07/06/2014

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CARRERA DE ESPECIALIZACION EN CARRERA DE ESPECIALIZACION EN

BIOTECNOLOGIA INDUSTRIALBIOTECNOLOGIA INDUSTRIALFCEyNFCEyN--INTIINTI

Materia de Especialización CEBI_E11

RECUPERACION Y PURIFICACION DE

MACROMOLECULAS

Docente a cargo: Fernando Oliver

CEBI_E11_2 : Ruptura Celular

Las moléculas de interés comercial producidas por

fermentación o cultivo celular son intracelulares o

extracelulares.

Para recuperar productos intracelulares las células tienen

que romperse antes de poder empezar el proceso de purificación.

Ruptura celular: Es el proceso por el cual se rompe la célula

para liberar los productos intracelulares.

Ruptura celular

(key words: cell disruption, lysis, homogenizer, bed mill)

Maximizar la liberación del producto.

Durante el proceso de ruptura se debe:

Minimizar la desnaturalización del producto (perdida de la

actividad biológica).

Evitar la generación de formas relacionadas (ej: la oxidación de enzimas puede llevar a la perdida de la actividad).

Evitar degradación térmica.

Objeticos del método de ruptura celular Factores que determinan el método a emplear en la ruptura:

Factores que dependen del producto:

•Sensibilidad del producto al calor.

•Sensibilidad al estrés mecánico (shear).

•Localización del producto (citoplasma, periplasma)

Factores que dependen del microorganismo:

•Tipo de microorganismo (pared celular)

•Tamaño y forma.

•Condición del cultivo

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Efectos de la condición de cultivo

Las condiciones que afecten la síntesis de los componentes de la pared se reflejaran como cambios en la fuerza de la pared celular.

En general tienen que ver con cambios en el grosor y entrecruzamiento de la capa de peptidoglicanos:

E. coli creciendo en medio complejo son mas difícil de romper.

E. coli tiene pared mas débil cuando esta creciendo en fase exponencial que cuando se encuentra en fase estacionaria.

Pared celular en bacterias

Escherichia coli Pared celular en levaduras

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Métodos directos: se cuenta el numero de células intactas.

Métodos indirectos: cuantificación de algún componente celular que se libere en forma proporcional al nivel de ruptura celular o

medición de algún parámetro que sea proporcional al numero de células.

¿Cómo medir ruptura celular? Microscopia (Método directo)

Ventajas: es una técnica rápida y sencilla.

Desventajas: es mas dificultoso contar bacterias (muy chicas) y es muy difícil diferenciar entre células intactas y parcialmente dañadas (puede solucionarse usando alguna técnica de tinción).

Plaqueo (Método directo)

Desventajas: es una técnica que lleva mucho tiempo y solo cuenta células viables.

Espectrofotometrico (Método indirecto)

Medicion de OD 600 nm

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Fracción de proteína liberada:

Rp = ( Ch – C0 ) / ( Cm – C0 )

C0 : concentración de proteínas solubles en el sobrenadante de la muestra pre ruptura.

Ch : concentración de proteínas solubles en el sobrenadante

de la muestra post ruptura.

Cm : concentración de proteínas solubles maxima que se

puede obtener en el sobrenadante de una muestra totalmente lisada.

Métodos indirectos Liberación de proteínas (Métodos indirectos)

Puedo medir proteínas totales o proteína especifica (actividad enzimática, ELISA, RIA, etc)

Métodos de ruptura Molino de bolillas

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Ecuación que describe homogeneización:

Ln ( Rm/ ( Rm – R ) ) = K t

Rm : cantidad máxima de proteína liberada

R : cantidad de proteína liberada

K : constante de velocidad

t : tiempo.

Molino de bolillas

La constante de velocidad K es función de:

•Diámetro de las bolillas

•Velocidad de agitación

•Diseño del molino

•Concentración de células

•Concentración de bolillas

•Temperatura

Molino de bolillas

Molino de bolillas

Mayor velocidad, mas lisis.

La lisis depende del tamaño del bead.

El tamaño optimo depende del microorganismo. Levaduras:

optimo entre 0,25 – 0,5 mm.

La ruptura baja con el aumento del flujo.

La concentración afecta la ruptura a cc > 20%.

Concentración utilizada 70-90% volumen cámara

Disminuye con la temperatura.

Molino de bolillas

Dyno-mill bead millhttp://www.wab.ch/en/home.html

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Homogeneizador de alta presión

Video: https://www.youtube.com/watch?v=E-C7DXzAKZM

Ecuación que describe la ruptura con homogeneizador de

alta presión:

Ln ( Rm/ ( Rm – R ) ) = K N Pa

Rm : cantidad máxima de proteína liberada

R : cantidad de proteína liberada

K : constante de velocidad de ruptura

P : presión del homogeneizador.

a: esta constante es una medida de la resistencia del microorganismo a la ruptura.

Homogeneizador de alta presión

Homogeneizador de alta presión

La ruptura celular aumenta con la presión.

Presiones normalmente utilizadas en escala industrial = 600 – 800 bar

Factores que afectan la constante de velocidad K:

•De la geometría de la válvula.

•De la temperatura

•De la concentración de células

Factores que afectan la constante “a”:

•Tipo de microorganismo: 2,9 para levaduras y 2,2 para E.coli

•Del estado metabolicodel microorganismo

Homogeneizador de alta presión

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Homogeneizador de alta presión

No es un método adecuado para la recuperación de DNA.

Se rompe a medida que pasa por el homogeneizador.

Homogeneizador de alta presión

GEA Niro Soavi Homogenizershttp://www.nirosoavi.com/products/products-Niro-Soavi.asp

APV Homogenizershttp://www.spx.com/en/apv/pc-homogenizers/

Homogeneizador de alta presión French Press

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Ultrasonido

Utilizado en el laboratorio. Es muy sencillo su utilización.

Mecanismo de ruptura es la cavitación:Se generan burbujas que al colapsar

generan ondas expansivas que se propagan por el medio (variación de presión).

Shock osmótico (Métodos físicos)

Se somete la célula a una fuerte presión osmótica de la siguiente manera:

Se equilibran las células en un medio fuertemente osmótico (sucrosa 1M)

Se diluye muy rápidamente, entonces se genera entrada de liquido a la

célula (osmosis) MUY RAPIDO.

Si la célula no es lo suficientemente fuerte explota.

Esta técnica no es capaz de lisar células que tengan pared de peptidoglicano.

Métodos Químicos

La pared celular se puede romper o permeabilizar utilizando distintos agentes químicos:

•Antibióticos

•Agentes quelantes

•Sustancias caotropicas

•Detergentes

•Solventes

•Alcali

Antibióticos (Métodos Químicos)

Hay distintos antibióticos que pueden lisar E.coli en crecimiento.

Su aplicación es en escala de laboratorio. No hay una aplicación industrial.

B-lactamasas afectan la síntesis de peptidoglicanos interaccionando con la PBP (penicilin binding protein).

No se utiliza en escala industrial ya que son costosos y su efectividad depende de la fase del cultivo. La mayoría de los

antibióticos no afectan a E.coli en fase estacionaria.

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Agentes quelantes (Métodos

Químicos)

Agentes quelantes como el EDTA rompen la membrana externa de gram negativos por unión de los cationes divalentes (Mg 2+ y Ca 2+)

que croslinkean las moléculas de LPS.

La eficiencia del EDTA es muy dependiente del buffer utilizado. No

son muy efectivos si se usa HEPES o fosfato y tiene mucha efectividad si se usa con buffer TRIS.

EDTA es muy efectivo para recuperar proteínas de espacio periplasmico. No es de utilidad para recuperar proteínas

citoplasmáticas.

EDTA no afecta la membrana interna ni peptidoglicanos. Para liberar proteínas citoplasmática se debe usar junto con otro tratamiento. Ejemplo: EDTA-lysosima, EDTA-detergentes

Agentes caotropicos (Métodos

Químicos)

Son moléculas que desorganizan la estructura tridimensional de macromoléculas (proteínas, DNA, etc) desnaturalizándolas. Actúan

sobre interacciones no covalentes.

Algunos agentes caotropicos utilizados: urea, guanidina.

Solubilizan proteínas de membrana.

No se utiliza en escala industrial debido a que se deben usar concentraciones muy altas (alto costo), su efectividad es muy

variable por lo que hay que setear bien condiciones experimentales (temperatura, concentración, estado del microorganismo) y generan

residuos complicados para eliminar.

Detergentes (Métodos Químicos)

Moléculas anfifilicas. Poseen una porción polar y otra no polar.

Solubilizan la membrana celular.

Se utilizan distintos tipos:

Anionicos: SDS

CationicosNo inonicos: Triton X, Brij

Muy importantes para la recuperación de proteínas de membrana.

Si el detergente desnaturaliza la

proteína no se puede usar (Ej: SDS)

Solventes (Métodos Químicos)

Los solventes permeabilizan la membrana solubilizando componentes hidrofobicos de la membrana.

También pueden inducir autolisis de algunos microorganismos.

Algunos solventes utilizados: etanol, tolueno, acetona.

Desventajas:

Algunos solventes son tóxicos o inflamables.

Pueden desnaturalizar el producto.

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Tratamiento con Alcali (Métodos

Químicos)

El tratamiento con álcali actúa por saponificación de los lípidos de la pared celular.

Es una técnica efectiva si el producto es estable a pH alto (pH >10).

Es una técnica de aplicación industrial

Ventajas:Económico, fácil de escalarInactiva proteasas

Elimina endotoxinas

Desventajas:Muy pocos productos son estables a tan alto pH (se desnaturalizan o se degradan)

Métodos Enzimáticos

Son los métodos en los que una enzima actúa sobre algún componente de la pared celular.

Lisis enzimática (agregado externo)

Autolisis (el propio microorganismo fabrica las enzimas)

Fagos (enzimas del fago)

Enzimas

AGA: N-acetilglucosamineAMA: N-acetylmuramic acid

Lisozima

Enzimas

Ventajas:Rápidos y sencillosCondiciones de trabajo suavesLisis selectivaNo necesitan de una inversión inicial importante.

Desventajas:Son costosos No siempre existen enzimas especificas para mi microorganismo.

Liberación de ADN aumenta viscosidad (puedo usar Benzonasapara disminuir este problema)Es necesario eliminarla posteriormenteHay que ajustar condiciones de buffer, pH y temperatura para que la enzima tenga actividad.

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Autolisis

Se basa en la producción de enzimas por el organismo productor, que digieren la pared celular, aumentando su permeabilidad y

eventualmente produciendo la lisis celular.

Se puede inducir por:

•Tratamiento con solventes

•Tratamiento con pH

•Shock térmico

Se emplea en la inducción de autolisis en levaduras (pH 5,5 después de cultivar a 45-50ºC durante 24 Hs).

No se utiliza en E. coli.

Lisis por fagos

La lisis por fagos es un fenómeno bien conocido.

El agregado del bacteriófago T4 a un cultivo de E. coli produce la lisis efectiva del cultivo.

No se utiliza en escala industrial debido a que es muy difícil eliminar los fagos remanentes. Esto podría producir la lisis prematura del

cultivo en los siguientes lotes.

Métodos combinados:

Utilizan métodos que se complementan (tienen distintos targets) para aumentar la eficiencia de la ruptura.

Se puede pensar muchas combinaciones, las mas comunes:

1. Combinación métodos químicos/enzimaticos:EDTA + agente caotropico

EDTA + LisozimaLisozima + detergente

2. Combinación químico, enzimático con mecánico:EDTA + Lisozima+Homogeizador de alta presión

Métodos mas utilizados:

En el laboratorio:

•Sonicado

•Lisis química (kit comercial (BugBuster, B-PER) o

lisozima + detergente + EDTA)

Escala industrial

Homogeneizador: 600-800 bar, optimizar numero de pasajes.

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Ejemplos Bibliografía

Process-Scale disruption of Microorganisms. Biotechnology Advances,

Vol.13, N3, pp 491-551 1995.

Encyclopedia of Bioprocess Tech [Vols 1-5, Fermentation, Biocatalysis

and Bioseparation] - M. Flickinger, S. Drew (Wiley, 1999)