Langkah Analisis Toksikologi Forensik

Interpretasi

Penulisan Laporan (Bukti Surat / Surat Keterangan / Keterangan Ahli)

Penyiapan Sampel

Analisis:Uji Penapisan (Screening test)

Uji Pemastian (Confirmation test)

Data Analisis

HPTLC/TLC – Densitometrik untuk uji penapisan dan pemastian

hRf / hRf cAnalit & Standard

Anal. Tox. For. (Screening & Determination test)

Sistem TLC/HPTLC

yg distandarkanSpektrum UV-Vis

analit insitu

hRf c Pustaka Dugaan golongan analit

Spektrum UV-Vispustaka

Pemastian identitas analitDapat dilanjutkan dengan anal.

kuantitatif

Systematic drug identification

• Melakukan pemisahan analit menggunakan sistem TLC-terstandarkan sehingga memungkinkan melakukan identifikasi analit berdasarkan data-base hRf-terstandarkan (hRfc) dari analit.

• Sistem TLC yang terstandarkan harus memenuhi persyaratan:– Analit harus dikerjakan (dipisahkan) menggunakan sistem TLC– Rf dari analit (senyawa pembanding) harus terdistribusi diseluruh

rentang Rf – Harga Rf terstandarkan sehingga memberikan reprodusibilitas

antarlab yang tinggi – Jika menggunakan sistem TLC lebih dari satu, maka dipilih sistem

yang memberikan korrelasi harga Rf antar sistem yang terrendah

ANALISIS (UJI PENAPISAN)

• Uji Penapisan (Screening Test / General unknown test)– bertujuan untuk menapis dan mengenali golongan analit yang terdapat

dalam sampel / spesimen– penggolongan dapat berdasarkan sifat kimia (struktur dasar molekul) atau

efek farmakologinya• Contoh: golongan opiat, kokain, kanabionoid, amfetamin derivat, bezodiazepin

derivat, asam barbiturat, metadon, tri-siklik-anti depresiva

• Uji penapisan seharusnya dapat mengidentifikasi golongan analit dengan derajat reabilitas dan sensitifitas yang tinggi, relatif murah dan pelaksanaannya selatif cepat

NO

OH

OH

Morphin

Teknik yang sering dipakai pada uji penapisan:– Immunoassay

• (paling umum digunakan pada analisis penyalahgunaan narkoba)• Berdasarkan interaksi antara „anti-drug-antibody dengan „antigent

target“ • “enzyme linked immunoassay” (ELISA), enzyme multiplied immunoassay technique

(EMIT), fluorescence polarization immunoassay (FPIA), cloned enzyme-donor immunoassay (CEDIA), dan radio immunoassay (RIA)

• Single Test atau Multiple Test– Kromatografi Lapis Tipis

• metode analitik yang relatif murah dan mudah pengerjaannya, namun KLT kurang sensitif jika dibandingkan dengan teknik immunoassay

– HPLC – DAD• Waktu tambat dan Spektrum UV-Vis analit (Data library dari

REMIDI)• Pengembangan isokratik

ANALISIS (UJI PENAPISAN)

• Bertujuan untuk memastikan identitas analit dan menetapkan kadarnya– Test ini harus paling sedikit sesensitif dengan uji

penapisan, namun harus lebih spesifik• Teknik:

– GC-MS– HPLC - DAD– LC – MS– TLC/HPTLC – Spektrofotodensitometri

ANALISIS (UJI PEMASTIAN)

TLC/HPTLC Spektrodensitometri „TLC-Scanner“• Sebagai screening test terdapat metode standar

dari: – DFG/TIAFT– ToxiLab, Menggunakan fase diam, gerak dan penampak noda

yang standar, bahkan dari ToxiLab melengkapi dengan data hRf dan tabulasi hasil reaksi warna

Penggolongan didasarkan atas kedekatan harga hRf dan reaksi warna

• Pengembangan – Menggunakan fase diam dan gerak yang telah

distandarkan → dikombinasi dengan data spektra hasil pembacaan TLC-Scanner

(Morfin Rf:0,19; MA Rf:0,27; Fenobarbital Rf:0,48; Kokain Rf:0,75; Diazepam Rf:0,8)

Kromatogram TLC - Scanner

Koreksi harga hRf analit• Koreksi hRf dengan metode Poligonal

Setiap sistem memiliki 4 standard (S1 – S4),

sehinga pada setiap pengembangan terdapat 6 spot hRf dan hRfc

Masing-masing senyawa pembanding telah diketahui harga hRf terkoreksinya (hRfc)

Pemanfaatan spektrum Library Street drugs dari CAMAG untuk uji Konfirmasi

• Spektrum analit insitu dibandingkan dengan spektrum pustaka, • Sistem camag menawarkan

– Jendela pembatas dengan hRf c tertentu (sistem planar chromatogram dari Camag)

– Pembandingan spektrum analit dengan spektrum pustaka – menampilkan kecocokan spektrum dengan nilai korelasi tertinggi

Pembandingan Langsung dgn Data Literatur

• Bentuk spektrum yang berubah• Terjadi geseran max (hipsokromik, batokromik)

Kepastian uji → data literatur tdk dapat digunakan langsung sbg pembanding

Diperlukan peta atlas spektrum pd sistem yang sama

Kebutuhan Uji Penapisan / Identifikas

Perubahan bentuk spektrum akibat perbedaan pH larutan pengeluen

• pH 1= HCl 10% dalam metanol,• pH 5 = kloroform:aseton (80:20), • pH 6 = metanol:n-butanol (60:40), • pH = 10 metanol:amonia (100:1,5), • pH = 11

sikloheksana:toluena:dietilamin (75:15:10),

• pH=12 0,1M KOH dalam metanol

alobarbital

0102030405060708090

100

190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300panjang gelombang (nm)

AU

pH 1

pH 5

pH 6

pH 10

pH 11

pH 12

O

O

O H

H

N

N

H

H

O

O

O

N

N

H

H

O

O

O

N

N

H

H - -

- H

asam bebas (pH 2) monolaktim (pH 10) dilaktim (pH 13)

Uji Skrining dan Konfirmasi dengan GC-MS

• Prinsip kerja GC– Pemisahan analit dalam fase gas berdasarkan perbedaan afinitas

analit dengan gas pembawa dan kolom cair atau padat– Pemisahan analit dengan suhu terprogram memungkinkan

memisahkan analit berdasarkan sifat volatilitasnya

• Prinsip Kerja MS– Molekul analit dalam fase gas dipecah (fragmentasi) dengan

tumbukan elektron atau ionisasi kimia, fragmen molekul tersebut kemudian dalam suatu medan magnet dipisah-pisahkan dan dianalisa, hasil analisa ditampilkan dalam spektrum rasio massa/muatan (M/Z)

Gambar skema alat

Data analisis GC-MS

Analisis kualitatif Data GC-MS

• Berdasarkan parameter waktu/volum tambat– Pembandingan waktu tambat.

• Analisa dari suatu senyawa dapat dilakukan dengan membandingkan waktu tambat senyawa yang diduga dengan baku pembanding

• Variasi waktu tambat oleh perlakuan atau radas dalam instrumen– Waktu tambat relatif

• Menggunakan waktu tambat relatif senyawa yang belum diketahui dibandingkan dengan membandingkan waktu tambatnya terhadap sejumlah senyawa pembanding pada kondisi yang sama

• Kelemahan penggunaan pembanding antar lab yang berbeda– Indek Waktu Tambat

• Metode berikutnya adalah metode Kovats atau indeks waktu tambat yang menggunakan n-alkana sebagai standard.

• Pada kondisi isotermal, logaritmik waktu tambat dari alkana adalah sebanding dengan jumlah atom C-nya.

• Keuntungan dari metode ini adalah relativ tidak bergantung pada laju aliran gas, persen fase diam dan panjang kolom.

– Indek respon • membandingkan respon relatif senyawa tersebut pada dua detektor yang berbeda

• Menggunakan detektor MS– Paling spesifik dan selektif

HPLC

• Kolom: – Si; – Kieselgur termodifikasi: NH2,CN; – Penukar ion– Fase balik „RP C-8, RP C-18, dll

• Fase gerak:– Elusi isokratik– Elusi gradien

• Detektor– UV (Photometer, DAD)– Fluorosensi– Elektrokimia– MS– Indekbias

HPLC-DAD

HPLC- DAD

AAS

• Umumnya analisis racun logam dan senyawa logam

• Untuk keperluan penetapan kadar racun logam berdasarkan valensi logam → perlu di koppel dgn Kromatografi Cair

Colour Test

• Used of colour test• in the visualization of developed TLC plates.• UV/visible absorption and spectrophotofluorimetry• were also amongst the early techniques applied in• qualitative and quantitative toxicological analyses,• UV spectrophotometry• is also important for monitoring reaction rates in• immunoassays or in monitoring

NAD/NADHorNADP/NADPH-linked enzyme reactions.

UV/visible spectrophotometry

• Gugus kromofor• Mereaksikan analit dengan reagen• tertentu membentuk hasil reaksi:• Berwarna• berfluoresensi

TERIMA KASIH