TELEFONO:

CLAVE:

/CARRERA:

TRRIMEsmBB:

HCRAS A L A S E W A :

LUGAR :

pEcH4 DB II(ICI0: 'FECHA bE SCWYIIVACIDIV :

Quintana Dias Mnorah Anllndraa

Ingenieria Bioqufmica Industrial

87-1

20 horae

Laboratorio de Fitoqubioe y Ro

de biotecnologíe de l a U.A.M.

duct08 N8Furale8 del departamento

P4 üe febrero de Z986

18 de J W ~ O 1987,

Q. Joe6 Ma. Barba Chávez profesor T.C.

a Ddterminacidn de sapogeninas n

---------u- ----- Quintana D \ i a Ynorah Andrea

.

OIIIvf9RSIDAD AUTDRQIA METROPOLITANA - IZTAPAUPA

DEPARTAMBRTO DE BIOTECAOLOCIA

. .

.,,.

OBTEACIOIi DE SAPOOENINAS PCB KEDIO DE UN ñüEV0 PROCESO

BIOTBCI?OIiOI)ICO

REPClWB DE SBBVICIO SOCIIL REblIIZM PQR:

Quintana Dias Dinonh Androa

1.- Reatamen

11.- 1ntroduoeí6n

111.- Ob$etivoa

1V.- iñétdoe J Te~nio88

V.- ReOUltadOO

VI.- M8OU8%On J ~OnClUS%h

Vi1.- Bibliografía

Vi1I.- Indiae %o Tablas J Myra6

Pagina

I

2

8

9

26

31

33

35

..-

I

... I"

. . ,..I

..~., L

R B S U Iy B R. a

-

~$1 bnrbaeco producto natural renovable del cual s. e*ae l a materia prim par8 l a slntesia quihíca o miicrobiel&$ar - de loa compuesto8 esterold8les. se han buseado *entes atar ~ t i + a ~ a l a produoalón de diosgonlna pare poder ~ t i s f a c e r

nu demanda, pero n o se cuenta o w una tecnol&8 de matom - -

Zlciencia en l a producalbn de honnonas o derivado8 estemida

l e s ,por l o que es necesario contar aon un procesa rfiaiente

que mejore at obtencih.

-

\ &a dlosgenina se encuentra asociada con amaaree J tmcrdi -

cloaaliente l a ruptura del enlace es por medlo de un trrtaaiai to o u ~ l c o con H2SO4 conaentrado,a altaa temperaturas , en - oondlalones drdsticas .ma alternativa 8 (ate procreo es e l - wo de iioroorganianos o parte de el los (enaimas) ,para l e 1%

beracibn de dlosgenina de IS8 saponinre,ls cual dlminuje l o

draetlao del tratemle@to qufmico.

- c

-

Ba obtenaih de l a diosgenina se r e a l f u en Un mdio sen - a i l l o que contiene barbasco J papa,dsta ultima provee P @u- coslddsas a m actividad sobre la8 saponinas de1 barpsao.aaf como un medio adecuado p8ra e l desarrollo de los mlgroorganls moe celuiolfticos los cualee producen P-glucosidasas .La - proporalh adecuada em 1:0.5 de barbaeco -papa respeatiremen te,en eolucl6n buffer pH 7,efectuandosé l a hldrdlisis a l cabo

de 7 dias a temperatura de 28-32'C en condiciones aerobias.

I -_

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- -

\

11.- I I T R O D U C C I O If

. ..

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c

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. ".

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,--

~n la induotria de estoroidde , la sapogenina de mayor im- portancia es la diosgenira ,excelente materia prima para la - fabricaci6n de hormonas y una gran Variedad de derivados hor- monalea y eateroidaies conocidos. La diosgeninr ( 2 0 u , 2 2 a ,

25-b-eapiros~i en-3 B 01 ) quimicamente pertenece a iaa aa - pogeninaa eeteroidales de 27 átomos de carbono en una cadena latera1,del tipo espiroatano o espiroacetal,6ate grupo no se

encuentra en ninyna otra clase de productos naturales cono- cidos actuaimente, y consiste en un anillo de cinco mienbroe y otro de seis,ambos heterocfclicoa sentan el anillo de sei8 miembros abierto se conocen c m o - firaetanoe. Fig.1.

.Lon compuesto8 que pre-

Las saponidas EO encuentran en forma natural en ciertos - vegetales ,asociados a diversos amcares ( p -D-giucoea y - W-Lramnosa) formando asi l os giucósidos, a i y n a e de aus caracterieticaa son: disminuyen la tensión superficial del agua,foman espuma faciimente y tienen la capacidad de pro- vocar hem6lieis: eon soluble8 en etanol y agua (parciaimente)

pero no en 4ter.Rsta asociación quimica BO caracterier por tener una unión glucosidica suseptible de ser hidrolisada - tanto quimica como microbiol6gicamente dejandola libre y - apreciablemente más eatable en fama de sapogenina.So enmen- t r ~ en una gran variedad de plantas entre la8 que se puede mencionar magueyee (género agave) ,isotes (género yuca), s* mandoca (samuekecaneroaana) y otros perteneoientes a las fa- milias delileaceas,dioecoreaceae,amariledaceae,auque su prin- c f p 7 r i i *

3

mexicano ( dioscorea composita) del cual constituye de 1-5 $ en peso seco de l a planta, perteneciente a l a familia de l a s

dioscoreaceae, se presentan como arbustos trepadores que par-

ten de grandes raíces tuberosas hasta de 20 cms de d i be t ro , alta con ta l lo globocilfndrico,semilefloso, al80 sulcado en - seco.

Hojas alternas, l$minas,coreaceae ,anchamente ovaladas de

7 a 9 15 a 23 cme de longitud por I O a I 7 cms de ancho, con

nervios prominentes en ambas superficies, peciolo robusto su1

cado de 8 a I1 cms de longitud. Inflorecencia masculina ro - busta 1-2 en l a & la compuesta , de 20 a 30 cms de longitud,

f lores sésiles 1-2-3 aglomeradas, estambres férti les; seis - centrales erectos, filamentos desiguales.Inflorecencia feme - nina alargada,simple o compuesta.

Estos risomas desecados constituyen l a parte que es utili- sada para l a extracción dehs saponinas, ya que l as demás p ~ r - tes de l a plan$a ,como son e l tal lo, las hojas y las flores l as

tontienen en pequeñas cantidades, auque en general se sabe - que l a planta esta compuesta de resinas, almidón, celnloaa,a - oxalato de calcio y saponinas, ésta ultimas no se encuentran

l ibres en l a planta , e s t h como heter6cidos compuestoe, que

derivan de l as formas ciclicas que a l ser hidrolizados generan

los compuestos denominados glucósidos o saponinas y estan for

mados por dos clases de mdleculas diferentes: un aef~car 6 - "radical heter6sido" y una fracción de diferente nrcftdraieea - llamada agiicón, sapogenina o geninadj)

-

I - ¡

8imple1~ente en éste caso es l a dioepnina . Ri los estudios de Merker,Kawasaky y Espejo, se determinb

l a naturalesa y l a s caracteristicas de l as eapogeninas del

barbasco; en forma compleja, l a s más abundantes son;

MOSCIIPA? Diosgenina ( 2-4-bis-&- L-ramnopiranosil P- ib glucopiranósido )

TRILLIAA: Diosgenina 8 - - ~giucopirau6sido.

wosapogenina ;- Dioagenina -3- 4) (4-L raminopiranosil -I

-4 1 - P - D @ u ~ o p i ~ ó ü i d o .

&ti como giucbsidos de furaetanoi, en los que los restoe

de glucosa se unen a l C-3 y a l C-26 de l a mol6cula esteroidal.

Como se menoion6 anterionnente , debe efectuarse una hidro l i s i e en e l enlace glucosidico para obtener e l núcleo esteroi

da1 l i b r e ( aglicón) , que constituye l a materia prima para - l a síntesis de compuestos biolbgicamente activos. Esta hi - drbliais tradicionalmente se efectua con ácido mineral y al- tas temperaturas, l o cual da condiciones drasticas de reacción

además de l a aparici6n de compuestos indeseables, y l a neee - sidad de neutmliaar e l exceso de ácido, lavar y secar. (5)

(6,79899)

- -

6

Una alternativa R este proceso, es e l uso de microorganis- m o ~ , hongos o = Z ~ ~ R S , para l levar a cabo l a hidrólisis en - condiciones m$s suaves . Ya en los estudios de Krider y co - laboradores reportarón que era posible l a hidrdlisie de 108

gluc6sidos de 53,220, eepirostanos usaddo extractos acuo-

sos de l a s plantas que los contenían, asf coat0 reportes ais- lados del uso de bacterias, hongos y plantas ,para l a obten- ción de sapogeninas 7 aglicones ester0idaies.f 11912*13,14,15)

En este caso dicha hidrdlisis e s por medio de una fermen - tación natural con un medic de papa,usando data como cop - piemento v ia microorganiamos, hongos o enzimas, basaddonos - en experimentos qaterioree. ñn ama mezcla de papa-barbasco

molida ,en una solucidn buffer @H-7, a l cabo de un tiempo

se efectua e l rompimiento giucoefdico de l a saponina dejan-

do a l aglicoh l ibre o aea l a disgenina de nuestro interes.

La papa (Solanum Tuberosum ) es una planta anual del ti- po herbáceo ,arbustiva,alcan~a alturas de 40-80 cms,está - oonstituida por l as siguientes partee;

Raíces; (tipo adventicio,propagada por tubdrculoe y - est& en los primeros 40 mas del suelo.)

Tubdrculoe , hojas (vellosas del tipo compuesto ,con va-

rios f iolos OpUe6tO8 y uno @ d e como termitmi )

Flores; (cmpuestas , 5 pétalos fbsionadoa formando un

' tubo f loral . )

, ., .._*-_ " . -- . -----

mtos; (redondoa,euaves,diámetro aproximado 2 a s a I O cma). ,

Semillas; ( pequeflae J aplastadas)

Su c i c l o de vida ee de 3-5 meses, su üesaxroiio y crecimien - t o depende de factores genéticos J existen uua gran variedad

de acuerdo con ciertas caracteristicas f isioiógicas y morio - iógicas,cmo son; color del tuberc&lo,fmxna,contenido de a l - midón etc. Cabe mencionar que en e l presente trabajo, se va

a determinar l a influencia de diferentes tipos de tubérculos

y l a s fementacionee a real isar para l a obtención de dioege-

nina. (16)

- mcontrar un nuevo proceso biotecnoibgico para l a obtención

de diosgenina.

- maontrm ias condiciones más propicias para BU obtención

- Prober diferentes tipos de papa

cia en la hidrói is is ensinática

para determinar l a influen

..

. ..,

-..

. .

c

. .

. .

. ,. . _ _ , . ., .. .I.r __--- *--

M ~ E T O D O S Y T B C I V I C A S

A) Actividad ensimhtica de l a papa

B) Cmpoeicidn de diferentes proporoionea de papa y

barbasoo para obtener una mayor cantidad de dios8enina

b.1) Meaclaa de barbqaco fresco y papa fresca b.2) mesolae de barbaeco 8oco y papa fresca b.3) lPesalss de barbasco @eco y eoluoión de papa

C ) Cromatografia

D) & l ie is Microbiol6gico.

Para l a reaiizacidn de esta pmebs se colocar6n meaclas de

IO0 g s de papa ( Solanum !haberosilm) J 200 m l de soluci6n - buffer a diferentes pHs (5,7,9), se e f e c t d l a prueba de l a - activfdad con soluciones de peroxido a diferentes concentra - clones a l 3,5,10% por medio de un desplasamiento de oxígeno

a travéz de tubo de vidrio, por l a inyeccich de un milili- t r o de muestra a l a solución de peroxido , con agitacidn com- pleta . Como se sabe las saponinas producen espuma, de aqd - l a adicibai del antieepwmnte al peroxido. -

Las lecturas se hiciéron en periodos de 5 minutos, hasta - que e l desplatamiento no hiera apreciable , e0 decir , que l a

actLridad de l as hidrolasas fuera minima.

ñ l equipo utilieado fue improvisado . Fíg.2

B1 tubo que comunica a l a probeta y a l tubo de ensaye es a que va a traaportar e l oxigeno desprendido, al aotuar las - enzimas , l o cual va a producir un deeplammiento en l a can - tidad

desplazados, hasta que no oourrata clliabioa apreciables.

de agua contenida en l a probeta, medida en mililitros

. .

. .”

tina ves deterninada l a aoción entimática de l a papa , 80

procedi6 a realizar di?erentee merclas de papa- barbasco , c a ~ objeto de encontrar l a s condiciones más optimas para l a obtet

cidn de un rendimiento mayor de diosgenina, así como para

observar l a actividad de diferente0 tipos de papa en varios - periodos de tiempo.

-

b.1) IUezclas de barbasco freeco con papa fresca.

I I , b - 1

Para r e a l i ~ a r las muestras con barbasco fresco, 88 efectuo

primeramente e l tratamiento de 1impiera;cortado , se lava con una eoiución de alcohol y cloruro mercurico concentrado , con

e l objeto de eliminar l o mha posible los contaminantes.

iba vez limpio ee pese l a centidad necesaria del barbasco,

a d como la cantidad neceearia de pipa previamente lavada 3

cortada, ambas se muelen oon eolua ih bufier pH-7 J se deja - en reposo a temperatura de IOIC e l tiempo requerido. Tabla1

4

Cam0 se pueae observar las muestrss solo Be efectuardn con

en proporciones variables y tiempos un tipo de papa (blanca

diferentes para encontrar l a cantidad adecuada de ambos. La

identificación de saponinas fue deteminada por e l método - colorimbtrico de Roeenthaler (2)

~

. ,.,

Hueetra Barbasco (gr) I

I 200

2

3

4

200

200

200

Tipo Be papa: Blanca

50

I50

75

200

Proporc

It0.25

Ii0.75

1:035

I: I

diae Perm.

14

9

I6

I9

Natenc ia ilosgenim

X

X

XX

xx

Tabla I1

woporcion I tipo ' papa

lueetra

5 6

7 8

9 IO

11

I2

I3

14

I5 I6

I7 18

I9 20

21

22 '

23

24

25

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

75 50

25

50

50

50

50

50

50

37.5

50

37.5 25

12.5

25

12.5

I6 07

25

25

75 50

50

37.5

16 07

25

37.5

25

12.5

i RE

em.

27

31

20

I4

20

30

28

40

34 25

3 - 5

I3 25

I3 I4

31

45

25

20

1 ~ 0 . 5

I: I

1~0.75

III

It0.75

1 ~ 0 . 5

I: 0.25

120.5

I;0.25

It0.37

1;O.S

1.05

I: I

I: I

I:2

1.0.75

1.037

110.5

It0.75

It0.5

I;0.25

(1

* sapata

(1

I

roja (1

I

(1

rosa ll

(1

aapata a

I

roja I

a

I

o

d 8 a C i a ,apogeninae

= X

a

X

X

n X

Lx

X

u xxz xx X

X

xx

X

tx

m X

xx X

b.2) Heeclas de barbasco seco y papa fresca.

El barbasco seco y molido se mezcla con l a papa , previa-

mente lavada y cortada con solución buffer pH-7,para una ma-

yor homogeniaación se iicuo l a mezcla, ae dejo en reposo - a una temperatura de 10’C.Tabla 11

Como ae pueda observar, los lotes se realisarón con cuatro

diferentes tipos de papa ( blanca,sapata,roja,rosa )en propor

cionea que van de I;I hasta 110.25 de barbasco y papa respec-

tivamente, con objeto de realizar un estudio más especifico

de l a actividad hidrolítica.

Como ae tuvo problemas para ut i l izar e l barbasco fresco , m

i t t i l ie6 e1 seco.

b.3) Mewlas de barbasco seco J solución de papa.

Se observó anteriomente que l a actividad máxima de l a - solución de papa se daba en un lapso de tiempo de 7 - I2diae

a IO%, l a cual fu6 ntiliaada para efectuar las meeclas , a- gregandole e l barbasco seco en determinadas proporcionea,a - 250 m l . La soiuci6n de papa mencionada anteriormente fue he

cha con 250 gr de papa en un litro de solución buffer,y apar - tir de éste tiempo se uti l is6 Tabla 111

TABLA I11

soluci6n papa ( m i )

I50

50

100

IO0

66.8 200

150

I50 200

IO0

IO0

Muestra

26

27 28

29 30

31

32 33 34 35

36

aiae de proporci6n Perm.

7 1~0 .75

30 110.25

I4 It0.5

54 1 ~ 0 . 5 20 1~0 .16

i 2 I: I

I 1 1 ~ 0 . 7 5

45 I:0.75 21 I: I

24 I;0.5

25 110.5 " I -

Barbasco (e)

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

50

i P 0 aPa

o ja 11

n

N

R

apata 11

It

n

It

0

existencia sap ogeninas

X

xx x x xx

X

xx X

X

X

xx

Obtención de l a diosgenina en l a s muestras.

ünn ves separado e l sOlid0 del liqrrido de iae niuestrais , anteriormente mencionadas , 6e seca en l a es+ciia e 50. C, ae me le para su posterior extracción del producto de inter86 - =la diosgenha* con UQ solvente adecuado, como e l beptsrio - por medio de un xostlet a una temperatura% 00.C durante 5 7 horas, al cabo de este tiempo ,y rma ves f r ia IR Soluc.56n se concentra por destilación simple, haat4 un volumen de - apmximadsaente 30 mi , COI) e l obfeto de obtener los crirr - tales del prociucto, y recuperar e l solveate -%ado.

Se puede observar que por e l tipo de enlace b-glucodbf-

eo, l a s ensimas que van a acatuar a- l a s hidrolasas, cm wxa

errpecificidad en cuanto a que no imports l a fuente de me - provenga^ sus caracteristicas son las mismas y pPeden actaar ea roma cruzada.

ün posible mecanismo de accidn para que a l enlace pueüa ear hidroiieadú por las glucoaidaeas ea -1en a l -

60 involucran dos áreas en i a superficie da ia ensima que-

interautdrul con e l sustrato, una con el asúcar 01 e i c 6 n (diosgeninB3 ; primero ocurre una 8Morcíbn - del snetrsto por medio de puentes de hiaitigeuo, iueruls - electroetáticas, fuerzas de Vader Waals y enlaces uayalen

tas débiles a l a s dos regonee ( aglicón y d a r ).

o t r a

-

I 2

. ..

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. .

R R

I ' I

5 R Or!

c - c - c - c 1 1 1

fi H H I1

I I I t

Una ves absorbido se forma un complejo por adicih de un i6n hidronio 6 hidroxilo al enlace glUCOSfdiC0, a au vez dete complejo ee dieocfa produciendo aaf la liberacibi de la diosgenina y el azúcar. Hay dos factores importan - tes en ia hidrblieis de ios ~-glucosi~icos , la fuersa del enlace glucosídico a hidrolioar y la fuersa y posi- ción de los enlaces entre el sustrato y l a entima.pi&,3

Cabe mencionar que cuando se utiliza plantas para-la+ obtencibn de glucósidos eeteroidales,los microorganiaiaoa celuiiticos juegan un papel muy importa?2te, pues al inau- cir ma actividad de calulasas inducen la produccidn de

glucosidasas , con el fin de hidroliear la celulosa y oelobiosa y algunos oligheros pequeños de glucosa , que también pueden hidrolisar a los glucbsidos eateraidales- ñn 1977, Rnmyantseva reporto que la glucosidase de de - pergillus niger juega un papel importante en la hidrbli- sie de glucbsidos esteroidalee. @3)

%a Bate caso el cataiiaador está intrinseco en la - papa, que presenta enzimas como las giucosidasas o hidro laeas, además de ser el medio adecuado para el crecimien to de microorganismos que pueden sintetiaarla, como se - menciono' anteriormente por la presencia de la ceiuio- ea presente ea el barbasco.

-

r

II.,

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8 .

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I

papa (-)

- 50

- 50

- 50

- 50

b

iniusiónl salas papa ( m i ) foafato

(err)

295 8.027

370 11.7

25 O 8.í

375 11.8

326 8.87

330 8.97

330 8.97

300 8.1

Ad miamo se eiactua e l medio para e l crecimiento de bacte-

r ias, en agar pera método eatandar con actldlona ogrieeofus vine y ea inocula con l a e mimas diluciones para hongos.

Una ven identificados l o s hongos ,sa realis6 un micro - cultivo en medio Saboraw ,con objeto de aislar los hongos - de nuestro lnteres ,se dejan a 28V1durants 7 diaa,para de-

terminar e l hongo de mayor influencia.

I

2

3

4

5

6

7

8

TABLA IV

IO0

IO0

IO0

IO0

IO0

IO0

IO0

IO0

extroa (ex)

20

20

20

20

20

20

20

20

I

La cromatograffa en capa f ina se u t i l i s a para separar - satisfactoriamente varios compuestos o componentes de una me5 - cia ;io8 cuales tienen propiedades f í s i cas y quimioas pareci-

das que serían di f io i l es de separar por m6todos ordiaarioe , basada en e l hecho de que l o s compuestos diferentes en soiu- cidn se absorben en forma distintaa en superiicies polares,

utilisando un absorbente s6lido , cono l a s i l i c a gel que se

extiende en capa delgada sobre una placa de vidrio de dife-

rentes medidas , que son colocdas en una cuba o cwara de v i

drio conteniendo un volumen de solvente elegido para que l a fase s6lida y l o s componentes que se van a separar queden en

equilibrio entre l a sbsorci6n en e l abeotbente y l a eolución

en e l l iquido reauiriendo muestras de uno 1040 microgramoe

.napleando una gran variedad de disolventes y absorbentea.(2))

-

Para preparar e l absorbente se pesa aproximadamente 30 -8

de s i l i c a gel G.F. 254 en un matraz , adicionando 60 m l de a- gua destilada con agitación constante hasta obtener una pas - fa uniforme l i b r e de burbujas de aire y gxumos.

por otro lado se preparan las placas de vidrio, l a s cuales

debar& lavarse perfectamente con dotergente u solución 0011-

oentrada de d lca l i o meecla crdmica y enjuagarse perfectemen8

con bastante a y a , postoriormente se limpian con cyio J a - cotona.

Se alinem las placas y se coloca el abaerbente an 01 - eiapasitivo adecuado para aplicar una capa fina (250 U da - eapesor) del absorbente a su aplicación sobre las placas , de jandolas durante atios minutos y posteriormente se secan en el horno a una temperatura de IO0 a I20 C durante 30 minutos las placas deben ser protegidas de vapores de laboratorio j

deeeriodo de tipo mechico. Las placas han de presentar un as - pecto uniforme y no tener grumos da major tamaño.

La mescla de compuestos que se van a separar se coloca en l a parte inferior de la placa , poniBnda tata gota d. solucidn l o lads Importante no sea dema- ciaiío grande, ya que un *BOBSO produciría colas y el crometo- grama no resultaría bueno.

es que la solución (la gota)

Para la aplicación se necesita una micropipota o un tubo - capilar pequeño y delgado que pueda contener 10-20 ml por ca- pilaridsd,Sin perforar la placa se depesita la muestra tocan- doia euavemente y r4pidamdnte esperando e l tiempo suficionte para que se seque ,despues de cada aplicaci6n:cada ves quo - ue vuelva a tocar la mancha debiendo aplicarse en el centro - en fonaa muy rdpida, de l o contrario, se extenderá en exceso

Una ves terminada la aplioacibn, se COlQCa en la camara de co rrimiento que contiene e l disolventa o dilwte esco6ido coma bancenotCHC13 3:l . i ü ~ muy iinpoffante que el nivel del disol vente quede bajo las manches ,muy pronto se ve que el disol- vente ascendera por l a plana iniciando la eeparacidn do los compuestos apareciendo una mancha8 una vee nivelado, cuando

- -

..

.. ,

' ..

."

.-,

... ! .-

el disolvente llegue a io marca previamente puesta del ii - mSte superior de la placa de vidrio, se saca con mucho cni- dado de la camara de revelado dejando mecar al aire,donde las muestras comparadas con el eetaadar tuvier6n el mismo resul- tado. Pig .6

Una ve5 obtenido el croastograma ,se obaerva cop lus Ultra- oioleta,siempre poniendo un blanco (diosgenina) para obtener los resultados más claros.

Estandar

I Diosgenina 11 Penogenina

' 1 )

?>-,, 6

Muestra

1 . 03 11

Para efectuar ¿eta prueba se ponen cantidades determina - das de papa y barbasco (lavada y picada) en medio de papa

dextrosa,la cual se prepara de l a siguiente manera;

200 grs de papa pelada se hierven en un volumen de ama destilada a fuego lento durante u11 tiempo de 45-60 minutos

se f i l tra , y una vez frio tie determina e l volumen del l i- quido f i l trado, e l cuál sirve como base para agregar las - sales de fosfato necesarias, as1 mismo se agregan 20 grs d,

dextrosa y se afors a un litro con aoiuci6n buffer corres

pondiente. Tabla IV -

Se dejan a una temperatura de 28 * C con agitación con-

tinua , para que l a s condicione8 aerobiaa sean completas - Una vez transcurridos los 7 dias de fermentacidn se t o m a

nuestras del liquido para l a s muestras microbiol6gicas y

e l s6lido una vez seco , se trata con heptano para l a e x t z

cidn de l a d%osgenina. -

Una vez tomadas l a s muestras del liquido, se hacen la8

para sembrar de I O -IO 5 8 diluciones

&ax Rosa de Bengala con estreptomicina , se ponen a una temperatura de 28 * C durante 7 dias ,

en medio para hongos ;

V.- R B S U L 1 A D O S

A f i n de obtener una aayor actividad en&im$tica se prwo

con diferentes pHs (5.7. y 9 ) y se observó que dicha activi-

dad enzimktica fu6 mayor a un pH neutro ,disminuyendo con-

forme se a le ja de l a neutralidad (acidez o alcalinidad) apesar

de hbber existido actividad hidrolftica. Fig.4,5.

Cabe mencionar que l a actividad ene idt ica es mayor en - l a basicidad que en l a ácidez,as< mismo se observó que l a - actividad mostrada aumenta conforme l a concentracián aumenta

en $ de peroxido aumenta y e l tiempo de refrigeración de 1.

solución de papa siendo e l apropiado de 7 a I 2 dias, despues

decrecia l a actividad a mayor tiempo hasta un mfnimo.

Ihr base a Batas resultados se h i c i e r h las muestras para

le detenninaci6n de diosgenina, observandose l a infiuencia 6

diferentes tipos de papa utilizada.10 cual demostró que no - 88 producen cmnbios significativos con respecto a BU actividad

variando e l tipo de papa.

As$ mismo loa resultados de l a s mezclas demuestran que la proporción adecuada para e l proceso de hidr6lisis es de I:0.5

Ue barbasco-pafia respectivamente. Bs de gran importancia meb cionar que e l basbasco se ut i l i zo seco y fresco, l o cual inili

ye en los resultados mostrando un l igero aumento en l a pro - duccián de diosgenina en fresoo 0.5$ más. El. tiempo que se n,

quiere para que l a hidr6lisis se efectue totaimente es de 7 a 12 dfas.apartir de este tiempo ea m i n i m a .

I

- las prueba8 se rsalisarón a IO'C sin agitación y a un tiem - PO mayor de I5 dias bajo Brrtae aondiciones, obteniendose un rendimiento entre 1.5 - 2 $ de dioagenina con una pureza baja io cual dio pauta a desarrullar de una manera más organisa - da la obtencidn de diosgenina , que s í bien, no se obtuvierón rendimientos competitivos con respecto a la hidrólisis ácida que tiene M rendimiento entre el 2.5 -5 $ con una pureza del 92 res de &ran importancia por ser un método natural.

I

A partir de éstos resultados, se efectuarón mescias en iaa condiciones opeimas encontradas anteriormente ; con una pro - poroion de barbasoo - papa de fr0.5 respectivamente, el tiem PO iue de 7 diaa, sin embargo, se efectuo con agitacih con - finua , debido a que se concidero que eran necas&ias las con diciones aerobias a una temperatura de 28'C -32*C, puesto - que es una temperatura a decuada para e1 crecimiento de niiCT0 orgenismos , asi como optima para le actividad enlim6tica.a éste caso el rendimiento obtenido fué de 1.7-2.4 $ siendo ma- for que el obtenido sin agitación. A éstas muestras se lea h i

s6 el an4lisis microbiológico , tomando en cuenta que los mi- croorganiemos son capaoes de crecer en medios que contienen - barbasco como fuente de carbono.

-

-

-

haí el analisis microbiológico mostró la presencig de hongos

da1 genero Aspergillus y Penioillum ,los cuales tienen ensi - mas extracelulares qua pueden efectuar la hidr6lisie de lae- saponinas extrafdas del barbasco.,aei como a l m o 8 microorga- nisaos celuióticos que producen actividad de endo y exoglucosi

damas auqus su presencia no fué importante, puesto que se en- contrnr6:i en pcr!u..;l,a p r o p a i c i h .

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Se tu06 una contaminacih con aarcina,lacual poaiblemente-

influyó en los resultados obtenidos.

con respecto a:íae bacterias ~e deteminardn ;Conybaote - rim y B.Coli, auqae no se determino realmente l a Anfluencia

de éstas en e l proceso fermentativo, i o cual es de gran impor

tancia para un posible estudio , ya que e l t ipo de ferments oión fué aerobio .

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La mayor actividad rnsimática da l a solucibn de papa se do

a un pH neutro,.debido a que son proteinae y no toleran l a ao-

cibn de Bcidos y bases fuertes, pudiendo ocaaoinar éstos; -üna variación en l a aiinidad de l a enzima por e l sristrato.

- Una variación en l a estabilidad de l a enzima.

- Una inactivación hacia uno u otro lado del pH optimo

- Un efecto reversible real del pH sobre l a velocidad máxima

de reacción. *

$1 peroxido utiliaado aumenta l a actividad enzimática a ma - yor concentración ,debido a que se encuentran mayor cantidad

de hidroddoe necesarios para efectuar l a hidrbliaia.

El tiempo optimo para l levar a oabo l a muma actividad en c

aimática en l a solución de papa ea de 7 - 12 dias a 10' c,.ya que en date tiempo loa microorganisraos crecen y se adaptan - produciendo l a s enzima8 inductiws hasta que e l sustrato decat

ce ( a mayor sustrato mayor l a actividad de lstas cuando dia

minuye e l sustrato ,disminuye Sa actividad y desaparece l a en cima 1.

-

LOS diferentes tipos de papa no presentan cambios s igni f i -

cativos con respecto a su actividad enziniática.Aei como l a pm

porcion adecvaüa para la8 muestras es de I;0.5 de barbasco - papa reepectivansntc.

II1 porcentaje de dioegenina obtenido por el m6todo fermen- tativo fu6 menor con respecto al utiliaado tradicionalmente - con dcido,debido a que se piensa qua en el barbasco hay una - gran cantidad de aaucares el a- s0 liberan, a su vec influye en l a liberacibn de diosee-

que al ponerse en contacto con

am 9 Otros COEbpUe8tOe prüüenteñ 9 Siendo a d hidr6lieis menos selectiva.

Las condiciones aerobiae 00n un factor que da u11 aumento - en el rendimiento de la diosgenina , ya que los microorganic- mos (Aspergillus y Penioiilimr) son ctapaces de crecer aerobí- cmente en los medios que contienen barhaaco como fuente de c carbono en forma de celuloaa y abid6n ,induciendo la produc- cidn de glucosidaeae en l a degradaci6n de los miemos y asf 3p

hidr6lisia de las saponinas. Loa microorganismos encontrados son celul6tiaoe en BU mayoria ,pudiendo efectuar la hidrbli- si6 de la8 saponinas.

se ha demostrado que e l d t o d o natural utilizado es viable en contiiciones menos aras- para la obtencidn de 1adiosC;enina

tioas con respecto al método qufmico tradicional con ácido. -

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VI I I . INDICE DB TABLM Y FIGURAS

I.- SaBLAS

I. Meeaclaa de barbasco fresco con papa

XI. Metclas de barbasco sego y papa

111. Medesclas

I V

$e barbasco seco y so luc ih de papa

láuestras para el analisis microbiologic0

I.

2.

3.

4

5

Extruahira de l a diosgenina y Saposefina

Bquipo utilisado para l a pnieba de actividad entimstica

Mdlelo de un posible meosniamo de aooibn de las glucosidaeas

Bepreeentacion de l a s soluciones pH 5-9

RepreaenDaci6n de l a soluci6n Pñ 7