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7/24/2019 Cursoclae 2012c i

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Parte C- setembro 2012

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DISCIPLINA:CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTAEFICINCIA - CLAE (IC -1339)

Profa. Rosane Nora [email protected]

COLUNAS

CROMATOGRFICAS

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semi-preparativas

d.i. =10-20mmL =50-250 mm

preparativasd.i. =20-50 mmL =250-300 mmanalticas

d.i.= 2.0-4.6mmL =15-250 mm

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Alargamento dos picos emfuno da vazo da FM e do dimetro das partculasda FE.

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,

Diferentes d.i. das colunas e as respectivas vazes da FM utilizadasnas diferentes escalas de trabalho da CLAE


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Espessura do Filme (df) Temperatura Dimetro Interno Seletividade da Fase Estacionria

CAPACIDADE DA COLUNA

FORMA ANORMAL DO PICO NA ANLISE CROMATOGRFICA

Excesso deamostra

origina um picocom um aumento

gradual tromba eaps um mximo

ocorre uma quedarpida

Uma cauda longa ocorre quando em algumas zonasos compostos so mais retidos do que noutras

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Mais comum: partculas esfricas de slica. Polmero compostopor tomos tetradricos de silcio conectados entre si por tomosde oxignio, por meio de ligaes siloxanos (Si-O-Si).

Fases Estacionrias

Si

OH

Si

HO OH

Si

OH

Si

OH

LIVRES GEMINAL

influenciam no grau de acidez da slica

VICINAIS

Modificao superficial:- QUIMICAMENTE LIGADAS- HBRIDAS- RECOBERTAS COM POLMEROS ORGNICOS

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Fase Quimicamente LigadaFASE ESTACIONRIA REVERSA-os grupos funcionais ligados base deslica so apolares. As substncias so atradas para a superfcie pelos seusgrupos funcionais no polares.A substnciamais polar eluiprimeiro, seguidos pelos outros em ordem decrescente de polaridade. Os gruposbutil, octil, octadecil e fenila so os mais utilizados. O grupo octadecil responsvel pela maioria das separaes em fase reversa.

Grupos silanis so responsveis por retenes noespecficas que provocam alargamento dos picos


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Pr-hidrlise do agente silanizante

FASES ESTACIONRIAS POLIMRICAS

Colunas com maior estabilidade

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Composta de Matriz orgnica-inorgnica

-Mais estveis do que as quimicamente ligadas convencionais- Menor quantidade de grupos de silanis

- CromatografiaUltra-fast.- O teor de carbono cerca de 7%, antes de modificaes da superfcie.Colunas Xterra (Waters) so produzidas com essas partculas.- Permitem uso na faixa de pH 1 a 12, sem perda de eficincia oucapacidade, devido ao teor reduzido de grupos silanol, fornecemexcepcional forma de picos para analitos bsicos.

Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano

(RO)4Si + n(RO)3SiR + (1,5n+2)H2O SiO2(R SiO1,5)0,5+ (3n+4)ROH

FASES ESTACIONRIAS HBRIDAS

Contm ambos slica e organosiloxane

Aumento do carregamento decarbono sobre as partculas,

AUMENTA RETENO

Influncia da % de CARBON LOAD

Colunas com formasgeomtricas similares

Carbon load 5% 7% 9% 12% 15% 17%

Tempo de reteno

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Grupo FuncionalDIOL partculas esfricas de slica - CH2-CH2-CHOH-CH2-CH2-CH2OH

com funo diol na cadeia-C

NH2 partculas esfricas de slica - CH2-CH2-CH2-NH2

com funo -aminopropil

CN partculas esfricas de slica - CH2-CH2-CH2-CN

com funo -Cianopropil

RP-Select B partculas esfricas de slica - CH2-(CH2)6 -CH3com derivado Octil

Fases Estacionrias de Polaridades Mdias

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PRINCPIOS DE SEPARAO

Interao do soluto nas fases estacionria e mvel(equilbrio)

-Interaes de van der valls

- Ligaes de hidrognio

- Interaes dipolo-dipolo

- Atrao eletrosttica

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Fases estacionrias Interaes

C8

Fenil

C2

van der Waals

van der Waals

van der Waals

Si

Si

Si

Fase Estacionria

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Fase Estacionria

Fases estacionrias Interaes

CN

NH2

DIOL

Dipolo/Dipolo

OH

Si NH

H

OSi

OH

OOH

H

SiN

OH

C

Ligao de

hidrognio

Ligao dehidrognio

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Modos SeparaoModos Separao

I. Cromatografia em Fase Normal

O

O

SiO

H

O

SiO

O

O

O

2CH

SiO

O

OO

H

H

H

O

Mecanismo:

Reteno pela interao da superfcie polarda FE com partes polares das molculasdas amostras.

Fase estacionria:

SiO2, Al2O3, -NH2, -CN, -Diol, -NO2

Fase Mvel:Heptano, hexano, cicloexano,CHCl3, CH2Cl2, dioxano, AcOEt, IPA

Mtodo:

Separao de substncias no-inicas, no-polares a mdia polaridade (cidoscarboxlicos hidrocarbnicos)

amostra

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II. Cromatografia em Fase Reserva

amostra

Mecanismo:Reteno pela interao da cadeiahidrocarbnica no-polar da FE com aspartes no-polares na amostra.

Fase Estacionria:Octadecil (RP-18), octil(RP-8), etill (RP-2), fenil, -CN.

Fase Mvel:

-Tipo de modificador:Metanol ou acetonitrila

-gua (pode ter adio de THF ou dioxano).

-Tampo: fosfato, acetato

-Fora inica: sais, conc. de tampo

Mtodo:Separao de substncias no-inicas,polares a de polaridade mdia (cidoscarboxlicos hidrocarbnicos). Se substnciasque se ionizam (cidos carboxlicos) soseparadas, o controle de pH necessrio.

2CH OH

O

O

SiO HO

SiO

O

O

O Si

3CH

3CH

SiO

O

O

O Si

3CH

3

CH

H2O

H2O

CH3OH

CH3OH

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III. Cromatografia de Troca inica

- Reteno se d por atraoeletrosttica entre ons na FM eos ons de carga oposta na FE.

Trocadores aninicos (+)e catinicos (-)

PrincipaisTrocadores de ons:

-Fraco R-CO2- Na+ (Catinico) / R-N+R2H Cl-(aninica)- Forte R-SO3- Na+ (Catinico) / R-N+R3 Cl-(aninica)

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IV. Cromatografia de Excluso

A separao se d peladiferena de tamanho ,

onde as molculaspequenas penetram nosporos, e as maiores soexcludas dos poros da FE.

Usado na separao dePTN, polmeros, peptdeos,etc.

Volume/forma

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Contedo de Metal em ppmContedo de Metal em ppm

Sdio Clcio Magnsio Ferro Alumnio

LiChrosorb 340-400 1300 160-220 20-25 15-20

LiChrospher 150-250 6-10 4-6 20-40 75-140

Purospher 1 1 1 3 1

PurospherSTAR

29

1.

400 20

RP-18 silica convencional

2

0 20 40

1

Purospher RP-18 eCondies cromatogrficas:

Fase mvel: Metanol / gua ( 55:45)Fluxo: 1.0 ml/minDetector: UV 254 nmTemperatura: 35 C

Influncia da superfcie Derivatizada

N N CH 3

Piridina (1 ) 2-metil-piridina(2)

30

Cetoprofeno

Fenoprofeno

Fluor-

biprofeno

Ibuprofeno

3.300 injeces depois de 1600 hours

1.650 injees depois de 800 hours

1. injeo

Estabilidade tempo - condies cidas pH < 2

Coluna: Purospher STARRP-18e (150 x4.6 mm x 5 m)

Eluente: acetonitrila/ gua (0,1 % TFA;50:50)

Fluxo: 1,0 ml / minDeteco: UV 254 nmInj. Volume: 10 lTemperatura: T.A.

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25 mm25 mm25 mm25 mm10 mm10 mm10 mm10 mm

4.6mm4.6mm4.6mm4.6mm

ChromolithChromolithChromolithChromolith

3mm3mm3mm3mm

Colunas de slica monolticas de d.i. diferentes

Formadas cilindricamente em forma de haste

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Chromolith Performance RP-18eChromolith SpeedROD RP-18e

125 - 4 mm

100 - 4.6 mm 50 - 4.6 mm

Anlise de Substncias cidas

Metanol/ Buffer pH 2.0 (30/70,v/v)

Fluxo: 1 ml/min

12

3

1111. cido 2-Nitrobenzico2. c. 2-Hidroxibenzico3. cido Benzico

1

2

3

1

2

3

Purospher RP-18e, 5m

Seletividade da Coluna Chromolith

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Efeito da Fora do solvente

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Otimizando a seletividade do Solvente

Mistura de 2solventes

fortesmelhora a

resoluo eseparao

Mudana dafora dosolvente

geraadequadareteno emelhora

resoluo

FM forte,amostra

fracamenteretida epobre

resoluo

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ANLISE DE COMPOSTOS BSICOS

Problemas com a forma do pico de compostos bsicos so normalmentecomuns.

Mas h vrios passos simples que podem melhorar significativamente aforma do pico de bases:

1- Selecione uma coluna base-slica desativada.

2- Usar fase mvel com baixo pH.

3 Aumento da concentrao de sais na fase mvel.

4 Selecione uma coluna endcapped.

5 Adicione uma base competitiva.


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ANLISE DE COMPOSTOS CIDOS

1 Adicione um cido orgnico competitivo.

Adicionou-se 1% de cido actico fase mvel para minimizar asinteraes soluto-silanol, pela ao de um cido competidor.

2- Substituindo o cido actico por 0.1% de cido trifluoractico -TFA.

A concentrao relativamente alta de cido actico resulta em rudo dalinha de base. Usando TFA 0.1% como modificador aquoso resulta numafase mvel mais transparente, menos rudo.

Em pH 3, a fase mvel est tamponada, porm a capacidade tamponante baixa. aumento da concentrao para 10 20mm melhorar areprodutibilidade cromatogrfica por mais tempo, alm de melhorar aindamais a forma do pico.

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Tempo de reteno no reprodutvel um problema comum quando se usa fasemvel altamente aquosa. Na separao de compostos muitopolares, solveis em gua no incomum usar FM com menos de 10% demodificador orgnico(metanol,acetonitrila, etc.) Para conseguir

reteno suficiente. Entretanto, nestas condies areprodutibilidade ruim. Com o tempo, os picos eluiro comtempo de reteno cada vez menores e aresoluo piora. A figura mostra cromatogramas deanlise de vitaminas em coluna C-18, FM:5 %MeOH 95% 0.1M KH2PO41ml/min Vitamina C vitamina B1 vitamina B6 -Nicotinamida.

CLAE : FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA

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A mudana do tempo de reteno causada pelo fenmeno denominadocolapso de fase (fases alqulicas hidrofbicas C18 ou C8 em condies defase mvel altamente aquosas. A medida que o colapso de fase progride, a viabilidade da fase alquilicainteragir com solutos diminui e o tempo de reteno decresce. H tambm evidncia que este colapso de fase pode deslocar a FM aquosados poros da FE, reduzindo a rea superficial acessvel para os solutos eportanto reduzindo os tempos de reteno. Em condies normais a fase alqulica est extendida na FM e solvente emolculasda amostra tem total acesso a FE. Quando se usa FM altamente aquosa a FE tende a colapsar e o tempo dereteno afetado

CLAE : FASE REVERSA COM FASE MVEL AQUOSA

Purgando a coluna com solventeorgnico a fase alquilica novamenteextendida e o tempo de reteno restaurado.

Separao de substncias quirais. Importante na anlise de produtosfarmacuticos, flavours, produtos naturais,etc.

- A presena de centros assimtricos em algunsfrmacos est relacionada sua atividade farmacolgica. Qualquer alterao na orientao

espacial desses centros pode causar inativaototal do frmaco, diminuio do efeito biolgicoou ento aparecimento de um efeito contrrio,que pode ser extremamentedanoso para a sade

FASE ESTACIONRIA QUIRAL

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EXEMPLOS DE FASES ESTACIONRIAS QUIRAIS:

A. ChiraDex e ChiraDex-Gamma - processo especial ligandocovalentemente ou - ciclodextrina partcula esfrica da slicavia espaadores.

ChiraDex - caracterizada pelaampla enantiosseletividade e porser usada para separao deenantimeros de classes desubstncias diferentes.

ChiraDex-Gamma deve serempregada com sucesso paraanlisede (D,L)-aa.

Eluente: mistura metanol/ H2O etampo, com aumento da faseorgnica (polaridade) ocorremelhora da separao

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B. Chiracel OD -fases estacionrias quirais de carbamato de celulose tris-3,5-dimetilfenil em partculas de slica de 10 m. A formao estereosseletiva doenantimero acontece na cavidade quiral da camada do polmero por meio deligao H e interao -. Apresentam alta estabilidade qumica e podem serusados com eluente de fase normal e reversa.

Anlise de-bloqueadores: atenolol, betaxolol, metoprolol,nadolol e pindolol

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Anlise por CLAE colunas quirais.CHIRALCEL OD-H, CHIRALCEL OB-H,CHIRALPAK AD e CHIRALPAK foramavaliadas sob condies de FN usandohexano/etanol ou hexano/2-propanolcomo FM. A coluna CHIRALCEL OJ-R foiavaliada sob condies de FR, usandoacetonitrila:H2O. A coluna CHIRAL AGPfoi usada com FM de tampo fosfato eacetonitrila.

Uso de coluna quiral na anlisede Omeprazol

Medicamento antiulceroso(benzimidazlico)

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Colunas: Astec CHIROBIOTICV e V 2 ( 25 c m x 4.6 m m x 5 m)Elue nte: 15mM formiato deamnio em metanolFluxo: 1 mL/ minTemp.: 25 CDetetor:UV a 230nm

Uso de coluna quiral na anlise de sibutramina(agente antiobesidade)

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2. PROCEDIMENTO DE LIMPEZA APS UMA LONGA SEQUNCIA DE

ANLISE:

Colunas RP: Fase mvel - *H2O -> ACN:H2O (10:90) -> ACN:H2O(90:10) mudana c/ gradiente linear (10min.)

*somente se a fase mvel for um tamponado concentrado.

Colunas NP: Fase mvel ->n-Propanol ->n-Heptano

Colunas de 100,125 e 150x4/4,6mm = 30 minutos para cada estgio,vazo de 1ml/min. Colunas de 250, 300 x 4/4,6mm = 60 minutos para cada estgio, vazode 1ml/min.

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3. PROCEDIMENTO DE REGENERAO QUMICA:

Colunas RP:gua -> Metanol -> Clorofrmio -> Metanol -> gua ou0,05M H2SO4.

Colunas NP:Heptano -> Clorofrmio -> Acetato de Etila -> Acetona ->Etanol -> gua.

Colunas de 100,125 e 150x4/4,6mm = 30 minutos para cada estgio,vazo de 1ml/min.

Colunas de 250, 300x4/4,6mm = 60 minutos para cada estgio, vazode 1ml/min.

OBS.: - Caso a presso de trabalho esteja elevada, pode-se inverter osentido da coluna durante todo o processo de regenerao.- Limpeza defritsda coluna.

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