Revista Médice de Costa Rica y Centroamélica XLI (527) 69·75; 1994

LABORATORIO

DIAGNOSTICODE LABORATORIODE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS

Rodrigo Siqueira-Batista *Luis Eduardo Meneses Quintas *'"Rubén Alberto Storino ***

SUMMARYIn the present paper it was intended

to establish the most important aspects onthe Chagas' Disease diagnosis, characteriz­ing its laboratory stage. Were observed themajor assays, their indications, contra-indi­cations and sensibility in the diferent phasesoC the disease (acute, indeterminated andchronic phases). We hope to be contributingthis way to widen the knowledge on this sosevere and prevalent disease.Key Words: Chagas's Disease. LaboratoryDiagnosis.

"'Entrenamiento del Departamento de Cirugía Cardíaca del HospitalUniversitario Pedro Ernesto (HUPE) y del Departamento deParasitología de la Facultad de Ciencias Médicas * VERJ.** Estudiante de Maestría en Farmacología por el Departamento deFarmacología Básica y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas,Universidad Federal de Río de Janeiro (UFRJ).••• Doctor en Medjcina y profesor de la Universidad Nacional de LaPlata.1- Trabajo realizado en la Facultad de Ciencias Médicas -UERJ, y en elInstituto Cardjova.~ctllar de La Plata - INCALP (Agentjna).

INTRODUCCIONPodemos tener clara noción de la impor­

tancia del diagnóstico de laboratorio de laenfermédad de Chagas, si tenemos en cuentaque solamente 5,0% de los individuos infecta­dos presentan los síntomas y señales caracterís­ticos de la patología 4,31. Veremos ahora losaspectos generales de los principales métodosde diagnóstico de laboratorio (Cuadro 1)

1- MÉTODOS DE DIAGNOSTICOPARASITOLOGICO

la) METODOS DIRECTOS:Utilizados preferentemente en la investi­

gación de la enfermedad de Chagas (EC)aguda, por cuenta de la alta parasitemia carac­terística de esta fase.

- Examen a fresco 4,27:

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CUADRO 1METODOS DE LABORATORIO UTILIZADOS EN LA

INVESTIGACION DE LA ENFERMEDAD DE CHAGAS.

Es un método sencillo y sensible, ensituaciones donde la parasitemia es elevada(fase aguda). Para realización del examen, secoge una gota de sangre del paciente (por ejem­plo a través de punción digital), poniéndola enla lámina y cubriéndola con una laminilla. Selleva al microscopio en busca de formas tripo­mastigotas.

Diagnóstico Parasitológico

DIRECTO

Diagnóstico Inmunológico

punto inicial. Secar la lámina, fijarla y colorear­la por el método de GIEMSA.

• Método de Deane y Kishner13:

Básase en el hecho de la lisis de eritroci­tos puede ocurrir más rápidamente que la de lostripomastigotas sanguíneas. A Iml de sangreañádase 9 mi de agua destilada, póngaseinmedia-tamente después Iml de solución deNaCl a 17%, para mantener la osmolaridad delmedio y consecuentemente mantener los tri­panosomas intactos. Se centrifuga a 2000 rpmpor 15 minutos, llévese el sedimento obtenidoal examen microscópico.

• Método de Silícones 28:

Se coloca la sangre sobre aceite de sili­cone de densidad 1075, el cual actúa como fil­tro. Después de centrifugada, los glóbulos rojos("más pesados") se depositan en el fondo de losparásitos, los leucocitos y las plaquetas quedanen el sobrante y es observado al microscopio.

• Floculación rápida

• Tripla centrifugación deMartín~Leubouef-Rouband

• Método de Strout• Punción biopsia de nódulos

linfáticos

• Examen en fresco _ Fijación del Complemento

• Gota gruesa • Hemoglutinación• Método de Deane e Kirchner • Inmunofluorescencia• Método de Silicones e Reacciones

InrnunoenzUnáticas• Aglutinación de látex

INDIRECTO• Inoculación en animales

sensibles• Xenodiagnóstico• Hemocultivos

• Gota gruesa 27,22:

Método preconizado por Salvador Mazza,consiste en colocar 2 o 3 gotas de sangre sobreuna lámina, reuniéndolas para confeccionar unaúnica mancha circular de Icm de diámetro.Después de la sangre secar, métese la lámina enagua destilada, para que ocurra hemolisis (y asíse torne más transparenteJ, se obtiene la colo­ración por el GIEMSA. Se examina al micros­copio, averiguando la presencia de parásitos.

• Distensión Sanguínea 27:

S(i: coloca una pequeña porción de sangresobre una lámina (completamente desengrasa­da), próxima a una de sus extremidades. Seapoya otra lámina sobre la primera, en un ángu­lo de 45° y a seguir, se distende la gota a lolargo de la lámina, de modo de moverla del

• Método de la triple centrifugación deMartin.Leubouef.Rouboud 7:

Se deposita 10 mI de sangre venoso en untubo de ensayo conteniendo 1ml de solución a20% de citrato sódico. Se procede entonces trescentrifugaciones -la primera a 1800 rpm/7min.;la segunda a 2000 rpmllO min.; utilizando elsobrante de la anterior; y por fin a 2000 rpm/20mino con el residuo de la segunda centrifu­gación. De este último centrifugado se retira elsobrante y analiza el sedimento al microscopio.

• Método de Strout 32,7,

Se coge 5ml de sangre, se dejan enreposo a temperatura ambiente, para que lacoagulaci6n y retracción espontánea delcoágulo ocurra. Se centrifuga el suero obtenidoa l60g/5 min., para la separación de los eritro­citos aún en suspensión, y enseguida se hacenueva centrifugación a 350gll0 min., paraobtenci6n del sedimento que será observado enel microscopio. Este método tiene alta sensibili­dad, pudiendo alcanzar 95% de éxito en la fase

Siqueira, Meneses, Storino: Enfermedad de Chagas 11

aguda 33,15.

. Punción Biopsia de Nódulos Linfáticos 30:Por su gran afinidad a las células del Sis­

tema Retículo-Histiocitário ll ,12, el T.cruzj desdetemprano puede ser encontrado en n6dulos lin­fáticos, parasitando macrófagos, dispersos enexudato inflamatorio (especialmente en casosde adenitis satélite y chagoma de inoculaci6n).Así, se hacen del material biopsiado, se puedeinvestigar una posible infección por T. cruzi.

lB) MÉTODOS INDIRECTOSUtilizados tanto en la fase aguda como en

la fase cr6nica, pero por tratarse de ensayos quepretenden encontrar parásitos, su sensibilidaden la fase cr6nica no es muy alta.

. Inoculación en animales sensibles 33,

Es un método preferentemente utilizadoen el aislamiento de parásitos, teniendo algunasrestricciones para su diagn6stico de rutina - (l)El desariOllo de los parásitos en el animaldependerá de las características del T. cruzi ; (2)Mantenci6n de animales para su investigaci6nes dispendiosa y también muy laboriosa; (3).Tiempo prolongado para obtenci6n de resulta­dos (entre 7 y 20 días 6). No obstante, la inocu­lación aún se utiliza para el diagnóstico enalgunos Centros de Pesquisas.

-Xenodiagnóstico:Lo fundamental de este método es la

simulaci6n en el laboratorio de condicionesnaturales para ciclo evolutivo del T. cruzj en losTriatomineos, hasta entonces exento de infec­ción 21. Se utilizan 4 cajas con 10 ninfas de ter­cer grado (alimentadas durante toda la vida enaves, para garantizar la "virgindad" de infec­ci6n de las nifas), con una fase abierta, cubiertasolamente por una cepa delgada de tul. Se apli­ca esta fase en el antebrazo del paciente por 30min., y después de este período, se guardan lascajas en condiciones adecuadas (local oscuro a27°C), para desarrollo del insecto. La lectura serealiza por la observación del contenido intesti-

nal del insecto, 30 y 60 días trás de la apli­caciÓn33•16. Durante la realizaci6n de examen,pueden ocurrir reacciones alérgicas, siendonecesario en tales casos, la prescri pci6n depomadas con corticoides33 • La sensibilidadacepta para el xenodiagn6stico es alrededor de100% para la fase aguda33 y 5,3 11 hasta 50%26de positividad para la fase cr6nica, parapacientes conocidos como chagásicos. El xe­nodiagn6stico está siendo motivo de numerososestudios 11,12, con el prop6sito de mejorar latécnica e incrementar la sensibilidad en la fasecr6nica (por ejemplo, se utiliza solamente enTriatomineos hembras25).

• Hemocultivos:Esta es una técnica diagn6stica que requieremenos infraestructura que el xenodiagn6s­tico lJ• La técnica empleda para la realizaciónde hemocultivos es demostrada en el cuadro n.

CUADRO 1ITECNICA PARA LA REALlZACION

DE HEMOCULTIVO

1- Se procede la colecta de 30 mi de sangre delpacieute a ser investigado, se utiliza como allticoagulante laHeparina o la EDTA;

2- Centrifugar la sangre a 300g/1O min., a tempera­tura ambiente;

3· Dejar en reposo por una hora (también a tempe­ratura ambiente);

4- Separar el sobrelíquido (plasma) del sedimento(fundamentalmente eritrocitos). centrifuga el primer a 900g/30 min., a temperatura de 4°C, adicionando 5ml de LIT alsedimento obtenido durante esta centrifugación;

5- Centrifúguese y lávese el sedimento de eritroci­tos con lOml de medio UT, y dividirlo a 6 tubos conteniendo3ml de medio UT cada;

6- Incubar los tubos a 27°C, procédase a la suavehomogeneización bisemanal;

7- Hacer lecturas trás 30, 60, 90, Y 120 días, recó­jase l gota del medio de cultivo. póngase sobre lámina devidrio limpia y posteriomlente cúbrase con lamínula. Lléveseal microscopio y examine toda la lámina en busca de parásitos.

A lo largo de los años, muchos GruposCientíficos se han esmerado en busca demejores técnicas de hemocultivo. Tanto paraaumentar la sensibilidad, como para el xeno­diagnóstico, es baja en la fase crónica (positivi­dad máxima aceptada alrededor de 50%"-24).

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La mayoría de los trabajosl2-23 utilizando elmedio LIT, han variado la positividad de25,7%33 hasta 71,4%23, dependiendo delnúmero de repeticiones del examen (cuantomayor el número de repeticiones, mayores sonlas tasas de positividad ll). Vale la pena resaltarun relato descrito en la literatura1, en la cual lapositividad del método fue de 100%, en taleventualidad se utilizaron dos series deexámenes. Actualmente, se está estudiando lainterferencia de diversos factores, que puedenresponder por la baia de positividad del métodoen la fase crónica, como por ejemplo diferen­cias en cuanto al anticoagulante empleado l8.Con la progresión de éstos y otros trabajos,esperamos en breve, una mayor eficacia de latécnica de hemocultivo y tener resultados másanimadores.

2) Métodos de diagnóstico InmunológicoEl Inmunodiagnóstico de la EC, hasta el

presente momento, se pronostica la detecciónde anticuerpos generados en el desenvolvimien­to de la evolución de la infección. Teniendo encuenta los mecanismos inmunológicos de estaenfermedad19, las técnicas inmunológicas sonde destacada relevancia para el diagnóstico dela etapa crónica, llevando gran ventaja sobrelos métodos parasitológicos ya descritos. Esinteresante resaltar que el inmunodiagnósticosolamente preconizará la enfermedad propia­mente33 que deberá ser identificada también.por hallazgos clínicos. Trataremos ahora lasprincipales reacciones suerológicas utilizadasen el diagnóstico de la EC. Reacción deFijación del Complemento (RFC): Las reac­ciones diagnósticas que utilizan la Fijación delComplemento, tiene como principio el ago­tamiento del Complemento existente en unadeterminada porción de suero, por inmunocom­piejos formados por reacción inmunológicaprevia27. En la sangre de chagásicos e¡¡istenanticuerpos ami T. cruzj, capaces de ligarse aun antígeno adicionado al medio (derivado delparásito). Este complejo antígeno-anticuerpo esligado por el Complemento (en la región-Fc de

la Inmunoglobulina). agotando este complejodel medio de la reacción. Tras este adicionadoun "Sistema hemolítico"21, constituído porglóbulos rojos de carnero ligados a las hemo­lisinas (anticuerpo anti-eritrocito de carnero),se puede tener los siguientes resultados - (1)Hemolisis, significando reacción negativa, puesen este caso el complemento no fue agotadorpor el complejo Ag-Ac. teniendo libertad paraactullr sobre el complejo eritrocito de carnero­hemolisina; y (2) la ausencia de hemolisis. sig­nifica positividad del test, pues el complementono actuó sobre el complejo eritrocito decarnero-hemolisina. originado de haber sidoagotado en la reacción Ag-Ac de la EC. La sen­sibilidad varía de 84.5%20 hasta 100,0%21. encuanto a la relación de especificidad. puedenocurrir reacciones positivas para enfermos conCalazar o Leishmaniosis TegumentariaAmericana 21.

- Hemaglutinación:Las reacciones están basadas en los tra­

bajos de Boyden4• que muestran la posibilidadde cambiar las membranas de eritrocitos uti­lizando ácido tánico, de manera que permitanque éstas sean capaces de incorporar Ags de losparásitos, pudiendo entonces utilizarse loseritrocitos sensibilizados en la detección de Acsdel suero-problema. Se coloca una muestra deeritrocitos sensibilizados en una placa tipoKline33• y enseguida añádase en suero a seraveriguado, así queda homogenizada la mixturaresultante. Se aguardan 10 mino y enseguida seprocede a la lectura. Por corto tiempo de reac­ción, la facilidad de la técnica y los bajos cos­tos33, la hemoglutinación es ideal para la regu­lación en bancos de sangre y averiguacionesepidemiológicas 27. Su único inconveniente esla necesidad de la preparación de los eritrocitossensibilizados. casi que diariamente8. La sensi­bilidad varía de 50%33 (fase aguda) hasta 100%(fase cronica)20.

- Reacción de InmunoOuorescencia:Es una de las técnicas más sensibles en

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Siqueira, Meneses, Storino: Enfermedad de Chagas 73

la suerología de la EC, se puede utilizar tantoen la fase aguda (detección de 10M), como enla crónica (detección de 100). Podemos subdi­vidir la Inmunofluorescencia en directa e indi­recta, siendo esta última la más utilizada en ladetección de la EC. La técnica se resume en lamarcación de un anticuerpo anti-inmunoglobu­lina, con la substancia fluorescente, siendo esteAc anti-Ac capaz de ligarlo a un complejo AgITcruzj) -Ac del paciente chagásico, la flores­cencia aparece, cuando es llevado al microsco­pio adecuado (equipado con luz ultravioleta).El resumen de la técnica es demostrada en elCuadro III.

CUADRO III

1) Se coloca una muestra de eritrocitos sensibiliza­dos en una placa tipo K1ine;

2) A continuación añádese el suero a ser investiga­do, luego se homogeniza la mistura resultante;

3) Se espera 10 min., y enseguida se procede 1alec-tura.

Estudios han indicado que la sensibilidad varíade 93%20 hasta valores próximos a 100%27. Laespecificidad es del orden de 99,7% pudiendo,en raros casos, ocurrir reacciones de falso posi­tivo para Leishmaniosis33.

-Reacciones Inmunoenzimáticas (ELISA);Así como la Inmunofluorescencia, estos

tests se basan en el uso de Ac anti-Ac. En cam­bio, al contrario de las sustancias fluorescentes,los Acs utilizados serán marcados con enzimas35. En el ensayo conocido por ELISA (Enzymelinked Inmunosorbent Assay), la reacción sehace en tubos o placa~ de material plástico conexcavaciones, en las cuales la superficie internaes cubierta por Ags (tripanosomas); luego, adi­ciónese el suero a ser investigado, incúbese elsistema por 2 horas a temperatura ambiente27.Enseguida se lava y adiciónase el Ac anti-Acenzimáticamente marcado (fosfatasa alcalina operoxidasa)33, incubando nuevamente por 3horas a temperatura ambiente. Se lava de

nuevo, se incluye el respectivo substrato para laactuación enzimática, y una vez más se incubaa temperatura ambiente de 30 mino hasta lhora, tiempo al fmal del cual se adiciona NaOH3N27, para la interrupción de la reacción enzi­mática. Leer en espectrofotómero a 440nm o400nm (para substratos de fosfatasa alcalina).Por su fácil ejecución, y por su bajo costo 27, esindicado para la investigación de la EC en granescala. Estudios apuntan una sensibilidad de98,0%20, para ELISA.

-Aglutinación de látex (directa);Desarrollada en 197134, teniendo origen

similar a la HA (hemaglutinación), pero uti­lizando partículas de látex adsorbidas con Ag, ala inversa de eritrocitos sensibilizados. La téc­nica es la misma de la HA, siendo la lecturarealizada más rápida (5-7 min.)27. Tanto para lafase aguda3, como para la fase crónica2O, la po­sitividad se sitúa en la escala de 94,0%.

- Test de Floculación Rápida29 ;

En este ensayo, se utilizan Tripano­somas fijados por formol, posteriormente rotospor el ultrasón y liofilizados. Para realizar elexamen, añádese sobre una lámina de vidrio 1gota de reactivo ya descrito arriba y una gotadel suero-problema, agítese por 8 minoProcédase al fmal de este intervalo de tiempo ala lectura. La sensibilidd de este método es si­milar a los ensayos descritos anteriormente.

PERSPECTIVAS 33,5

No se cuenta hasta el momento conmétodos que permitan pronosticar la evoluciónde los enfermos, aunque numerosos estudioshan sido dirigidos a buscar parámetros que per­mitan identificar este grupo de pacientes. Hayalgunas alternativas para correlacionar el perfilde anticuerpos con la sintomatología clínica.Estos trabajos parecen promisorios pero esnecesario realizar un estudio en un gran númerode pacientes, a fin de confirmar los resultados.

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RESUMENEste tipo pretendió establecer los más

importantes aspectos del diagnóstico de laenfermedad de chagas, en su estudio de labora­torio. Fueron observados los mejores ensayos,sus indicaciones, contraindicaciones y sensibili­dad en las diferentes etapas (aguda, indetermi­nada, crónica). Se espera haber contribuído enalgo para el conocimiento de esta enfermedadtan importante.UNITERMOS: Enfermedad de Chagas,Diagnóstico de laboratorio.

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