carrera de especializacion en biotecnologia...

CARRERA DE ESPECIALIZACION EN BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL FCEyN-INTI

Materia de Articulación CEBI-E5

BIOCATÁLISIS APLICADA

Docente a cargo: Dra. Cristina dos Santos [email protected]

CEBI- E5-4 :Métodos de estabilización/Biocatalizadores en medio no convencionales.

mailto:[email protected]

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES


Se pueden estabilizar biocatalizadoresEn solución : ➢ Soluciones concentradas de enzimas ➢ Pureza no muy alta➢ Con presencia de cofactores metálicos o en

soluciones reguladoras ➢ Con agentes cosmotrópicos

En fase sólida ➢ Liofilización➢ Secado por aspersión Eliminación de agua

para aumentar la estabilidad

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDALiofilización

Método de deshidratación en el que se elimina el agua por congelación del producto húmedo y posterior sublimación del hielo en condiciones de vacío.

Ventajas• Se obtienen productos de redisolución rápida • La forma y características del producto final son esencialmente las originales • Proceso idóneo para sustancias termolábiles • Los constituyentes oxidables están protegidos • Contenido muy bajo de humedad final • Compatible con la elaboración en medio aséptico Desventajas • Alto costo de instalaciones y equipos • Elevado gasto energético • Operación de larga duración

Utilizado en industria farmacéutica y médica:SuerosAntígenos, antibióticos, vitaminasEnzimas Extractos animales, vegetalesConservación de semillas, flores, frutosIndustria alimentaria

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDASecado por aspersión

Método de deshidratación en el que se elimina el agua al entrar en contacto con aire caliente

Ventajas• Se obtienen productos de redisolución rápida, amorfos • Bajo costo de instalaciones y equipos • Contenido bajo de humedad final • Compatible con la elaboración en medio aséptico • Puede hacerse de forma continua y estérilDesventajas • Producto variable en calidad si no se controlan las variables del proceso• Proceso no idóneo para sustancias termolábiles • Requiere aire caliente en gran cantidad• Requiere de una matriz o material encapsulante

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDASecado por aspersión

Utilizado probióticos (lactobacilos)- Vitaminas- Enzimas - Extractos animales, vegetales

SECADO POR ASPERSIÓN

Mejora:✓ Estabilidad✓ Costos Transporte✓ Sabor✓ Textura✓ Vida útil✓ Propiedades de

dispersabilidad

Alimentos

Farmaceútica

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES FASE SÓLIDAAspersión( congelación spray) + Liofilización

Este tipo de granulación

con congelación en spray y la

posterior liofilización o

criodesecación.

Se consigue el control de la densidad

de los gránulos, alta homogeneidad,

menor grado de oxidación.


Se pueden estabilizar biocatalizadoresMétodos químicos➢ Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas➢ Inmovilización químicas

Métodos Físicos➢ Inmovilización Física➢ Solventes diferentes agua➢ Encapsulación

Métodos de ingeniería genética➢ Diseño racional➢ Evolución dirigida➢ Expresión de enzimas de organismos termófilos

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculas

¿Por qué se modifican enzimas?• Para estudios estudios estructurales, conformacionales, mecanismos enzimáticos. Analizar correlaciones estructura- función •Para mejoramiento y aumento de la estabilidad en diferentes condiciones de reacción y almacenamiento

¿Cómo se modifica químicamente enzimas?

➢ Modificando grupos funcionales superficiales sin entrecruzamiento➢ Provocando entrecruzamientos inter o intramoleculares

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculasEjemplos

Grupos funcional modificado

Reacción o reactivo Enzima modificada

N terminal de Lisina Acilación Quimotripsina

Carboxilo de ácidos aspártico o glutámico

Carbodiimida Beta-glucosidasa

Imidazol Histidina Bromoacético Beta-glucosidasa

CarboiimidasActivan ácidos… dan ésteres o amidas

Modificaciones químicas/conjugación con macromoléculas

Modificación química para mejorar estabilidad de Tripsina

Aumenta estabilidad térmicade la tripsina de 45 a 60 °C.

Mayor resistencia a la degradación a pH 9

.

Utilizando una proteasa de Streptoverticillum

Sp. Grupo amino de la CD reacciona con residuos glutámico de tripsina

AMINA: propilen, butilen o etilediaminaCiclodextrina tosilada +

Ots =

Proteasa (tosil-asa

TRIPSINA BOVINA

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESModificaciones químicas/conjugación con macromoléculas

Modificaciones con PEG

Se utiliza en enzimasterapeúticas ,

disminuyendo la inmunogenicidad y

aumentando la vida útil en el organismo

.

Aumenta la solubilidad en agua por la hidrofilicidad de PEG

Disminuye el acceso de enzimas proteolítica o anticuerpos

Aumenta tamaño y reduce la filtración en riñon

ENZIMA

PEG 10000 n=195-265


Modificación con PEG

La modificación química con PEG es el primer paso para otras modificaciones de la

enzima que afectan la solubilidad en agua o en

solventes orgánicos.

Es importante el grado de sustitución ya que afecta la

entrada de gruposfuncionales más voluminosos

.

ACTIVACIÓN

SUSTITUCIÓN CON OTROS GRUPOS


APLICACIÓN: Modificación con PEG de enzimas terapeúticas

Sustitución con PEG esimportantes en:

-aumento del tiempo de retención- protección contra la degradación en células y tejidos de enzimas, proteínasy pequeñas moléculas, liposomas y nanopartículasutilizadas en terapia.

.

Tratamiento antitumoralUtilizando enzimas que degradan aminoácidos específicos emanera de inhibir crecimiento celular. La Arginina no es esencialen humanos pero su deficit inhibe crecimiento de células. Laarginina deiminasa (ADI) y la arginasa (ARG),se utilizan comoantitumorales.



Métodos Físicos➢ Inmovilización Física➢ Encapsulación➢ Solventes diferentes agua


BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS



VENTAJAS▪ Recuperación del biocatalizador del medio de

reacción▪ Reducción de la inhibición por el medio o por

productos▪ Aumento de la concentración del

biocatalizador y de la productividad enzimática

▪ Facilidad de recuperación y purificación de los productos.

▪ La posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control, adaptado a la aplicación del biocatalizador inmovilizado.

▪ Se puede elegir entre una gran variedad de diseños.

▪ Ideal en procesos continuos!!

DESVENTAJASo Puede perderse actividad enzimática con la

inmovilización.o Sistema enzima soporte es heterogéneo,

pueden existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferentes uniones al soporte.

o A veces, se pueden originar contactos proteína-proteína indeseados.

o Puede aumentar el costo del proceso comparado con la enzima nativa.

o El intervalo de pH, afinidad por sustrato, actividad enzimática de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo.

o Puede haber problemas difusivos es un sistema heterogéneo, enzima fase sólida y sustrato/medio fase líquida

MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES

Unión COVALENTE ADSORCIÓNADSORCIÓN

ENTRECRUZAMIENTO

ATRAPAMIENTO

ENCAPSULACIÓN

INMOVILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORES


1. Inmovilización química por enlaces covalentes

▪ La interacción entre el biocatalizador y el soporte es mediante enlaces covalentes pero NO entre moléculas

de enzima.

▪ El tipo soporte determina tipo inmovilización.

SOPORTE

Activación para obtener grupos funcionales reactivos

Grupo Funcional Soporte

-CONH2 Poliacrilamida

-COOH Carboximetilcelulosa

-NH2

-OHPoliestireno, NylonCelulosa, agarosa, sephadex

-Si(OH)3 Vidrio poroso

ENZIMA

Unión a través de cadenas laterales de los aade la enzima

-NH2 Lisina-OH Serina-OH-Ph , Tirosina-COOH Asp.,Glutam.

-SH Cisteína-N (imidazol) Histidina

IMPORTANTE centro activo no debe ser afectado x los reactivos de la inmovilización.Protección el CA con un análogo del sustrato.

MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES1.Inmovilización química por enlaces covalentes. Método acil-azida (Soporte con grupos ácidos)

1. Se activan los grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas en

dos etapas

2. Idém antes se utiliza grupos reactivos superficiales de la enzima (N-terminal y aminos de Lys, SH de

Cys, OH de Tyr, imidazol de Hys)

MÉTODOS DE INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES1.Inmovilización química por enlaces covalentes. Método azo (grupos básicos en soporte)

1. Se activan los grupos químicos del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas.

2. Después se utiliza grupos reactivos superficiales de la enzima (N-terminal y aminos de Lys, SH de

Cys, OH de Tyr, imidazol de Hys)

▪ Es adecuado para enzimas aisladas, es una inmovilización selectiva (con Tyr, en ej. ).

▪ Se evita la agregación de proteínas.

▪ Aumenta la resistencia a cambios pH y temperatura


2. Inmovilización química por entrecruzamiento

Formación de enlaces covalentes INTERMOLECULARES (entre moléculas de enzima) y entre estas y el soporte.

VENTAJA :Cantidades altas de ENZIMA inmovilizada resistentes a condiciones extremas de pH y temperatura

DESVENTAJA: pérdida de actividad por problemas estéricos y difusionales del sustrato


2. Inmovilización química por entrecruzamiento con glutaraldehído MÉTODO DE CO-

RETICULADOPara evitar pérdida deActividad EnzimáticaEntrecruzar agregando unaproteína sin actividad y ricaen lisina.Ej. Albúmina bovina

MÉTODO ENTRECRUZAMIENTO

CON CRISTALIZACIÓN (CLECs)Cristalizan enzimas y luego sereticulan cono glutaraldehído


3. Inmovilización Física por atrapamiento o inclusión en un gel, polímero o matriz porosa.

▪ Formación de polímero altamente entrecruzado en presencia de la enzima. Esta queda atrapada en la matriz polimérica formada.

▪ Importante control de condiciones de la polimerización para que NO se altere la enzima.

▪ Ventaja: Se pueden obtener membranas con enzimas inmovilizadas. Aplicación general

▪ Nanoencapsulación en medios mesoporosos

▪ Desventaja: Pérdidas de enzima con el régimen de trabajo.


4. Inmovilización por encapsulación

MICROENCAPSULACIÓN (1-100µm) dentro de membranas semipermeables de polímeros que permiten la difusión de sustratos y productos y no de proteína. Desventaja : elevadas concentraciones iniciales de enzima (10mg/L)

ENCAPSULACIÓN POR GELACIÓN IÓNICA: cápsulas de alginato en soluciones de Ca (II)

Con bicapas lipídicas se puede obtener:MISCELAS REVERSAS fase continua : ORG/fase dispersa agua

LIPOSOMAS fase continua : agua/fase dispersa ORG

Catalasasoxidoreductasas


5. Inmovilización por Adsorción

Interacción física NO ESPECÍFICA entre la ENZIMA y el SOPORTE ( interacciones de van der Waals, puente H, hidrofóbicas, iónicas)

Ventaja: método muy sencillo, general, costo moderado.

Desventaja: estabilidad limitada, control riguroso de condiciones de trabajo para evitar desorción de la Enzima


5. Inmovilización por Adsorción-Resinas

LIPOZYME CAL-B( Novozymes) lipasa de Candida antárctica producida en Aspergillus oryzae inmovilizada en resinas intercambio iónico

Lewatit 2431 (Bayer-Resina macroporosa ácida). No gel, esferas grandes muchos espacio. Alquilación fenol y olefinas, esteficación , eterificación condensación de moléculas grandes.


EFECTOS SOBRE LA ESTABILIDAD de la ENZIMA

Las propiedades de las enzimas inmovilizadas diferentes a E en solución ➢ Cambios conformacionales: puede rigidizarse la estructura por las uniones al soporte,

mayor resistencia a la desactivación térmica o química.

➢ Mayor protección de ataque de proteasas

➢ Efectos material de soporte, mayor fuerza iónica ( menor efecto oxígeno) ➢ Menor agregación molecular

➢ Efecto soporte, mayor control de pH enmicroentorno de la enzima➢ Mayor estabilidad en solventes no acuosospor el carácter hidrofílico del soporte


EFECTOS SOBRE LA CINÉTICA DE LA ENZIMA

Las propiedades cinéticas de las enzimas inmovilizadas son diferentes a las de las enzimas en solución porque:

➢ La inmovilización puede inactivar la enzima si se afectan los AA del sitio activo, si existen impedimentos estéricos

➢ Cambios en la afinidad por el sustrato

➢ Problemas difusionales

➢ Cambios pH. Por ejemplo, enzima unida a un soporte con q negativa (v.g. CM-sephadex) será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-sephadex). Entonces AE DEPENDE DE SOPORTE!!!

INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES

Problemas difusionalesaparentan MENOR

AFINIDAD !!!

INMOVILIZACION DE BIOCATALIZADORES

QUIMOTRIPSINA EN SOPORTE CATIÓNICO O ANIÓNICO


APLICACIONES



APLICACIONES ANALÍTICAS

BIOSENSORES

BIORREACTORES

APLICACIONES INDUSTRIALES

-ALIMENTOS

-QUÍMICA

FARMACEÚTICA

APLICACIONES MÉDICAS

Tratamientos con enzimas inmovilizadas


ALIMENTOS : PRODUCCIÓN LECHE SIN LACTOSA

ALGINATO El alginato está formado por dos tipos de monosacáridos, el ácido gulurónicoy el ácido manurónicoEn presencia de Ca2+ forma geles irreversibles a pH maor a 3,5.

LECHE con lactosa

La enzima lactasa inmovilizada convierte lactosa a glucosa y galactosa en un proceso continuo

Cápsulas de alginatocon lactasa inmovilizada

LECHE sin lactosa

Aplicaciones inmovilización de enzimas

ALIMENTOS: PRODUCCIÓN JARABES ALTA FRUCTOSA

Amilasasinmovilizadas

Glucosa isomerasainmovilizada


PRODUCCIÓN DE AROMAS: ÉSTERES

pH óptimo 6.5 tanto para la lipasainmovilizada como la libre, pero la inmovilizada retiene actividad máxima a más alta temperatura 55 – 60°C

LIPASA CATALIZA LA FORMACIÓN DE ÉSTERES , butirato de etilo

Lipasa de Candida rugosa inmovilizada en Eupergit®C85% eficiencia


PRODUCCIÓN DE AROMAS: ÉSTERES, TERPENOIDES

Microorganismos pueden sintetizar alcoholes, ésteres, lactonasy terpenosGeotrichum candidum y las levaduras Hansenula y Pichiaproducen alcoholes y ésteres; la Trichoderma viride produce la lactona gentil-6-alfa pirina, que tiene un olor a coco; algunas especies de Ceratocystis, Penicillium, Aspergillus, Sacharomices y Pseudomonas sintetizan terpenos volátiles.

Ventaja de que estas biotrasformaciones son estereoespecíficas.


APLICACIONES: BIOSENSORES

ELEMENTO DE RECONOCIMIENTO ESPECÍFICO

TRANSDUCTOR

ELECTRÓNICA

BIOSENSORES ENZIMÁTICOS


APLICACIONES: BIOSENSORES

BIOSENSORES ENZIMÁTICOS

Para cuantificación de sustratos Glucosa usando biosensor de glucosa oxidasa

Para cuantificación de inhibidores Para pesticidas carbámicos con acetilcolinesterasa



Métodos Físicos➢ Inmovilización Física➢ Encapsulación➢ Solventes diferentes agua


ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESINGENIERÍA GENÉTICA

ESTABILIZACIÓN DE BIOCATALIZADORESBIOCATALIZADORES MODIFICADOS

INGENIERÍA GENÉTICA

CLONACIÓN

PCR amplifica un gen determinado

MUTAGÉNESIS

Producir un ADN con diferencias en las bases del original.

Puede hacerse con agentes químicos o radiación.

OMG organismos modificados

Aplicaciones de la ingeniería genética

➢ Fármacos, como la insulina y la hormona del crecimiento humano, en bacterias

recombinantes y animales transgénicos, aumentando la velocidad y el rendimiento en la producción de los mismos

➢ Enzimas más activas para disolver manchas, como las que se usan en los detergentes en polvo, mayormente por medio de microorganismos recombinantes (transgénicos) que crecen en biorreactores.

➢ Aumenta la velocidad de producción de enzimas para la industria alimenticia, como las empleadas en la elaboración del queso y en la obtención de jugos de fruta, entre otras.

➢ En biocatálisis, la obtención de diferentes isoenzimas puras con diferentes selectividades y enzimas con diferentes características deseadas

BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOS


➢ Bacillus, como p. ej. B. subtilis y B. licheniformis.

➢ Saccharomyces cerevisiae (levadura de panadería).

➢ Aspergillus niger y A. oryzae.

➢ Lactobacillus y estreptococos lácticos.

Para usar un microorganismo que produzca enzimas de consumohumano se debe usar un microorganismo “GRAS” (generallyaknowledged as secure).Existen unos 50 microorganismos GRAS aprobados para la industria

alimentaria por ejemplo


ENZIMAS RECOMBINANTES LIPOLASA® Novoenzyme, es la primera enzima recombinante aprobada para detergentes. El gen de la lipasa fue aislado del hongo filamentoso Humícolay transferido a Aspergillus.oryzae

Cutinasa de Fusarium que degrada ácidos grasos de expresa en la levadura S.cerevisiae

Quimosina recombinante (rennina,EE.UU y Gran Bretaña, 90% de los quesos duros), sustituyendo a la escasa quimosina de terneros y a la biotecnológica tradicional obtenida de hongos (Rhizomucor, Endothiaparasitica). La quimosina recombinante se obtiene en Kluyveromyces lactis y Aspergillus niger manipulados.

Otras aplicaciones X mutagénesis dirigida sobre genes clonados ya existentes para generar productos con propiedades nuevas. Algunas moléculas –entre ellas, muchos antibióticos– se sintetizan en células mediante rutas bioquímicas que emplean una serie de enzimas, las cuales pueden ser modificadas genéticamente para producir formas modificadas de antibióticos.


MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

Subtilisina, proteasa de B.

licheniformis que elimina manchasde sangre y de comida, se hamejorado con ingeniería genéticapara que tenga actividad de catalasay resista pH alcalinos y altastemperaturas

BIOTALIZADORES ARTIFICIALES Y MODIFICADOSENZIMAS RECOMBINANTES : produccíón somatrotopinaAplicación en veterinaria

• Se aisla de la vaca el ARNmde la somatotrofina bovina

• Con transcriptasa inversa se transforan en cADN

• Se clona en un vector bacteriano de E. coli

• Se produce en cultivo de células la STB recombinante

Somatotropina bovina recombinante pare estimular la producción de leche de vacas (aprobada por la FDA en 1994 para Monsanto, con el nombre comercial de Prosilac, pero no en la UE).


ENZIMAS RECOMBINANTES: LIPASAS COMERCIALES

carrera de especializacion en biotecnologia...

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