ASPERGILLUS-ANTIGENE Aspergillus antigens 52942Aspergillus fumigatus antigens 52962Aspergillus fumigatus positive control serum 61681Aspergillus positive control sera 61682

SERODIAGNOSE DER ASPERGILLOSE MITTELSIMMUNPRÄZIPITATIONSREAKTION

IVD

1- KLINISCHE BEDEUTUNGBio-Rad produziert verschiedene Aspergillus-Antigene für die Serodiagnoseder Aspergillose mittels Immunpräzipitations-reaktion. Die Diagnose einer Aspergillose durch Nachweis von spezifischenAntikörpern im Patientenserum ist häufig einfacher als die Diagnose durchdirekte Identifikation des Pilzes.

2- PRINZIPDie Antigene von Bio-Rad können in verschiedenen Immunpräzipitations-reaktionen verwendet werden.Folgende zwei Techniken werden insbesondere empfohlen:• IMMUNELEKTROPHORESE (IEP)• ELEKTROSYNHÄRESE (ES)Immunpräzipitationstechniken erhöhen die diagnostische Präzision fürAspergillose durch Identifizierung spezifischer Antikörper für die beidenEnzyme, Chymotrypsin und Katalase, die in Antigenextrakten vorhandensind. Ihre Enzymaktivität wird durch Präzipitationsbögen sichtbar gemacht.

3- DARREICHUNGSFORM• Aspergillus fumigatus antigens (Aspergillus fumigatus-Antigene), Kat.-

Nr. 529622 Fläschchen mit lyophilisierten Antigenen, die in 1 ml sterilem,destilliertem Wasser rekonstituiert werden (für ca. 10 Reaktionen).- Aspergillus fumigatus metabolic antigen- Aspergillus fumigatus somatic antigen

• Aspergillus antigens (Aspergillus-Antigene), Kat.-Nr. 529424 Fläschchen mit lyophilisierten Antigenen, die in 1 ml sterilem,destilliertem Wasser rekonstituiert werden (für ca. 10 Reaktionen).- Aspergillus flavus metabolic antigen- Aspergillus nidulans metabolic antigen - Aspergillus niger metabolic antigen- Aspergillus terreus metabolic antigen

• Aspergillus fumigatus positive control serum (Positives Aspergillus fumigatus-Kontrollserum), Kat.-Nr. 616811 Fläschchen mit lyophilisiertem anti-Aspergillus fumigatus-Kaninchenserum,das in 1 ml sterilem, destilliertem Wasser rekonstituiert wird.

32

• Aspergillus positive control sera (Positives Aspergillus-Kontrollserum), Kat.-Nr. 616824 Fläschchen mit lyophilisiertem anti-Aspergillus-Kaninchenserum, das in 1 mlsterilem, destilliertem Wasser rekonstituiert wird.- Aspergillus flavus positive control serum- Aspergillus nidulans positive control serum- Aspergillus niger positive control serum- Aspergillus terreus positive control serum

4- ZUSAMMENSETZUNGAntigene (zwei Typen):• Stoffwechselantigen, durch Filtration von Kulturen nach 10-tägiger

Inkubation bei 30°C gewonnen.• Körper- oder Zellantigen, aus jungen Pilzkulturen (3 Tage, ohne Sporen)

gewonnen, die zerstoßen und bei 30°C geschüttelt werden.

5- LAGERUNGDie lyophilisierten Reagenzen sind bei einer Lagerung bei +2-8°C aneinem trockenen Ort bis zu dem auf der Packung angegebenenVerfallsdatum haltbar.Nach der Rekonstitution: Die Reagenzen können in Aliquoten bei -20°Cmehrere Monate aufbewahrt werden. Die Reagenzen nicht mehrmalseinfrieren und wieder auftauen.

6- PROBEN 1. Der Test kann nur mit in Trockenröhrchen gesammelten Serumproben

durchgeführt werden.2. Folgende Empfehlungen für die Handhabung, Vorbereitung und Lagerung

der Serumproben beachten:- Bei der Entnahme al ler Serumproben die routinemäßigen

Vorsichtsmaßnahmen beachten.- Die Proben vor der Zentrifugation vollständig gerinnen lassen. - Probenröhrchen stets verschlossen halten.- Nach der Zentrifugation das Serum trennen und in einem fest

verschlossenen Aufbewahrungsröhrchen lagern.- Die Proben können bei +2 - 8°C aufbewahrt werden, sofern sie

innerhalb von 24 Stunden getestet werden. Wird der Test nichtinnerhalb von 24 Stunden durchgeführt bzw. für den Versand dieProben bei –20°C oder kälter einfrieren.

33

- Die Proben vorzugsweise nur einmal auftauen. Zuvor tiefgefroreneProben sollten nach dem Auftauen und vor der Analyse gründlichgemischt werden.

3. Eine Interferenz aufgrund hoher Albumin-, Lipid-, Hämoglobin- undBilirubinwerte wurde noch nicht getestet.

4. Proben nicht erhitzen.

7- TESTVERFAHRENA)ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL• Natriumbarbital• Chlorwasserstoffsäure• Destilliertes Wasser• Barbital• Glycin• Tris-Puffer 0,05 M pH7• Agarose• 30% H2O2

• N-Acetyl-DL-Phenylalanin-Naphtylester• Dimethylformamid• Diazoblau B

B) IMMUNELEKTROPHORESE (photo 1)Die Immunoelektrophorese (Grabar) kann auf Glasobjektträgern fürmikroskopische Untersuchungen durchgeführt werden.• Mit gereinigtem Agar oder mit Barbitalpufferlösung (pH 8,2) auf 1%

gemischter Agarose (durch Zugabe von Merthiolat 1 :10.000) ein Gelherstellen.

• In das Gel ein 60 mm lange und 2 mm breite Rinne und zwei Löcher miteinem Durchmesser von 2 mm auf jeder Seite der Rinne im Abstand von 4mm schneiden (siehe Schema).

• 20 µl des unverdünnten Antigens in beide seitlichen Löcher geben.• Über eine Zeitspanne von 1 Stunde und 30 Minuten eine Spannung von 5

Volt/cm an den Enden des Objektträgers anlegen.• Das Serum in die Mitte der Rinne geben und 48 Stunden bei feuchter

Atmosphäre und Raumtemperatur (18-30°C) diffundieren lassen.• Am dritten Tag die Objektträger 24 Stunden in eine Waschlösung

eintauchen.

34

• Den Objektträger am 4. Tag ablesen. Eine Färbung mit Coomassie-Blaukann erforderlich sein, um besonders feine Linien abzulesen.

C) ELEKTROSYNÄRESE (abb. 1)Elektrosynhärese (Bussard) oder Gegenelektrophorese kann mit Agarose-Geloder Cellulose-Acetat durchgeführt werden. Dies ist eine einfache Technik, diesehr empfindlich und schnell ist, und sich daher für die Screening-Untersuchung einer großen Anzahl an Seren eignet.• Unter Verwendung von Agarose-Gel und Mikroskop-Objektträgern können

Löcher gemäß dem Schema geschnitten werden: Die Antigene werden aufdie Kathodenseite (-), die Seren auf die Anodenseite aufgetragen (+). DieLöcher mit einem Durchmesser von 2 mm liegen 6 mm auseinander.

• Die Löcher für das Antigen mit reinen Lösungen in den Verdünnungen 1 :2und 1 :4 befüllen. Die Löcher für die Seren mit 20 ml befüllen.

• Eine Spannung von 5 Volt/cm 1 Stunde und 30 Minuten lang anlegen.• Die Reaktion wird in der Regel direkt nach der Migration abgelesen.• Ist eine Färbung mit Coomassie-Blau erforderlich, müssen zuvor zwei

aufeinander folgende Waschgänge vorgenommen werden: inphysiologischem Serum (über Nacht) und destilliertem Wasser (24Stunden), anschließend trocknen lassen.

Es wird empfohlen, parallel eine positive Kontrolle nach dem gleichenVerfahren wie für die Antigene zu testen.

D) IDENTIFIZIERUNG DER ENZYMAKTIVITÄT IN MANCHENPRÄZIPITATIONSBÖGEN

Die am häufigsten nach Immunelektrophorese beobachteten Bögen werdenals C und j (siehe Schema) bezeichnet und deuten auf Enzymaktivität hin (C: Chymotripsin und J: Katalase). Weitere Anzeichen für das Vorliegendieser Enzyme liefern spezifische Reaktionen (BIGUET et al.) (siehe Anhang).

E) VORBEREITUNG DER REAGENZIEN1) PUFFER- VERONAL pH 8,2

Natriumbarbital 15,85 gHCl 1N 23 mlH2O ausreichend für 1000 ml

35

- BARBITAL- NATRIUMBARBITAL-TRIS-GLYCIN (BBNa TG) pH 8,8A. Natriumbarbital 65 g

Barbital 10,35 gH2O ausreichend für 5000 ml

B. Glycin 281 gTris 226 gH2O ausreichend für 5000 ml

Nach dem Mischen gleicher Volumina der Lösungen a und b wird ein Puffermit einem pH-Wert von 8,8 und einer Osmolarität von 0,08 gewonnen.

2) 1% AGAROSE (GEWICHT/VOLUMEN)Agarose 10 gH2O 500 ml

Zum Kochen bringen, anschließend abkühlen (auf ca. 60°C.)Zusetzen:

Barbitalpuffer pH 8,2 500 mlOder

BBNa TG-Puffer pH 8,8 500 ml(50% mit destilliertem Wasser verdünnt).

3) KATALASE30% H2O2 verdünnt in TRIS 0,05M pH7-Puffer (0,3 ml H2O2 + 50 ml Puffer)auf Immunelektrophorese-Agarose.Positive Reaktion: Blasen um den spezifischen Bogen.

4) CHYMOTRYPSIN- LÖSUNG A

N-Acetyl-DL-Phenylalanin-Naphtylester 5 mgDimethylformamid 2 ml

- LÖSUNG BDiazoblau B 10 mgTris-Puffer 0,05 M pH 7,4 18 ml

Vor der Verwendung die Lösungen A* & B* mischen, die Elektrosynäresemembran in dieser Mischung 30 Minuten bei 37°C inkubieren.Die Mischung entfernen und über Nacht in 18 ml Reagenz B bei 37°Cinkubieren.Die Membranen mit Wasser waschen.Positive Reaktion: violette Bögen entsprechen einer Chymotrypsin-Aktivität.

36

F) ZUSAMMENFASSUNGP.J. SVENDSEN MANUEL OF QUANTITATIVE IMMUNOELECTROPHORESIS,FURLAGET UNIVERSITY, OSLO. HERAUSGEBER: EXELSEN KROLL-WEEXE.Analyse der ASPERGILLUS-ANTIGENE (Tabelle).

* Siehe Abschnitt 6, Testverfahren (E - Vorbereitung der Reagenzien).

8- INTERPRETATIONDas Vorliegen spezifischer Präzipitationsböden mittels Immunpräzipitationgegen das Aspergillus-Antigen weist auf eine infektiöse Aspergillose hin. Da die Elektrosynhärese ein schnelleres Ver fahren ist, is t sie derImmunelektrophorese für Screening-Untersuchungen vorzuziehen. Dennochmüssen mit dieser Methode als posi t iv befundene Seren mit telsImmunelektrophorese bestätigt werden. Chymotripsin und die Katalase-Enzymaktivität bei manchen Präzipitationsbögen sind weitere Beweise ihrerSpezifität. Im Fall einer bronchopulmonalen oder diffusen Aspergillose sind bei 80 bis90% der Fälle die Tests positiv, und es werden in der Regel spezifische Bögenbeobachtet.

37

Puffer Spannung Dauer Farbstoffe

Immunelektrophorese Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mnVeronalpuffer pH 8,2 Coomassie

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn-Blau

BBNa TG-Puffer pH 8,8

Elektrosynärese Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mnVeronalpuffer pH 8,2 Coomassie

Agarose 1%/ 10 V / cm 60 mn -BlauBBNa TG-Puffer pH 8,8

Katalase Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Verdünntes H2O2*Veronalpuffer pH 8,2 Positive Reaktion:

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mnBlasen um den

BBNa TG-Puffer pH 8,8spe-zifischen Bogen j

Chymotrypsin Agarose 1%/ 5 V / cm 90 mn Reagenzien A* und B*Veronalpuffer pH 8,2 Positive Reaktion:

Agarose 1%/ 25 V / cm 60 mn Violette Färbung um denBBNa TG-Puffer pH 8,8 spezifischen Bogen C

Pur O O O O O O1/2 O O O O O O1/4 O O O O O O

1 S 2 S 1 ou 2 Sr

photo 1

1 et 2 : AntigenenS : PatientserumSr : Kontrollserum

Abb. 1

photo 2

photo 3

Bei einem Aspergillom sind die Reaktionen stark positiv: 5 bis 10 Bögen undein C-Bogen werden in der Regel beobachtet.Bei einer allergischen Aspergillus-Bronchitis ist die Reaktion bei 50% der Fällepositiv. Präzipitierende Antikörper treten in einer späten Phase der Infektion auf: Inmanchen Fällen werden sie bei einer zweiten Screening-Untersuchung einenMonat nach der ersten Untersuchung nachgewiesen.

9- LEISTUNG / QUALITÄTSKONTROLLE DES TESTSA) NACHWEIS VON PRÄZIPITATIONSBÖGENDie Leistungsmerkmale der Aspergillus-Antigene werden mit positivenAspergillose-Kontrollseren (Anti-Aspergillus -Kaninchenserum, durchImmunisierung des Tieres mit gemischten standardisierten A. fumigatus-Antigenen gewonnen und mit standardisierten Stoffwechsel-A. flavus, A. niger,A. nidulans und A. terreus-Antigenen gemischt) überprüft.

Nachweis von Präzipitationsbögen durch Immunelektrophorese (pH = 8,2)

38

Positives Kontrollserum Anti- A. fumigatus Anti- A. flavus Anti- A. nidulans Anti- A. niger Anti- A. terreus

A. fumigatus- +Körperantigen 4 – 8 Bögen - - - -

A. fumigatus- +Stoffwechsel- 3 – 5 Bögen - - - -antigen

A. flavus- - +Stoffwechsel- 3 – 5 Bögen - - -antigen

A. nidulans- - - +Stoffwechsel- 3 – 5 Bögen - -antigen

A. niger- - - - + -Stoffwechsel- 3 – 5 Bögenantigen

A. terreus- - - - - +Stoffwechsel- 3 – 5 Bögenantigen

B) NACHWEIS DER ENZYMAKTIVITÄT VON PRÄZIPITATIONSBÖGEN

10- QUALITÄTSKONTROLLE DES HERSTELLERSAlle von der Firma Bio-Rad hergestellten Reagenzien unterliegen einemQualitätssicherungssystem vom Rohstoffeingang bis zur Vermarktung derFertigprodukte. Jede Fertigproduktcharge wird einer Qualitätskontrolleunterzogen und nur dann verkauft, wenn sie den Freigabekriterien entspricht.Die Unterlagen bezüglich Herstellung und Kontrolle der einzelnen Chargenwerden bei Bio-Rad aufbewahrt.

11- GRENZEN DES TESTSDie Diagnose einer Aspergillose kann nur in Zusammenhang mit denklinischen, radiologischen und biologischen (mikrobiologischen,histologischen, chirurgischen) Daten gestellt werden, wobei jedes Ergebniseinzeln und mit Vorsicht interpretiert werden muss.

39

Inmunoelectroforesis (pH = 8,2) Elektrosynärese (pH 8,2)Nachweis der Katalase- +Enzymaktivität Nach Zugabe von H2O2

Bläschen um den Bogen j,Unterstützung der Katalaseaktivität

Nachweis der Chymotrypsin- +Enzymaktivität Nach Beimpfung mit den

Reagenzien A und B violette Färbungdes Bogens C, Unterstützung der

Chymotrypsin-Aktivität

40

12- REFERENZEN1. BIGUET J.; TRAN VANKY P.; FRUIT J. ; ANDRIEU S. : Identification

d’une activité chymotrypsique au niveau de fractions remarquables del’extrait antigénique d’Aspergillus fumigatus. Répercussion sur lediagnostic immunologique de l’Aspergillose. REV. IMMUNOL. (1967)31, pp. 317-328.

2. DROUHET E.; CAMEY L. ; SEGRETAIN G. : Valeur de l’immunoprécipitationet de l’immunofluorescence indirecte dans les Aspergilloses broncho-pulmonaires. ANN. INST. PASTEUR (1972) 123, pp. 379-395.

3. DROUHET E. ; DUPONT B. : Infections mycosiques et parasitaires aucours des traitements immunosuppresseurs. PATHOL. BIOL. (1976) 24,pp. 99-116.

4. LONGBOTTOM J.L. : Immunological aspects of infection and allergydue to Aspergillus Species. MUKOSEN (1978), supp. 1 pp. 207-217.

5. SEGRETAIN G.; DROUHET ; MARIAT F.; Diagnostic de laboratoire enmycologie médicale (1979, 4e édition), MALOINE Edt. PARIS 150pages.

82

- CE marking (European directive 98/79/CE on in vitro diagnostic medical devices)- Marquage CE (Directive européenne 98/79/CE relative aux dispositifs médicaux de diagnosticin vitro)

- Marcado CE (Directiva europea 98/79/CE sobre productos sanitarios para diagnóstico in vitro)- EG Markierung (Europäische Richtlinie 98/79/EG über In-vitro-Diagnostika)- Marchiatura CE (Direttiva europea 98/79/CE relativa ai dispositivi medico-diagnostici in vitro)- Marcação CE (Directiva europeia 98/79/CE relativa aos dispositivos médicos de diagnósticoin vitro)

- CE-märkning (Europa direktiv 98/79/EG om medicintekniska produkter lör in vitro-diagnostik)- CE-mærkningen (Europa direktiv 98/79/EF om medicinsk udstyr til in vitro-diagnostik)

- For in vitro diagnostic use - Catalogue number- Pour diagnostic in vitro - Référence catalogue- Para diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro-Diagnostikum - Bestellnummer- Per uso diagnostico in vitro - Numero di catalogo- Para uso em diagnóstico in vitro - Número de catálogo- In vitro diagnostik - Katalognummer- In vitro diagnose - Katalognummer

- Manufacturer - Authorised Representative- Fabricant - Représentant agréé- Fabricante - Representante autorizado- Hersteller - Bevollmächtigter- Produttore - Distributore autorizzato- Fabricante - Representante Autorizado- Tillverkad av - Auktoriserad representant- Fremstillet af - Autoriseret repræsentant

- Batch code - Expiry date YYYY/MM/DD- Code du lot - Date de peremption AAAA/MM/JJ- Código de lote - Estable hasta AAAA/MM/DD- Chargen-Bezeichnung - Verwendbar bis JJJJ/MM/TT- Codice del lotto - Da utilizzare prima del AAAA/MM/GG- Código do lote - Data de expiração AAAA/MM/DD- Batch nr. - Utgångsdatum År/Månad/Dag- Batchkoden - Anvendes før ÅÅÅÅ/MM/DD

- Storage temperature limitation - Consult Instruction for use- Limites de températures de stockage - Consulter le mode d'emploi- Temperatura limite - Consulte la instrucción para el uso- Lagerungstemperatur - Siehe Gebrauchsanweisung- Limiti di temperatura di conservazione - Consultare le istruzioni per uso- Limites de temperatura de armazenamento - Consulte o folheto informativo- Temperaturbegränsning - Se instruktionsanvisning vid användning- Temperaturbegrænsning - Se instruktion før brug

LOT

IVD

EC REP

REF

83

The other languages which are required in conformity to the EuropeanDirective can be obtained from your local Bio-Rad agent.

Les autres langues requises par la Directive Européenne sont disponiblesauprès de votre représentant Bio-Rad local.

Los otros idiomas que se requiren para la conformidad de la DirectivaEuropea puede ser obtenida en su oficina local Bio-Rad.

Die anderen Sprachen, die in Übereinstimmung mit der europäischen IVDDirektive benötigt werden, erhalten Sie über Ihre lokale Bio-RadNiederlassung.

Le altre lingue che sono richieste in conformità con le Direttive Europeepossono essere ottenute dal locale agente Bio-Rad.

As restantes línguas, obrigatórias em conformidade com a DirectivaEuropeia, podem ser obtidas através da subsidiária Bio-Rad mais próximade si.

Övriga språk som krävs i enlighet med EG-direktivet kan erhållas från dinlokala Bio-Rad-representant.

De øvrige sprog som kræves i henhold til EU direktiv kan fås vedhenvendelse til den lokale Bio-Rad leverandør.

Bio-Rad3, boulevard Raymond Poincaré92430 Marnes-la-Coquette FranceTel. : +33 (0) 1 47 95 60 00 11/2003Fax.: +33 (0) 1 47 41 91 33 code: 880011