intensity of the dots and the total area covered by the GFP-LC3 positive dots. 10

Only the size of autophagosomes remained unchanged. Moreover, we noticed that simultaneous 11

expression of TRS1 and IRS1 leads to a block of the autophagic flux. 12

In order to examine the respective roles of TRS1 and IRS1 in the context of infection, we 13

constructed mutant viruses that do not express TRS1, or IRS1 or either protein. Whereas the 2 14

viruses lacking either TRS1 or IRS1 each partially control autophagy, deletion of both proteins 15

leads to a marked stimulation of autophagy. However, it is important to note that HCMV [∆I-∆T] 16

does not replicate in wild-type fibroblasts, as a result of protein synthesis shutoff.14 Most viral 17

proteins are therefore not expressed. In the same way, when all de novo viral protein expression 18

is prevented by UV-inactivation, HCMV stimulates autophagy.8 We also demonstrated that 19

HCMV infection leads to a profound inhibition of the autophagic flux, resulting of an 20

accumulation of LC3-II. Both TRS1 and IRS1 are necessary to clearly establish this blockade, 21

since none of the single deletion mutant viruses is able to act the same way as WT virus. 22

We characterized the mechanism by which the viral proteins modulate autophagy. TRS1 23

and IRS1 have been identified as viral tegument proteins that localize to the nucleus and 24

cytoplasm in infected cells.30, 31 They both have been reported to activate transcription in 25

17

cooperation with other viral activators and TRS1 might be involved in the assembly of virus 1

capsids.12, 32-34 Both TRS1 and IRS1 interact with UL44, a processivity factor of the DNA 2

polymerase, but not simultaneously.35 TRS1 has recently been reported to bind to mRNA caps 3

and stimulate translation.36 However, the best characterized function known for these 2 large 4

proteins is the repression of EIF2AK2 activity.14 In addition to a dsRNA binding domain that is 5

identical in TRS1 and IRS1, they both have homologous but not identical carboxy-terminal 6

regions that are required for binding to EIF2AK2. Interestingly, we have previously demonstrated 7

that the herpes simplex virus type 1 (HSV-1) late protein Us11 is able to block autophagy, by 8

direct interaction with EIF2AK2.20 However, we demonstrated here that the mechanism by which 9

TRS1 and IRS1 inhibit autophagy is independent of their activity on EIF2AK2. Instead, TRS1 10

and IRS1 colocalize with and bind to the autophagy machinery protein BECN1. Moreover, their 11

identical N-terminal regions are required both for this interaction and for their antiautophagic 12

activity. Interestingly, this region of IRS1 or TRS1 is not required for interaction with UL44, 13

EIF2AK2 or dsRNA.15, 16, 35 14

Several viral proteins that are able to modulate autophagy act by interaction with 15

BECN1.21 Whereas the adenovirus E1B19K protein triggers autophagy by displacement of the 16

antiautophagic protein, BCL2, from the BECN1 interactome,37 all the other viral BECN1-17

interacting proteins disrupt autophagy, either at the autophagosome formation or at the 18

maturation step.21 The Nef protein of HIV-1,38 M2 protein of influenza virus39 and ICP34.5 of 19

HSV-140 suppress autophagosome maturation into autolysosomes, likewise via their interaction 20

with BECN1.22 Viral encoded BCL2 proteins block autophagosome formation through a direct 21

interaction with the BH3 domain of BECN1, as does cellular BCL2,22 while HSV-1 ICP34.5 and 22

HCMV IRS1 do not interact with the BH3 domain of BECN1.19 We found that the CCD domain in 23

BECN1, a universal oligomerization domain, is the binding domain of IRS1. Notably, this CCD 24

domain allows ATG14 and UVRAG (UV radiation resistance associated) to interact with BECN1 25

18

respectively in 2 distinct PtdIns3K-containing complexes that function differentially in autophagy 1

formation and in maturation of the endosome and the autophagosome.41 Interestingly, our 2

results suggest that individually IRS1 and TRS1 may block autophagosome biogenesis through 3

the PtdIns3K-BECN1-ATG14 complex, and coexpression of them may block the maturation 4

process through the PtdIns3K-BECN1-UVRAG complex. 5

Infection with HCMV [∆I-∆T] virus leads to a global shutdown of proteins synthesis 6

because of the lack of control of EIF2AK2.25 In order to retain the inhibitory activity of TRS1 on 7

EIF2AK2 (but not on BECN1), we constructed an HCMV IRS1 recombinant virus containing a 8

mutation in TRS1 that abrogates binding to BECN1 (TRS1(45-795)- IRS1). We found that this 9

virus is not able to inhibit autophagy. This finding supports that conclusion that HCMV uses both 10

TRS1 and IRS1 to block autophagy. 11

Autophagy can contribute to antiviral defenses and it has been reported in others studies 12

that autophagy can directly reduce viral multiplication. For example, autophagy has an inhibitory 13

effect on chikungunya virus propagation.42 In the case of HCMV, our results show that the 14

inability to control of autophagy by the mutant virus HCMV TRS1(45-795)- IRS1 has no impact 15

on viral multiplication. Viral protein expression, viral replication, intracellular viral production, and 16

viral release were not different in HCMV TRS1(45-795)- IRS1-infected cells compared to WT 17

virus, suggesting that, at least in cultured human fibroblasts, autophagy is not detrimental to viral 18

propagation. It is interesting to note that HSV-1 lacking the ICP34.5 BECN1-binding domain 19

grows as well as WT HSV-1 in fibroblasts in vitro but is clearly neuroattenuated in mice.19 It is 20

possible that inhibition of autophagy by HCMV may be immune-response related and therefore 21

apparent in natural infections of humans but not in fibroblast culture. It will be interesting to 22

explore whether HCMV has different consequences in other cells types. We noted that the 23

TRS1(45-795)- IRS1 recombinant virus, unlike the HCMV [∆I-∆T], does not stimulate autophagy 24

after 24 h of infection although autophagy is induced by this virus quickly after infection, in the 25

19

same manner as WT virus (data not shown). Among the possible explanations for these results 1

is that another viral protein, not expressed in HCMV [∆I-∆T]-infected cells but expressed by this 2

virus, participates to the control of autophagy. This might explain the lack of effect on viral 3

replication. Further investigations will be needed to determine whether HCM encodes additional 4

autophagy-modulating proteins. 5

Since the recombinant virus TRS1(45-795)- IRS1 seems not able to fully block 6

autophagy, we decided to use pharmacological approaches and ATG16L1 knockdown cells to 7

study the impact of the modulation of autophagy on viral multiplication. Surprisingly, we 8

observed that activation of autophagy enhanced HCMV infectivity, whereas its inhibition 9

decreased viral production. We noticed similar effects of the drugs on extra and intracellular viral 10

yields, suggesting that autophagy does not influence release of the virus. Viral DNA replication 11

was severely repressed by autophagy inhibition but was not increased by autophagy induction. 12

These findings suggest that stimulation of autophagy may contribute to HCMV infection after 13

viral DNA replication. Conversely, inhibition of autophagy seems to have an impact earlier in the 14

viral replication cycle. Taken together, these results show that autophagy has a proviral role in 15

HCMV replication. These unexpected findings in HCMV exhibit similarities with recent report of a 16

proviral role for autophagy during Epstein Barr virus reactivation, a gammaherpesvirus.43 The 17

Epstein Barr virus inhibits autophagosome degradation and seems to utilize the molecular 18

machinery of autophagy for its envelope. Another Herpesvirus, varicella zoster virus induces an 19

autophagic response which has a proviral effect, that may be related to the fact that autophagy 20

improves biosynthesis and processing of the viral glycoprotein gE.44 In fact, one has to wonder 21

whether HCMV subverts autophagosome formation and maturation in order to avoid degradation 22

in some cell types and to utilize the autophagic machinery to its own profit. Indeed, recent 23

studies have demonstrated that several DNA viruses utilize autophagosomes or the autophagic 24

process to benefit their viral life cycle. For example, autophagy positively affects infection of 25

20

adenovirus, hepatitis B virus, and human BK polyomavirus.45-47 Interestingly, inhibition of 1

autophagy is now considered to be possibly used as a therapeutic strategy in cancer and in 2

neurodegenerative diseases,48, 49 and it could be attractive to explore that possibility for HCMV. 3

4

Materials and Methods 5

Cells and virus 6

Primary human embryonic lung fibroblasts MRC5 were purchased from Biomérieux, and used 7

between passages 23 and 28 post isolation. These cells were maintained in minimum essential 8

medium (Gibco®, 21090-022) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), penicillin G 9

(100U/ML), streptomycin sulfate (100µg/ml), l-glutamine (1%), and nonessential amino acids 10

(1%). HeLa cells were cultured in RPMI (Gibco®, 61870-10) 10% FCS. GFP-LC3 stably-11

transfected HeLa cells50 were provided by Aviva Tolkovsky, (Cambridge Centre for Brain Repair, 12

Cambridge, UK) and were grown in RPMI 10% FCS with 500 µg/ml of G418. Eif2ak2+/+ and 13

eif2ak2-/- MEFs kindly provided by B. R. G. Williams (Monash University, Victoria, Australia), and 14

human foreskin fibroblasts, provided by Thomas Shenk (MolBio Department, Princeton 15

University, Princeton USA) were maintained in DMEM (Gibco®, 41965-039) supplemented with 16

10% FCS. The pTRS1-expressing cell line, HF-2.7βTRS1 was described elsewhere.14 The WT 17

virus used in this study was the AD169 strain. The AD169 strain of HCMV was obtained from 18

ATCC and was propagated in MRC5 cells as previously described.51 All mutant viruses were 19

constructed on the basis of the AD169 bacterial artificial chromosome (BAC), which contains the 20

full-length genome of the HCMV AD169 strain.52 The AD169-BAC (WT) virus and the mutants 21

AD169 IRS1, AD169 TRS1, and AD169 IRS1- TRS1 are previously described.14 The 22

mutants TRS1HA- IRS1 and TRS1(45-795)- IRS1 were generated by reinserting either the full-23

length TRS1 coding sequence or a truncated TRS1 sequence lacking the first 44 codons into the 24

AD169 IRS1- TRS1 BAC. Briefly, oligonucleotide primers containing 50-nucleotide homologies 25

21

immediately up- and downstream of TRS1 were used to amplify HA-tagged TRS1 and a 1

kanamycin resistance marker flanked by FLP recombination target (FRT) sites. Forward and 2

reverse primers for full-length TRS1 were 5’-TGACGCGGGTTTGCTTCCTA-3

TATAGTGGACGTCGGAGGTGTCCGGCGCCCATGGCCCAGCGCAACGGCAT-3’ and 5’-4

GGATGTCTGGTACTTATCACTGGCGTCGTTATAACATTGTAAAACAAGTTTTCGAAACATAA-5

CGACAGCTGCAAAAGAAAACCAGT-3’. For the truncated TRS1, 5’-TGACGCGGGTTTGCTT-6

CCTATATAGTGGACGTCGGAGGTGTCCGGCGCCCATGACTGGTGCGAGTGCTGC-3’ and 7

the same reverse primer as for full-length TRS1 was used. Plasmid pBS-TRS1HA-fk served as 8

PCR template. The PCR product was used to insert the full-length or truncated TRS1 gene into 9

the AD169 IRS1- TRS1 BAC by homologous recombination in Escherichia coli strain EL250.53 10

The kanamycin resistance marker was subsequently removed by arabinose-induced FLP 11

recombinase as described.53 All the recombinant viruses, except the AD169 IRS1- TRS1 virus, 12

were propagated and their titers were determined in MRC5 cells. The AD169 IRS1- TRS1 13

virus was grown and its titer was determined in HF-2.7βTRS1 cells. 14

Pharmacological modulators of autophagy 15

The compounds 3MA (M9281), Spautin 1 (SML0440), rapamycin (R8781) and M CD (C4555) 16

were purchased from Sigma and the concentrations used were 10 mM, 10 µM, 5 nM and 5 mM, 17

respectively. When indicated, drugs were applied to cultured infected cells 18 h pi. Chloroquine 18

(Sigma, C6628) was used at 50 µM 4 h previous cell lysis to block autophagic degradation. 19

Plasmids 20

The GFP-LC3 expression vector was kindly provided by Tamotsu Yoshimori (Research Institute 21

for Microbial Diseases, Osaka University, Osaka, Japan).54 The FLAG-ICP34.5 plasmid was a 22

gift from Bin He (University of Illinois, Chicago, USA).55 The FLAG-tagged BECN1 plasmids 23

were a kind gift of Beth Levine (UT Southwestern, Dallas, USA). The pEQ1180 construct 24

expresses full-length HCMV TRS1 protein cDNA.56 The pEQ1100 construct expresses 25

22

enhanced green fluorescent protein (EGFP) (5). The pEQ1007 construct, containing a full-length 1

HCMV IRS1 protein cDNA and the pEQ1002 (1 to 656), pEQ1010 (1 to 668), pEQ1033 (1 to 2

692) constructs, containing the indicated lengths of IRS1, have been previously described.16 The 3

plasmids pEQ1455 (45 to 847) and pEQ1456 (93 to 847) were constructed by PCR amplification 4

of pEQ1007 using forward primers 5’ ACCATGGGTGCAAGTACTGCGGGTTCG-3’ or 5’-5

ACCATGGTGGA-GCGGCAGGCGCTG-3’, respectively, with the reverse primer 5’-6

ATGATGAACGTGGTGAGGG-GCGTGT-3’.16 The resulting PCR product was cloned into 7

pcDNA3.1/V5-His-TOPO (Invitrogen). All of these constructs have a carboxyl–terminal 6-His tag. 8

Transfections were performed using the FuGENE HD transfection reagent (Roche), as 9

previously described.8 Starvation-induced autophagy was carried out by culturing the cells in 10

Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, GIBCO) for 4 h before fixation. 11

12

Antibodies 13

To detect HCMV-infected cells, we used a murine monoclonal antibody directed against the viral 14

proteins IE1 and IE2 (clone E13; Biomérieux, 11-003) and a murine monoclonal antibody 15

directed against the tegument protein pp65 (Biomérieux, 11-002). A mouse monoclonal antibody 16

against the late protein pp28 (clone CH19, sc-69749) was purchased from Santa Cruz. To detect 17

His- and FLAG-tagged constructions, we used a rabbit antibody directed against 6xHis (Cell 18

Signaling Technology, 2365) or a mouse antibody against FLAG (Sigma, F3165). Additional 19

primary antibodies used in this study included anti-SQSTM1 (Abnova clone 2C11, H00008878-20

M01), anti-BECN1 (BD bioscience, 612112), anti-ATG16L1 (Clinisciences, PM040), and anti-21

ACTB/ -actin (Merck Millipore MAB1501 clone C4). For immunoprecipitation of BECN1, we 22

used a goat antibody provided by Santa Cruz Biotechnology (sc-16647). Secondary fluorescein 23

isothiocyanate (FITC), tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC)-conjugated, horseradish 24

peroxidase-labeled goat anti-mouse or anti-rabbit secondary antibodies were purchased from 25

23

Jackson ImmunoResearch Laboratories (115-035-003, 111-035-003). The IRS1-TRS1 rabbit 1

polyclonal antiserum αp999 directed against amino acids 74 to 248 of TRS1 has been previously 2

described.14 3

4

Coimmunoprecipitation assays 5

To study the interaction between BECN1 and IRS1 or TRS1, HeLa cells were transfected to 6

coexpress BECN1, and the various molecular partners (EGFP-His, His-IRS1, His-TRS1, 7

IRS1(45 to 847) and IRS1(93 to 847) proteins). To identify the interaction domain of BECN1 with 8

IRS1, HeLa cells were cotransfected with different constructions of FLAG-BECN1 and His-IRS1. 9

To study the interaction between TRS1 and endogenous BECN1 in the context of infection, 10

MRC5 cells were infected with a mutant virus TRS1(45-795)- IRS1 or the repair virus TRS1HA-11

IRS1. Forty-eight h after transfection or infection, the cells were washed with cold, sterile 12

phosphate-buffered saline (PBS; Gibco®, 14200-067) and then lysed at 4°C for 2 h in lysis 13

buffer (50 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, 0.5% Triton X-100 (Sigma, T-8787) 0.5% deoxycholic acid 14

(Sigma, D-6750), 0.2% bovine serum albumin (Sigma, A1595), 25 mM NaPPi, 50 mM NAF, 1 15

mM Na3VO4) followed by ultracentrifugation at 274,000xg at 4°C for 30 min to remove cell 16

debris. Immunoprecipitation was performed overnight at 4°C with a goat polyclonal anti-BECN1 17

antibody or a mouse anti-FLAG antibody. Protein G-Sepharose beads were added for 1 h at 4°C 18

and were washed 3 times with lysis buffer and 2 times with wash buffer (20 mM Tris HCl, 50 mM 19

NaCl, 0.2% bovine serum albumin). The immune complexes were finally boiled for 5 min in 20

loading buffer (62.5 mM Tris, pH 6.8, 10% glycerol, 1.5% SDS, 0.025% bromophenol blue, 8% 21

β-mercaptoethanol) before being analyzed by SDS-PAGE. 22

23

Immunoblot analysis 24

MRC5 and HeLa cells were lysed in 65 mM Tris, pH 6.8, 4% SDS, 1.5% β-mercaptoethanol, and 25

held at 100°C for 5 min. After SDS-PAGE, the proteins were electrotransferred onto a 26

24

polyvinylidene difluoride membrane. After incubation in blocking buffer, the blots were probed 1

overnight with specific antibodies, then incubated with secondary antibodies, followed by 2

chemiluminescent detection, according to the Manufacturer's instructions (Immobilon, Millipore). 3

Scanning for quantification was monitored using ImageJ software. 4

Immunofluorescence analysis 5

Cell monolayers were washed 3 times with PBS, and then fixed with 3.5% paraformaldehyde in 6

PBS or acetone. The cells were permeabilized using 0.2% Triton X-100 in PBS and incubated 7

for 1 h in blocking buffer, and then with appropriate primary antibodies for 1 h or overnight. The 8

cells were washed 3 times, and then incubated with appropriate secondary antibodies. To detect 9

IRS1 or TRS1 expression, cells were stained with mouse anti-His Mab or rabbit anti-IRS1-TRS1 10

serum. Coverslips were mounted in Glycergel (Dako, C0563) and examined using a Nikon 11

Eclipse 80i epifluorescence microscope (Nikon instruments, Champigny sur Marne, France) or a 12

LSM510 Zeiss confocal microscope (Carl Zeiss Microscopy, Iena, Germany). Digitized images 13

were stored, and overlaid to evaluate 2-color experiments. Photographic images were resized, 14

organized, and labeled using Adobe Photoshop software. 15

Optimized automated quantification of GFP-LC3 dots by high throughput microscopy 16

GFP-LC3 HeLa cells were transfected with empty vector, IRS1 or TRS1 and fixed after 4 h of 17

starvation. GFP-LC3 dots were quantified using a Thermo Cellomics ArrayScan VTI HCS 18

Reader (Thermo Fisher, Pittsburgh, PA, USA). The analysis program detected DAPI-labeled 19

nuclei, cell outline, GFP-LC3 dots and nontransfected rejected cells. The number of GFP-LC3 20

dots per cell, the total intensity of GFP-LC3 dots per cell, the total area covered by GFP-LC3 21

dots per cell and the average area covered by GFP-LC3 dots per well were determined by the ID 22

view software. 23

Virus production. 24

25

For multistep growth analysis, supernatant fractions of infected cells were harvested at the 1

indicated times after infection at a MOI of 0.02 and virus titers were determined in triplicate by 2

50% tissue culture infective dose (TCID50) assay. For single step growth analysis, viruses were 3

collected from both cell-free supernatant fractions and infected cells at various time points pi and 4

quantified as previously described.26 Cell-associated virus was isolated through 3 rounds of 5

freezing and thawing in a liquid nitrogen bath. Serial dilutions of virus samples were plated on 6

MRC5 cells. Infected cells were fixed 48 h pi and permeabilized in acetone/water at -20°C for 20 7

min. IEA-positive cells were labeled using the primary mouse antibody against IEA (clone E13) 8

and the secondary goat anti-mouse antibody conjugated with horseradish peroxidase, and 9

positive cells were quantified at the appropriate dilution. To determine viral DNA levels in 10

infected cells, cells were harvested and lysed in the presence of proteinase K and total DNA was 11

purified using the DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, 69506) according to the manufacturer’s 12

instructions. Real-time PCR was performed using Taqman probes and primers specific for the 13

UL123 viral gene, and ACTB or CXCR4 cellular genes, as previously described.57 14

Lentiviral Delivery of shRNA. 15

Stable ATG16L1 and scrambled shRNA cells were generated using MISSION shRNA 16

lentiviruses, which were kindly provided by Patrice Codogno (INEM, Paris, France). Stable cells 17

were cultured in puromycin-containing media (5 µg/ml; InvivoGen anti-pr-1). 18

Statistics. 19

Data are expressed as means ± standard error of the means (SEM) and were analyzed with 20

Prism software (GraphPad version 6.0) by using one-way analysis of variance (ANOVA), 21

followed by the Dunnett test comparisons. P values less than 0.05 were considered statistically 22

significant. Experiments were performed a minimum of 3 times. 23

Acknowledgments 24

26

We would like to thank Michael Crawford for assistance in constructing IRS1-deletion plasmids. 1

We are also very grateful to Beth Levine for providing us with the BECN1 constructs. We thank 2

the FHCRC Genomics Core for technical assistance. We thank Valérie Nicolas from cellular 3

imaging MIPSIT facility and Claudine Delomenie from the Transprot facility for technical 4

assistance. We thank Patrice Codogno for insightful discussions and help for shRNA 5

knockdown. This work was supported by institutional funding from the Institut National de la 6

Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), from Univ. Paris-Sud, from Agence Nationale de 7

la Recherche (to A.E.), from NIH AI027762 (to A.P.G.), from DFG BR1730/3-2 (to W.B.), and 8

from Tichrine University-Syria (to L.M.). L.D. was supported by an EMBO fellowship. 9

10

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16

Figure legends 17

Figure 1. Inhibition of starvation-induced autophagy by ectopic expression of TRS1 and IRS1. 18

(A) Representative images of GFP-LC3 HeLa cells transfected with an empty vector (vector), 19

IRS1, or TRS1 plasmids and then fixed after starvation. (B) The number of GFP-LC3-dots in 20

TRS1 or IRS1-expressing cells in the transfected HeLa cells was quantified. The results are the 21

mean of 6 independent experiments; 50 to 100 cells were analyzed per assay. (C) (Microscopy 22

panels). (Left) Cellomics ArrayScan images of GFP-LC3 HeLa cells transfected with empty 23

vector, IRS1 or TRS1. (Right) Image analysis software detected DAPI-labeled nuclei (blue), cell 24

outline (red line), GFP-LC3 dots (green dots) and nontransfected cell nuclei (yellow line). The 25

number of GFP-LC3 dots per cell, total intensity, total area and average area were quantified 26

using Cellomics spot detector software. (D) (Top panel) SQSTM1 staining in HeLa cells under 27

starvation or after 3-methyladenine (3MA) treatment. (Lower panel) SQSTM1 staining in HeLa 28

cells expressing IRS1 or TRS1 and after starvation. (E) Autophagy was quantified by counting 29

the number of SQSTM1 dots per transfected cell. The results are the mean of 3 independent 30

experiments; 20 cells were analyzed per assay. (F) Immunoblot analysis of SQSTM1 and LC3 31

30

proteins in HeLa cells transfected with IRS1, TRS1 or ICP34.5 plasmids. CM, complete medium. 1

ACTB was used as a loading control. **, P<0.01; ***, P<0.001 (One-way ANOVA). 2

Figure 2. IRS1 and TRS1 inhibit autophagy independently of EIF2AK2. (A and B) eif2ak2-/- and 3

Eif2ak2+/+ MEFs were cotransfected with GFP-LC3 and IRS1 or TRS1 and, 48 h later were 4

grown in starvation medium for 4 h before fixation. (A) Representative images of GFP-LC3 with 5

insets showing TRS1 or IRS1 expression (red), and (B) quantification of GFP-LC3 dots per cell. 6

(C) Immunoblot analysis of SQSTM1 protein in lysates of eif2ak2-/- and Eif2ak2+/+ MEFs 7

transfected with IRS1 or TRS1 plasmids. (D) Schematic representation of full-length and 8

truncated IRS1 expression plasmids, showing positions of the dsRNA-binding domain (amino 9

acids 74 to 248) and the EIF2AK2 binding domain (amino acids 669 to 692). (E) Representative 10

images of GFP-LC3 HeLa cells transfected with the indicated IRS1 constructs and then starved 11

for 4 h and (F) quantification of GFP-LC3 dots. (G) Immunoblot analysis of SQSTM1 and LC3 12

proteins in HeLa cells transfected with the indicated IRS1 constructs. CM, complete medium. *, 13

P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001 (One-way ANOVA). 14

Figure 3. IRS1 interacts with BECN1 and inhibits autophagy via its N-terminal region. (A) 15

Colocalization of IRS1 and TRS1 with BECN1 in MRC5 cells infected with HCMV 24 h pi by 16

confocal microscopy. (B) Schematic representations of different IRS1 N-terminal-deleted 17

fragments and BECN1-deleted fragments. (C) Immunoprecipitation assays of BECN1 in HeLa 18

cells transfected with EGFP-His, different constructs of His-IRS1 or full length His-TRS1. (D) 19

Immunoprecipitation assays of FLAG-BECN1 in HeLa cells transfected with full-length His-IRS1 20

and different constructs of BECN1. (E) GFP-LC3 dots were quantified in GFP-LC3 HeLa cells 21

transfected for 48 h with the indicated IRS1 constructs. (F) Immunoblot analysis of SQSTM1 22

levels in HeLa cells transfected with the indicated constructs and then grown in starvation 23

medium for 4 h before cell lysis. The results are the mean of 3 experiments; 100 cells were 24

analyzed per assay. **,P<0.01 (One-way ANOVA). 25

31

1

Figure 4. IRS1 and TRS1 are involved in the inhibition of autophagy after HCMV infection. (A) 2

MRC5 cells were mock-infected or infected with HCMV, ∆IRS1-∆TRS1, ∆IRS1 and ∆TRS1 3

mutant viruses at an MOI of 1, transfected with GFP-LC3 and then fixed at 24 h pi. Cells were 4

fixed and immunostained for pp65 or IEA viral proteins as indicated (Scale bar 10 µm). (B) GFP-5

LC3 dots were quantified in pp65- or IEA-positive cells. The results are the mean of 6 6

independent experiments. Twenty-five cells were counted per assay. **, P<0.01; ***, P<0.001 7

(One-way ANOVA). (C and D) Immunoblot analysis of SQSTM1 and LC3 proteins in mock-8

infected MRC5 cells or infected with WT HCMV or the indicated mutant viruses for 24 h. (E) 9

Immunoblot analysis of LC3 protein in cells transfected with the indicated constructs for 24 h and 10

grown in starvation medium for 4 h before cell lysis. (D and E) Chloroquine was added 4 h 11

before lysis to monitor autophagic flux. 12

Figure 5. The BECN1-binding-deficient TRS1 mutant virus does not inhibit autophagy. (A) 13

Schematic representation of the HA-tagged TRS1 recombinant viruses. (B) Expression of TRS1 14

and IRS1, detected by immunoblotting with anti-TRS1 and IRS1 antibody of cells lysates after 15

infection with the indicated viruses. (C) MRC5 cells were infected with TRS1(45-795)- IRS1 and 16

TRS1HA- IRS1 recombinant viruses for 48 h. Cells were immunoprecipitated with a goat anti 17

BECN1 antibody, followed by immunoblotting with an anti-HA antibody and anti-BECN1. (D) 18

MRC5 cells were infected with the indicated viruses, transfected with GFP-LC3 and then fixed 19

24 h pi. Autophagy was quantified in IEA-positive cells by counting the number of GFP-LC3 dots 20

per cell. The results are the mean of 3 independent experiments. Twenty cells were counted per 21

assay. ***, P<0.001 (One-way ANOVA). (E) Immunoblot analysis of SQSTM1 and LC3 levels in 22

MRC5 cells infected with the indicated viruses at MOI 1. ACTB was used as a loading control. 23

CQ, chloroquine. 24

32

Figure 6. Characterization of a HCMV recombinant virus containing a mutation in TRS1 that 1

abrogates binding to BECN1. (A) Multiple step growth analysis. MRC5 cells were infected at 2

MOI of 0.02 with the indicated viruses. Cultures were harvested at the indicated times pi, and 3

viral titers were determined by TCID50 assay. Results represent the averages of 3 independent 4

experiments. (B) Single step growth analysis was performed to examine the production of 5

extracellular virus and intracellular virus. MRC5 cells were infected at MOI 0.5 with AD169-BAC 6

(WT), TRS1(45-795)- IRS1, or TRS1HA- IRS1 recombinant viruses. Infected cell culture 7

medium were harvested at the indicated times pi (cell-free), and intracellular virus was isolated 8

by freezing and thawing cell pellets (cell associated). The amount of virus present in each 9

sample was determined by infecting MRC5 cells with these samples and counting the number of 10

IEA-positive cells. Results represent the averages of 2 independent experiments. (C) Lysates 11

from HCMV-infected cells were prepared at 1, 2 and 5 days pi and immunoblotted using 12

antibodies specific for IEA, αp999 antiserum specific for pIRS1 and pTRS1, and for pp28. (D) 13

Viral DNA genome after infection of MRC5 cells with the indicated viruses, 2 to 4 days pi. 14

Figure 7. Autophagy affects HCMV infection. (A) SQSTM1 immunoblots and LC3 staining in 15

MRC5 cells under starvation or after the indicated treatments. (B) MRC5 cells were infected with 16

HCMV (MOI 0.02), treated with M CD, rapamycin or serum starved 18 h pi and analyzed for 17

viral production after 4 days. (C) MRC5 cells were infected in the same conditions then treated 18

with Spautin 1 and viral production was analyzed. (D) Viral DNA genome replication after the 19

indicated treatments 4 days pi. (E) Images and quantification of IEA expression in MRC5 cells 20

infected with HCMV for 4 days and treated with the indicated drugs. Representative assay of 3 21

independent experiments (F) Immunoblot analysis of ATG16L1, LC3, SQSTM1 and viral 22

proteins expression in ATG16L1 shRNA- or scrambled RNA-expressing cells. (G) Viral DNA 23

genome replication and IEA expression after 4 days. NT no treatment. 24

25

Figure 1. Inhibition of starvation-induced autophagy by ectopic expression of

TRS1 and IRS1.

Figure 2. IRS1 and TRS1 inhibit autophagy independently of EIF2AK2/PKR

Figure 3. IRS1 interacts with BECN1 and inhibits autophagy via its N-terminal

region.

Figure 4. IRS1 and TRS1 are involved in the inhibition of autophagy after HCMV

infection.

Figure 5. The BECN1-binding deficient-TRS1 mutant virus does not inhibit

autophagy.

Figure 6. Characterization of a HCMV recombinant virus containing a mutation

in TRS1 that abrogates binding to BECN1.

Figure 7. Autophagy affects HCMV infection.

134

Discussion de l’article

Dans cet article, nous montrons que les protéines virales IRS1 et TRS1 sont capables de

bloquer l’autophagie induite par la carence ou au cours de l’infection virale. Leur expression

diminue non seulement le nombre des autophagosomes mais également l’intensité de leur

marquage et la superficie totale couverte par l’autophagosome. Seule leur taille reste inchangée.

Le mécanisme par lequel les protéines TRS1 et IRS1 inhibent l’autophagie est indépendant de

leur activité sur PKR. En effet, nous avons montré qu’elles sont capables de l’inhiber dans des

cellules qui n’expriment pas PKR et que les mutants d’IRS1 dans la région C-terminale (le

domaine d’interaction avec PKR) contrôlent l’autophagie au même niveau que la protéine

complète. L’activité anti-autophagique d’IRS1 et de TRS1 est, en revanche, dépendante de la

protéine de la machinerie autophagique Beclin 1. Nous avons montré qu’IRS1 et TRS1

colocalisent avec Beclin 1 dans le cytoplasme en microscopie confocale et qu’elles interagissent

avec Beclin 1 par immunoprécipitation. En outre, l’utilisation de formes tronquées de ces

protéines dans leur région terminale N a confirmé l’importance de cette région dans l’interaction

avec Beclin 1 et dans leur propriété anti-autophagique. Nous avons également cherché le

domaine de Beclin 1 qui interagit avec IRS1 en transfectant des formes tronquées et taggées de

Beclin 1 et nous avons observé qu’IRS1 interagit avec le domaine en superhélice CCD de

Beclin 1.

Afin d'examiner les rôles d’IRS1et de TRS1 dans l’inhibition de l’autophagie dans le contexte de

l'infection virale, nous avons construit des virus mutants qui n’expriment pas TRS1 ou IRS1 ou

encore les deux à la fois. Nous avons observé que les virus mutants ΔIRS1 et ΔTRS1 contrôlent

partiellement l’autophagie et que le virus double mutant HCMV [ΔI/ΔT] induit en revanche

fortement l'autophagie. Nous avons également observé que lors de l'infection par le HCMV,

l’accumulation de LC3 II est le résultat d'une inhibition du flux autophagique et que les deux

protéines IRS1 et TRS1 sont clairement nécessaires pour établir ce blocage, puisqu’aucun des

virus mutants n’est capable de bloquer le flux autophagique et que la co-expression de ces deux

protéines entraine l’accumulation de LC3 II et le blocage de flux.

Ensuite, nous avons étudié la signification fonctionnelle de l'interaction d’IRS1 et de TRS1 avec

Beclin 1 dans le contexte de l'infection virale. Pour cela nous avons construit un virus mutant à

partir du virus double mutant [ΔI/ΔT] dans lequel le gène TRS1 a été réintroduit soit complet

(virus réparé) soit tronqué des 44 premiers acides aminés du domaine N-terminal d’interaction

avec Beclin 1 (TRS1(45-795)/IRS1). Nous avons constaté que ce virus mutant ne se lie pas à

135

Beclin 1 et n’est pas capable de contrôler l’autophagie. Nous avons été surpris de constater que

l'interaction de TRS1 avec Beclin 1 et la capacité de bloquer l'autophagie ne sont pas

importantes pour la réplication virale. En effet, l’infection par ce virus produit un nombre similaire

de particules virales infectieuses extracellulaires et intracellulaires et le niveau d’expression des

protéines virales est identique à celui du virus sauvage. Ces résultats suggèrent que la

modulation de l’activité autophagique par les protéines TRS1 et IRS1 n’a pas un rôle direct dans

l’infection virale des fibroblastes humains, en ce qui concerne l’expression des protéines virales,

la réplication de l’ADN viral, la production ou la sortie des particules virales.

Dans le but de clarifier l'impact de la modulation de l'autophagie sur la réplication virale et

puisque le virus mutant TRS1(45-795)/IRS1 ne semble pas en mesure de bloquer totalement

l'autophagie, nous avons cherché à déterminer si la modulation de l'autophagie par des

approches pharmacologiques pourrait influer la multiplication virale. Nous avons été très surpris

d’observer que l'activation de l'autophagie, par la carence, le MCD ou la rapamycin, renforce

l’infection virale, alors que son inhibition, par la spautin 1 ou des shRNA dirigés contre ATG16,

diminue la production virale. Nous avons observé des effets similaires des modulateurs

pharmacologiques sur les rendements viraux intracellulaires et extracellulaires, suggérant que

l'autophagie n'influence pas la sortie du virus de la cellule. La réplication de l'ADN viral a été

grandement diminuée après inhibition de l'autophagie mais n'a pas été augmentée suite à

l’induction de l’autophagie. Ceci suggère que la stimulation de l'autophagie contribue à l'infection

par le HCMV à un moment du cycle viral qui se situerait entre la formation des nucléocapsides

et l'acquisition de l'enveloppe virale finale. A l'inverse, l'inhibition de l'autophagie semble avoir un

impact plus précoce dans le cycle viral.

L’ensemble de ces résultats nous conduit à proposer que l'autophagie joue un rôle proviral au

cours de l’infection par le HCMV. On pourrait se demander si l'interaction entre Beclin 1 et les

protéines virales IRS1 et TRS1 ne correspond pas en fait à un signal détecté par la cellule lui

permettant de bloquer l'autophagie et de limiter l'infection virale.

136

137

Résultats complémentaires

138

139

En parallèle de l’étude de l’inhibition de l’autophagie aux temps tardifs, nous avons

recherché comment et pourquoi il y a une induction de l’autophagie aux temps précoces

de l’infection. Nous nous sommes notamment intéressés à identifier les mécanismes par

lesquels le HCMV stimule l’autophagie.

Il a été précédemment rapporté dans notre laboratoire et le laboratoire de Chris Preston que

l’infection par le HCMV de fibroblastes humains stimule l’autophagie dans les premières heures

de l’infection (McFarlane, Aitken et al. 2011; Chaumorcel, Lussignol et al. 2012). Mac Farlane et

al ont proposé que l’autophagie soit induite suite à l’interaction initiale du HCMV avec la cellule

et que l’induction de l’autophagie soit due à la présence d'ADN viral (donc étranger) dans le

cytosol et à sa détection. Nous avons testé de notre côté au laboratoire plusieurs approches afin

de déterminer les mécanismes utilisés par le HCMV pour stimuler l’autophagie et nous avons

obtenu des résultats préliminaires non publiés.

Dans un premier temps, nous avons recherché si l’attachement du virus aux protéoglycanes à

héparane sulfate (PGHS) était nécessaire à cette stimulation, à l’aide de deux composés,

l’héparine et l’héparinase, qui bloquent l’attachement et l’entrée du virus dans la cellule.

L’héparine entre en compétition avec les PGHS pour la fixation du HCMV alors que le

prétraitement des cellules par l’héparinase dégrade les PGHS à leur surface. Le traitement aussi

bien par l’héparine que par l’héparinase bloque l’entrée du virus dans la cellule et diminue

l’accumulation de LC3 dans les cellules infectées (Figure 28). Les résultats que nous avons

obtenus suggèrent donc que la liaison du virus aux PGHS est nécessaire à la stimulation de

l’autophagie par le HCMV.

Figure 28 : La fixation du virus aux PGHS est nécessaire à la stimulation de l’autophagie. Panel A. les deux traitements bloquent l’infection par le HCMV. IEA Immediate early antigen. Panel B. les deux traitements diminuent l’accumulation de LC3 au cours de l’infection.

B

A

140

Après interaction avec les PGHS, le HCMV se lie à ses récepteurs puis pénètrent dans la cellule

via les radeaux lipidiques. Nous avons voulu savoir si l’interaction du HCMV avec un de ses

récepteurs suffit à induire l’autophagie ou si le virus doit pénétrer dans la cellule. Il a été montré

que la désorganisation des radeaux lipidiques par une déplétion du cholestérol cellulaire bloque

l’entrée du HCMV dans la cellule alors qu’elle n’a pas d’effet sur la liaison du virus à ses

récepteurs (Juckem, Boehme et al. 2008). Nous nous sommes demandé si le HCMV a besoin

d’interagir avec les radeaux lipidiques pour stimuler l’autophagie. Pour cela nous les avons

désorganisés en utilisant le méthyl beta cyclodextrin (MβCD) afin de bloquer l’entrée du virus.

Nous avons constaté que le traitement par le MβCD induit l’autophagie par lui-même, confirmant

ce qui avait été publié précédemment (Cheng, Ohsaki et al. 2006). Par conséquent, nous avons

essayé de faire varier les conditions de traitement par le MβCD et le délai entre le traitement et

l’infection, afin de nous affranchir de la stimulation de l’autophagie induite par le MβCD.

Malheureusement, il ne nous a pas été possible d’avoir des résultats convaincants et

reproductibles et nous avons donc été dans l’incapacité d’étudier le rôle des radeaux lipidiques

dans la stimulation de l’autophagie par le virus.

Nous avons exploré au laboratoire d’autres possibilités. En effet, il a été démontré que le HCMV

interagit avec le toll-like récepteur membranaire TLR2, une interaction qui n’a pas d’effet sur

l’entrée du virus mais sur l’activation de l’immunité innée (Juckem, Boehme et al. 2008). Or

l’activation des TLR peut entrainer une stimulation de l’autophagie (Delgado, Elmaoued et al.

2008). Nous avons donc recherché si cette interaction est nécessaire pour la stimulation de

l’autophagie induite par le HCMV. Les résultats concernant l’implication de TLR2 dans

l’induction de l’autophagie sont préliminaires, mais semblent très prometteurs (Figure 29). En

effet, nous avons utilisé un anticorps neutralisant anti-TLR2 dirigé contre ce récepteur. Après

avoir confirmé que le traitement par cet anticorps n’a pas d’effet sur l’entrée du virus dans les

cellules infectées, nous avons étudié l’activation de la voie TLR2 en suivant la production d’IL-6

par Elisa après infection par l’UV-CMV. La production d’IL6 obtenue reflète l’activation de ce

récepteur. Nos résultats démontrent que dans les cellules infectées par l’UV-CMV et traitées par

l’anti-TLR2, il y a une diminution de 20% de la production d’IL-6, suggérant que l’anticorps

neutralisant ne bloque que de 20% l’activité de TLR2. Malgré un faible blocage, nous avons

obtenu une diminution de 20% du niveau d’autophagie dans les cellules infectées par l’UV-CMV

et traitées par l’anti-TLR2. Il serait donc très intéressant de bloquer complètement l’activité de ce

récepteur. Nous envisageons, pour cela, d’utiliser la technique de l’ARN Interférence afin

d’inhiber l’expression de TLR2 dans les fibroblastes humains.

141

Figure 29 : Impact des anticorps neutralisants anti-TLR2 sur l’autophagie induite par UV-HCMV.

Nous avons également, toujours dans le but d’étudier le rôle de TLR2 dans la stimulation de

l’autophagie, utilisé des cellules HEK293. Ces cellules n’expriment pas TLR2 et elles ne sont

pas permissives au HCMV (le virus entre dans les cellules mais elles ne produisent pas de

particules virales). Nous avons réussi à augmenter le niveau de l’infection (25%) en rajoutant

une étape de centrifugation au cours de l’adsorption. Nous avons observé que le HCMV

n’entraine pas de stimulation de l’autophagie aux temps précoces de l’infection dans les cellules

HEK293 (Figure 30). Cela suggère que l’interaction du HCMV avec TLR2 semble nécessaire à

cette stimulation. Nous avons aussi utilisé des cellules HEK-hTLR2 qui surexpriment TLR2

humain. Ces cellules expriment également un gène rapporteur dépendant de NF-kB qui permet

de suivre l’activation de TLR2 (Invivogen). TLR2 a été stimulé par le Zymosan, son agoniste

habituel. Malheureusement, nous avons eu plusieurs problèmes avec ces cellules. Elles ne

répondaient pas à la stimulation de TLR2 et nous étions incapables de les infecter à un niveau

correct.

142

Figure 30 : Etude de la modulation de l’autophagie par le HCMV dans les celles HEK293 infectées.

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS, Reactive Oxygen Species) jouent un rôle important

dans la réponse cellulaire à une situation de stress telle que l’infection virale. Une augmentation

des ROS peut induire un stress oxydatif capable de moduler diverses fonctions comme

l’autophagie.

L’infection de fibroblastes humains in vitro par le HCMV révèle une augmentation précoce et

transitoire des ROS cellulaires évaluée par spectrofluorimétrie (Figure 31A). L’utilisation d’anti-

oxydants a montré une diminution de l’induction de l’autophagie après 4 heures d’infection en

suivant les marqueurs de l’autophagie par Western-Blot (Figure 31B). Ces résultats suggèrent

une implication des ROS viro-induites dans l’induction précoce de l’autophagie par le HCMV. De

plus, nous avons montré par Western-Blot et immunofluorescence que les anti-oxydants

diminuent l’expression des protéines virales très précoces (Figure 31C). Ainsi, les ROS seraient

également nécessaires à la synthèse des protéines virales et joueraient donc un rôle important

lors des étapes précoces de l’infection par le HCMV. Il serait intéressant de mieux étudier cette

approche et de confirmer l’implication des ROS dans la stimulation de l’autophagie par le

HCMV.

143

Figure 31 : Implication du stress oxydatif dans l’induction précoce de l’autophagie. (A) L’infection par HCMV induit un stress oxydatif au cours de l’adsorption (40 minutes) . (B) Le traitement par la Catalase diminue l’induction de l’autophagie à 2h post-infection. (C) La NAC diminue l’expression des protéines virales dès 2h post-infection par WB et diminue de 20% le nombre de cellules exprimant les protéines virales IEA à 4h post-infection.

La signification de l'induction précoce de l'autophagie par le HCMV reste à déterminer. Elle peut

représenter une réponse de stress cellulaire suite à l’infection et peut aider à une réponse

immunitaire adaptative pour favoriser la présentation des antigènes viraux aux CMH de classe I

et II. Elle peut également contribuer à une réponse immunitaire innée. Le mécanisme exact

reste encore à clairement identifier.

144

145

Conclusions et perspectives

146

147

Au cours de cette thèse, nous nous sommes attachés à caractériser deux protéines virales du

HCMV, IRS1 et TRS1, capables de bloquer l’autophagie. Nous avons également montré pour la

première fois un rôle proviral de l’autophagie au cours de l’infection par le HCMV. Il avait été

préalablement montré au laboratoire dans le contexte de l’infection par le HCMV de fibroblastes

humains que ce virus est capable d’inhiber l’autophagie à partir de 18 heures après l’infection

mais sans pouvoir identifier le rôle de la modulation de l’autophagie pour le virus (Chaumorcel,

Lussignol et al. 2012).

Nous montrons que l’expression ectopique de ces protéines est capable d’inhiber l’autophagie

induite par la carence nutritionnelle. L’expression de TRS1 ou d’IRS1 entraine une diminution du

nombre des autophagosomes, correspondant à une inhibition du processus autophagique à un

stade précoce. De plus, quand les deux protéines sont exprimées de manière concomitante,

elles entrainent un blocage du flux autophagique. Afin d’étudier le rôle d’IRS1 et de TRS1 au

cours de l’infection virale, nous avons caractérisé différents virus mutants de HCMV : des virus

dans lesquels on a supprimé soit le gène IRS1 (HCMVIRS1) soit le gène TRS1 (HCMVTRS1)

et un virus mutant pour lequel il manque à la fois le gène IRS1 et le gène TRS1 (HCMV

IRS1/TRS1). Les virus mutants ΔIRS1 et ΔTRS1 n’inhibent que faiblement la formation des

autophagosomes alors que le virus IRS1/TRS1 stimule l’autophagie, ce qui suggère que les

deux protéines sont impliquées dans la régulation de l’autophagie dans le contexte de l’infection

virale. L’infection par le HCMV conduit aussi à un blocage du flux autophagique et à une

accumulation de LC3 II par immunoblot. Il semble que les deux protéines virales soient

nécessaires pour inhiber le flux autophagique car aucun des virus mutants n’a été en mesure de

le faire. Nous avons pu ensuite confirmer cette hypothèse par la cotransfection d’IRS1 et de

TRS1, qui conduit à un blocage complet du flux autophagique. Ces résultats montrent qu’IRS1

et TRS1 sont toutes deux impliquées de manière complémentaire dans la régulation de

l'autophagie par le HCMV.

Nous avons cherché à identifier les mécanismes utilisés par ces deux protéines pour inhiber

l’autophagie. Il avait déjà été montré par le laboratoire de notre collaborateur Dr Adam Geballe

qu’IRS1 et TRS1 interagissent directement avec la kinase PKR et qu’elles la bloquent, ce qui

inhibe la phosphorylation du facteur d'initiation de la traduction eIF2 et empêche l'arrêt de la

synthèse des protéines produites lors de l'infection (Hakki, Marshall et al. 2006). De notre côté,

nous avons montré au laboratoire que la protéine virale Us11 d’HSV-1 est capable de bloquer

l'autophagie, par interaction directe avec PKR (Lussignol, Queval et al. 2013). Nous avons donc

regardé si l’inhibition de l’autophagie passait par la voie PKR. Nous avons conclu que le

148

mécanisme est indépendant de cette voie. En effet, IRS1 et TRS1 sont capables d’inhiber

l’autophagie dans des cellules n’exprimant pas PKR et le domaine de liaison à PKR d’IRS1 et de

TRS1, situé dans leur région C-terminal, n’est pas nécessaire à leur activité inhibitrice. Comme

plusieurs protéines des Herpesvirus inhibent l’autophagie en interagissant avec Beclin 1, nous

avons regardé si TRS1 et IRS1 étaient capables de se lier à cette importante protéine de la

machinerie autophagique. Nous avons montré qu’IRS1 et TRS1 se lient à Beclin 1 par leur

région N-terminale identique (Beclin Binding Domain BBD localisé dans les 44 premiers acides

aminés) et que cette région est nécessaire pour leur interaction avec Beclin 1. Nous avons

ensuite voulu évaluer la capacité de formes tronquées dans la partie N-terminale d’IRS1 à

inhiber l’autophagie induite par la carence nutritionnelle. Nous avons démontré que l’expression

de ces formes tronquées, qui ne se lient pas à Beclin 1, n’inhibe pas l’autophagie au même

niveau que la protéine complète. Nous avons également mis en évidence qu’IRS1 interagit avec

le domaine CCD (coiled-coil domain) de Beclin 1, ce qui n’avait jamais été décrit pour une

protéine virale. Les autres protéines virales comme vBcl-2 bloquent la formation des

autophagosomes par une interaction directe avec le domaine BH3 de Beclin 1, comme le fait la

protéine cellulaire Bcl-2 (Pattingre, Tassa et al. 2005). Il est intéressant de noter que ce n’est

pas le cas de la protéine ICP34.5 d’HSV-1. En effet, elle n’interagit pas avec le domaine BH3 de

Beclin 1 mais le site d'interaction n’a pas été précisément identifié (Orvedahl, Alexander et al.

2007).

Afin de mieux comprendre le rôle de l’interaction avec Beclin 1 au cours de l’infection virale,

nous avons étudié le phénotype de nouveaux virus mutants. La construction de ces virus

mutants a été réalisée à notre demande par Rebekka Brost dans le laboratoire de notre

collaborateur allemand Pr Wolfram Brune. Il s’agit d’un virus mutant qui n’exprime pas IRS1 et

qui contient une délétion de la région N-terminale de TRS1 (TRS1(45-795) / IRS1) et de son

virus réparé (TRS1-HA/IRS1). Nous avons montré que ce virus mutant ne se lie pas à Beclin 1

et ne bloque pas l’autophagie. Ceci confirme que l’interaction de TRS1 avec Beclin 1 est

primordiale pour bloquer l’autophagie au cours de l’infection.

Il faut noter que, comme le virus sauvage, ce virus mutant stimule l’autophagie aux temps

précoces de l’infection (Figure 32). Mais, contrairement au virus IRS1/TRS1 ou à un virus

inactivé par les UV, cette stimulation ne perdure pas après 24h d’infection.

149

Figure 32 : Stimulation de l’autophagie aux temps précoces de l’infection. AD169-BAC virus sauvage

Il se pourrait donc qu’une limitation de l’autophagie se produise tout de même sans le contrôle

d’IRS1 et de TRS1. Une des hypothèses possibles est que le HCMV code d’autres protéine(s)

virale(s) capable de contrôler l’autophagie. En effet, le virus IRS1/TRS1 est un virus défectif

incapable de former des protéines néosynthétisées et le traitement par les UV va également

entrainer l’absence de toute protéine virale néosynthétisée dans les cellules infectées. Cela

pourrait expliquer l’absence d’effet sur la réplication virale. Il serait donc intéressant de

rechercher si le HCMV code d’autre(s) protéine(s) anti-autophagique(s). Par exemple, il a été

montré que la protéine anti-apoptotique UL38 du HCMV interfère dans la cascade de

signalisation de mTOR et empêche sa régulation négative en se liant à TSC1 et TSC2. Il sera

intéressant de rechercher si UL38 est impliquée dans l’inhibition de l’autophagie via la voie

mTOR.

Nous avons ensuite cherché à déterminer si l'inhibition de l’autophagie suite à l’interaction de

TRS1/IRS1 avec Beclin 1 est importante pour la réplication virale. Nous avions émis l’hypothèse

qu'un virus incapable de contrôler l’autophagie, en raison de la suppression d'IRS1 et du

domaine BBD de TRS1, va se multiplier de manière moins efficace que le virus sauvage. La

présence d’une majeure partie de TRS1 permet à la protéine d’interagir avec PKR et de lever le

blocage de la synthèse protéique. De manière surprenante, nous avons constaté que le virus

mutant TRS1(45-795)/IRS1 n’a pas de défaut de production virale, suggérant que l’inhibition de

l'autophagie n’est pas essentielle pour la réplication virale dans les fibroblastes humains.

Cependant, il est tout à fait possible que l'inhibition de l'autophagie par le HCMV ait des

conséquences différentes dans d'autres types cellulaire ou encore in vivo au cours des

infections naturelles chez l'homme. Il faut noter qu’un virus mutant d’HSV-1 auquel il manque le

domaine de liaison à Beclin 1 dans la protéine anti-autophagique ICP34.5 se multiplie de la

150

même manière que le virus sauvage in vitro alors que ce virus est neuroatténué chez la souris

(Orvedahl, Alexander et al. 2007).

Puisque que le virus recombinant ne stimule pas l'autophagie comme le double mutant, nous

avons cherché si une modulation de l’autophagie pourrait influencer la multiplication virale. Pour

cela, nous avons développé d’autres approches, comme l’utilisation de modulateurs

pharmacologiques de l’autophagie ou de lentivirus hébergeant des shRNA dirigés contre des

protéines de l’autophagie. Nous avons observé cette fois-ci que l’inhibition de l’autophagie est

capable de diminuer la production virale et au contraire sa stimulation l’augmente. En revanche,

l’effet sur la production virale extracellulaire et intracellulaire est similaire, ce qui indique que

l’autophagie n’affecte pas la sortie du virus de la cellule. La réplication de l'ADN viral a été

sévèrement réprimée après l’inhibition de l'autophagie mais n'a pas été augmentée suite à

l’induction de l’autophagie. Ces résultats suggèrent que l’inhibition de l'autophagie peut limiter

l'infection par le HCMV au moment de la réplication de l'ADN viral, voire avant la réplication. Ces

résultats suggèrent aussi que la stimulation de l'autophagie pourrait contribuer à l'infection par le

HCMV après la réplication de l'ADN viral alors que son inhibition semble avoir un impact plus tôt

dans le cycle viral. L’ensemble de ces résultats suggèrent que l’autophagie pourrait être

bénéfique au HCMV dans certaines conditions.

Une des premières questions que l’on peut se poser est de savoir pourquoi le virus a besoin

d’exprimer au moins deux protéines anti-autophagiques IRS1 et TRS1?

Les deux protéines sont connues comme étant des antagonistes de la voie PKR/eIF2 (Hakki,

Marshall et al. 2006). Il a été montré que le virus double mutant IRS1/TRS1 est défectif car la

voie PKR est activée (Marshall, Bierle et al. 2009). L’expression d’une seule protéine est

suffisante pour que le virus inhibe la voie PKR alors que nous pensons que le HCMV a besoin

de ces deux protéines ensemble pour bloquer l’autophagie de manière efficace. Nous avons

observé que le flux autophagique est bloqué uniquement par les deux protéines. Nos résultats

suggèrent que l’expression des protéines individuellement ne diminue que la synthèse des

autophagosomes.

Il faut noter que HSV-1, un virus voisin du HCMV, possède également deux protéines anti-

autophagiques ICP34.5 et US11 qui agissent par des mécanismes différents, par interaction

respectivement avec Beclin 1 ou avec PKR (Orvedahl, Alexander et al. 2007; Lussignol, Queval

et al. 2013). Dans le cas de HSV-1, les deux protéines bloquent la voie PKR/eIF2 à des

moments différents du cycle viral pour maintenir une synthèse protéique normale tout au long de

151

la réplication virale (Cassady, Gross et al. 1998a; Cassady, Gross et al. 1998b; Cassady and

Gross 2002). Il est possible que cela se passe de la même manière pour l’autophagie. ICP34.5

bloquerait l’autophagie avant la réplication virale (c’est une protéine tardive dite 1 qui s’exprime

avant la réplication) et Us11 pourrait prendre le relais après la réplication virale (c’est une

protéine tardive vraie, true late ou 2). Dans le cas du HCMV, l’expression d’IRS1 et TRS1 est

sous le contrôle de promoteurs identiques, donc elles ne peuvent pas agir sur l’autophagie à des

moments différents. Les deux protéines apparaissent de manière concomitante dans les cellules

infectées vers 12-18 heures post infection (Figure 33). Ceci correspond au moment où apparait

une inhibition de l’autophagie dans les cellules infectées. Nous avons cependant noté que la

protéine TRS1 est plus abondante que la protéine IRS1 (Figure 33).

Figure 33 : Expression des protéines IRS1 TRS1 au cours de l’infection. Des cellules MRC5 ont été

infectées par le HCMV à MOI 1 et prélevées à différents temps post infection.

Nous avons montré qu’IRS1 interagit avec le domaine CCD de Beclin 1. Il est très probable que

la protéine TRS1, qui a beaucoup d’homologie avec IRS1 et qui interagit aussi avec Beclin 1,

interagisse aussi avec ce domaine CCD. Ceci pourrait être vérifié par immunoprécipitation dans

les mêmes conditions que pour IRS1. Il a été montré dans la littérature que le domaine CCD de

Beclin 1 est le domaine d’interaction avec plusieurs protéines de la machinerie autophagique,

notamment Atg14L et UVRAG, mais aussi VMP1, TAB2/3 et AMBRA1 et lui-même pour former

des homodimères de Beclin 1 (Levine, Liu et al. 2015). Atg14L et UVRAG interagissent avec

Beclin 1 dans deux complexes distincts contenant la PI3K de classe III et qui fonctionnent

respectivement dans la formation de l'autophagosome et dans la maturation de

l’autophagosome et de l'endosome (Figure 34) (Levine, Liu et al. 2015). Il serait dont intéressant

d’isoler les différents complexes de Beclin 1 qui sont associés à IRS1 et TRS1 par des

immunoprécipitations dans des cellules infectées ou transfectées par des plasmides taggées de

ces gènes. Comme les protéines virales sont à la fois capables de bloquer la formation et la

maturation des autophagosomes, il est possible que TRS1 et IRS1 soient retrouvés dans les

deux sortes de complexes.

152

Figure 34 : Différents complexes Beclin 1/ PI3K de classe III (Levine, Liu et al. 2015)

Puisque nous avions mis en évidence que les protéines IRS1 et TRS1 bloquent l’autophagie,

nous avions posé comme hypothèse que les protéines virales étaient là pour protéger le virus et

que l’autophagie était un mécanisme de défense antiviral. Nous avons donc été surpris de

découvrir que l’autophagie est en fait bénéfique pour le HCMV.

Bien que le HCMV possède deux protéines anti-autophagiques et que l'autophagie soit réprimée

lors de l’infection, l’autophagie joue un rôle proviral au cours de l’infection.

Nous avons préalablement montré au laboratoire que le HCMV module l’autophagie dans deux

directions opposées. Tout d'abord, le HCMV stimule l’autophagie au cours des premiers stades

de l'infection. Cette stimulation se produit indépendamment de la synthèse de novo de protéines

virales car un virus inactivé par les UV stimule aussi l’autophagie à ce stade. Au stade tardif de

l'infection, le HCMV bloque l’autophagie et cela nécessite l'expression de novo de protéine(s)

virale(s) (Chaumorcel, Lussignol et al. 2012).

Il est bien connu que l'autophagie peut contribuer aux défenses antivirales et il a été rapporté

dans plusieurs études que l’autophagie peut réduire directement la multiplication virale, comme

dans le cas du virus Chikungunya (Joubert, Werneke et al. 2012). Mais dans d’autres cas,

l’autophagie peut être détournée par les virus et utilisée à leur profit (Lennemann and Coyne

2015).

153

Dans le cas du HCMV, nous avons observé que l’autophagie joue un rôle proviral dans les

temps tardifs de l’infection. Une de nos hypothèses est que le virus stimule l’autophagie dès les

temps précoces de l’infection car cette stimulation est bénéfique pour améliorer sa production.

Or la stimulation excessive et prolongée de l’autophagie est dommageable pour la cellule qui

pourrait essayer d’inhiber cette autophagie en reconnaissant les protéines TRS1 et IRS1. Ceci

aurait pour conséquence de limiter l’infection. Nous pensons donc que l’interaction de Beclin 1

avec les protéines virales IRS1 et TRS1 pourrait faire partie d'une réponse cellulaire, qui limite la

production virale. Ces résultats inattendus chez le HCMV ont une grande similarité avec

plusieurs études récentes qui montrent un rôle proviral de l’autophagie au cours de l’infection

par certains herpesvirus comme l’EBV ou le VZV. En effet, au cours de sa réactivation, l’EBV

semble détourner l’autophagie en induisant une autophagie incomplète et pourrait utiliser la

machinerie moléculaire de l'autophagie pour optimiser l'acquisition de son enveloppe (Nowag,

Guhl et al. 2014). Un autre herpesvirus, le VZV, induit une réponse autophagique complète

(jusqu’à la dégradation du contenu des autolysosomes) qui a un effet proviral. Ceci pourrait être

lié au fait que l'autophagie améliore la maturation de la glycoprotéine d’enveloppe gE

(Buckingham, Carpenter et al. 2014).

A ce jour, l’importance et l'influence de l'autophagie sur l’infection par le HCMV ne sont pas

connues. Seule une étude succincte a rapporté en 2013 un rôle proviral de l’autophagie au

cours de l’infection (Zhao, Li et al. 2013). Les auteurs y proposent, sans réellement le

démontrer, que la modulation de l’autophagie quel que soit le moment de l’infection par le

HCMV soit bénéfique pour sa propre réplication. Ils ont montré que l’induction de l'autophagie

par la rapamycine augmente le titre viral et que l'inhibition de l'autophagie par le 3-MA réduit ce

titre. Ils ont confirmé ce qui avait été préalablement rapporté que l'infection par le HCMV stimule

la voie de signalisation mTOR dans les étapes tardives. Les données de cette étude suggèrent

donc que l’autophagie induite par le HCMV facilite sa propre réplication via mTOR. Cependant,

alors que le HCMV a un cycle de réplication très long de 4 à 5 jours, on peut s’étonner que les

auteurs soient capables d’observer une production virale à 12h post infection et d’avoir un effet

des modulateurs autophagiques. De plus, des recherches complémentaires seraient

nécessaires pour prouver l’implication de mTOR dans cette activation bénéfique de l’autophagie.

Aucune expérience sur l’invalidation de mTOR n’a été faite. Leur conclusion est uniquement

basée sur l’utilisation de la rapamycine et du 3MA, ce qui n’exclut pas la possibilité d'autres

effets de ces drogues, indépendants de la régulation de l'autophagie.

154

L’étude de l’inhibition de l’autophagie par ces deux protéines et l’utilisation de différents virus

mutant nous a permis de mieux comprendre comment le HCMV contrôle l’autophagie. Nos

résultats suggèrent que les deux protéines sont toute deux nécessaires pour bloquer

l'autophagie. Cependant, le blocage de l'autophagie ne semble pas être essentiel pour optimiser

la réplication virale. En fait, des études utilisant des modulateurs pharmacologiques de

l’autophagie et l'inhibition de l'autophagie par l’extinction du gène ATG16 par shRNA suggèrent

que, bien que l'autophagie soit réprimée, elle joue un rôle proviral au cours de l’infection par le

HCMV.

Il est important de noter que les traitements anti HCMV commercialisés sont responsables de la

sélection de mutants résistants, possèdent de nombreux effets secondaires et sont couteux. Il

est donc intéressant de mieux comprendre la façon dont le HCMV interagit avec la cellule, afin

de pouvoir utiliser ces connaissances pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

L’autophagie semble constituer une nouvelle cible dans le traitement de certaines pathologies,

comme le cancer et les maladies neurodégénératives. Un exemple, récemment il a été montré

que l’autophagie a un effet antiviral vis-à-vis de HSV-1 et que son induction diminue la

production virale (Yakoub and Shukla 2015). La modulation de l’autophagie, en particulier son

inhibition, pourrait être utilisée potentiellement comme cible thérapeutique pour lutter contre le

HCMV.

155

Travaux annexes

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The Human Cytomegalovirus Protein TRS1 Inhibits Autophagy via ItsInteraction with Beclin 1

Magali Chaumorcel,a Marion Lussignol,a Lina Mouna,a Yolaine Cavignac,a Kamau Fahie,a Jacqueline Cotte-Laffitte,a Adam Geballe,b

Wolfram Brune,c Isabelle Beau,a Patrice Codogno,a and Audrey Esclatinea

INSERM UMR984, Université Paris Sud, Faculté de Pharmacie, Châtenay-Malabry, Francea; Fred Hutchinson Cancer Research Center and University of Washington, Seattle,Washington, USAb; and Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, Hamburg, Germanyc

Human cytomegalovirus modulates macroautophagy in two opposite directions. First, HCMV stimulates autophagy during theearly stages of infection, as evident by an increase in the number of autophagosomes and a rise in the autophagic flux. This stim-ulation occurs independently of de novo viral protein synthesis since UV-inactivated HCMV recapitulates the stimulatory effecton macroautophagy. At later time points of infection, HCMV blocks autophagy (M. Chaumorcel, S. Souquere, G. Pierron, P.Codogno, and A. Esclatine, Autophagy 4:1– 8, 2008) by a mechanism that requires de novo viral protein expression. Explorationof the mechanisms used by HCMV to block autophagy unveiled a robust increase of the cellular form of Bcl-2 expression. Al-though this protein has an anti-autophagy effect via its interaction with Beclin 1, it is not responsible for the inhibition inducedby HCMV, probably because of its phosphorylation by c-Jun N-terminal kinase. Here we showed that the HCMV TRS1 proteinblocks autophagosome biogenesis and that a TRS1 deletion mutant is defective in autophagy inhibition. TRS1 has previouslybeen shown to neutralize the PKR antiviral effector molecule. Although phosphorylation of eIF2� by PKR has been described asa stimulatory signal to induce autophagy, the PKR-binding domain of TRS1 is dispensable to its inhibitory effect. Our resultsshow that TRS1 interacts with Beclin 1 to inhibit autophagy. We mapped the interaction with Beclin 1 to the N-terminal regionof TRS1, and we demonstrated that the Beclin 1-binding domain of TRS1 is essential to inhibit autophagy.

Human cytomegalovirus (HCMV) a member of the Herpesviri-dae family, is widespread in human populations, with up to

90% of some populations seropositive for the virus (42). AlthoughHCMV infection is usually asymptomatic in healthy individuals, itis a major cause of morbidity and mortality in immunocompro-mised individuals, such as AIDS patients or bone marrow andsolid organ transplant recipients, and it can cause life-threateninginfections that compromise long-term graft function. Moreover,HCMV congenital infection is the most common cause of virus-induced birth defects, particularly disorders of the central nervoussystem.

Macroautophagy (here referred to as autophagy) is a vacuolarhomeostatic “self-eating” process that involves the digestion ofcytoplasmic components via the lysosomal pathway. During au-tophagy, part of the cytoplasm is surrounded by a cisternal mem-brane, known as the phagophore. The phagophore then closes toform a double-membraned vesicle, known as the autophagosome.The autophagosome finally fuses with the lysosome, forming theautolysosome, which digests the sequestered material. The forma-tion of the autophagosome requires the activity of severalautophagy-related (Atg) proteins, initially identified in Saccharo-myces cerevisiae. Beclin 1, the mammalian counterpart of Atg6in yeast, is a keystone of this process, because it forms threedifferent complexes involved in both autophagosome forma-tion and maturation. The assembly of the phagophore requiresthe Beclin 1-phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) complex,consisting of Beclin 1, the class III PI3K hVps34, its regulatoryprotein kinase hVps15, and Atg14L. This Beclin 1 complex istightly modulated by the recruitment of positive and negativeregulators of autophagy (such as Bcl-2 and Bcl-xL) (48, 51, 52).Regulation is also achieved through posttranslational modifi-cations of Beclin 1 or Bcl-2, through interactions with BH3-only proteins and BH3 mimetics, or by a recently discovered

Beclin 1-targeted microRNA (65). This complex and other Atgproteins recruit the Atg5-Atg12-Atg16L multimeric complexand the lipidated form of LC3 (microtubule-associated proteinlight chain 3) to the phagophore. These last two constituents,which are essential for the forming autophagosome to expand,act sequentially and result from two ubiquitin-like conjugationsystems. Two other Beclin 1 complexes regulate the maturation ofautophagosomes, via interaction of Beclin 1 with UVRAG (UV radi-ation resistance-associated gene) and Rubicon (39, 64).

Under normal conditions, autophagy allows cells to degradelong-lived proteins and aged organelles and has two main physi-ological functions. The first involves recycling macromoleculesand long-lived proteins to provide cells exposed to nutrient stresswith amino acids and energy. The second function is to help thecell eliminate damaged organelles, such as mitochondria, andtoxic aggregate-prone proteins. Autophagy has also recently beenshown to be modulated by intracellular pathogens. Whereas somemicroorganisms, such as poliovirus, use the autophagic machin-ery for their own benefit such as enhanced replication, autophagycan function in cellular defenses against intracellular pathogens,including viruses, by stimulating both innate and adaptive immu-nity (reviewed in references 16, 17, and 58). However, virusesincluding herpes simplex virus 1 (HSV-1) and human herpesvirus8 (HHV-8) have developed various strategies to counteract thehost’s antiviral autophagic mechanism (reviewed in references 7

Received 21 July 2011 Accepted 19 December 2011

Published ahead of print 28 December 2011

Address correspondence to Audrey Esclatine, audrey.esclatine@u-psud.fr.

Copyright © 2012, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.

doi:10.1128/JVI.05746-11

0022-538X/12/$12.00 Journal of Virology p. 2571–2584 jvi.asm.org 2571

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and 17). We and others previously reported that HCMV alsomodulates autophagy in infected cells (9, 40, 54).

Several viruses are able to counteract autophagy by an interac-tion between a viral protein and a cellular protein of the autophagymachinery. For example, two members of the Gammaherpesviri-nae subfamily, HHV-8 and herpesvirus saimiri, express the viralprotein vFLIP, a viral counterpart of cellular FLIP, which is knownto regulate apoptosis from death receptors. vFLIP interacts withAtg3 and represses autophagy by preventing the binding of Atg3 toLC3 and consequently the processing of LC3, which is essential forautophagic vesicle expansion (35). Most importantly, Beclin 1 hasemerged as the major target for the modulation of autophagy byviruses (24). Indeed, it has been reported that several viral proteinsbind and inhibit Beclin 1. HHV-8 and mouse herpesvirus strain 68(HV-68) express viral homologs of Bcl-2, vBcl-2 and M11, respec-tively, which achieve inhibition of autophagy by their interactionwith Beclin 1 (48, 53). The infected cell protein 34.5 (ICP34.5) ofHSV-1 also interacts directly with Beclin 1 and inhibits autopha-gosome biogenesis (44). Other viral proteins seem to block au-tophagosome maturation rather than formation by interactionwith Beclin 1. The Nef protein of human immunodeficiency virus(HIV) and the matrix protein M2 of influenza A virus interactwith Beclin 1 but are responsible for autophagosome accumula-tion during viral infection, by blocking fusion of the autophago-some with the lysosome (23, 33). These two viral proteins mightinteract with the other Beclin 1-hVps34 complex containingUVRAG, which is involved in autophagosome maturation.

In this paper, we have explored the modulation of autophagyduring HCMV infection and the mechanisms used by HCMV toblock autophagy. HCMV induces autophagy independently of vi-ral protein synthesis during the early stages of infection. Later,HCMV actively blocks the autophagosome biogenesis by expres-sion of viral protein(s). We observed viral-induced modificationsof Bcl-2, a negative regulator of autophagosome biogenesis. Inaddition, we identified TRS1 as a new anti-autophagic protein. Ithas been previously reported that TRS1 blocks the activity of theinterferon-induced double-stranded RNA-dependent protein ki-nase PKR (10, 26). However, we found that the anti-autophagicactivity of TRS1 is independent of its interaction with PKR but isrelated to its binding to Beclin 1.

MATERIALS AND METHODSCells and virus. Primary human embryonic lung fibroblasts MRC5 werepurchased from RD-Biotech and used between passages 23 and 28 posti-solation. These cells were maintained in minimum essential medium(MEM) (Gibco) supplemented with 10% fetal calf serum (FCS), penicillinG (100 U/ml), streptomycin sulfate (100 �g/ml), l-glutamine (1%), andnonessential amino acids (1%). Cells were cultured at 37°C under 5%CO2. HeLa cells were maintained at 37°C under 5% CO2 in RPMI with10% FCS. PKR�/� and PKR�/� mouse embryo fibroblasts kindly pro-vided by B. R. G. Williams (Monash University, Victoria, Australia) werepropagated in Dulbecco MEM supplemented with 10% FCS. The AD169strain of HCMV was obtained from ATCC and was propagated in MRC5cells as previously described (19). The AD169�TRS1 mutant was con-structed on the basis of the AD169 bacterial artificial chromosome (BAC),which contains the full-length HCMV AD169 genome (27). Mutagenesisby homologous recombination was performed in Escherichia coli strainDY380 essentially as described previously (5, 38). Briefly, a kanamycinresistance gene (kan) flanked by FLP recombination target sites was PCRamplified using oligonucleotide primers containing 50-nucleotide ho-mologies immediately up- and downstream of TRS1. The PCR productwas used to replace the TRS1 gene by homologous recombination. The

kan gene was subsequently removed with FLP recombinase as describedpreviously (5). BAC DNA was purified from E. coli using the NucleoBondMidi kit (Clontech). To reconstitute the �TRS1 mutant virus, BAC DNAwas introduced by electroporation into human foreskin fibroblast (HFF)cells essentially as described previously (38). For gradient purification ofHCMV virions, infectious supernatants from infected MRC5 cells with 90to 100% late-stage cytopathic effects were made cell free by centrifugationfor 10 min at 4,000 rpm. Supernatants were then ultracentrifuged for 70min (23,000 rpm, 4°C, Beckman SW28 rotor). Pellets containing virionsand other particles were resuspended in 1 ml of MEM and transferredonto a preformed linear glycerol-tartrate gradient (15 to 35% Na-tartrateand 30 to 0% glycerol in 0.04% Na-phosphate), which was then ultracen-trifuged for 45 min (23,000 rpm, 4°C, Beckman SW41 rotor). The virion-containing band was harvested with a syringe, and the virions werewashed and pelleted by an additional ultracentrifugation for 70 min at23,000 rpm. The pellet was resuspended in MEM and stored at �80°Cuntil used for infection experiments. For UV inactivation, HCMV stockswere diluted in MEM, placed in a thin layer in plastic dishes, and irradi-ated with UV light (254 nm, 6 W, 8 min) at �4 cm away from a (VL-6MC)UV lamp (Bioblock Scientific). The efficacy of inactivation was tested byimmunofluorescence staining of MRC5 cells infected with UV-HCMVusing anti-immediate-early antigens (IEAs) monoclonal antibody (MAb)and pp65 MAb (see below), followed by a secondary fluorescein isothio-cyanate (FITC)-conjugated goat anti-mouse antibody (data not shown).Successful inactivation was ensured through abrogation of IE antigen ex-pression, whereas pp65 tegument protein detection was comparable tocell infection with nonirradiated virus by using methods previously de-scribed (13, 34).

Antibodies. Murine MAb E13 was purchased from Argene and recog-nizes the HCMV nonstructural immediate-early antigens (IEAs) of 52, 72,and 86 kDa. Antibody directed against the C-terminal region of TRS1protein was a kind gift of T. Shenk (50). In order to detect 6�His-taggedTRS1 constructs, we used a rabbit antibody directed against 6�His (CellSignaling Technology). For the detection of FLAG-tagged Beclin 1 andFLAG-tagged ICP34.5, we used a rabbit antibody directed against FLAG(Cell Signaling Technology). Antibody against LC3 was produced as pre-viously described (9). Antibodies against p62 (BD Biosciences), Beclin 1(Santa Cruz), RelB (Santa Cruz), Bcl-2 total (Santa Cruz), and phosphor-ylated Bcl-2 (Cell Signaling) were used in this study. To explore the JNKpathway, antibody directed against total JNK was obtained from SantaCruz and antibodies directed against phosphorylated (Thr183/Tyr185)JNK and against total and phosphorylated (Ser73) c-Jun were purchasedfrom Cell Signaling. Anti-actin antibody was supplied by Sigma. Second-ary fluorescein isothiocyanate (FITC) and tetramethyl rhodamine iso-thiocyanate (TRITC)-conjugated goat anti-mouse or anti-rabbit IgG werepurchased from Jackson. Alexa Fluor 350 donkey anti-rabbit secondaryantibody was obtained from Invitrogen.

HCMV infection of fibroblasts. MRC5 cells were grown in MEMsupplemented with 10% FCS. HCMV or UV-inactivated HCMV, dilutedin serum-free MEM, or serum-free MEM alone (mock infected) was ad-sorbed onto cells for 1 h at 37°C at a multiplicity of infection (MOI) of 1 or3. After the inoculum was removed, the cells were maintained in MEMcontaining 10% FCS and processed for the different assays at varioustimes postinfection (p.i.). Cell viability was tested by a trypan blue exclu-sion test, and no significant cell death was observed in HCMV-infectedcells at 24 and 48 h p.i. Cells were centrifuged for 45 min at 1,400 � gduring the adsorption period, to enhance infectivity of HCMV, in exper-iments in which MRC5 cells were transfected with green fluorescent pro-tein (GFP)-LC3 (21).

Immunoblot analysis. MRC5 and HeLa cells were lysed in 65 mMTris, pH 6.8, 4% SDS, 1.5% �-mercaptoethanol and held at 100°C for 5min. Proteins were separated on gels containing different percentages ofSDS-polyacrylamide: 10% to resolve Beclin 1, His-tagged TRS1, or TRS1,12% for Bcl-2 and p62, and 15% to resolve LC3 forms I and II. For im-munoblot analysis, the proteins were electrotransferred onto a polyvi-

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nylidene difluoride membrane (Perkin Elmer, Les Ulis, France). Themembrane was incubated for 1 h in Tris-buffered saline (25 mM Tris [pH7.5], 150 mM NaCl, and 0.05% Tween 20) containing 5% nonfat dry milkand then incubated with primary antibodies at an appropriate dilution.After three washes with Tris-buffered saline, a goat anti-rabbit or anti-mouse horseradish peroxidase-labeled antibody (Amersham, Orsay,France) was used at 1/10,000 dilution as a secondary antibody. Boundimmunoglobulins were revealed using the ECL� detection system underconditions recommended by the manufacturer (Immobilon, Orsay,France). Anti-actin was used to ensure equal loadings. The effect ofHCMV on autophagosome maturation is monitored by p62 protein levelsand confirmed by comparing untreated samples with those treated withinhibitors of acidic lysosomal proteases E64d/pepstatin A that inhibit deg-radation of autolysosome content.

Coimmunoprecipitation assays. To immunoprecipitate Bcl-2 andendogenous Beclin 1 in MRC5 cells, cells were lysed in lysis buffer (20mM Tris HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0.2% CHAPS, 10%glycerol) for 1 h at 4°C, followed by centrifugation to remove celldebris. Immunoprecipitation was performed overnight at 4°C with agoat polyclonal anti-Beclin 1 antibody (Santa Cruz Biologicals, SantaCruz, CA) or a control goat serum. Protein G-Sepharose beads (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) were added for 1 h at 4°C and were washed threetimes with 0.05% CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate) buffer (20 mM Tris HCl, pH 7.4, 140 mM NaCl, 2mM EDTA, 0.05% CHAPS, 10% glycerol). Anti-Beclin 1 immunoprecipi-tates were eluted in Laemmli buffer and subjected to SDS-PAGE, andBcl-2 was detected by immunoblot analysis. To immunoprecipitate en-dogenous Beclin 1 and different HCMV TRS1 constructs, HeLa cells weretransfected with different TRS1 constructs and then treated as describedabove. To immunoprecipitate TRS1 and endogenous Beclin 1 in HCMV-infected MRC5 cells, cells were lysed in a different lysis buffer (50 mM TrisHCl, 50 mM NaCl, 0.5% Triton, 0.2% bovine serum albumin [BSA],25 mM NaPPi, 50 mM Na3VO4) for 1 h at 4°C, followed by ultracentrifu-gation at 120,000 � g to remove cell debris. Immunoprecipitation was per-formed overnight at 4°C with a goat polyclonal anti-Beclin 1 antibody or acontrol goat serum. Protein G-Sepharose beads were added for 1 h at 4°C andwere washed three times with buffer (50 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, 0.5%Triton, 0.2% BSA, 25 mM NaPPi, 50 mM Na3VO4) and two times with an-other buffer (20 mM Tris HCl, 50 mM NaCl, 0.2% BSA). Anti-Beclin 1 im-munoprecipitates were eluted in Laemmli buffer and subjected to SDS-PAGE, and TRS1 was detected by immunoblot analysis.

Immunofluorescence analysis. Cell monolayers prepared on glasscoverslips were fixed for 10 min at room temperature in 3.5% paraformal-dehyde (PFA) in phosphate-buffered saline (PBS) and then washed threetimes with PBS. Different staining protocols were used for different anti-bodies. In some experiments, cell permeabilization was performed by in-cubating the coverslips for 4 min with PBS– 0.2% Triton X-100. The cellswere stained with a mouse antibody against HCMV IE antigens (1:50;Argene Biosoft) followed by a TRITC-conjugated goat anti-mouse anti-body (1:200). To detect 6�His TRS1 construct expression, cells werestained with anti 6�His antibody (1:100; Cell Signaling) followed byTRITC-conjugated goat or Alexa Fluor 350 donkey anti-rabbit secondaryantibodies. Cells were also stained overnight with an antibody againstphosphorylated Bcl-2 (1:100; Cell Signaling), followed by FITC-conjugated secondary antibody. Coverslips were mounted with Glycergel(Dako) before being analyzed on a Nikon Eclipse 80i epifluorescence mi-croscope. Digitized images were stored and overlaid to evaluate two-colorexperiments. Photographic images were resized, organized, and labeledusing Adobe Photoshop software.

Real-time PCR. Total RNA was extracted with the aid of TRIzol re-agent according to the manufacturer’s instructions and then digested withDNase (Life Technologies), extracted with phenol-chloroform, and pre-cipitated with ethanol to remove contaminating DNA. Total RNA (2.5�g) from mock-infected and HCMV-infected cell samples was reversetranscribed with random hexamers and SuperScript reverse transcriptase

(Invitrogen). cDNA quantities were normalized to 18S rRNA quantities.The following primers were used: Bcl-2 forward, 5=-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3=, and reverse, 5=-ACAGTTCCACAAAGGCATCC-3=.The primers for Beclin 1 were previously validated and described (18).Reactions were performed in a 10-�l volume that included diluted cDNAsample, primers (0.5 �M), and LightCycler DNA Master SYBR green Imix (Roche) that contained nucleotides, Taq DNA polymerase, and opti-mized buffer components. Real-time PCRs were performed on a LightCy-cler 2.0 detection system (Roche). To compare mock-infected and in-fected cell samples, relative changes in gene expression were determinedusing the 2���CT method.

Transfection. The GFP-LC3 expression vector and the GFP and redfluorescent protein (RFP) tandemly tagged LC3 construct (mRFP-GFP-LC3) were kindly provided by T. Yoshimori (Research Institute for Mi-crobial Diseases, Osaka University, Osaka, Japan) (30). The pEQ1180construct, containing a full-length HCMV TRS1 protein cDNA and thepEQ979 (1-738), pEQ1001 (1-679), pEQ1013 (45-795), and pEQ1000(93-795) constructs, containing the indicated lengths of TRS1, were de-scribed previously (25). These constructs were tagged with 6�His. Plas-mid FLAG-ICP34.5 was a gift from B. He (University of Illinois, Chicago).Cultures of HeLa cells at 50 to 80% confluence were transiently trans-fected with empty vector, GFP-LC3, or mRFP-GFP-LC3 plasmids or var-ious TRS1 constructs using FuGENE HD transfection reagent (Roche),according to the manufacturer’s instructions. After 4 h, the medium wasreplaced by MEM-10% FCS, and the cells were incubated for 24 to 48 h.Amino acid starvation by EBSS (starvation medium) was carried out 4 hbefore fixation. The cells were then fixed in PFA for 10 min at roomtemperature and washed three times with PBS. Data were statisticallycompared by using a global Student test (P � 0.01) as indicated in thefigure legends.

Proteolysis. This assay was adapted from that of Bauvy et al. (1).MRC5 cells were incubated for 24 h at 37°C with 0.2 �Ci/ml L-[14C]valine. At the end of the radiolabeling period, the cells were washed threetimes with PBS, pH 7.4. Cells were then incubated in complete mediumsupplemented with 10 mM cold valine. After incubating for 1 h, by whichtime short-lived proteins are degraded, the medium was replaced withfresh medium (MEM plus 10% bovine serum albumin and 10 mM coldvaline), and the incubation was continued for an additional 4 h. Wort-mannin (200 nM) was added to inhibit de novo formation of autophagicvacuoles. Cells and radiolabeled proteins from the 4-h chase medium wereprecipitated in trichloroacetic acid at a final concentration of 10% (vol/vol) at 4°C. The precipitated proteins were separated from the solubleradioactivity by centrifugation at 600 � g for 10 min and then dissolved in0.5 ml of 0.2 N NaOH. Radioactivity was determined by liquid scintil-lation counting. Protein degradation was calculated by dividing theacid-soluble radioactivity recovered from both cells and medium bythe radioactivity contained in precipitated proteins from both cellsand medium.

Statistics. Data are expressed as means � standard errors of the means(SEM) of at least three experiments. The statistical significance was as-sessed by a Student’s t test.

RESULTSHCMV infection triggers autophagy at early stages of infection.We previously demonstrated that HCMV inhibits autophagy infibroblasts 24 h postinfection (9). During the first 24 h of infec-tion, HCMV binds to the cell surface, penetrates into the cyto-plasm, and targets its genome to the nucleus, and viral immediateearly proteins are synthesized. In order to guide our research intothe mechanisms of HCMV-mediated inhibition of autophagy, wefirst investigated at what time this inhibition started. To measureautophagy, we transfected fibroblasts with GFP-LC3, a specificmarker of mammalian autophagy. Upon autophagy induction,the lipidated form of LC3 associates with autophagosomal mem-

HCMV Bidirectionally Modulates Autophagy

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branes, resulting in the formation of punctuate structures that canbe visualized by fluorescence microscopy. MRC5 cells were trans-fected with GFP-LC3 and then infected with HCMV (MOI � 1)for 4 to 24 h, and the number of puncta of GFP-LC3 per cell wasmeasured only in infected cells, which exhibit pp65 red staining, aviral tegument protein (Fig. 1). We used HCMV particles purifiedby density gradient centrifugation because we observed a stimu-lation of autophagy when cells were exposed only to supernatantof HCMV-infected cells, probably via soluble factors (Fig. 2A). Inpurified HCMV-infected cells, we observed an increase in thenumber of puncta per cell from 4 to 8 h p.i. but a clear decrease at24 h p.i. (Fig. 1A and B), confirming our previous results (9).Therefore, these results suggest that autophagy is induced early inresponse to infection but is then thwarted by the virus by 24 h afterinfection.

To assess whether the inhibition of autophagy observed inHCMV-infected cells requires expression of viral proteins, weused UV-inactivated HCMV, which is able to interact with cellularreceptors and to enter the cells but does not exhibit any viral geneexpression. The number of puncta per cell in UV-inactivated in-fected cells (detected by identification of virion-associated tegu-ment protein pp65 inside the cells) was constantly increased (toaround 40 per cell) regardless of the time of infection, comparedto that in mock-infected cells (Fig. 1C). Twenty-four hours afterinfection, a large number of MRC5 cells infected with UV-inactivated HCMV (visualized by pp65 staining) showed a punc-tuate staining of GFP-LC3 compared to the results in mock- andHCMV-infected cells (Fig. 1A).

However, an increased accumulation of autophagosomes incells can also correspond to an inhibition of their fusion withlysosomes and to an impaired autophagy (41). Therefore, it is notsufficient to monitor static levels of autophagy, and three addi-tional independent assays were performed to quantify the au-tophagic flux: the use of a tandem mRFP-GFP LC3 probe, thedegradation of p62, and the degradation of [14C]valine-labeledlong-lived proteins. We did not use the alternative method ofmeasuring LC3-II by Western blot analysis, because we noticed aconstant accumulation of LC3-II, independent of the autophagiclevel (see Fig. 2B).

First, we used the tandem mRFP-GFP-LC3 probe developed todifferentiate autophagosomes (GFP� RFP� or yellow puncta)from autolysosomes (GFP� RFP� or red puncta), as the GFP sig-nal is quenched in acidic compartments (31). The number ofGFP� RFP� puncta per cell, corresponding to autolysosomes, wasmeasured in MRC5 cells infected with HCMV or UV-inactivatedHCMV (Fig. 3A and B). We used amino acid-starved cells as apositive control, as this condition stimulates autophagy. Infectionof MRC5 cells by HCMV resulted in an increase in autolysosomesat 4 and 8 h p.i. and in a strong decrease at 24 h p.i. UV-inactivatedHCMV-infected cells displayed increased GFP� RFP� puncta percell, confirming a constant increase in the number of autolyso-somes from 4 to 24 h. We next examined cellular expression levelsof the autophagy substrate p62 in UV-inactivated HCMV- andHCMV-infected cells by immunoblotting (Fig. 3C) (2). Whereasp62 protein levels were decreased in HCMV-infected cells com-pared to control cells at 8 and 12 h p.i., p62 clearly accumulated at18 and 24 h p.i. Moreover, the presence of lysosomal inhibitors(E64 and pepstatin A) did not further increase p62, suggesting that

FIG 1 Autophagosome formation at early and late time points afterHCMV infection. MRC5 cells were transfected with GFP-LC3 for 48 h andthen mock-infected or infected with HCMV or with UV-inactivatedHCMV (UV-HCMV) for 4, 6, 8, and 24 h. Cells were fixed and immuno-stained for pp65 viral protein (red). (A) Representative images; bar, 10 �m.(B and C) Autophagy was quantified in pp65-positive cells by counting thenumber of GFP-LC3 puncta per cell. The results are the means of threeindependent experiments. Between 50 and 100 cells were analyzed perassay. *, P � 0.05; **, P � 0.01 (t test).

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the autophagy flux is blocked at later stages of infection. In con-trast, in UV-inactivated HCMV-treated cells, p62 protein levelswere clearly increased in the presence of lysosomal inhibitors at 4and 24 h p.i., confirming stimulation of the autophagic flux at anytime during the treatment (Fig. 3C). Finally, the effects of HCMVon autophagy were confirmed by analyzing the rate of degradationof long-lived proteins. As illustrated in Fig. 3D, UV-inactivatedHCMV and HCMV infection increased the rate of long-lived pro-teins degradation sensitive to wortmannin, an inhibitor of au-tophagic sequestration (4). However, the stimulation of proteindegradation sensitive to wortmannin was no longer observed incells infected with HCMV at 24 h p.i. Together these results indi-cate that HCMV stimulates autophagy at early times of infectionbut then inhibits it by 24 h p.i. The later inhibitory effect requiresde novo viral gene expression, since UV-inactivated virus is nolonger able to thwart autophagy, consistent with our previousresults (9).

Expression of Beclin 1 and Bcl-2 during HCMV infection.Several viral proteins have been described to interact with Beclin 1

and to modulate its autophagy activity (23, 33, 44). Moreover, ithas been reported in the context of HIV infection that the Env-mediated autophagy triggered in T cells correlates with Beclin 1protein accumulation (22). In a first series of experiments inMRC5 cells, neither Beclin 1 protein expression nor Beclin 1mRNA level was modified during HCMV infection (data notshown). We then analyzed the impact of HCMV infection on theexpression of Bcl-2 protein, a negative regulator of the Beclin 1complex (48). A significant increase in the amount of Bcl-2 pro-tein was detected in HCMV-infected cells from 1 to 3 days p.i.,regardless of the MOI (Fig. 4A). We next analyzed the mRNA levelof Bcl-2 in HCMV-infected cells (Fig. 4A). The amount of Bcl-2mRNA rapidly increased, as early as 6 h p.i. At 24 and 48 h p.i.,corresponding to the time when HCMV inhibited autophagy (9),the level of Bcl-2 mRNA was 3-fold higher than in mock-infectedcells. We did not observe any modification of Bcl-2 mRNA levelsin UV-inactivated HCMV-infected cells compared to mock-infected cells, suggesting that expression of viral proteins is neces-sary for this induction.

Upregulation of Bcl-2 is not involved in the HCMV-inducedinhibition of autophagy. It is well known that the overexpressionof Bcl-2 inhibits starvation-induced autophagy and that Bcl-2 is anegative regulator of autophagy which interacts with Beclin 1 toavoid stimulation of autophagy (48). We therefore hypothesizedthat HCMV increases cellular Bcl-2 to potentiate its interactionwith Beclin 1 and thereby inhibit autophagy. Fibroblasts weregrown 4 h in amino acid excess (rich medium [RM]) to inhibitautophagy (data not shown) and to maximize interaction betweenBeclin 1 and Bcl-2 (Fig. 4B). Consistent with previous results (48),we observed that Bcl-2 bound to Beclin 1 in normal conditionsand that Bcl-2 coimmunoprecipitated more with Beclin 1 duringautophagy-inhibiting conditions (RM) (Fig. 4B). However, coim-munoprecipitation of Beclin 1 and Bcl-2 in fibroblasts infectedwith HCMV showed that, whereas Bcl-2 was overexpressed com-pared to mock-infected cells, only a small part of the pool of Bcl-2interacted with Beclin 1 in these cells (Fig. 4B). These results sug-gest that the inhibition of autophagy by HCMV was not due to theoverexpressed Bcl-2 binding to Beclin 1.

Several mechanisms have been described that could explain thedisruption of Beclin 1-Bcl-2 interaction during HCMV infection:phosphorylation of either Bcl-2 or Beclin 1 (61, 63), competitivedisruption of Beclin 1/Bcl-2 by BH3-only proteins or BH3 mimet-ics (36), or, potentially, effects of membrane-anchored receptorsor their adaptors on Bcl-2/Beclin 1 interactions (57). Interestingly,we observed an increase of Bcl-2 phosphorylation in HCMV-infected cells by immunoblotting as early as 24 h p.i. (Fig. 4C).Moreover, there was no detectable signal of the phosphorylationof Bcl-2 in mock-infected cells but HCMV-infected cells, identi-fied by staining for viral IE antigens, showed strong staining forphosphorylated Bcl-2, visualized by a clear juxtanuclear signal af-ter 24 h of infection (Fig. 4D). Taken together, these results sug-gest that posttranslational modifications of Bcl-2 might explainwhy the interaction between Beclin 1 and Bcl-2 is reduced inHCMV-infected cells.

It has been previously reported that the c-Jun N-terminal ki-nase (JNK) disrupts the Bcl-2/Beclin 1 complex after nutrient de-privation and ceramide-induced autophagy, by phosphorylatingBcl-2 (46, 61). We observed that the JNK pathway was activatedduring HCMV infection based on accumulation of phosphory-lated JNK during the first 24 h p.i. and of its phosphorylated sub-

FIG 2 (A) Supernatant of HCMV-infected cells is able to stimulate autophagy.MRC5 cells were treated during 4 h with supernatant of HCMV-infected cellsclarified of viral particles and cellular debris by ultracentrifugation (see Mate-rials and Methods) or infected with UV-inactivated HCMV, followed by im-munoblotting with anti-LC3, anti-p62, or anti-actin antibodies. Lysosomalinhibitors E64 and pepstatin A (pepst) were added under all conditions, toblock the lysosomal degradation of LC3-II and p62. (B) Accumulation of LC3during HCMV infection is independent of the autophagic level. MRC5 cellswere infected with HCMV at an MOI of 1 during 6, 24, or 48 h and treated ornot with E64, followed by immunoblotting with anti-LC3 and anti-actin anti-bodies. Note that the level of LC3-II in infected cells does not change in thepresence of lysosomal inhibitor.

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strate, c-Jun, at later times (Fig. 5A and B). Treatment of infectedcells with SP600125, a selective JNK inhibitor, showed that Bcl-2phosphorylation in infected cells was JNK specific (Fig. 5C). Ec-topic expression of HCMV immediate-early protein 1 (IE1) waspreviously shown to selectively induce RelB NF-�B transcriptionand activity, via the JNK pathway (59–60). Similarly, we observed

in HCMV-infected cells a JNK-mediated upregulation of RelBNF-�B subunit and its nuclear relocalization (Fig. 5D and E),which might be responsible for the HCMV-mediated Bcl-2 up-regulation. Finally, our results suggest that HCMV-induced Bcl-2upregulation and phosphorylation of Bcl-2 are both mediated byJNK activation, either via RelB activity or directly. Taken together,

FIG 3 Inhibition of autophagic flux requires expression of viral genes. (A) Representative images of MRC5 cells transfected with mRFP-GFP-LC3 plasmid andinfected with HCMV or UV-inactivated HCMV. Red and yellow dots indicate GFP� RFP� and GFP� RFP� puncta, respectively. (B) Autolysosomes werequantified by counting GFP� RFP� puncta per cell. The results are the means of three independent experiments. Twenty cells were analyzed per assay. *, P � 0.05(t test). Amino acid-starved cells (EBSS) were used as a positive control (C) Immunoblot analysis of p62 levels in cells infected with HCMV or UV-inactivatedHCMV for the indicated times. Lysosomal inhibitors E64/pepstatin A were added to all conditions, to block the lysosomal degradation. Actin immunoblottingwas used as a loading control. (D) Effect of HCMV infection on long-lived protein degradation. [14C]valine-radiolabeled MRC5 cells were mock infected orinfected with HCMV or UV-inactivated HCMV for 8 or 24 h, and proteolysis was measured as described in Materials and Methods. Cells were treated with 200nM wortmannin (Plus WN) or not (No WN). The results are the means of three independent experiments. *, P � 0.05.

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these results could explain the mechanism by which the Beclin1/Bcl-2 complex is disrupted during HCMV infection. While thisdissociation should lead to an increased autophagy, HCMV infec-tion has the opposite effect. Therefore, we still needed to explorethe mechanisms for this HCMV-mediated inhibition of au-tophagy.

The viral protein TRS1 inhibits starvation-induced au-tophagy. As viral expression during HCMV infection is necessaryto inhibit autophagy, we sought to identify the viral protein(s)responsible for autophagy inhibition. It has been previouslyshown that several viral proteins prevent autophagy induction.The viral proteins ICP34.5 of HSV-1 and vBcl-2 of HHV-8 inhibit

FIG 4 Bcl-2 is not responsible for autophagy inhibition in HCMV-infected cells. (A) Bcl-2 protein and mRNA expression. Immunoblot analysis of Bcl-2 proteinin mock-infected cells and in cells infected with HCMV at MOIs of 1 and 3 from 24 to 72 h. Bcl-2 mRNA level was analyzed in control cells, in cells in starvationmedium (EBSS), and in cells infected with HCMV at an MOI of 1 from 6 to 72 h or with UV-inactivated HCMV for 24 h. The results are the means of threeindependent experiments. (B) Coimmunoprecipitation of Beclin 1 and Bcl-2 in MRC5 cells. MRC5 cells were mock infected, infected with HCMV (MOI � 1)for 2 days, or grown in rich medium (RM) for 4 h prior to coimmunoprecipitation. Rich medium is known to inhibit autophagy. Cell lysates were immuno-precipitated with preimmune goat serum or a goat polyclonal anti-Beclin 1 antibody followed by immunoblotting with the indicated antibodies. (C and D)Accumulation of hyperphosphorylated Bcl-2 during HCMV infection in MRC5 fibroblasts. (C) Immunoblot analysis of the phosphorylated Bcl-2 (Ser70).MRC5 cells were mock infected or infected with HCMV at an MOI of 1 from 12 to 72 h. Actin immunoblotting was used as a loading control. (D) MRC5 cellswere mock infected or infected with HCMV at an MOI of 1 from 18 to 72 h and at an MOI of 3 from 18 to 48 h. An increased staining of phosphorylated Bcl-2(juxtanuclear green staining) was observed in the HCMV-infected cells compared to mock-infected cells (nuclear red staining shows HCMV IE antigens).

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autophagy by interaction with Beclin 1, whereas the viral homo-logue vFLIP of HHV-8 is able to reduce it by interaction with Atg3(35, 44, 48). Despite the fact that HCMV belongs to the Herpes-viridae family, the HCMV genome does not contain any orthologof the HSV-1 �134.5 gene or viral Bcl-2 and FLIP homologs, likethose known to be present in gammaherpesviruses. However,ICP34.5 was previously described to preclude the host shutoff ofprotein synthesis via the PKR/eIF2� signaling pathway andHCMV possesses a functional homolog of ICP34.5, called TRS1

(11, 26). TRS1 binds double-stranded RNA and interferon-induced kinase PKR and inhibits the PKR/eIF2� signaling path-way (10, 26). To determine whether TRS1 interacts with Beclin 1and antagonizes its autophagy function, like ICP34.5, we per-formed coimmunoprecipitation studies. In MCR5 cells infectedwith HCMV at an MOI of 1 for 24 h, we found that endogenousBeclin 1 coimmunoprecipitated with TRS1 (Fig. 6A). To assess theimpact of TRS1 on the autophagic pathway, different assays tomonitor the autophagic flux were performed initially in HeLa cells

FIG 5 Activation of the JNK pathway during HCMV infection. (A) HCMV activates JNK phosphorylation. MRC5 cells were mock infected or infected withHCMV at MOIs of 1 and 3 from 6 to 72 h. Total cell lysates were prepared, and samples were subjected to immunoblot analysis of JNK and phosphorylated JNK(P-JNK). (B) Immunoblot analysis of the phosphorylated c-Jun during HCMV infection. MRC5 cells were mock infected or infected with HCMV at MOIs of 1and 3 from 24 to 96 h. (C) Cells were infected with HCMV during 48 h and treated with SP600125, a selective JNK inhibitor, during different time frames asindicated in the diagram (conditions 1 to 4). SP600125 blocks Bcl-2 overexpression when added during the first 24 h of infection (lane 2) and phosphorylationof Bcl-2 when added from 24 until 48 h p.i. (lane 3). SP600125 blocks phosphorylation of c-Jun when added during 24 or 48 h (lanes 3 and 4) (D) RelB mRNAanalysis by real-time PCR. MRC5 cells were mock infected or infected with HCMV at an MOI of 1 for 6 to 72 h, infected with UV-inactivated HCMV for 24 h,or grown in starvation medium (EBSS) for 4 h. The results are the means of three independent experiments. (E) Confocal analysis of the expression of RelB inHCMV-infected cells. MRC5 cells were infected with HCMV at an MOI of 1 for 48 h. Whereas RelB presents a marked nuclear staining in HCMV-infected cells,it has a diffuse (nuclear and cytoplasmic) staining in mock-infected cells. The cells were observed under a confocal laser scanning microscope (Zeiss LSM 510)and analyzed with Imaris software for three-dimensional reconstruction.

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since they are much more transfectable than MRC5 cells. HeLacells were transiently transfected with 6�His-tagged TRS1 expres-sion vector or an empty vector, and autophagy was induced bystarvation. A decrease of LC3-II was observed by immunoblotanalysis in TRS1-transfected cells (Fig. 6B). Comparable resultswere obtained in HEK cells (data not shown). To determinewhether autophagy inhibition caused by TRS1 led to inhibition ofthe autophagic flux, we used the tandem mRFP-GFP-LC3 probe(Fig. 6C). HeLa cells were transiently cotransfected with TRS1 orempty vector and mRFP-GFP-LC3 plasmids. After starvation for4 h, TRS1 expressing cells were detected using 6�His antibody byimmunofluorescence and GFP� RFP� (yellow) or GFP� RFP�

(red) puncta were quantified in those cells (Fig. 6C and D). HeLacells transfected with TRS1 displayed decreased total LC3 punctaper cell, confirming a decrease in the number of autophagosomes.Similar results were obtained with the GFP-LC3 probe (data notshown). Expression of TRS1 resulted in a decrease of GFP� RFP�

puncta, corresponding to autophagosome and a strong decreaseof GFP� RFP� puncta, representing autolysosomes. These resultsindicate that TRS1 inhibits starvation-induced autophagic flux inHeLa cells. To complement these results, we examined cellularexpression levels of p62 in TRS1-transfected cells that were cul-tured in starvation medium. In TRS1-transfected cells, p62 pro-tein levels were approximately increased by 40% compared tocontrol cells, confirming inhibition of the autophagic flux byTRS1 expression (Fig. 6E). Taken together, the decrease of LC3-II,the diminution of autolysosomes per cell detected with mRFP-GFP-LC3 probe, the diffuse staining of GFP-LC3, and the increaseof p62 in cells transfected with TRS1 demonstrate that this viralprotein can inhibit the formation of autophagosome.

TRS1 inhibits autophagy independently of its interactionwith PKR. With the finding that TRS1 blocks autophagy, we in-vestigated which domain of TRS1 is responsible for inhibition ofautophagy. To accomplish this, we assessed the ability of different6�His-tagged TRS1 constructs to inhibit starvation-induced au-tophagy in HeLa cells (Fig. 7). TRS1 contains a domain requiredfor PKR binding located at its carboxy-terminal region and adouble-stranded RNA-binding domain (dsRBD) at its amino ter-minus (Fig. 7A). The percentage of GFP-LC3-positive cells withGFP-LC3 dots was measured in starved cells. We observed thateven TRS1 (1-679), which lacks the region required for PKR bind-ing, inhibited starvation-induced autophagy (Fig. 7B and C). Thisresult suggests that PKR binding is not required for autophagyinhibition. This was confirmed by the observation that TRS1 wasable to block starvation-induced autophagy in murine fibroblastslacking PKR (Fig. 8). PKR�/� and PKR�/� MEFs were cotrans-fected with plasmids expressing GFP-LC3 and either HSV-1ICP34.5 or HCMV TRS1. The ability of the viral proteins to blockstarvation-induced autophagy was compared in wild-type versusPKR-deficient cells. We observed that both TRS1 and ICP34.5block autophagy, independently of the expression of PKR (Fig. 8).In contrast, an amino-terminal truncation mutant TRS1 (45-795)failed to inhibit starvation-induced autophagy (Fig. 7B and C).The number of GFP-LC3 positive cells was clearly increased aftertransfection with TRS1 (45-795) and autophagy induction. Thus,the inhibition of autophagy by TRS1 requires the amino terminusof TRS1. Next, we performed a series of coimmunoprecipitationexperiments with different His-tagged forms of TRS1 transfectedin HeLa cells. We observed that TRS1 (1-738) and (1-679) boundto Beclin 1 whereas TRS1 (45-795) and (93-795) did not bind

FIG 6 The viral protein TRS1 interacts with Beclin 1 and inhibits autophagicflux. (A) Coimmunoprecipitation of Beclin 1 and TRS1 in HCMV-infectedMRC5 cells. MRC5 cells were mock infected or infected with HCMV at anMOI of 1 for 48 h. Cell lysates were immunoprecipitated with preimmune goatserum or a goat polyclonal anti-Beclin 1 antibody followed by immunoblot-ting with an anti-TRS1 antibody. (B) Immunoblot analysis of LC3 in HeLacells transfected with TRS1 and cultured in starvation medium. Actin immu-noblotting was used as a loading control. (C) Representative images of HeLacells cotransfected with mRFP-GFP-LC3 and TRS1 plasmids for 24 h andcultured in starvation medium during the last 4 h of infection. Red and yellowdots indicate GFP� RFP� and GFP� RFP� puncta, respectively. Bar, 10 �m.(D) Quantitation of autophagy as measured by the number of LC3 puncta percell, total puncta per cell (GFP� RFP� and GFP� RFP� puncta), GFP� RFP�

puncta per cell, and GFP� RFP� puncta per cell. Only TRS1-expressing cellswere quantified as described in Materials and Methods. The results are themeans of three independent experiments. Twenty cells were analyzed per as-say. *, P � 0.05; **, P � 0.01 (t test). (E) Immunoblot analysis of p62 proteinin HeLa cells transfected with TRS1 plasmids and cultured in starvation me-dium. Actin immunoblotting was used as a loading control.

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efficiently to Beclin 1 (Fig. 7D). These results demonstrated thatthe deletion of the PKR-interacting domain of TRS1 did not im-pair the interaction of the viral protein with endogenous Beclin 1but that the N-terminal domain is required for the interactionwith Beclin 1. These findings, together with the observation thatTRS1 blocks starvation-induced autophagy in PKR�/� cells, sup-port the hypothesis that TRS1 inhibits autophagy as a result of itsinteraction with Beclin 1.

A TRS1 deletion mutant virus is defective in autophagy inhi-bition in fibroblasts. The observations that TRS1 interacts withBeclin 1 and inhibits starvation-induced autophagy to the sameextent as ICP34.5 support the role of TRS1 in the inhibition ofautophagy in HCMV-infected cells. To test whether the virallyexpressed TRS1 is necessary for the inhibition of autophagy inHCMV-infected cells, we analyzed autophagy in cells infectedwith an HCMV mutant lacking the TRS1 gene (�TRS1) (Fig. 9A).We observed that �TRS1 infected cells exhibit levels of autophagyindistinguishable from those of mock-infected fibroblasts (Fig.9B). In contrast, the number of autophagosomes was significantlydecreased in HCMV-infected cells. Moreover, the number ofGFP-LC3 dots increased after nutrient deprivation (EBSS) and the�TRS1 mutant virus was not able to block starvation-inducedautophagy. We found that Bcl-2 is overexpressed and hyperphos-phorylated in �TRS1 mutant virus-infected cells similarly to re-sults in HCMV-infected cells (Fig. 9C and D). These results con-firmed that increased expression of Bcl-2 plays no role ininhibition of autophagy by HCMV.

DISCUSSION

In this report, we report that HCMV stimulates autophagy in hu-man fibroblasts during the early stages of infection independentlyof viral protein synthesis and is able to inhibit autophagosomeformation and maturation by 24 h postinfection, as a result ofexpression of one or more viral proteins. We identify the viralprotein TRS1 of HCMV as a negative modulator of autophagy,independently of its previously described function on the kinasePKR but likely via its interaction with the autophagy protein Be-clin 1 (26).

The observation that autophagy is stimulated at early timepoints after infection independently of the viral replication is in agood agreement with a recent study by McFarlane et al. (40). Thesignificance of the early induction of autophagy by HCMV re-mains to be determined. It could represent a cell stress response toinfection and may aid in an adaptive immune response by pro-moting viral antigen presentation by major histocompatibilitycomplex (MHC) class II molecules. It might also contribute to anearly innate immune response by degradation of viruses into au-tophagolysosomes, referred to as xenophagy (45, 56). In fact,other viruses, such as HIV or measles virus, also trigger autophagyby interacting with cell surface receptors and/or soon after theirentry in the cell cytoplasm (22, 28). For example, the binding ofmeasles virus (Edmonston strain) to CD46 at the surface of hu-man cells induces de novo formation of autophagosome (28). Themechanism by which HCMV triggers autophagy remains to bebetter defined. McFarlane et al. proposed that autophagy is stim-

FIG 7 The N-terminal region of TRS1 is required for inhibition of autophagyand Beclin 1 binding. (A) Schematic representation of TRS1 showing positionof the region required for PKR binding (amino acids 679 to 738) and thedsRNA-binding domain (amino acids 74 to 248). Different TRS1 constructswere used: C-terminal deleted fragment [TRS1 (1-738)], PKR-binding deletedfragment [TRS1 (1-679)], and N-terminal deleted fragments [TRS1 (45-795)and (93-795)]. (B) Representative images of GFP-LC3 staining in HeLa cellscotransfected for 48 h with GFP-LC3 and indicated TRS1 constructs. Fourhours before fixation, cells were grown in starvation medium to induce au-tophagy. TRS1-transfected cells were visualized by an anti-His antibody, andGFP-LC3-positive cells with GFP-LC3 dots were quantified (C). The resultsare the means of three independent experiments. Between 50 and 100 cells

were analyzed per assay. *, P � 0.05 (t test). (D) Coimmunoprecipitation ofendogenous Beclin 1 and indicated His-tagged mutant TRS1 in HeLa cellstransfected with the indicated plasmids.

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ulated as a response to the HCMV DNA genome (40). However, itmay be that contact of the viral particle with the cell surface orinteraction between a viral structural component and a cellularsensor triggers autophagy. In line with this possibility, we ob-served that the binding of HCMV to cell surface heparan sulfateproteoglycan is required to stimulate autophagy (data not shown).HCMV interacts with Toll-like receptor 2 (TLR2) via two viralenvelope glycoproteins and initiates inflammatory cytokine secre-tion independently of viral entry (29). Since TLR activation bydifferent ligands induces autophagy, it will be interesting to testwhether activation of TLR2 by HCMV triggers autophagy (15).

Whatever the mechanism responsible for the induction of au-tophagy by HCMV, we observed that the virus is able to inhibitautophagy at later time points (reference 9 and the present study).The inhibition of autophagy has been shown by the use of differ-ent readouts for autophagy: accumulation of GFP-LC3 and GFP-RFP-LC3 puncta, degradation of the autophagy cargo p62, andrate of long-lived protein degradation in the presence and absenceof wortmannin. On the basis of these criteria, we conclude thatHCMV blocks autophagy at the stage of autophagosome forma-tion. This inhibition is dependent on the synthesis of viral proteinsbecause we observed that autophagy is stimulated in cells infectedwith UV-inactivated HCMV, as recently reported by McFarlane etal. (40). Contrary to our results, these authors suggest that HCMVis still able to stimulate autophagy after 24 h of infection. Thisconclusion relies on the analysis of the accumulation of LC3-II byWestern blotting, a usually reliable method to detect the form ofthe protein associated with autophagosomes. However, we previ-ously noticed that LC3-I and -II accumulated in HCMV-infectedcells independently of the accumulation of autophagosomes (9)(Fig. 2). Reggiori and colleagues reported that LC3-I is hijacked bycoronaviruses to provide the membranous support for viral rep-lication complex, in an autophagy-independent way (49). More-over, the final envelopment of HCMV in the viral assembly com-plex requires a remodeling of membranes from differentorganelles, such as the trans-Golgi network (TGN) and endo-somes (8, 14), that are also reservoirs for autophagy proteins suchas Atg9 (37, 62). Therefore, it would be interesting to investigatewhether LC3 and/or some Atg proteins could have a role duringHCMV infection, independently of their function in autophagy.

To understand the mechanisms by which HCMV inhibits au-tophagy, we decided to focus on the HCMV protein TRS1, whichappears to be a functional homolog of the HSV-1 ICP34.5, regard-ing the PKR/eiF2� pathway. Activation of this signaling pathwaytriggers autophagy in the context of infection with a �34.5-HSV-1recombinant virus, and the viral protein ICP34.5 is capable ofinhibiting autophagy (55). In this report, we identified for the firsttime TRS1 as a HCMV protein able to block autophagy and tointeract with Beclin 1. Consistent with the timing of HCMV-mediated autophagy inhibition, we observed that TRS1 accumu-lates predominantly in the cytoplasm of infected cells as early as 24h p.i. (data not shown). Two functional domains of TRS1 havebeen identified: the carboxy-terminal part, which is required forinteraction with PKR, and an unconventional dsRNA-bindingdomain located in a 175-amino-acid stretch close to the N termi-nus (between amino acids 74 and 248) (25). We thus exploredwhich domain of TRS1 is involved in the inhibition of the au-tophagy process. As the domain of TRS1 required for PKR bindingis necessary for the prevention of PKR activation and thereby pre-venting phosphorylation of eIF2�, we were surprised to discover

FIG 8 TRS1 inhibits autophagy independently of PKR. Murine PKR�/� andPKR�/� cells were cotransfected for 48 h with GFP-LC3 and His-TRS1 orFLAG-ICP34.5 constructs. Four hours before fixation, cells were grown instarvation medium to induce autophagy. TRS1-transfected cells were visual-ized by an anti-His antibody, and ICP34.5-transfected cells were visualized byan anti-FLAG antibody. (A) Representative images of GFP-LC3 in PKR�/�

and PKR�/� cells. Inserts show the viral protein staining. (B) GFP-LC3 posi-tive cells with GFP-LC3 dots were quantified. The results are the means of threeindependent experiments. Twenty cells were analyzed per assay. *, P � 0.05;**, P � 0.01 (t test).

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that this domain is not necessary for inhibiting autophagy in ourmodel. However, a truncated form of TRS1 in the N-terminal partis no longer able to block autophagy. This observation, togetherwith the fact that the N-terminal part of TRS1 is required forstrong binding to Beclin 1, suggests that TRS1 blocks autophagyby interaction with Beclin 1. It is interesting that both ICP34.5 andTRS1 inhibit autophagy not via their ability to interfere with theactivation of PKR but via their interaction with Beclin 1 (44).Since numerous viral proteins block the PKR-eIF2� signalingpathway to preclude the shutoff of protein synthesis, one impor-tant question that arises is whether autophagy can be inhibited bythe unique blockade of PKR-dependent signaling by a viral pro-tein.

We observed that the form of virally expressed TRS1 is suffi-cient for the inhibition of autophagy in HCMV-infected cells (Fig.9). It is interesting to note that even though �TRS1 mutant virusdid not inhibit autophagy, we did not observe a stimulation ofautophagy such as the one induced by UV-HCMV. HCMV ex-presses a second gene product, IRS1, that is highly homologous toTRS1 (10). Thus, it will be important to explore whether IRS1 canalso antagonize autophagy. It is likely that IRS1, which has anamino terminus identical to that of TRS1, duplicates this TRS1function. Indeed, the N-terminal 549-amino-acid regions of thetwo proteins are identical and although their C-terminal regionsdiverge, they nevertheless remain 55% identical in the divergentregion (3). Construction of �TRS1/�IRS1 recombinant mutantvirus revealed that IRS1 can compensate for TRS1 regarding PKRinactivation (38). Unfortunately, the mutant virus lacking bothgenes is totally unable to replicate in human fibroblasts (38). Analternative approach could be to use a chimeric �34.5-HSV-1 re-combinant virus which expresses the HCMV gene TRS1. Indeed,Cassady showed that TRS1 can complement �34.5-HSV-1 re-combinant virus regarding wild-type viral protein synthesis in in-fected cells (6). Whereas infection with a �34.5-HSV-1 recombi-nant virus stimulates autophagy, it is not known whether TRS1can also restore the inhibitory effect of ICP34.5 on autophagy ininfected cells. Monitoring the autophagy level after infection withthe HCMV/HSV-1 chimeric virus would address this possibility.

It is possible that HCMV possesses more than one mechanismfor inhibiting the autophagic pathway. Cellular Bcl-2 (cBcl-2) isan anti-autophagy protein which acts via its inhibitory interactionwith Beclin 1 (48). Despite the fact that other herpesviruses, suchas HHV8 and MHV-68, express a viral homolog of Bcl-2 able toinhibit autophagy, HCMV does not possess one. AlthoughHCMV stimulates the expression of cBcl-2, it does not use thisstrategy to block autophagy. Indeed, Bcl-2 is overexpressed in�TRS1 mutant virus-infected cells whereas autophagy is not in-hibited. We also observed an accumulation of the phosphorylatedform of Bcl-2 that does not interact with Beclin 1. This phosphor-ylation, as well as the induction of the expression of Bcl-2, is de-pendent on the activity of JNK. Previous studies have shown thatthe JNK-dependent phosphorylation of Bcl-2 triggers the dissoci-ation of its complex with Beclin 1 (47, 61). It is interesting to notethat the gammaherpesvirus Bcl-2 homologue constitutivelyblocks autophagy via its interaction with Beclin 1, because vBcl-2does not have the N-terminal loop that contains amino acid sub-strates for JNK and thus cannot be phosphorylated (61). Anotherpossibility concerns the autophagy regulatory complex mTORC1(mammalian target of rapamycin complex 1), which is stimulatedby HCMV during infection (32). Activation of mTORC1 not only

FIG 9 TRS1 is required for inhibition of autophagy in fibroblasts. (A) Expres-sion of TRS1 and IEA in MRC5 cells infected with HCMV wild-type and�TRS1 mutant virus. (B) MRC5 cells were infected with HCMV wild-type or�TRS1 mutant virus at an MOI of 1 during 48 or 72 h and transfected for 48 hwith GFP-LC3. When indicated, cells were grown in starvation medium(EBSS) 4 h before fixation to induce autophagy. Autophagy was quantified inIEA-positive cells by counting the number of GFP-LC3 puncta per cell. Theresults are the mean of three independent experiments. Twenty cells wereanalyzed per assay. *, P � 0.05; ns, not significant (t test). (C) Immunoblotanalysis of Bcl-2 protein in cells infected with wild-type HCMV or �TRS1mutant virus at an MOI of 1, from 24 to 72 h. (D) Accumulation of hyper-phosphorylated Bcl-2 during �TRS1 mutant virus infection in MRC5 fibro-blasts at 24, 48, and 72 h p.i. Nuclear red staining corresponds to viral IEantigens.

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turns on the protein synthesis involved in cell growth but alsosuppresses autophagy (reviewed in reference 20). HCMV influ-ences multiple cellular pathways that communicate withmTORC1, such as inhibition of the tuberous sclerosis complexTSC1/2 by the HCMV UL38 protein (43). Moreover, the activa-tion and the perinuclear localization of mTORC1 are maintainedin HCMV-infected cells, even during nutrient starvation, whichnormally inhibits mTOR and activates autophagy (12).

In conclusion, HCMV uses a strategy related to the one used byHSV-1 to block autophagy by interacting with Beclin 1. Herpes-viruses have developed redundant strategies to block autophagyby interfering with the function of Beclin 1 or other Atg proteinsinvolved in the biogenesis of autophagosomes. Our results dem-onstrate that two viruses of the herpes family use a similar strategyto block autophagy independently of their ability to produce aviral form of Bcl-2.

ACKNOWLEDGMENTS

We thank T. Yoshimori for providing us with the GFP-LC3 and mRFP-GFP-LC3 constructs. We are very grateful to Chantal Bauvy for immuno-precipitation and proteolysis experiments. We thank Claudine Delomé-nie (IFR141 innovation thérapeutique, Châtenay-Malabry) for providingassistance with quantitative reverse transcription-PCR studies and Caro-line Tran Van (UPS, Châtenay-Malabry).

This work was supported by institutional funding from The InstitutNational de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) and fromParis Sud University, by grants from the Agence Nationale de la Recherche(ANR MIME 2007) to A.E., from the National Institutes of Health(AI26672) to A.P.G., and the Deutsche Forschungsgemeinschaft(BR1730/3-1) to W.B.

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HCMV Bidirectionally Modulates Autophagy

March 2012 Volume 86 Number 5 jvi.asm.org 2583

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2584 jvi.asm.org Journal of Virology

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698 m/s n° 8-9, vol. 28, août-septembre 2012DOI : 10.1051/medsci/2012288008

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confirment que tous les types de fonc-tions cellulaires sont affectés par des transferts. Cependant, les gènes dont les fonctions sont liées à des processus centraux de la vie de la cellule, notam-ment la transmission et la traduction de l’information génétique montrent des taux nettement plus faibles que les gènes aux fonctions plus périphériques, tels que des facteurs de virulence par exemple. Enfin, au-delà de son intérêt pour reconstruire les liens de parentés entre espèces, notre étude démontre égale-ment le potentiel du caractère « trans-fert horizontal » pour résoudre la dif-ficile question du positionnement de la racine, c’est-à-dire de la position de l’ancêtre le plus ancien dans l’arbre. En effet, la plupart des changements moléculaires classiquement modélisés en phylogénie ne sont pas orientés dans le temps, c’est-à-dire qu’ils permettent de révéler la forme d’un arbre (quelles

L’autophagie est un mécanisme complexe de défense antivirale L’autophagie - du grec (soi-même) et (manger) - est avant tout un mécanisme constitutif de dégradation des protéines de longue durée de vie et des organites, comme les mitochondries endom-magées. Elle se déroule en plusieurs étapes : une membrane préautophagosomale ou phagophore se forme notamment à par-tir des membranes du réticulum endoplas-mique et séquestre une partie du cytoplasme (Figure 1). Cette structure membranaire se courbe en faisant intervenir des protéines

Atg (autophagy related genes) spécifiques de l’autophagie, puis se ferme pour donner l’autophagosome, une vésicule à double membrane caractéristique de la voie auto-phagique. L’autophagosome fusionne ensuite avec un lysosome pour donner l’autolyso-some dans lequel le contenu est dégradé par les enzymes lysosomales. Une protéine de la machinerie autophagique, bécline 1, qui est une protéine hautement régulée, intervient dans les étapes de formation et de matura-tion des autophagosomes (Figure 1).Depuis quelques années, il a été montré que l’autophagie peut également partici-

per à la protection de la cellule vis-à-vis des infections, notamment des infections virales. Ce mécanisme antiviral semble revêtir plusieurs aspects. Il pourrait s’agir de capturer des virus ou des protéines virales dans les autophagosomes pour cibler leur dégradation par la voie auto-phagique. On parle alors de xénophagie. Par exemple, au cours de l’infection par le virus Sindbis, le stress engendré par l’accumulation des protéines virales dans les neurones est contrecarré par la dégra-dation autophagique de ces agrégats [1, 13]. L’autophagie participe aussi à l’im-

Le cytomégalovirus dit stop à l’autophagieUn mécanisme de défense antiviraleMarion Lussignol, Magali Chaumorcel, Lina Mouna, Audrey Esclatine

NOUVELLE

Inserm UMR 984, Université Paris Sud, Faculté de Pharmacie, 5, rue Jean-Baptiste Clément, 92296 Châtenay-Malabry Cedex, France.audrey.esclatine@u-psud.frmarion.lussignol@u-psud.fr

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homologue chez HHV-8, nommée vBcl-2, se lie et bloque l’activité de bécline 1 de manière non réversible [4].

La machinerie autophagique s’emballe en réponse à l’infectionLe cytomégalovirus (CMV), un virus de la famille des Herpès, cause des infections asymptomatiques chez les sujets sains. En revanche, il est responsable d’infections

Ainsi, dans la famille des Herpès-virus, plusieurs protéines virales sont capables de bloquer l’autophagie, comme la viral Fas-associated death domain-like interleukin-1-converting enzyme-inhi-bitory protein (vFLIP) de l’Herpèsvirus humain 8 (HHV-8), qui bloque l’action d’Atg3 [3]. Contrairement à la protéine anti-autophagique cellulaire Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) dont l’action est régulée, son

munité innée, notamment en facilitant l’interaction des génomes viraux avec les récepteurs membranaires de type Toll (Toll-like receptors ou TLR) présents dans les endosomes. Son rôle dans l’immu-nité adaptative serait de contribuer à la présentation des antigènes viraux aux cellules effectrices de l’immunité [2, 14]. Face à ces mécanismes de défense cel-lulaire, les virus ne se laissent pas faire.

Figure 1. Modulation de l’autophagie par le CMV au cours du cycle viral. L’autophagie débute par la formation du phagophore, initiée par le complexe bécline 1/Vps34 (vacuolar protein sorting 34)/ATG14. Puis le phagophore s’allonge, se recourbe et se referme pour former l’autophagosome. Cette étape d’élongation fait intervenir les deux systèmes de conjugaison Atg5-Atg12 et LC3 (light chain 3)-phosphatidylethanolamine. L’autophagosome fusionne ensuite avec le lysosome pour former l’autolysosome, faisant intervenir cette fois le complexe bécline 1/Vps34/UVRAG (UV radiation resistance associated gene) au cours de la maturation. Le contenu de l’autolysosome est dégradé par les enzymes lysosomales. Les premières étapes de l’infection des cellules par le CMV stimulent l’autophagie. Après une liaison initiale aux héparanes sulfates, le virus se fixe sur des récepteurs membranaires spécifiques, puis entre par fusion de son enveloppe avec la membrane plasmique et libère sa nucléocapside. Lors de son contact avec la surface cellulaire, le virus se fixe également sur le récepteur de type Toll TLR2, et ainsi active une cascade de signalisations. Dans la cellule, la nucléocapside migre et libère son génome dans le noyau. La fixation du virus sur les héparanes sulfates est nécessaire à la stimulation précoce de l’autophagie. Le génome viral semble être également impliqué dans cette stimulation, mais la fixation du virus sur TLR2 pourrait également jouer un rôle. Débute ensuite la synthèse séquentielle des protéines virales très pré-coces, précoces, puis la réplication de l’ADN, et enfin la synthèse des protéines tardives. On note alors une inhibition de la formation des autophagosomes. La protéine TRS1, une protéine précoce, est capable d’inhiber l’autophagie en se liant à bécline 1.

AutophagieRécepteurs Fusion

Héparanessulfates

Génome viral

Virion Capside virale Vps34 ATG14 LC3 UVRAG

Complexes ATG12-5-16bécline 1ARNm

Phagophore

Autophagosome

Autolysosome

Lysosome

Protéines très précoces

Protéinesprécoces

Protéinestardives

TLR2

Cycle viralEntrée

Initiation

Élongation

Maturation

Maturation

Répl

icat

ion

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ADN

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Libération

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que l’autophagie soit capable de limiter la multiplication d’HSV-1 d’une manière significative, du moins in vitro, mais elle permet peut être de le faire in vivo et de contrer sa neurovirulence. Il est intéres-sant de noter que deux virus voisins uti-lisent une stratégie similaire de blocage de l’activité de bécline 1 via deux pro-téines structurellement très différentes. ◊When human cytomegalovirus says STOP to autophagy: an antiviral defense mechanism

LIENS D’INTÉRÊTLes auteurs déclarent n’avoir aucun lien d’intérêt concernant les données publiées dans cet article.

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Le CMV est armé pour se défendre contre l’autophagieGrâce à ses protéines virales, le CMV va mettre en place dans un second temps un système de blocage actif et performant de l’autophagie. Ce blocage se produit au moment de la formation des autophago-somes (Figure 1). C’est la particularité du cycle de multiplication du CMV, particu-lièrement lent dans le règne des virus, qui a facilité la mise en évidence de ces deux phases de modulation de l’autophagie au cours de l’infection [5, 10]. La protéine précoce TRS1 (terminal repeat short 1) du CMV a été identifiée par notre laboratoire comme un inhibiteur fort de l’autophagie [5]. D’ailleurs, un virus mutant TRS1, qui n’exprime pas TRS1, n’est plus capable d’inhiber l’autophagie. Comme d’autres protéines virales inhibitrices de l’autopha-gie, TRS1 va bloquer l’initiation de l’auto-phagie en se liant à bécline 1 (Figure 1). Ce mécanisme d’action n’allait pas de soi car TRS1 bloque aussi la protéine kinase R (PKR), un senseur de l’infection virale qui fait partie d’une voie de stimulation de l’autophagie [11, 12]. Malgré cette liaison directe à PKR, TRS1 agit indépendam-ment de PKR pour bloquer l’autophagie via bécline 1. Il semble que le virus soit également capable de moduler la kinase mTOR (mammalian target of rapamycin), également impliquée dans la régulation de l’autophagie [10].Même si à l’heure actuelle, le rôle de l’autophagie vis-à-vis du CMV n’a pas été clairement explicité, le fait que le virus ait développé au moins une protéine virale pour bloquer spécifiquement cette voie confirme bien qu’il s’agit d’un méca-nisme antiviral important dont il sera primordial de comprendre le fonctionne-ment dans le futur. Un proche cousin du CMV, HSV-1, est également capable de bloquer l’autophagie, notamment grâce à la protéine virale ICP34.5 (infected cell protein 34.5) [9, 11]. Bien qu’il n’existe pas d’homologie entre les protéines TRS1 et ICP34.5, leur mécanisme d’action semble similaire puisque ICP34.5 se lie à bécline 1 pour bloquer les étapes ini-tiales de l’autophagie. Il ne semble pas

congénitales et de graves manifestations cliniques chez les personnes immunodépri-mées, comme après une greffe d’organe. Nos travaux, ainsi que ceux de l’équipe de Chris Preston, ont récemment montré que l’infection des cellules par le CMV entraîne très rapidement une induction de l’autophagie [5, 6]. En effet, la cellule répond au stress de l’infection en accu-mulant aussi bien des autophagosomes que des autolysosomes dans le cyto-plasme (figure 1). Un virus inactivé, qui ne fabrique pas de nouvelles protéines virales mais est capable d’entrer dans la cellule, stimule l’autophagie. Cette activation de l’autophagie est donc due à la détection du virus ou de ses com-posants par la cellule. Chris Preston et ses collaborateurs proposent le génome viral comme signal d’activation, même si la majorité de l’ADN viral libre est plutôt nucléaire [6]. Nous explorons actuelle-ment l’hypothèse selon laquelle la fixa-tion du virus sur TLR2 serait responsable de l’activation précoce de l’autophagie. En effet, le CMV interagit avec TLR2 à la surface de la cellule, entraînant une cascade de signalisations [7]. De plus, l’activation des TLR déclenche en général une induction de l’autophagie [8].Le déclenchement de l’autophagie en réponse à l’infection par le CMV ne semble pas un fait isolé, mais plutôt un méca-nisme général puisqu’il a été rapporté pour d’autres virus [2]. L’interaction du virus de la rougeole avec son récepteur CD46, ou encore la fixation des protéines d’enveloppe du VIH (virus de l’immuno-déficience humaine) sur ses récepteurs et corécepteurs à la surface des cellules stimule immédiatement l’autophagie. On peut imaginer qu’il s’agit d’une réponse rapide de la cellule pour mettre en place son système de défense. Dans le cas du CMV, la finalité de cette réponse auto-phagique n’est pas encore bien comprise. Dans le contexte de l’encéphalite her-pétique à HSV-1 (Herpes simplex virus de type 1), l’activation de l’autophagie semble diminuer la virulence d’HSV-1 dans les neurones et ainsi les protéger de la multiplication virale [9, 13].

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Université Paris-Saclay

Espace Technologique / Immeuble Discovery

Route de l’Orme aux Merisiers RD 128 / 91190 Saint-Aubin, France

Titre : Analyse du mécanisme et du rôle de l'inhibition de l'autophagie par deux protéines

complémentaires du cytomégalovirus humain

Mots clés : Autophagie, HCMV, IRS1, TRS1, Beclin 1, PKR

Résumé : L’autophagie est un mécanisme constitutif et

inductible de dégradation des composants cytoplasmiques

afin de maintenir l’homéostasie cellulaire. Elle est souvent

modulée par les virus car il s’agit également d’un

mécanisme de défense antiviral. Elle peut avoir un rôle

proviral quand elle est détournée et régulée par les virus.

Nous avons précédemment observé au laboratoire que le

cytomégalovirus humain (HCMV) stimule la formation

des autophagosomes de manière précoce indépendamment

de l’expression des protéines virales, puis qu’il entraine un

blocage de l’autophagie aux temps tardifs. Dans ce travail,

nous avons montré que ce virus a développé des stratégies

impliquant la synthèse de deux protéines virales, IRS1 et

TRS1, pour inhiber l’autophagie. De façon surprenante,

nous avons également mis en évidence un rôle proviral de

l’autophagie aux temps tardifs de l’infection par le HCMV.

Nous avons pu montrer par des techniques de biochimie et

d’imagerie cellulaire que l’expression aussi bien de TRS1

que d’IRS1 est capable de bloquer la formation des

autophagosomes dans les cellules. Nous avons identifié le

mécanisme d’action de ces protéines. Il est indépendant de

la protéine kinase PKR mais nécessite une interaction avec

Beclin 1, une protéine de la machinerie autophagique.

Nous avons localisé le site d'interaction de Beclin 1 avec

IRS1 et TRS1 (BBD pour Beclin 1 binding domain) au

niveau de leur région N-terminale. Ce domaine, conservé

entre les deux protéines, est nécessaire pour l’inhibition de

l’autophagie. Le site d’interaction d’IRS1 a été identifié

dans le domaine en superhélice (coiled-coil domain) CCD

de Beclin 1. Nous avons caractérisé le rôle de TRS1 et

IRS1 dans la modulation de l’autophagie dans le contexte

de l’infection virale, en utilisant différents virus mutants :

des virus dans lesquels on a supprimé soit le gène IRS1,

soit le gène TRS1 et un virus dans lequel il manque les

deux gènes IRS1 et TRS1. Les résultats obtenus suggèrent

qu’IRS1 et TRS1 sont effectivement toutes les deux

impliquées dans ce processus. Afin de mieux comprendre

le rôle de l’interaction de ces protéines avec Beclin 1, nous

avons étudié le phénotype d’un virus mutant qui n’exprime

pas IRS1 et qui contient une délétion de la région BBD de

TRS1. Nous avons montré que ce virus mutant ne se lie

pas à Beclin 1 et qu’il ne bloque pas l’autophagie. De

manière surprenante, il n’a pas de défaut de production

virale, suggérant que l’inhibition de l'autophagie ne serait

pas essentielle pour la réplication virale. Nous avons

développé d’autres approches, comme l’utilisation de

modulateurs pharmacologiques de l’autophagie ou de

lentivirus hébergeant des shRNA, qui montrent que

l’inhibition de l’autophagie est capable de diminuer la

production virale et au contraire que sa stimulation

l’augmente. Ces derniers résultats suggèrent que

l’autophagie pourrait être bénéfique au HCMV dans

certaines conditions.

Title : Analysis of the mechanism and the role of autophagy inhibition by two complementary human

cytomegalovirus proteins

Keywords : Autophagy, HCMV, IRS1, TRS1, Beclin 1, PKR

Abstract: Autophagy is a constitutive and inducible

mechanism of degradation of cytoplasmic components, in

order to maintain the cellular homeostasis. Autophagy is

often modulated by viruses, because it is also considered

as an antiviral defense mechanism. It can have a

beneficial role, when it is hijacked and regulated by

viruses. We have previously observed in our laboratory

that the human cytomegalovirus (HCMV) stimulates

autophagosome formation, at the early stage of infection,

independently of viral protein expression then, later on, it

blocks autophagy. In this work, we showed that this virus

has developed strategies involving the synthesis of several

viral proteins, such as IRS1 and TRS1, to inhibit

autophagy. Surprisingly, we also demonstrated a proviral

role of autophagy at late stages of infection with HCMV.

We showed, through biochemical and cellular imaging

technologies, that expression of both TRS1 and IRS1 is

able to block the formation of autophagosomes. We

identified the mechanism of action of these proteins. It is

independent of the protein kinase PKR but requires

interaction with Beclin 1, a protein of the autophagic

machinery. We mapped the interaction site of Beclin 1

with IRS1 and TRS1 in their N-terminal region and called

it BBD for Beclin 1-binding domain. This domain (BBD)is

conserved between the two proteins and essential to inhibit

autophagy. We also identified the site of interaction of IRS1 in

the coiled-coil domain (CCD) of Beclin 1. We characterized

the role of IRS1 and TRS1 in the modulation of autophagy, in

the context of viral infection, using different mutant viruses:

viruses in which either the IRS1 or the TRS1 gene has been

removed and a mutant virus lacking both IRS1 and TRS1

genes. Our results suggest that both IRS1 and TRS1 are

involved in the regulation of this process. To better understand

the role of the interaction of these proteins with Beclin 1, we

studied the phenotype of a mutant virus that does not express

IRS1 and which contains a deletion of the N-terminal region of

TRS1. We showed that this mutant does not bind to Beclin 1

and is not able to block autophagy. Surprisingly, it has no

defects in viral production, suggesting that inhibition of

autophagy is not essential for viral replication. We developed

other approaches, including the use of pharmacological

modulators of autophagy or shRNA knockdown, which show

that the inhibition of autophagy is able to reduce viral

production and, on the contrary, that its stimulation increases it.

These results suggest that autophagy may be beneficial to

HCMV in certain conditions.