chronic exposure of hit cells to high glucose concentrations paradoxically decreases insulin gene...

8/7/2019 Chronic exposure of HIT cells to high glucose concentrations paradoxically decreases insulin gene transcription and

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R a p i d P u b l i c a t i o nC h r o n i c Exposure o f H I T C e l l s t o High GlucoseC o n c e n t r a t i o n s P a r a d o x i c a l l y Dec reases I n s u l i n G en e T r a n s c r i p t i o nand A l t e r s B i n d i n g o f I n s u l i n Gene Regulatory P r o t e i nL . K a r l O l s o n , * J . B r u c e R e d mo n, * H o w ar d C . T o w l e , and R . P a u l Robertson** D i ab e t e s C e nt e r a n d t h e D i v i s i o n o f E n d o c r i n o l o g y a n d M e t ab o l is m , D e p a r t m e n t o f M e d i c i n e , a n d t D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y andI n s t i t u t e o f H u m an G e n e t i c s , U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a M e d i c a l S c h o o l , M i n n e a p o l i s , M i n n e s o t a 5 5 4 5 5

A b s t r a c tC h r o n i c a l l y c u l t u r i n g H I T - T 1 5 c e l l s i n m e d i a c o n t a i n i n g h i g hg l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s l e a d s t o d e c r e a s e d i n s u l i n mRNA l e v e l s ,i n s u l i n c o n t e n t , a n d i n s u l i n s e c r e t i o n . T h e s e c h a n g e s c a n b ep r e v e n t e d b y c u l t u r i n g t h e c e l l s i n m e d i a c o n t a i n i n g l o w e r g l u -c o s e l e v e l s ( R o b e r t s o n , R . P . , H . - J . Z h a n g , K . L . P y z d r o w s k i ,a n d T . F . W a l s e t h . 1 9 9 2 . J . C l i n . I n v e s t . 9 0 : 3 2 0 - 3 2 5 ) . T h em e c h a n i s m o f t h i s s e e m i n g l y p a r a d o x i c a l p h e n o m e n o n w a s e x -a m i n e d b y t r a n s i e n t l y t r a n s f e c t i n g H IT c e l l s w i t h a c h l o r a m -p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C A T ) r e p o r t e r g e n e c o n t r o l l e d b yt h e 5 ' - r e g u l a t o r y d o m a i n o f t h e h u m a n i n s u l i n g e n e( I N S C A T ) . E a rl y p as s ag e s o f H IT c e l l s r e a d i l y e x p r e s s e dI N S C A T , w h e r e a s l a t e p a s s a g e s o f c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n1 1 . 1 mM g l u c o s e e x p r e s s e d o n l y 2 8 . 7 2 . 3 % (meanSEM) o ft h e CAT a c t i v i t y e x p r e s s e d i n e a r l y p a s s a g e s . I n c o n t r a s t , l a t ep a s s a g e s o f H IT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n 0 . 8 mM g l u c o s er e t a i n e d t h e a b i l i t y t o e x p r e s s t h e INSCAT r e p o r t e r g e n e t o6 9 . 6 1 0 . 0 % o f t h e CAT a c t i v i t y o b s e r v e d i n e a r l y p a s s a g e s .T h e d e c r e a s e i n INSCAT e x p r e s s i o n i n l a t e p a s s a g e s o f c e l l ss e r i a l l y c u l t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e w a s a s s o c i a t e d w i t h t h ei n a b i l i t y t o f o r m a s p e c i f i c n u c l e a r p r o t e i n - D N A c o m p l e x w i t ht h e CT m o t i f s o f t h e h u m a n i n s u l i n p r o m o t e r . F o r m a t i o n o f t h i ss p e c i f i c p r o t e i n - D N A c o m p l e x w a s p r e s e r v e d i n l a t e p a s s a g e so f HIT c e l l s w h e n s e r i a l l y c u l t u r e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e . M u t a -t i o n s o f t h e CT m o t i f s c a u s e d m a r k e d l y d i m i n i s h e d CAT a c t i v -i t y i n a l l p a s s a g e s e x a m i n e d . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t c h r o n i ce x p o s u r e o f t h e f c e l l t o h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s c a n p a r a -d o x i c a l l y d e c r e a s e i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n , i n p a r t , b y a l t e r -i n g t h e a b i l i t y o f a r e g u l a t o r y p r o t e i n ( G S T F ) t o i n t e r a c t w i t ht h e i n s u l i n g e n e p r o m o t e r . T h i s p r o v i d e s a p o t e n t i a l m e c h a n i s mf o r g l u c o t o x i c e f f e c t s o n t h e , c e l l a t t h e l e v e l o f t h e i n s u l i ng e n e . ( J . C l i n . I n v e s t . 1 9 9 3 . 9 2 : 5 1 4 - 5 1 9 . ) K e y w o r d s : g l u c o s et o x i c i t y * d i a b e t e s m e l l i t u s * t r a n s c r i p t i o n f a c t o rI n t r o d u c t i o nC h r o n i c h y p e r g l y c e m i a i n h u m a n s w i t h t y p e I I d i a b e t e s m e l l i -t u s ma y c o n t r i b u t e s e c o n d a r i l y t o d e f e c t i v e g l u c o s e - i n d u c e dA d d r e s s r e p r i n t r e q u e s t s t o L . K a r l O l s o n , P h . D . , T h e D i a b e t e s C e n t e r ,B o x 1 0 1 UMHC, U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a , M i n n e a p o l i s , MN 5 5 4 5 5 .R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 1 2 N o v e m b e r 1 9 9 2 a n d i n r e v i s e d f o r m 1 1M a r c h 1 9 9 3 .

i n s u l i n s e c r e t i o n , t h e s o - c a l l e d g l u c o s e t o x i c i t y t h e o r y ( r e -v i e w e d i n r e f e r e n c e s 1 a n d 2 ) . N o r m a l i z a t i o n o f b l o o d g l u c o s el e v e l s o f t y p e I I d i a b e t i c p a t i e n t s p a r t i a l l y r e s t o r e s d e f e c t i v ei n s u l i n r e l e a s e ( 3 - 7 ) , a n d n o r m a l i z a t i o n o f g l u c o s e l e v e l s i ns e v e r a l h y p e r g l y c e m i c a n i m a l m o d e l s l e a d s t o f u l l r e s t o r a t i o no f n o r m a l i n s u l i n s e c r e t i o n ( 8 - 1 0 ) . H o w e v e r , n o b i o c h e m i c a lm e c h a n i s m h a s b e e n i d e n t i f i e d f o r g l u c o t o x i c e f f e c t s o n t h ep a n c r e a t i c , 3 c e l l ( 2 ) . O u r p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s ( 1 1 ) s u g g e s t e dt h a t o n e p o t e n t i a l e x p l a n a t i o n c o u l d i n v o l v e a n a l t e r a t i o n i ni n s u l i n g e n e e x p r e s s i o n .T h e H I T - T 1 5 c e l l i s a c l o n a l p a n c r e a t i c , 3 c e l l l i n e d e r i v e df r o m S V - 4 0 t r a n s f e c t e d S y r i a n h a m s t e r p a n c r e a t i c i s l e t s ( 1 2 ) .T h i s c e l l l i n e s y n t h e s i z e s a n d r e l e a s e s i n s u l i n i n r e s p o n s e t op h y s i o l o g i c a l s e c r e t a g o g u e s i n c l u d i n g g l u c o s e ( 1 3 - 1 8 ) . How-e v e r , t h e HIT c e l l l o s e s i t s a b i l i t y t o s e c r e t e i n s u l i n w i t h i n -c r e a s i n g p a s s a g e ( 1 2 , 1 4 , 1 8 ) . R e c e n t l y , R o b e r t s o n e t a l . h a v es h o w n t h a t t h e l o s s o f i n s u l i n s e c r e t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h d e -c r e a s e d i n s u l i n c o n t e n t a n d i n s u l i n mRNA, a n d t h a t t h i s l o s sc a n b e p r e v e n t e d b y p a s s a g i n g HIT c e l l s i n l o w g l u c o s e ( 0 . 8m M ) r a t h e r t h a n t h e h i g h g l u c o s e ( 1 1 . 1 m M ) c o n c e n t r a t i o n su s u a l l y u s e d w h e n c u l t u r i n g t h e s e c e l l s ( 1 1 ) . T h e s t u d i e s r e -p o r t e d h e r e w e r e d e s i g n e d t o d e te r m in e w h e t he r a s e e m i n g l yp a r a d o x i c a l d e c r e a s e i n i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n m i g h t b e am e c h a n i s m t h r o u g h w h i c h c h r o n i c a l l y c u l t u r i n g HIT c e l l s i nh i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e s i n s u l i n c o n t e n t a n d i n -s u l i n m R NA.We s o u g h t t o a n s w e r t h r e e q u e s t i o n s : ( a ) D o e s s e r i a l l y p a s -s a g i n g HIT c e l l s i n h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s l e a d t o d e -c r e a s e d i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n ? ( b ) D o e s s e r i a l l y p a s s a g i n gHIT c e l l s i n a l o w g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n p r e s e r v e i n s u l i n g e n et r a n s c r i p t i o n ? ( c ) I s t h e r e e v i d e n c e f o r a l t e r e d a c t i v i t y o f i n s u -l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s t h a t m i g h t e x p l a i n t h e o b s e r v e dc h a n g e s i n i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n ?MethodsHIT c e l l c u l t u r e s . HIT c e l l s t o c k s w e r e r o u t i n e l y g r o w n a t 5 % C 0 2 /9 5 % a i r a t 3 7 ' C i n R P M I - 1 6 4 0 m e d i a c o n t a i n i n g 1 0 % F B S a n d 1 1 . 1mM g l u c o s e , a n d p a s s a g e d w e e k l y a f t e r t r y p s i n - E D T A d e t a c h m e n t( 1 8 ) . B e g i n n i n g a t p a s s a g e 7 0 , HIT c e l l s w e r e s p l i t w e e k l y a n d c o n t i n u -o u s l y c u l t u r e d i n R P M I - 1 6 4 0 c o n t a i n i n g e i t h e r 1 1 . 1 o r 0 . 8 mM g l u c o s et h r o u g h p a s s a g e 1 4 0 ( 1 1 ) . T h e s e c o n c e n t r a t i o n s w e r e c h o s e n b e c a u s et h e y s t i m u l a t e i n s u l i n r e l e a s e a t e i t h e r e x t r e m e o f t h e HIT c e l l i n s u l i nr e s p o n s e c u r v e ( 1 8 ) .P l a s m i d c o n s t r u c t s a n d o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s . T h e f o l l o w i n g o l i -g o d e o x y n u c l e o t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d b y t h e M i c r o c h e m i c a l F a c i l i t y ,I n s t i t u t e o f H uman G e n e t i c s , U n i v e r s i t y o f M i n n e s o t a .

514 L . K O l s o n , J . B . R e d m o n , H . C . T o w l e , a n d R . P . R o b e r t s o n

J . C l i n . I n v e s t . T h e A m e ri c a n S o c i e t y f o r C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n , I n c .0 0 2 1 - 9 7 3 8 / 9 3 / 0 7 / 0 5 1 4 / 0 6 $ 2 . 0 0V o l u m e 9 2 , J u l y 1 9 9 3 , 5 1 4 - 5 1 9


2/6

I n s ( - 3 2 6 / - 3 0 7 )I n s ( + l 1/ + 3 0 )I n s ( - 2 3 0 / - 2 0 1 )I n s m C T 2 ( - 2 3 0 / - 2 0 1 ) aI n s m C T 2 ( - 2 3 0 / - 2 0 1 ) bI n s ( - 2 4 9 / - 2 2 0 )I n s ( - 9 4 / - 6 5 )I n s m C T 1 ( - 9 4 / - 6 5 ) aI n s m C T l ( - 9 4 / - 6 5 ) b

5'-GCGTCTAGATCTCCTGGTCTAATGTGGAA-3'5'-GCGCTCGAGCTCTTCTGATGCAGCCTGTC-3'5'-GCGTCTAGACCCCTGGTTAAGACTCTAATGACCCGCTGG-3'3'-GGGGACCAATTCTGAGATTACTGGGCGACC-5'5'-CCCCTGGTTAAGACTACGCGTACCCGCTGGTCC-3'3'-GGGGACCAATTCTGATGCGCATGGGCGACCAGG-5'5'-GCGTCTAGAGACAGGTCTGGCCACCGGGCCCCTGGTTAA-3'3'-CTGTCCAGACCGGTGGCCCGGGGACCAATT-5'5'-CCACCCCAGGCCCTAATGGGCCAG-3'3'-GGTGGGGTCCGGGATTACCCGGTCCGCCGT-5'5'-CCACCCCAGGCCGCGCGCGGCCAGGCGGCA-3'3'-GGTGGGGTCCGGCGCGCGCCGGTCCGCCGT-5'

T h e p l a s m i d I N S C A T , c o n t a i n i n g t h e human i n s u l i n g e n e s e -q u e n c e s - 3 2 6 t o + 3 0 , w a s c o n s t r u c t e d a s f o l l o w s . T h e s e q u e n c e s f r o m- 3 2 6 t o + 3 0 w e r e a m p l i f i e d b y PCR u s i n g o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e sI n s ( -3 2 6 / - 3 0 7 ) a n d I n s ( + l l / + 3 0 ) a s p r i m e r s a n d p h i n s 3 0 0 p l a s -m i d c o n t a i n i n g t h e human i n s u l i n g e n e ( a g i f t f r o m D r . G r a e m e I . B e l l ,H o w a r d H u g h e s M e d i c a l I n s t i t u t e a n d t h e U n i v e r s i t y o f C h i c a g o ) a s at e m p l a t e . X b a I a n d X h o I s i t e s w e r e p r e s e n t o n t h e 5 ' - a n d 3 ' - e n d s o f t h ep r i m e r s u s e d f o r P C R , r e s p e c t i v e l y . T h i s DNA f r a g m e n t w a s c l e a v e dw i t h X b a I a n d X h o I a n d t h en s u b c lo n e d i n t o t h e X b a I a n d X h o I s i t e so f p C A T ( A n ) , a p r o m o t e r l e s s p l a s m i d c o n t a i n i n g t h e b a c t e r i a l c h l o r -a m p h e n i c o l a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C A T ) ' g e n e ( 1 9 ) .P l a s m i d s c o n t a i n i n g m u t a t i o n s i n t h e CT m o t i f s o f t h e i n s u l i n p r o -m o t e r r e g i o n w e r e c o n s t r u c t e d b y a P C R - b a s e d m u t a g e n e s i s t e c h n i q u e .T h e mCT2CAT p l a s m i d w a s c o n s t r u c t e d b y PCR a m p l i f i c a t i o n o f s e -q u e n c e s - 3 2 6 t o - 2 0 1 a n d s e q u e n c e s - 2 3 0 t o + 3 0 u s i n g o l i g o d e o x y n u -c l e o t i d e s I n s ( - 3 2 6 / - 3 0 7 ) a n d I n s m C T 2 ( - 2 3 0 / - 2 0 1 ) b a n d u s i n gI n s ( + 1 1 / + 3 0 ) a n d I n s m C T 2 ( - 2 3 0 / - 2 0 1 ) a a s p r i m e r s , r e s p e c t i v e l y ,a n d INSCAT a s t h e t e m p l a t e . T h e I n s m C T 2 ( - 2 3 0 / - 2 0 1 ) o l i g o d e o x y -n u c l e o t i d e h a s a M l u I s i t e , r e p l a c i n g t h e n a t i v e i n s u l i n g e n e s e q u e n c e sa t - 2 1 5 / - 2 1 0 . T h e - 3 2 6 t o - 2 0 1 PCR p r o d u c t w a s t he n c l e a v e d w i t hX b a I a n d M l u l , w h i l e t h e - 2 3 0 t o + 3 0 PCR p r o d u c t w a s c l e a v e d w i t hX h o I a n d M l u I . T h e s e PCR p r o d u c t s w e r e t h e n s i m u l t a n e o u s l y s u b -c l o n e d i n t o t h e X b a I a n d X h o I s i t e s o f p C A T ( A n ) . T h e mCTlCATp l a s m i d w a s c o n s t r u c t e d b y PCR a m p l i f i c a t i o n o f s e q u e n c e s - 3 2 6 t o- 6 5 a n d s e q u e n c e s - 9 4 t o + 3 0 u s i n g o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e sI n s ( - 3 2 6 / - 3 0 7 ) a n d I n s m C T l ( - 9 4 / - 6 5 ) b a n d u s i n g I n s ( + l l /+ 3 0 ) a n d I n s m C T l ( - 9 4 / - 6 5 ) a a s p r i m e r s , r e s p e c t i v e l y , a n d I N S -CAT a s t h e t e m p l a t e . T h e I n s m C T 1 ( - 9 4 / - 6 5 ) o l i g o d e o x y n u c l e o t i d eh a s a B s s H I I s i t e r e p l a c i n g t h e n a t i v e i n s u l i n g e n e s e q u e n c e s a t - 8 2 /- 7 7 . T h e - 3 2 6 t o - 6 5 PCR p r o d u c t w a s t h e n c l e a v e d w i t h X b aI a n dB s s H I I , w h i l e t h e - 9 4 t o + 3 0 PCR p r o d u c t w a s c l e a v e d w i t h X h o I a n dB s s H I I . T h e s e PCR p r o d u c t s w e r e t h e n s u b c l o n e d i n t o t h e X b a I a n dX h o I s i t e s o f p C A T ( A n ) . T h e mCTlCT2CAT p l a s m i d w a s c o n -s t r u c t e d b y t h e s a m e m e t h o d a s f o r t h e m CT 1 C A T p l a s m i d e x c e p t t h a tt h e mCT2CAT p l a s m i d w a s u s e d a s t h e DNA t e m p l a t e d u r i n g P C R .P r o p e r i n s e r t i o n a n d c o n f i r m a t i o n o f s e q u e n c e f o r a l l v e c t o r s w e r ed e t e r m i n e d b y d i d e o x y s e q u e n c i n g .C e l l t r a n s f e c t i o n s a n d CAT a s s a y . HIT c e l l s w e r e s u b c u l t u r e d i nRPMI- 1 6 4 0 c o n t a i n i n g 1 1 . 1 mM g l u c o s e a t a d e n s i t y o f 1 . 2 x 1 0 6 c e l l sp e r w e l l i n 6 - w e l l p l a t e s ( d i a m e t e r 3 . 5 c m ) 2 d b e f o r e e a c h s t u d y . D u p l i -c a t e w e l l s o f c e l l s w e r e t h e n t r a n s f e c t e d w i t h 0 . 5 t o 1 . 0 u g o f INSCATD N A o r 0 . 1 t o 0 . 5 u g o f RSVCAT DNA b y a l i p o s o m e - m e d i a t e dm e t h o d ( L i p o f e c t i n ; B R L , G a i t h e r s b u r g , MD). A l l t r a n s f e c t i o n s a n ds u b s e q u e n t i n c u b a t i o n s w e r e d o n e i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e . C e l l s w e r er i n s e d w i t h F B S - f r e e R P M I - 1 6 4 0 , t h e n 1 m l o f F B S - f r e e R P M I - 1 6 4 0c o n t a i n i n g 1 : 4 ( w t : w t ) p l a s m i d DNA t o l i p o f e c t i n w a s a dd e d a n d c e l l sw e r e i n c u b a t e d f o r 5 h a t 3 7 C , a f t e r w h i c h 2 m l R P M I - 1 6 4 0 c o n t a i n -i n g 1 5 % F B S w a s a d d e d . 3 0 h a f t e r t r a n s f e c t i o n , c e l l s w e r e h a r v e s t e da n d CAT a c t i v i t y w a s a s s a y e d ( 2 0 ) . D a t a a r e e x p r e s s e d a s r e l a t i v e I N S -

1 . A b b r e v i a t i o n s u s e d i n t h i s p a p e r : C A T , c h l o r a m p h e n i c o l a c e t y lt r a n s f e r a s e ; EMSA, e l e c t r o p h o r e t i c s h i f t a s s a y ; G S T F , g l u c o s e - s e n s i t i v et r a n s c r i p t i o n f a c t o r .

CAT t o RSVCAT e x p r e s s i o n t o c o n t r o l f o r v a r i a b i l i t y i n t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y o b s e r v e d b e t w e e n c e l l s c u l t u r e d i n l o w a n d h i g h g l u c o s e c o n -c e n t r a t i o n s .N u c l e a r e x t r a c t s a n d e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y s h i f t a s s a y ( E M S A ) .N u c l e a r e x t r a c t s w e r e m a d e f r o m v a r i o u s HIT c e l l p a s s a g e s a c c o r d i n gt o m e t h o d s o r i g i n a l l y d e s c r i b e d b y D i g n a m e t a l . ( 2 1 ) a n d m o d i f i e d b yA b m a y r a n d Workman ( 2 2 ) . O l i g o d e o x y n u c l e o t i d e s I n s ( - 2 3 0 /- 2 0 1 ) , I n s ( - 2 4 9 / - 2 2 0 ) , a n d I n s ( - 9 4 / - 6 5 ) w e r e a n n e a l e d a n d t h e nl a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] d C T P b y f i l l i n g o v e r h a n g i n g 5 ' - e n d s w i t h t h e l a r g ef r a g m e n t o f D N A p o l y m e r a s e 1 . B i n d i n g r e a c t i o n s a n d e l e c t r o p h o r e s i sw e r e p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d b y S h i h a n d T o w l e ( 2 3 ) e x c e p t t h a t 0 . 3 M go f p o l y ( d I - d C ) a n d p o l y ( d A - d T ) w e r e u s e d a s n o n s p e c i f i c c o m p e t i t o r si n t h e b i n d i n g r e a c t i o n s .R e s u l t sI n s u l i n g e n e p r o m o t e r a c t i v i t y i n H IT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i ne i t h e r 1 1 . 1 m M o r 0 . 8 m M g l u c o s e . I n s u l i n g e n e p r o m o t e r a c t i v -i t y i n e a r l y a n d l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e di n 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e w a s a s s e s s e d b y t r a n s i e n t l yt r a n s f e c t i n g t h e c e l l s w i t h a CAT r e p o r t e r g e n e c o n t r o l l e d b yt h e 5 ' - r e g u l a t o r y d o m a i n ( - 3 2 6 t o + 3 0 ) o f t h e human i n s u l i ng e n e . HIT c e l l s f r o m p a s s a g e 7 3 t o 7 6 c u l t u r e d i n 1 . 1 mMg l u c o s e r e a d i l y e x p r e s s e d CAT a c t i v i t y w h e n t r a n s i e n t l y t r a n s -f e c t e d w i t h e i t h e r INSCAT o r RSVCAT ( T a b l e I ) . I n e a r l yp a s s a g e s o f HIT c e l l s t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f INSCAT t oRSVCAT w a s 1 . 0 2 0 . 0 2 . T h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f INSCATt o RSVCAT w a s 0 . 2 9 0 . 0 2 f o r l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c u l -t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e . T h e d e c r e a s e i n r e l a t i v e CAT a c t i v -i t y o b s e r v e d i n t h e l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c u l t u r e d i n 1 1 . 1mM g l u c o s e a p p e a r s t o b e s p e c i f i c f o r INSCAT e x p r e s s i o n ,s i n c e RSVCAT e x p r e s s i o n w a s t h e s a m e f o r b o t h e a r l y a n d l a t ep a s s a g e s o f HIT c e l l s ( T a b l e I ) .C o m p a r e d w i t h l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l -t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e , c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n 0 . 8 mMg l u c o s e e x p r e s s e d 2 . 4 - f o l d ( P < 0 . 0 0 5 , n = 5 ) m o r e r e l a t i v eCAT a c t i v i t y w h e n t r a n s f e c t e d w i t h INSCAT ( T a b l e I ) . I n l a t ep a s s a g e s o f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e , i n s u -l i n p r o m o t e r a c t i v i t y w a s s h o w n t o b e 6 9 . 6 1 0 . 0 % c o m p a r e dw i t h e a r l y p a s s a g e s o f c e l l s ( T a b l e I ) . When e a r l y a n d l a t e p a s -s a g e s o f HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n e i t h e r I 1 . 1 mM o r 0 . 8mM g l u c o s e w e r e c o t r a n s f e c t e d w i t h b o t h INSCAT a n d a R S V -d r i v e n l u c i f e r a s e r e p o r t e r c o n s t r u c t , t o c o n t r o l f o r t r a n s f e c t i o ne f f i c i e n c y , q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r r e s u l t s t o t h o s e d e s c r i b e d i n T a -b l e I w e r e o b s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T he s e d a t a s u g g e s t t h a tl a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n 0 . 8 mM g l u -c o s e h a v e p r e s e r v e d i n s u l i n p r o m o t e r a c t i v i t y , w h i c h may e x -p l a i n t h e p r e s e r v a t i o n o f b o t h i n s u l i n mRNA a n d i n s u l i n c o n -t e n t ( 1 1 ) .

P a r a d o x i c a l G l u c o s e R e g u l a t i o n o f I n s u l i n G e n e T r a n s c r i p t i o n 5 1 5


3/6

T a b l e I . E x p r e s s i o n ofINSCATand RSVCAT i n E a r l y P a s s a g e s a n d L a t e P a s s ag e s o f H IT C e l l s S e r i a l l y P a s s a g e d i n E i t h e r 1 1 . 1 mM o r0 . 8 mM G l u c o s eP 7 0 1 . 1 m M g l u c o s e P 1 3 0 1 1 . 1 mM g l u c o s e P I 3 0 0 . 8 mM g l u c o s e

P e r c e n t c o n v e r s i o n I N S C A T : P e r c e n t c o n v e r s i o n I N S C A T : P e r c e n t c o n v e r s i o n I N S C A T :E x p e r i m e n t INSCAT RSVCAT RSVCAT INSCAT RSVCAT RSVCAT INSCAT RSVCAT RSVCAT

1 5 . 2 5 . 3 0 . 9 8 1 . 5 4 . 0 0 . 3 8 1 3 . 7 2 5 . 8 0 . 5 32 5 . 3 5 . 0 1 . 0 6 0 . 8 2 . 9 0 . 2 8 1 0 . 8 1 7 . 0 0 . 6 43 5 . 8 5 . 6 1 . 0 4 1 . 1 3 . 9 0 . 2 8 1 7 . 7 1 6 . 5 1 . 0 74 4 . 9 4 . 6 1 . 0 5 1 . 5 5 . 1 0 . 3 0 1 2 . 0 1 5 . 4 0 . 7 65 4 . 4 4 . 5 0 . 9 6 1 . 4 6 . 1 0 . 2 3 1 1 . 0 2 0 . 9 0 . 5 3

MeanSE 5 . 1 0 . 2 5 . 0 0 . 2 1 . 0 2 0 . 0 2 1 . 3 0 . 1 4 . 4 0 . 6 0 . 2 9 0 . 0 2 * 1 3 . 0 1 . 3 1 9 . 1 1 . 9 0 . 6 9 0 . 1 0 P e r c e n t c o n v e r s i o n r e p r e s e n t s t h e m e a n o f d u p l i c a t e t r a n s f e c t i o n s f o r e a c h HIT c e l l p a s s a g e . * P < 0 . 0 0 1 , s i g n i f i c a n c e o f r e l a t i v e INSCATt o RSVCAT e x p r e s s i o n b e t w e e n e a r l y a n d l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e . Y P < 0 . 0 0 5 , s i g n i f i c a n c e o f r e l a t i v eINSCAT t o RSVCAT e x p r e s s i o n b e t w e e n l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n e i t h e r 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e .

A l t e r a t i o n i n i n s u l i n g e n e 5 ' - r e g u l a t o r y d o m a i n b i n d i n gp r o t e i n s i n HIT c e l l s s e r i a l l y c u l t u r e d i n 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mMg l u c o s e . To d e t e r m i n e w h e t h e r d e c r e a s e d i n s u l i n p r o m o t e r a c -t i v i t y m i g h t b e a s s o c i a t e d w i t h a l t e r e d a c t i v i t y o f t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s t h a t i n t e r a c t w i t h i n s u l i n g e n e r e g u l a t o r y s e q u e n c e s ,n u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d f r o m e a r l y p a s s a g e s ( 7 4 a n d 8 0 )a n d l a t e p a s s a g e s ( 1 1 9 a n d 1 3 3 ) o f HIT c e l l s c u l t u r e d e i t h e r i n1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e . EMSAs w e r e t h e n p e r f o r m e dw i t h t w o o v e r l a p p i n g s e q u e n c e s , - 2 4 9 / - 2 2 0 a n d - 2 3 0 /- 2 0 1 , o f t h e human i n s u l i n p r o m o t e r . T h e human i n s u l i n p r o -m o t e r s e q u e n c e - 2 4 9 / - 2 2 0 c o n t a i n s a s t r o n g p o s i t i v e r e g u l a -t o r y e l e m e n t ( 2 4 ) , w h i l e s e q u e n c e s - 2 3 0 / - 2 0 1 h a v e b e e ns h o w n t o b i n d t h e 3 c e l l s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ,I U F - l ( 2 5 ) .W i t h a n o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e p r o b e c o n t a i n i n g s e q u e n c e s- 2 3 0 / - 2 0 1 o f t h e human i n s u l i n g e n e , a t l e a s t 5 D N A - p r o t e i nc o m p l e x e s w e r e d e t e c t e d when u s i n g n u c l e a r e x t r a c t s f r o me a r l y p a s s a g e s o f c e l l s ( F i g . 1 A , l a n e 2 ) . Of t h e s e , o n e p r o m i -n e n t D N A - p r o t e i n c o m p l e x w a s a b s e n t i n n u c l e a r e x t r a c t sf r o m l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c u l t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e( F i g . 1 A , l a n e 3 ) . I n c o n t r a s t , n u c l e a r e x t r a c t s made f r o m l a t e rp a s s a g e s o f c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e r e t a i n e dt h e a b i l i t y t o f o r m t h i s D N A - p r o t e i n c o m p l e x ( F i g . 1 A , l a n e4 ) . T h e s p e c i f i c i t y o f t h e D N A - p r o t e i n c o m p l e x e s f o r m e d w i t ht h e d i f f e r e n t e x t r a c t s w a s d e t e r m i n e d b y u s e o f a n e x c e s s o fu n l a b e l e d DNA f r o m - 2 3 0 / - 2 0 1 t o c o m p e t e f o r b i n d i n g ( F i g .1 A , l a n e s 5 - 7 ) . T h is s l ow m o b i l i t y c o m p l e x , p r e s e n t i n e a r l yp a s s a g e s a n d l a t e p a s s a g e s o f c e l l s c u l t u r e d i n 0 . 8 mM g l u c o s ea n d a b s e n t i n l a t e p a s s a g e s o f c e l l s c u l t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u -c o s e , i s d e s i g n a t e d a s t h e g l u c o s e - s e n s i t i v e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r( G S T F ) . To v a l i d a t e t h a t t h e l o s s o f a s p e c i f i c DNA b i n d i n gp r o t e i n i n n u c l e a r e x t r a c t s f r o m HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n0 . 8 mM g l u c o s e w a s n o t d u e t o a n a b e r r a t i o n o f t h e n u c l e a re x t r a c t i o n , we t e s t e d t h e v a r i o u s p r e p a r a t i o n s f o r a c t i v i t y o f t h eu b i q u i t o u s MLTF n u c l e a r f a c t o r . A l l t h e H IT c e l l n u c l e a r e x -t r a c t i o n s s h i f t e d a n MLTF DNA p r o b e t o t h e same e x t e n t( d a t a n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t a l l t h e n u c l e a r p r e p a r a t i o n sw e r e a c t i v e . F u r t h e r m o r e , s e v e r a l o t h e r n u c l e a r f a c t o r s b i n d i n gt o t h e - 2 3 0 / - 2 0 1 f r a g m e n t w e r e a l s o u n c h a n g e d i n t h e d i f f e r -e n t p r e p a r a t i o n s ( F i g . 1 A ) .T h e o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e p r o b e c o n t a i n i n g t h e s e q u e n c e s- 2 4 9 / - 2 2 0 o f t h e human i n s u l i n g e n e was u s e d t o s e a r c h f o r

c h a n g e s i n o t h e r DNA b i n d i n g p r o t e i n s f r o m HIT c e l l s p a s -s a g e d e i t h e r i n 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e . N u c l e a r e x t r a c t sf r o m e a r l y a n d l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n1 1 . 1 o r 0 . 8 mM g l u c o s e s h i f t e d t h i s o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e t ot h e s a m e e x t e n t ( F i g . 1 B ) . T h e s e d a t a d e m o n s t r a t e t h a t t h ed i f f e r e n c e s i n INSCAT e x p r e s s i o n i n t h e e a r l y a n d l a t e p a s s a g e so f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n e i t h e r 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM

A . - 2 3 o - 2 o 1C o m p e t i t o r : n o n e w i A d t p e m u t a n t

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0_ _ _o

*igh.--IADB . - o / - 2 2 o

n o n e1 2 3 4

F i g u r e 1 . A n a l y s i s o f p r o t e i n b i n d i n g t o t h e i n s u l i n p r o m o t e r s e -q u e n c e s f r o m - 2 3 0 t o - 2 0 1 a n d - 2 4 9 t o - 2 2 0 u s i n g n u c l e a r e x t r a c t sf r o m a n e a r l y p a s s a g e a n d l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e di n e i t h e r 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e . ( A ) E M S A u s i n g 3 2 P - l a b e l e di n s u l i n p r o m o t e r s e q u e n c e - 2 3 0 t o - 2 0 1 . L a n e 1 , f r e e p r o b e ; l a n e s2 , 5 , 8 , n u c l e a r e x t r a c t f r o m HIT c e l l p a s s a g e 7 4 ; l a n e s 3 , 6 , 9 , n u c l e a re x t r a c t f r o m HIT c e l l p a s s a g e 1 3 3 s e r i a l l y p a s s a g e d i n 1 1 . 1 mM g l u -c o s e ; l a n e s 4 , 7 , 1 0 , n u c l e a r e x t r a c t s f r o m HIT c e l l s p a s s a g e 1 3 3 s e r i a l l yp a s s a g e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e . C o m p e t i t o r a d d e d , l a n e s 5 - 7 , 1 0 0 - f o l dm o l a r e x c e s s o f u n l a b e l e d w i l d t y p e s e q u e n c e - 2 3 0 t o - 2 0 1 ; l a n e s8 - 1 0 , 1 0 0 - f o l d m o l a r e x c e s s o f u n l a b e l e d m u t a t e d - 2 3 0 t o - 2 0 1 .A r r o w i n d i c a t e s D N A - p r o t e i n c o m p l e x p r e s e n t i n e a r l y p a s s a g e s o fHIT c e l l s a n d l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c u l t u r e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e ,b u t n o t i n l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c u l t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e .( B ) E M S A u s i n g 3 2 P - l a b e l e d i n s u l i n p r o m o t e r s e q u e n c e - 2 4 9 t o- 2 2 0 . L a n e 1 , f r e e p r o b e ; l a n e s 2 - 4 , n u c l e a r e x t r a c t s f r o m HIT c e l lp a s s a g e 7 4 a n d p a s s a g e 1 3 3 s e r i a l l y p a s s a g e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e a n d0 . 8 mM g l u c o s e , r e s p e c t i v e l y . T h i s f i g u r e r e p r e s e n t s r e s u l t s o b s e r v e df o r t w o i n d e p e n d e n t n u c l e a r e x t r a c t i o n s f r o m e a c h HIT c e l l p a s s a g ed e s c r i b e d . T h e s e d a t a a l s o r e p r e s e n t a minimum o f t h r e e i n d e p e n d e n te x p e r i m e n t s p e r c o n d i t i o n ( n = 3 ) .

5 1 6 L . K . O l s o n , J . B . R e d m o n , H . C . T o w l e , a n d R . P . R o b e r t s o n


4/6

g l u c o s e a r e n o t d u e t o c h a n g e s i n t h e b i n di n g o f n u c l e a r f a c t o r st o t h i s s t r o n g e n h a n c e r e l e m e n t .T h e CT 2 m o t i f (CTAATG) l o c a t e d a t - 2 1 5 / - 2 1 0 o f t h ehuman i n s u l i n p r o m o t e r h a s p r e v i o u s l y b e e n s h o w n t o b e t h eb i n d i n g s i t e f o r a t r a n s c r i p t i o n f a c t o r , I U F - 1 ( 2 5 ) . To t e s tw h e t h e r t h i s s e q u e n c e m i g h t b e a s i t e f o r b i n d i n g o f G S T F , t h es e q u e n c e CTAATG w a s m u t a t e d t o ACGCGT i n t h e - 2 3 0 /- 2 0 1 o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e . T h i s m u t a t e d o l i g o d e o x y n u c l e o -t i d e n o l o n g e r c o m p e t e d f o r t h e s p e c i f i c D N A - p r o t e i n c o m p l e xt h a t w a s o n l y p r e s e n t i n t h e e a r l y p a s s a g e s c e l l s a n d l a t e p a s -s a g e s o f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e ( F i g . 1 A ,l a n e s 8 - J 1 0 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t GSTF b i n d s t o t h e I U F - 1b i n d i n g s i t e .S i n c e GSTF a p p e a r e d t o b i n d t h e CT2 m o t i f , t h e n u c l e a re x t r a c t s f r o m t h e v a r i o u s HIT c e l l p a s s a g e s w e r e t e s t e d f o r b i n d -i n g t o a n o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e c o n t a i n i n g t h e s e q u e n c e s - 9 4 /- 6 5 o f t h e human i n s u l i n g e n e . T h i s o l i g o d e o x y n u c l e o t i d ep r o b e c o n t a i n s t h e C T l m o t i f (CTAATG), l o c a t e d a t - 8 2 /-77 o f t h e human i n s u l i n p r o m o t e r , w h i c h h a s b e e n s h o w n t ob e a n a d d i t i o n a l b i n d i n g s i t e f o r I U F - 1 ( 2 5 ) . W i t h t h e - 9 4 /- 6 5 o l i g o d e o x y n u c l e o t i d e p r o b e , o n e p r o m i n e n t D N A - p r o -t e i n c o m p l e x w a s o b s e r v e d w i t h n u c l e a r e x t r a c t s f r o m p a s s a g e7 4 c e l l s ( F i g . 2 , l a n e 2 ) . N u c l e a r e x t r a c t s f r o m p a s s a g e 1 3 3 H ITc e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e w e r e u n a b l e t of o r m t h i s D N A - p r o t e i n c o m p l e x ( F i g . 2 , l a n e 3 ) . I n c o n t r a s t ,n u c l e a r e x t r a c t s f r o m p a s s a g e 1 3 3 HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l -t u r e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e r e t a i n e d t h e a b i l i t y t o f o r m t h i s DNA-p r o t e i n c o m p l e x ( F i g . 2 , l a n e 4 ) . T h e s p e c i f i c i t y o f t h e DNA-p r o t e i n c o m p l e x f o r m e d w i t h n u c l e a r e x t r a c t s f r o m HIT c e l l

- 9 4 / 6 5C o m p e t i t o r : n o n e w i l d t y p e

___________________ 50x 1 O O x

1 2 3 4 5 6

m u t a n t - 2 3 0 1 - 2 0 15 0 x 1 O O x 5 0 x 1 O O x7 8 9 1 0

p a s s a g e 7 4 w a s d e t e r m i n e d b y u s i n g a n e x c e s s o f u n l a b e l e d- 9 4 / - 6 5 d e o x y n u c l e o t i d e p r o b e t o c o m p e t e f o r b i n d i n g ( F i g .2 , l a n e s 5 , 6 ) .T h e p r o t e i n -D N A c o m p l e x f o r m e d w i t h t h e HIT c e l l p a s -s a g e 7 4 n u c l e a r e x t r a c t a n d t h e - 9 4 / - 6 5 o l i g o d e o x y n u c l e o t i d ew a s d i r e c t l y c o m p e t e d b y t h e a d d i t i o n o f e x c e s s u n l a b e l e d- 2 3 0 / - 2 0 1 DNA ( F i g . 2 , l a n e s 9 , 1 0 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a tt h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r e s e n t i n n u c l e a r e x t r a c t s f r o m p a s -s a g e 7 4 HIT c e l l s a n d p a s s a g e 1 3 3 HIT c e l l s c u l t u r e d i n 0 . 8 mMg l u c o s e , b u t a b s e n t i n p a s s a g e 1 3 3 HIT c e l l s c u l t u r e d i n 1 1 . 1mM g l u c o s e , w h i c h b i n d s t o - 9 4 / - 6 5 p r o b e , may b e r e l a t e d t oG S T F . To f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h i s p o s s i b i l i t y , t h e CT1 m o t i f( - 8 2 / - 7 7 , CTAATG) c o n t a i n e d w i t h i n t h e - 9 4 / - 6 5 o l i g o -d e o x y n u c l e o t i d e p r o b e w a s m u t a t e d t o G C G C G C a n d t e s t e df o r i t s a b i l i t y t o c o m p e t e f o r n u c l e a r e x t r a c t b i n d i n g t o t h e w i l dt y p e - 9 4 / - 6 5 d e o x y n u c l e o t i d e p r o b e . T h i s m u t a t e d o l i g o -d e o x y n u c l e o t i d e n o l o n g e r c o m p e t e d f o r t h e s p e c i f i c DNA-p r o t e i n c o m p l e x p r e s e n t i n p a s s a g e 7 4 HIT c e l l s ( F i g . 2 , l a n e s7 , 8 ) . O v e r a l l t h e s e d a t a s u g g e s t t h a t GSTF b i n d s t o t h e CTm o t i f s , w h i c h h a v e b e e n p r e v i o u s l y s h o w n t o b i n d I U F - 1 .

M u t a t i o n s o f GSTF b i n d i n g s i t e s w i t h i n S ' - r e g u l a t o r y d o -m a in o f t h e h u m a n i n s u l i n g e n e l e a d t o d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o fINSCA T r e p o r t e r g e n e . To t e s t w h e t h e r t h e l o s s o f GSTF c o r r e -l a t e s t o t h e d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f INSCAT i n l a t e p a s s a g e s o fHIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e , s i t e - d i r e c t e dm u t a t i o n s o f t h e GSTF b i n d i n g s i t e s w i t h i n t h e INSCAT v e c -t o r w e r e c o n s t r u c t e d a n d t e s t e d i n t h e v a r i o u s HIT c e l l p a s -s a g e s . T h r e e m u t a n t INSCAT v e c t o r s w e r e c o n s t r u c t e d ;mCT2CAT i n w h i c h t h e CT 2 m o ti f w a s m u t a t e d t o ACGCGT,m CT 1 CAT i n w h i c h t h e CT I m o t i f w a s m u t a t e d t o GCGCGC,a n d mCTlCT2CAT i n w h i c h t h e C T l a n d CT2 m o t i f s w e r em u t a t e d t o GCGCGC a n d ACGCGT, r e s p e c t i v e l y . T h e e x -p r e s s i o n o f t h e mCTlCT2CAT v e c t o r , i n w h i c h b o t h GSTFb i n d i n g s i t e s w e r e m u t a t e d , i s m a r k e d l y d e c r e a s e d i n e a r l y p a s -s a g e s o f HIT c e l l s a n d i n l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l s c u l t u r e d i ne i t h e r 1 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e ( F i g . 3 ) . M u t a t i o n o f t h ei n d i v i d u a l GSTF b i n d i n g s i t e s (mCTlCAT o r mCT2CAT)a l s o t e n d e d t o d e c r e a s e CAT e x p r e s s i o n i n a l l HIT c e l l p a s -s a g e s , b u t t h e s e e f f e c t s w e r e n o t a l w a y s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t .T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t t h e GSTF b i n d i n g s i t e s p r e s e n t w i t h i nt h e 5 ' - r e g u l a t o r y d o m a i n o f t h e human i n s u l i n g e n e p l a y af u n c t i o n a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o na n d t h a t t h e l o s s o f GSTF b i n d i n g l e a d s t o d e c r e a s e d i n s u l i ng e n e t r a n s c r i p t i o n .

F i g u r e 2 . A n a l y s i s o f p r o t e i n b i n d i n g t o i n s u l i n p r o m o t e r s e q u e n c e sf r o m - 9 4 t o - 6 5 u s i n g n u c l e a r e x t r a c t s f r o m a n e a r l y a n d l a t e p a s s a g eo f HIT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n e i t h e r I 1 . 1 mM o r 0 . 8 mM g l u c o s e .L a n e 1 , f r e e p r o b e ; l a n e s 2 , 5 - 1 0 , n u c l e a r e x t r a c t f r o m HIT c e l l p a s -s a g e 7 4 ; l a n e 3 , n u c l e a r e x t r a c t f r o m HIT c e l l p a s s a g e 1 3 3 s e r i a l l yp a s s a g e d i n 1 1 . 1 mM g l u c o s e ; l a n e 4 , n u c l e a r e x t r a c t f r o m HIT c e l lp a s s a g e 1 3 3 s e r i a l l y p a s s a g e d i n 0 . 8 mM g l u c o s e . C o m p e t i t o r a d d e d ,l a n e s 5 - 6 , 5 0 - a n d 1 0 0 - f o l d e x c e s s o f u n l a b e l e d w i l d t y p e - 9 4 / - 6 5 ;l a n e s 7 - 8 , 5 0 - a n d 1 0 0 - f o l d m o l a r e x c e s s o f u n l a b e l e d m u t a t e d - 9 4 /- 6 5 ; l a n e s 9 - 1 0 , 5 0 - a n d 1 0 0 - f o l d m o l a r e x c e s s o f u n l a b e l e d - 2 3 0 /- 2 0 1 .

D i s c u s s i o nI n e x p e r i m e n t s d e s i g n e d t o e x a m i n e p o t e n t i a l l y a d v e r s e e f f e c t so f h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s o n i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n ,w e f o u n d t h a t t h e a c t i v i t y o f t h e i n s u l i n g e n e p r o m o t e r i s d e -c r e a s e d i n H IT c e l l s s e r i a l l y p a s s a g e d i n m a x i m a l l y s t i m u l a t o r yc o n c e n t r a t i o n s o f g l u c o s e . T h i s c an b e p a r t i a l l y p r e v e n t e d b yc u l t u r i n g HIT c e l l s i n a l o w e r g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n . T h ec h a n g e s i n t h e a c t i v i t y o f t h e i n s u l i n p r o m o t e r c o r r e l a t e w i t hc h a n g e s i n i n s u l i n mRNA l e v e l s f o r t h e d i f f e r e n t HIT c e l l p a s -s a g e s ( 1 1 ) . T h e o b s e r v a t i o n t h a t c h r o n i c e x p o s u r e o f HIT c e l l st o h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n l e a d s t o d e c r e a s e d i n s u l i n g e n ee x p r e s s i o n r e p r e s e n t s a n a p p a r e n t t i m e - r e l a t e d p a r a d o x . A c u t ei n c r e a s e s i n g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s h a v e b e e n s h o w n t o i n -c r e a s e i n s u l i n mRNA l e v e l s ( 2 6 - 3 0 ) b y b o t h s t a b i l i z i n g i n s u l i nm e s s a g e ( 3 0 ) a n d i n c r e a s i n g t h e r a t e a t w h i c h t h e i n s u l i n g e n e


40 4 0 - 4 0 lo


5/6

I .4 4c

4A .

1. 0 -

0 0 . 8_ : w 0 . 8u x:w 0 . 4c l u 0 4 6

0 . 2 -0 . 0 -PASSAGE:

TT

68- 73 1 3 1 - 1 3 2 1 3 1 - 1 3 2

* I N S C A T* mCT1 CAT| mCT2CATS mCT1CT2CAT

[GLUCOSE]: 1 1 . 1 m M 1 1 . 1 mM 0 . 8 m MF i g u r e 3 . F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f t h e CT m o t i f s c o n t a i n e d w i t h i n t h ehuman i n s u l i n g e n e p r o m o t e r . E a r l y a n d l a t e p a s s a g e s o f HIT c e l l ss e r i a l l y p a s s a g e d i n 1 1 . 1 mM a n d 0 . 8 mM g l u c o s e w e r e t r a n s i e n t l yt r a n s f e c t e d w i t h INSCAT v e c t o r s w i t h e i t h e r t h e CT1 ( m C T l C A T ) ,CT2 ( m C T 2 C A T ) , o r b o t h t h e C T l a n d CT2 (mCTlCT2CAT) m o -t i f s m u t a t e d . T h e s e q u e n c e CTAATG w a s m u t a t e d t o G CG CG C a n dACGCGT f o r t h e C T l a n d CT 2 m o t i f s , r e s p e c t i v e l y . T h e r e l a t i v ee x p r e s s i o n o f t h e INSCAT t o RSVCAT a r e n o r m a l i z e d t o e x p r e s s i o no b s e r v e d i n e a r l y p a s s a g e s o f HIT c e l l s . D a t a r e p r e s e n t t h emeanSEM f o r 3 i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s w i t h d u p l i c a t e o b s e r v a -t i o n s ( n = 3 ) . * P < 0 . 0 5 , s i g n i f i c a n c e o f r e l a t i v e CAT e x p r e s s i o nb e t w e e n t h e w i l d t y p e INSCAT a n d m u t a n t INSCAT v e c t o r s f o r e a c hi n d i v i d u a l p a s s a g e .

i s t r a n s c r i b e d ( 2 6 , 3 1 , 3 2 ) . T h e c h r o n i c e f f e c t o f g l u c o s e o ni n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n t h a t w e d e s c r i b e a n d w h i c h c a n b ep a r t i a l l y p r e v e n t e d b y c h r o n i c a l l y c u l t u r i n g HIT c e l l s i n l o w e rg l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s , may r e p r e s e n t a d i r e c t g l u c o s e t o x i ce f f e c t o n a i n s u l i n - g e n e s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f a c t o r ( s ) .A g l u c o s e - r e s p o n s i v e DNA e l e m e n t h a s b e e n m a p p e d t o- 2 4 7 / - 1 9 6 o f t h e r a t 1 i n s u l i n g e n e e n h a n c e r ( 3 1 ) . B o t h u b i q -u i t o u s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s , P a n - l a n d P a n - 2 ( 3 3 - 3 6 ) , a n d (c e l l s p e c i f i c f a c t o r s ( 3 7 - 3 9 ) h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o DNAs e q u e n c e s c o n t a i n e d i n t h i s g l u c o s e - r e s p o n s i v e r e g i o n . A , c e l ls p e c i f i c f a c t o r ( I U F - 1 ) b i n d s t o t h e CT m o t i f s (CTAATG) l o -c a t e d a t - 2 1 5 / - 2 1 0 ( C T 2 m o t i f ) a n d - 8 2 / - 7 7 ( C T l m o t i f )i n t h e h u m a n i n s u l i n g e n e e n h a n c e r ( 2 5 ) . The CT m o t i f s a r eh i g h l y c o n s e r v e d a c r o s s a l l m a m m a l i a n s p e c i e s , s u g g e s t i n g t h a tt h e s e m o t i f s may p a r t i c i p a t e i n t h e t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n o ft h e i n s u l i n g e n e . T h e CT2 m o t i f o f t h e human i n s u l i n g e n e i ss i m i l a r t o s e q u e n c e s l o c a t e d i n t h e FLAT e l e m e n t ( - 2 2 2 /- 2 0 8 ) o f r a t 1 i n s u l i n g e n e ( 4 0 ) . M u t a t i o n s o f t h e FLAT e l e -m e n t h a v e b e e n s h o w n t o d e c r e a s e t h e r a t 1 i n s u l i n g e n e p r o -m o t e r a c t i v i t y ( 4 1 ) a n d t o a l t e r t h e a c t i v i t y o f a r a t 1 i n s u l i ng e n e m i n i - e n h a n c e r l i n k e d t o a h e t e r o l o g o u s p r o m o t e r ( 4 0 ) .R e c e n t l y , G e r m a n e t a l . h a s c l o n e d t w o p r o t e i n f a c t o r s , l m x - 1a n d c d x - 3 , w h i c h b i n d t o t h e FLAT e l e m e n t ( 4 2 ) . Lmx- 1 , a ( 3c e l l s p e c i f i c LIM-homeo d o m a i n p r o t e i n , s y n e r g i s t i c a l l y i n t e r -a c t s w i t h P a n - 1 a n d i n c r e a s e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e r a t 1 i n s u l i ng e n e m i n i - e n h a n c e r i n n o n p a n c r e a t i c b e t a c e l l s ( 4 2 ) . H ow -e v e r , t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n I U F - 1 a n d FLAT e l e m e n t b i n d -i n g p r o t e i n s , l m x - 1 a n d c d x - 3 , h a s y e t t o b e d e t e r m i n e d .O u r d a t a s h o w t h a t n u c l e a r e x t r a c t s made f r o m l a t e p a s -s a g e s o f HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l t u r e d i n a h i g h g l u c o s e c o n -c e n t r a t i o n f a i l t o f o r m a s p e c i f i c D N A - p r o t e i n c o m p l e x( G S T F ) t o s e q u e n c e s - 2 3 0 / - 2 0 1 a n d - 9 4 / - 6 5 o f t h e humani n s u l i n g e n e a n d t h a t GSTF r e q u i r e s t h e CT m o t i f s c o n t a i n e dw i t h i n t h e s e s e q u e n c e s f o r b i n d i n g . O u r s t u d i e s a l s o d e m o n -s t r a t e t h a t m u t a t i o n s o f t h e CT m o t i f s d e c r e a s e i n s u l i n p r o -

m o t e r a c t i v i t y i n a l l p a s s a g e s o f HIT c e l l s . T h e s e d a t a s u g g e s tt h a t t h e CT m o t i f s p l a y a f u n c t i o n a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f t h ehuman i n s u l i n g e n e p r o m o t e r a c t i v i t y . O u r f i n d i n g s s t r o n g l ys u g g e s t t h a t t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n f o r t h e d e c r e a s e i n i n s u l i ng e n e t r a n s c r i p t i o n i n c e l l s c u l t u r e d c h r o n i c a l l y i n h i g h g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n s i s t h e l o s s o f GSTF b i n d i n g t o t h e CT m o t i f se i t h e r b e c a u s e GSTF h a s b e e n a l t e r e d o r i s n o l o n g e r p r e s e n t .T h e e x a c t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n I U F - 1 a n d GSTF h a s n o t b e e nr e s o l v e d , b u t t h e y may b e c l o s e l y r e l a t e d t o t h e FLAT b i n d i n gp r o t e i n s , l m x - 1 o r c d x - 3 . T h e d e c r e a s e i n i n s u l i n g e n e t r a n -s c r i p t i o n i s n o t d u e t o t h e l o s s o f a t r a n s c r i p t i o n f a c t o r t h a tb i n d s t o t h e s t r o n g e n h a n c e r e l e m e n t l o c a t e d b e t w e e n - 2 4 9a n d - 2 2 0 o f t h e human i n s u l i n g e n e b e c a u s e s i m i l a r l e v e l s o fD N A - p r o t e i n c o m p l e x e s , a s s e s s e d b y EMSA, w e r e f o r m e dw h e n u s i n g n u c l e a r e x t r a c t s f r o m HIT c e l l s c h r o n i c a l l y c u l -t u r e d i n h i g h o r l o w g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s .

T h e l o s s o f i n s u l i n r e s p o n s e t o g l u c o s e i n HIT c e l l s s e r i a l l yp a s s a g e d i n h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s a n d t h e a b i l i t y t o p r e -v e n t t h i s b y p a s s a g i n g c e l l s i n a m o r e p h y s i o l o g i c a l g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n i s r e m i n i s c e n t o f t h e a d v e r s e e f f e c t s o f c h r o n i ch y p e r g l y c e m i a w h i c h o c c u r i n p a t i e n t s w i t h t y p e I I d i a b e t e sm e l l i t u s a n d a ni m a l m o d e l s f e d e x c e s s g l u c o s e . A l t h o u g h i t i sg e n e r a l l y t h o u g h t t h a t s u c h g l u c o s e t o x i c e f f e c t s o c c u r a t s i t e sw i t h i n t h e e x o c y t o t i c p a t h w a y , o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e s ea d v e r s e e f f e c t s o c c u r a t t h e l e v e l o f t h e i n s u l i n g e n e a n d l e a d t oa p a r a d o x i c a l d e c r e a s e i n t h e r a t e o f t r a n s c r i p t i o n . R e c e n t l yp u b l i s h e d d a t a d e m o n s t r a t e d t h a t p r o l o n g e d e x p o s u r e o f t h ehuman p a n c r e a t i c i s l e t t o h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s l e a d s t oi m p a i r e d i n s u l i n s e c r e t i o n ( 4 3 ) . T h i s w a s a t t r i b u t e d m a i n l y t oa d e c l i n e i n i n s u l i n c o n t e n t t h a t w a s p r e v e n t a b l e b y c u l t u r i n gt h e i s l e t s i n l o w g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s ( 4 3 ) . T h i s c o n c l u s i o n i sc o n s i s t e n t w i t h o u r s u g g e s t i o n t h a t d c e l l s a r e s e n s i t i v e t o d i r e c tg l u c o s e t o x i c e f f e c t s o n i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n . We t h e r e -f o r e p r o p o s e a t i m e - r e l a t e d d i s t i n c t i o n b e t w e e n t h e t e r m s g l u -c o s e d e s e n s i t i z a t i o n a n d g l u c o s e t o x i c i t y . T h e f o r m e r m a y b e am o r e a c u t e , r e v e r s i b l e p h e n o m e n o n a t t h e l e v e l o f i n s u l i n e x o -c y t o s i s , w h e r e a s t h e l a t t e r may b e a m o r e c h r o n i c , l e s s r e v e r s -i b l e p h e n o m e n o n a t t h e l e v e l o f i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n .To t h e e x t e n t t h a t o n e c a n g e n e r a l i z e f r o m o b s e r v a t i o n s i nHIT c e l l s t o t h e p a t h o p h y s i o l o g y i n t y p e I I d i a b e t i c p a t i e n t s ,o u r d a t a s u g g e s t t h a t c l o s e r e g u l a t i o n o f g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n si n t y p e I I d i a b e t i c p a t i e n t s m i g h t p r o v i d e t h e p r e v i o u s l y u n a n -t i c i p a t e d b e n e f i t o f h e l p i n g p r e s e r v e i n s u l i n g e n e e x p r e s s i o n . Ac o r o l l a r y o f t h i s l o g i c i s t h a t p r o l o n g e d h y p e r g l y c e m i a , d e s p i t et r e a t m e n t w i t h o r a l h y p o g l y c e m i c a g e n t s , may c o n t r i b u t e t od e t e r i o r a t i o n o f i n s u l i n p r o d u c t i o n a n d s e c r e t i o n a n d , t h u s ,l e a d t o s o - c a l l e d " s e c o n d a r y f a i l u r e " o f t h e s e d r u g s .A c k n o w l e d g m e n t sT h e a u t h o r s t h a n k D r . H u i - J i a n Z h a n g f o r t h e i n i t i a l c u l t u r i n g a n dc h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e HIT c e l l p a s s a g e s a n d e x p r e s s t h e i r g r a t i t u d e t oM e r s i n i S p i r o p o u l o s f o r s e c r e t a r i a l h e l p .

T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h g r a n t sR O I - D K - 3 8 3 2 5 ( R . P . R o b e r t s o n ) , R O I - D K - 2 6 9 1 9 ( H . C . T o w l e ) ,a n d F 3 2 - D K - 0 8 7 4 2 ( L . K . O l s o n ) , a n d b y t h e M i n n e s o t a A f f i l i a t e o ft h e A m e r i c a n D i a b e t e s A s s o c i a t i o n .R e f e r e n c e s

1 . U n g e r , R . H . , a n d S . G r u n d y . 1 9 8 5 . H y p e r g l y c a e m i a a s an i n d u c e r a s w e l la s a c o n s e q u e n c e o f i m p a i r e d i s l e t c e l l f u n c t i o n a n d i n s u l i n r e s i s t a n c e : i m p l i c a -t i o n s f o r t h e m a n a g e m e n t o f d i a b e t e s . D i a b e t o l o g i a . 2 8 : 1 1 9 - 1 2 1 .

5 1 8 L . K O l s o n , J . B . R e d m o n , H . C . T o w l e , a n d R . P . R o b e r t s o n


6/6

2 . R o b e r t s o n , R . P . 1 9 8 9 . T y p e I I d i a b e t e s , g l u c o s e " n o n - s e n s e , " a n d i s l e td e s e n s i t i z a t i o n . D i a b e t e s . 3 8 : 1 5 0 1 - 1 5 0 5 .3 . T u r n e r , R . C . , S . T . M c C a r t h y , R . R . H o l m a n , a n d E . H a r r i s . 1 9 7 6 . B e t a -c e l l f u n c t i o n i m p r o v e d b y s u p p l e m e n t i n g b a s a l i n s u l i n s e c r e t i o n i n m i l d d i a b e t e s .B r i t . M e d . J . 1 : 1 2 5 2 - 1 2 5 4 .4 . S c h m e l t z , R . , H . J . W e n d o r f f , a n d J . B . F i e l d . 1 9 7 8 . E f f e c t o f c o n t r o l o fb l o o d g l u c o s e o n p l a s m a i n s u l i n r e s p o n s e s t o v a r i o u s s t i m u l i i n s e c o n d a r y f a i l u r e st o o r a l h y p o g l y c e m i c a g e n t s a n d i n n e w l y d i a g n o s e d , m a t u r i t y o n s e t , k e t o s i s - r e -s i s t a n t d i a b e t i c s . J C l i n . E n d o c r i n o l . & M e t a b . 4 6 : 5 1 9 - 5 2 7 .

5 . K o s a k a , K . , T . K u z u y a , Y . A k a n u m a , a n d R . H a g u r a . 1 9 8 0 . I n c r e a s e i ni n s u l i n r e s p o n s e a f t e r t r e a t m e n t o f o v e r t m a t u r i t y - o n s e t d i a b e t e s i s i n d e p e n d e n to f t h e m o d e o f t r e a t m e n t . D i a b e t o l o g i a . 1 8 : 2 3 - 2 8 .6 . H i d a k a , H . , M . N a g u l e s p a r a n , I . K l i m e s , R . C l a r k , H . S a s a k i , S . L . A r o n o f f ,B . V a s q u e z , A . H . R u b e n s t e i n , a n d R . H . U n g e r . 1 9 8 2 . I m p r o v e m e n t o f i n s u l i ns e c r e t i o n b u t n o t i n s u l i n r e s i s t a n c e a f t e r s h o r t t e r m c o n t r o l o f p l a s m a g l u c o s e i no b e s e T y p e I I d i a b e t i c s . J . C l i n . E n d o c r i n o l . & M e t a b . 5 4 : 2 1 7 - 2 2 2 .7 . V a g u e , P . , a n d J . - P . M o u l i n . 1 9 8 2 . T h e d e f e c t i v e g l u c o s e s e n s i t i v i t y o f t h e ( 3c e l l i n n o n - i n s u l i n d e p e n d e n t d i a b e t e s . I m p r o v e m e n t a f t e r t w e n t y h o u r s o f n o r -m o g l y c a e m i a . M e t a b . C l i n . E x p . 3 1 : 1 3 9 - 1 4 2 .8 . R o s s e t t i , L . , G . I . S h u l m a n , W. Z a w a l i c h , a n d R . A . D e F r o n z o . 1 9 8 7 . E f f e c to f c h r o n i c h y p e r g l y c e m i a o n i n v i v o i n s u l i n s e c r e t i o n i n p a r t i a l l y p a n c r e a t e c t o -m i z e d r a t s . J . C l i n . I n v e s t . 8 0 : 1 0 3 7 - 1 0 4 4 .9 . I m a m u r a , T . , M . K o f f l e r , J . H . H e l d e r m a n , D . P r i n c e , R . T h i r l b y , L . I n -m a n , a n d R . H . U n g e r . 1 9 8 8 . S e v e r e d i a b e t e s i n d u c e d i n s u b t o t a l l y d e p a n c r e a -t i z e d d o g s b y s u s t a i n e d h y p e r g l y c e m i a . D i a b e t e s . 3 7 : 6 0 0 - 6 0 9 .1 0 . L e a h y , J . L . , S . B o n n e r - W e i r , a n d G . C . W e i r . 1 9 8 8 . M i n i m a l c h r o n i ch y p e r g l y c e m i a i s a c r i t i c a l d e t e r m i n a n t o f i m p a i r e d i n s u l i n s e c r e t i o n a f t e r a ni m c o m p l e t e p a n c r e a t e c t o m y . J . C l i n . I n v e s t . 8 1 : 1 4 0 7 - 1 4 1 4 .1 1 . R o b e r t s o n , R. P . , H . - J . Z h a n g , K . L . P y z d r o w s k i , a n d T . F . W a l s e t h . 1 9 9 2 .P r e s e r v a t i o n o f i n s u l i n mRNA l e v e l s a n d i n s u l i n s e c r e t i o n i n HIT c e l l s b y a v o i d -a n c e o f c h r o n i c e x p o s u r e t o h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s . J . C l i n . I n v e s t . 9 0 : 3 2 0 -3 2 5 . 1 2 . S a n t e r r e , R . F . , R. A . C o o k , R . M . D . C r i s e l , J . D . S h a r p , R . J . S c h m i d t ,D . C . W i l l i a m s , a n d C . P . W i l s o n . 1 9 8 1 . I n s u l i n s y n t h e s i s i n a c l o n a l c e l l l i n e o fs i m i a n v i r u s 4 0 - t r a n s f o r m e d h a m s t e r p a n c r e a t i c b e t a c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i .U S A . 7 8 : 4 3 3 9 - 4 3 4 3 .1 3 . H i l l , R . S . , a n d A . E . B o y d , I I I . 1 9 8 5 . P e r i f u s i o n o f a c l o n a l c e l l l i n e o fs i m i a n v i r u s 4 0 - t r a n s f o r m e d b e t a c e l l . I n s u l i n s e c r e t o r y d y n a m i c s i n r e s p o n s e t og l u c o s e , 3 - i s o b u t y l - l - m e t h y l x a n t h i n e , a n d p o t a s s i u m . D i a b e t e s . 3 4 : 1 1 5 - 1 2 0 .1 4 . A s h c r o f t , S . J . H . , P . H a m m o n d s , a n d D . E . H a r r i s o n . 1 9 8 6 . I n s u l i ns e c r e t o r y r e s p o n s e s o f a c l o n a l c e l l l i n e o f s i m i a n v i r u s 4 0 - t r a n s f o r m e d f l c e l l s .D i a b e t o l o g i a . 2 9 : 7 2 7 - 7 3 3 .1 5 . L a m b e r t , D . G . , K . H u g h e s , a n d T . W. A t k i n s . 1 9 8 6 . I n s u l i n r e l e a s e f r o m ac l o n e d h a m s t e r w - c e l l l i n e ( H I T - T 1 5 ) . T h e e f f e c t s o f g l u c o s e , a m i n o a c i d s , s u l -p h o n y l u r e a s a n d c o l c h i c i n e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 1 4 0 : 6 1 6 - 6 2 5 .1 6 . M e g l a s s o n , M . D . , C . D . M a n n i n g , H . N a j a f i , a n d F . M . M a t s c h i n s k y .1 9 8 7 . F u e l - s t i m u l a t e d i n s u l i n s e c r e t i o n b y c l o n a l h a m s t e r ( 3 - c e l l l i n e HIT T - 1 5 .D i a b e t e s . 3 6 : 4 7 7 - 4 8 4 .1 7 . R o b e r t s o n , R . P . , P . T s a i , S . A . L i t t l e , H . - J . Z h a n g , a n d T . F . W a l s e t h .1 9 8 7 . R e c e p t o r - m e d i a t e d a d e n y l a t e c y c l a s e - c o u p l e d m e c h a n i s m f o r P G E 2 i n h i b i -t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n i n HIT c e l l s . D i a b e t e s . 3 6 : 1 0 4 7 - 1 0 5 3 .1 8 . Z h a n g , H . - J . , T . F . W a l s e t h , a n d R . P . R o b e r t s o n . 1 9 8 9 . I n s u l i n s e c r e t i o na n d cAMP m e t a b o l i s m i n HIT c e l l s . R e c i p r o c a l a n d s e r i a l p a s s a g e - d e p e n d e n tr e l a t i o n s h i p s . D i a b e t e s . 3 8 : 4 4 - 4 8 .1 9 . J a c o b y , D . B . , N . D . Z i l z , a n d H . C . T o w l e . 1 9 8 9 . S e q u e n c e s w i t h i n t h e5 ' - f l a n k i n g r e g i o n o f t h e S , 4 g e n e c o n f e r r e s p o n s i v e n e s s t o g l u c o s e i n p r i m a r yh e p a t o c y t e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 4 : 1 7 6 2 3 - 1 7 6 2 6 .2 0 . K i n g s t o n , R. E . , a n d J . S h e e n . 1 9 9 1 . I n t r o d u c t i o n o f D N A i n t o mamma-l i a n c e l l s . I n C u r r e n t P r o t o c o l s i n M o l e c u l a r B i o l o g y . F . A u s u b e l , R . B r e n t , R.K i n g s t o n , D . M o o r e , J . S e i d m a n , J . S m i t h , a n d K . S t r u h l , e d i t o r s . G r e e n e P u b -l i s h i n g A s s o c i a t e s a n d W i l e y - I n t e r s c i e n c e , Ne w Y o r k . 9 . 0 . 1 - 9 . 9 . 62 1 . D i g n a m , J . D . , R. M . L e b o v i t z , a n d R . G . R o e d e r . 1 9 8 3 . A c c u r a t e t r a n -s c r i p t i o n i n i t i a t i o n b y RNA p o l y m e r a s e I I i n a s o l u b l e e x t r a c t f r o m i s o l a t e dm a m m a l i a n n u c l e i . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 1 : 1 4 7 5 - 1 4 8 9 .2 2 . A b m a y r , S . M . , a n d J . L . W o r k m a n . 1 9 9 1 . D N A - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . I n

C u r r e n t P r o t o c o l s i n M o l e c u l a r B i o l o g y . F . A u s u b e l , R . B r c n t , R. K i n g s t o n , D .M o o r e , J . S e i d m a n , J . S m i t h , a n d K . S t r u h l , e d i t o r s . G r e e n e P u b l i s h i n g A s s o -c i a t e s a n d W i l e y - l n t e r s c i e n c e , Ne w Y o r k . S u p p l e m e n t : 1 2 . 0 . 1 - 1 2 . 1 . 92 3 . S h i h , H . - M . , a n d H . C . T o w l e . 1 9 9 2 . D e f i n i t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t e r e -s p o n s e e l e m e n t o f t h e r a t S , 4 g e n e . E v i d e n c e f o r a common f a c t o r r e q u i r e d f o rc a r b o h y d r a t e r e g u l a t i o n o f h e p a t i c g e n e s . J . B i o l . C h e m . 2 6 7 : 1 3 2 2 2 - 1 3 2 2 8 .2 4 . B o a m , D . S . W . , A . R . C l a r k , a n d K . D o c h e r t y . 1 9 9 0 . P o s i t i v e a n d n e g a -t i v e r e g u l a t i o n o f t h e h u m a n i n s u l i n g e n e b y m u l t i p l e t r a n s - a c t i n g f a c t o r s . J . B i o l .C h e m . 2 6 5 : 8 2 8 5 - 8 2 9 6 .

2 5 . B o a m , D . S . W . , a n d K . D o c h e r t y . 1 9 8 9 . A t i s s u e - s p e c i f i c n u c l e a r f a c t o rb i n d s t o m u l t i p l e s i t e s i n t h e human i n s u l i n - g e n e e n h a n c e r . B i o c h e m . J . 2 6 4 : 2 3 3 -2 3 9 .2 6 . H a m m o n d s , P . , P . N . S c h o f i e l d , a n d S . J . H . A s h c r o f t . 1 9 8 7 . G l u c o s er e g u l a t e s p r e p r o i n s u l i n m e s s e n g e r R N A l e v e l s i n a c l o n a l c e l l l i n e o f s i m i a n v i r u s4 0 - t r a n s f o r m e d ( 3 c e l l s . FEBS ( F e d . E u r . B i o c h e m . S o c . ) L e t t . 2 1 3 : 1 4 9 - 1 5 4 .2 7 . G i d d i n g s , S . J . , J . C h i r g w i n , a n d M . A . P e r m u t t . 1 9 8 2 . E f f e c t s o f g l u c o s eon p r o i n s u l i n m e s s e n g e r R N A i n r a t s i n v i v o . D i a b e t e s . 3 1 : 6 2 4 - 6 2 9 .2 8 . B r u n s t e d t , J . , a n d S . J . C h a n . 1 9 8 2 . D i r e c t e f f e c t o f g l u c o s e o n t h e p r e -p r o i n s u l i n mRNA l e v e l i n i s o l a t e d p a n c r e a t i c i s l e t s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .C o m m u n . 1 0 6 : 1 3 8 3 - 1 3 8 9 .2 9 . H a m m o n d s , P . , P . N . S c h o f i e l d , S . J . H . A s h c r o f t , R . S u t t o n , a n d D . W . R.G r a y . 1 9 8 7 . R e g u l a t i o n a n d s p e c i f i c i t y o f g l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n g e n e e x p r e s -s i o n i n h u m a n i s l e t s o f L a n g e r h a n s . FEBS ( F e d . E u r . B i o c h e m . S o c . ) L e t t .2 2 3 : 1 3 1 - 1 3 7 .3 0 . W e l s h , M . , D . A . N i e l s e n , A . J . M a c K r e l l , a n d D . F . S t e i n e r . 1 9 8 5 . C o n t r o lo f i n s u l i n g e n e e x p r e s s i o n i n p a n c r e a t i c ( 3 - c e l l s a n d i n an i n s u l i n - p r o d u c i n g c e l ll i n e , R I N - 5 F c e l l s . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 1 3 5 9 0 - 1 3 5 9 4 .3 1 . G e r m a n , M . S . , L . G . M o s s , a n d W. J . R u t t e r . 1 9 9 0 . R e g u l a t i o n o f i n s u l i ng e n e e x p r e s s i o n b y g l u c o s e a n d c a l c i u m i n t r a n s f e c t e d p r i m a r y i s l e t c u l t u r e s . J .B i o l . C h e m . 2 6 5 : 2 2 0 6 3 - 2 2 0 6 6 .3 2 . E f r a t , S . , M . S u r a n a , a n d N . F l e i s c h e r . 1 9 9 1 . G l u c o s e i n d u c e s i n s u l i n g e n et r a n s c r i p t i o n i n a m u r i n e p a n c r e a t i c ( 3 - c e l l l i n e . J . B i o l . C h e m . 2 6 6 : 1 1 1 4 1 - 1 1 1 4 3 .3 3 . G e r m a n , M . S . , M . A . B l a n a r , C . N e l s o n , L . G . M o s s , a n d W. J . R u t t e r .1 9 9 1 . Two r e l a t e d h e l i x - l o o p - h e l i x p r o t e i n s p a r t i c i p a t e i n s e p a r a t e c e l l - s p e c i f i cc o m p l e x e s t h a t b i n d t h e i n s u l i n e n h a n c e r . M o l . E n d o c r i n o l . 5 : 2 9 2 - 2 9 9 .3 4 . N e l s o n , C . , L . P . S h e n , A . M e i s t e r , E . F o d o r , a n d W. J . R u t t e r . 1 9 9 0 . P a n :a t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o r t h a t b i n d s c h y m o t r y p s i n , i n s u l i n , a n d A P - 4 e n h a n c e rm o t i f s . G e n e s & D e v . 4 : 1 0 3 5 - 1 0 4 3 .3 5 . S h i b a s a k i , Y . , H . S a k u r a , F . T a k a k u , a n d M . K a s u g a . 1 9 9 0 . I n s u l i n en -h a n c e r b i n d i n g p r o t e i n h a s h e l i x - l o o p - h e l i x s t r u c t u r e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s .C o m m u n . 1 7 0 : 3 1 4 - 3 2 1 .3 6 . W a l k e r , M . D . , C . W. P a r k , A . R o s e n , a n d A . A r o n h e i m . A c DNA f r o m am o u s e p a n c r e a t i c , c e l l e n c o d i n g a p u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r o f t h e i n s u l i ng e n e . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 8 : 1 1 5 9 - 1 1 6 6 .3 7 . O h l s s o n , H . , a n d T . E d l u n d . 1 9 8 6 . S e q u e n c e - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s o f nu -c l e a r f a c t o r s w i t h t h e i n s u l i n g e n e e n h a n c e r . C e l l . 4 5 : 3 5 - 4 4 .3 8 . M o s s , L . G . , J . B . M o s s , a n d W. J . R u t t e r . 1 9 8 8 . S y s t e m a t i c b i n d i n ga n a l y s i s o f t h e i n s u l i n g e n e t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l r e g i o n : I n s u l i n a n d i m m u n o -g l o b u l i n e n h a n c e r s u t i l i z e s i m i l a r t r a n s a c t i v a t o r s . M o l . C e l l B i o l . 8 : 2 6 2 0 - 2 6 2 7 .3 9 . O h l s s o n , H . , 0 . K a r l s s o n , a n d T . E d l u n d . 1 9 8 8 . B e t a c e l l s p e c i f i c p r o t e i nb i n d s t o tw o m a j o r r e g u l a t o r y s e q u e n c e s o f t h e i n s u l i n g e n e e n h a n c e r . P r o c . N a t i .A c a d . S c i . U S A . 8 5 : 4 2 2 8 - 4 2 3 1 .4 0 . G e r m a n , M . S . , L . G . M o s s , J . W a n g , a n d W. J . R u t t e r . 1 9 9 2 . T h e i n s u l i na n d a m y l o i d p o l y p e p t i d e g e n e s c o n t a i n s i m i l a r c e l l - s p e c i f i c p r o m o t e r e l e m e n t st h a t b i n d i d e n t i c a l ( 3 - c e l l n u c l e a r c o m p l e x e s . M o l . C e l l . B i o l . 1 2 : 1 7 7 7 - 1 7 8 8 .4 1 . K a r l s s o n , O . , M. D . W a l k e r , W . J . R u t t e r , a n d T . E d l u n d . 1 9 8 9 . I n d i v i d u a lp r o t e i n - b i n d i n g d o m a i n s o f t h e i n s u l i n g e n e e n h a n c e r p o s i t i v e l y a c t i v a t e ( - c e l l -s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n . M o l . C e l l . B i o l . 9 : 8 2 3 - 8 2 7 .4 2 . G e r m a n , M . S . , J . W a n g , R. B . C h a d w i c k , a n d W. J . R u t t e r . 1 9 9 2 . S y n e r -g i s t i c a c t i v a t i o n o f t h e i n s u l i n g e n e b y a L I M - h o m e o d o m a i n p r o t e i n a n d a b a s i ch e l i x - l o o p - h e l i x p r o t e i n : b u i l d i n g a f u n c t i o n a l i n s u l i n m i n i e n h a n c e r c o m p l e x .G e n e s & D e v . 6 : 2 1 6 5 - 2 1 7 6 .

4 3 . E i z i r i k , D . L . , G . S . K o r b u t t , a n d C . H e l l e r s t r o m . 1 9 9 2 . P r o l o n g e d e x p o -s u r e o f h u m a n p a n c r e a t i c i s l e t s t o h i g h g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n s i n v i t r o i m p a i r s t h e( 3 - c e l l f u n c t i o n . J . C l i n . I n v e s t . 9 0 : 1 2 6 3 - 1 2 6 8 .


chronic exposure of hit cells to high glucose concentrations paradoxically decreases insulin gene...

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