Toxoplasmosi negli animali: valutazione dei

metodi diagnostici convenzionali ed

innovativi e prospettive future

Comparison of detection methods for

Toxoplasma gondii in naturally infected

animals

Prof. ssa Daniela Piergili Fioretti

Dipartimento di Scienze Biopatologiche ed Igiene delle

Produzioni Animali e Alimentari

Facoltà di Medicina Veterinaria di Perugia

La Toxoplasmosi è una delle zoonosi più diffuse tra gli animali domestici e selvatici.

Si differenzia dalle altre zoonosi perchè cosmopolita, grazie al particolare ed unico ciclo biologico, e perchè non dimostra specificità per alcuna specie animale potendo colpire tutti i mammiferi, uomo compreso, e molti uccelli.

La toxoplasmosi è un tipico esempio di patologia

sulla quale convergono gli interessi delle

diverse specialità della medicina umana e

veterinaria.

Modello di sinergia tra medicina umana e

veterinaria

“ONE MEDICINE- ONE HEALTH”

La toxoplasmosi

è considerata tra

le maggiori

“Foodborne

diseases”

Negli USA la

toxoplasmosi è la

3a causa di morte

tra le malattie

alimentari

Episodi epidemici di toxoplasmosi nella

popolazione umana (Dubey, 2010) associati

al consumo di acqua di conduttura non

adeguatamente trattata o ingestione di

acqua ricreazionale ha portato alla

definizione di “Waterborne Zoonosis”

WHO raccomanda la raccolta di dati epidemiologici per:

capire l’importanza delle varie

sorgenti di infezione per l’uomo;

controllare la malattia nell’uomo;

controllare la malattia negli animali.

La direttiva CE 2003/99 (recepita in Italia dal D.L. 4

Aprile 2006, n. 191) ha inserito la toxoplasmosi tra le

zoonosi da sottoporre a sorveglianza in funzione della

situazione epidemiologica nazionale.

Nonostante questo

Non esistono dati epidemiologici significativi nè

per l’infezione nell’uomo e negli animali nè per

la presenza del parassita negli alimenti.

La CE (2007) ha incaricato l’EFSA (European Food

Safety Authority) di fornire indicazioni circa:

Metodi ottimali di sorveglianza e di monitoraggio

nella popolazione, negli animali e negli alimenti per la

tutela della salute pubblica;

Metodi diagnostici da utilizzare per l’evidenziazione

del parassita negli animali (caratterizzati in termini di

sensibilità, specificità, affidabilità, ripetibilità) e negli

alimenti (tipi di campioni da prelevare, fase

produttiva).

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

FINALITÀ

Tutela della salute

pubblica

Il consumo di

carni crude o

poco cotte

rappresenta per

l’uomo il rischio

maggiore di

contrarre

l’infezione

Tutela della salute

animale

Forme cliniche sia

in animali

immuno-

compromessi che

animali sani

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

Panel Biological Hazards EFSA

Raccomanda di sottoporre ad

indagine gli allevamenti ovini,

caprini, suini e selvaggina

Non essendo possibile svelare

l’infezione al mattatoio, la tutela

deve essere fatta a livello di

produzione primaria

(programma di biosicurezza

2007-2013 CE)

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

FINALITÀ

Tutela della salute

pubblica

Il consumo di

carni crude o

poco cotte

rappresenta per

l’uomo il rischio

maggiore di

contrarre

l’infezione

Tutela della salute

animale

Forme cliniche sia

in animali

immuno-

compromessi che

animali sani

Manifestazioni cliniche nei pets (gatti, cani) ed equini

Fattori legati all’ospite

-Età dei soggetti

-Stato immunitario

Fattori legati al parassita

-Patogenicità dei ceppi

(la genotipizzazione degli isolati ha

portato all’identificazione di diversi

genotipi Dubey, 2009)

-Dose infettante

Sintomi clinici legati alla compromissione d’organo

Polmonite (rilevante nel cane)

Epatite, Miosite, Miocardite

Uveite (rilevante nel gatto)

Dermatite

Meningoencefalite (rilevante negli equini)

sintomi nervosi (depressione del sensorio, incoordinazione motoria,

alterazioni del comportamento, crisi epilettiformi….)

IN SOGGETTI IMMUNODEFICIENTI TOXOPLASMOSI SISTEMICA

Manifestazioni cliniche nei pets (gatti, cani) ed equini

Nel gatto Toxoplasma ha importanza sia dalpunto di vista epidemiologico sia clinico;

I gatti randagi mostrano tassi di

sieropositività maggiori rispetto a quelli

padronali

La maggior parte dei gatti infetti non mostra alcun sintomo

E’ possibile osservare in prima infezione una

linfoadenomegalia retromandibolare

La sieroprevalenza varia con l’età(trasmissione orizzontale prevalentesulla verticale), e con lo stile di vita(attività predatoria).

I segni più frequentemente descritti sono ascrivibili asoggetti FIV/FELV+ (in analogia con la specie umana siosserva una predisposizione alla toxoplasmosi sistemica);

La forma clinica nel gatto è per lopiù rappresentata da formeneurologiche (iperestesia,alterazionicomportamentali);

Altre conseguenze dell’infezione sonoepatiti, necrosi del pancreas, miositi,miocarditi, uveite/corioretinite.

In presenza di forme oculari o di sintomi

nervosi è sempre opportuno inserire tra la

diagnostica di laboratorio la ricerca di

Toxoplasma

Negli USA sono stati condotti studi sulle

cause di uveite nel gatto e gli agenti più

comunemente riscontrati in ordine di

frequenza sono stati:

Toxoplasma

FELV

FIV

FIP

MANIFESTAZIONI CLINICHE NEGLI ANIMALI DA

REDDITO

OVICAPRINI

Aborto per passaggio

transplacentare favorito da:

placente sindesmocoriali,

lunghezza gravidanza,

virulenza dei ceppi,

sistema immune materno.

MANIFESTAZIONI CLINICHE

NEGLI ANIMALI DA REDDITO

CONTAGIO MATERNO IN GESTAZIONE

1-40 GIORNI 70-90 GIORNI > 110 GIORNI

↓ ↓ ↓ABORTO

EMBRIONALE

ABORTO FETALE O

NATIMORTALITA’

PER

TERATOGENESI

SANI MA

CONGENITAMETE

INFETTI

Suini (Dubey, 2009)

Rare segnalazioni di aborti e

nascite premature

Rare segnalazioni di polmoniti,

miocarditi, encefaliti

Bovini-avicoli non esistono

casi conformati di malattia

(Dubey, 2008)

Generalmente infezioni subcliniche o con segni non

patognomonici quali ipertermia, anoressia, tachipnea

Iter diagnostico necessita delle risultanze di

esami in grado di evidenziare il parassita o

la risposta immune da esso evocata.

Il reperto clinico ed ematobiochimico non

sono patognomonici dell’infezione.

DIAGNOSI DI TOXOPLASMOSI ANIMALE

Test diretti per evidenziazione del parassita

Esclusivi per felidi

Ricerca di oocisti

non sporulate

Tecnica di flottazione

con soluzione satura di

NaCl, ZnSo4 al 33%

(p.s. 1200), Tecnica di

Telemann

(sedimentazione con

acido acetico ed etere)

Campioni

bioptici di organi

target (linfonodi,

milza, fegato,

polmone, SNC).

Emulsioni

antibiotate di

campioni bioptici

Inoculazione per via

peritoneale in topini

cortisonizzati

Prove in vitro su

colture cellulari

(VERO,

Fibroblasti umani)

Esami coprologici

Immunoistochimica

Esami istologiciEsami biologici

Sezioni colorate

con

ematossilina-

eosina

Diagnosi differenziale con oocisti di

Isospora (I. felis, I. rivolta), Sarcocystis

(S. bovifelis, S. ovifelis), Hammondia (H.

hammondi)

ESAMI COPROLOGICI

Limiti e vantaggi

scarso significato per il

breve periodo di patenza

(15 giorni)

Oocisti parzialmente

sporulate di T.gondii :

12x10m

Oocisti sporulate di

Sarcocystis ovi-felis : m

14X9m

Oocisti parzialmente sporulate di

Hammondia hammondi : 15x10m

Oocisti sporulate diIsospora felis : 45x35 m

ESAMI ISTOLOGICI

Falsa negatività nei casi

di infezioni

pauciparassitarie

Utile per l’evidenziazione

parassitaria la tecnica di

immunofluorescenza

diretta

Pseudociste e tachizoiti nel

polmone di un cane (IF)

IF su sezioni istologiche

Preparato istologico colorato

con ematossilina-eosina

Cisti nel cuore di un ovino

TECNICA DI IMMUNOISTOCHIMICA

(con anticorpi policlonali) utile per l’evidenziazione parassitaria di

forme pseudocistiche e tachizoitiche.

(A) Numerous tachyzoites are present, but are not visible

(H and E);

(B) Immunohistochemical staining with anti-T. gondiiI

antibodies; all black spots (arrowheads) are

tachyzoites (Dubey, 2002).

ESAMI BIOLOGICIPermettono la riproducibilità del parassita, utili nelle infezioni

pauciparassitarie

La circolazione di ceppi

cistogeni permette la

diagnosi dopo trenta

giorni con il reperimento

di cisti cerebrali

Richiedono laboratori specializzati per

la produzione di linee cellulari.

Si ha positività dopo 48-72 ore

dall’inoculo con aree di lisi cellulare e

clusters di tachizoiti

Colture cellulari

Fibroblasti umani invasi da

tachizoiti di Toxoplasma gondii

ESAMI BIOLOGICI

POCO ECONOMICHE

PIU’ SENSIBILI

RISPETTO ALLE

PROVE BIOLOGICHE

SU TOPINI

“CAT FEEDING TEST”

IL GATTO MANGIA ANCHE 500 GR. DI CARNE E

PUO’ INFETTARSI CON POCHI BRADIZOITI

TEST BIOMOLECOLARI

PCR

(amplificazione

del gene B1)

Su sangue, siero,

liquor,

umor acqueo, con

sensibilità pari a

quantità di

DNA equivalenti a 10

tachizoiti (100 nel

sangue)

Negatività sull’UA in

caso di paucinfezione

o infezione ristretta al

segmento posteriore

(corpo vitreo) o

trattamento

farmacologico (la

sierologia sull’UA è

invece positiva)

Diagnosi ante-mortem

Positività sul liquor dirimente per la diagnosi

(sierologia positiva non discrimina tra produzione

locale di IgG o passaggio emato-encefalico)

La PCR deve essere associata al

rilievo anticorpale (IFAT, ELISA)

Di recente acquisizione e non comprovati su un numero significativo di animali

Lappin, 1996)

TEST DIRETTI SIEROLOGICI

ELISA e WESTERN

BLOT si dimostrano

validi per la ricerca di

antigeni circolanti

(Dubey, 2009)

Utili nei casi di soggetti immunodepressi

Primo movimento anticorpale

IgM e IgG verso antigeni

cuticolari (Proteina P30)

METODI INDIRETTI SIEROLOGICI

(Per evidenziare la risposta immune specifica e duratura nel

tempo)

Test più precoci e specifici

quelli che utilizzano il

parassita intero in fase

tachizoitica

Test di riferimento secondo

OMS: IFAT e Dye Test

MAT (Modified agglutination test)- molto utilizzato per studi epidemiologici

negli animali domestici e selvatici per facilità di utilizzo e non richiesta di

reagenti specie-specifici (Montoya, 2002)

Popolazione felina buona sensibilità

Popolazione canina non affidabile

METODI INDIRETTI SIEROLOGICI

(Per evidenziare la risposta immune specifica e duratura nel

tempo)

Anticorpi IgG verso antigeni

citoplasmatici più tardivi

IHA, Elisa

(Test più accreditato per

via della migliore

standardizzazione della

metodica)

Sensibilità 94,5, specificità 93,6

1/16 in IFAT 1/32 in ELISA

IFAT ed ELISA sono test di riferimento per la diagnosi in quanto possono

saggiare tutte le classi anticorpali.

Diagnosi di infezione acuta IgM specifiche e sieroconversione delle IgG

Difficile stabilire un titolo significativo di malattia.

Forme asintomatiche con titoli elevati e forme

cliniche con titoli molto bassi

Validi come cut-off per una diagnosi di

infezione nel cane e nel gatto

(Dubey, 2004; Silva, 2002)

Test sierologici di recente introduzione

P30 IgG AVIDITY (con test ELISA) per le IgG

(validata sul modello in medicina umana)

P30 IgG AVIDITY (con test ELISA) per le IgG (validata sul

modello in medicina umana)

Principio di reazione le IgG prodotte nella fase acuta

presentano una bassa forza di legame con l’antigene

(bassa avidità), mentre presentano un’elevata avidità nella

fase cronica

IgG AVIDITY CON TECNICA ELISA

Pozzetti sensibilizzati con antigene

Siero diluito

Lavaggio tampone

Lavaggio con urea (agente dissociante)

Anticorpi anti-IgG animali marcati con fosfatasi alcalina (coniugato)

Lavaggio

Substrato (4-metilumbelliferil fosfato)

La fosfatasi alcalina catalizza l’idrolisi del substrato in un prodotto fluorescente

Lettura a 450 nm

Solo gli anticorpi ad alta avidità

non vengono staccati dall’urea

Indice di avidità quantità IgG legate dopo trattamento con urea/quantità di IgG legate prima del trattamento con urea

Interpretazione dei risultati

< 15% bassa avidità infezione recente (ultimi 3 mesi)

15-25% media avidità ultimi 6 mesi

>25% alta avidità infezione cronica

ANIMALI DA REDDITO

Importante la diagnosi di aborto da Toxoplasma

negli ovicaprini

METODI DIRETTI (per l’evidenziazione del parassita su campioni di

cotiledoni placentari,cervello fetale, polmone)

• Prova biologica Inoculazione per via peritoneale in

topini cortisonizzati

• Esami istologici

• Esami immunoistochimici

• IF diretta

Fissazione, disidratazione,inclusione

e colorazione delle sezioni con

Ematossilina –Eosina

• Esami biomolecolari B1PCR (sensibilità su campioni

placentari pari a 10 tachizoiti)

• Prove in vitro su colture cellulari

LIMITI E VANTAGGI

•PCR -, prova biologica +

infezioni pauciparassitarie

•PCR +, prova biologica –

parassiti non vitali per

autolisi tissutale (DNA più

resistente)

METODI INDIRETTI SIEROLOGICI

1) IFAT con IgM positive, IgG ad alto titolo (640-1280).

2) P30 IgG Avidity ELISA (discrimina fra infezione acuta e cronica negli ovini

→→ alti valori di avidità si rilevano nel 90% delle pecore naturalmente infette al mattatoio

→→ alti valori di avidità (infezione cronica) in pecore con problemi abortigeni indicano che probabilmente Toxoplasma gondii non è l’agente causale

Salute pubblica

rischio per il consumatore dal

consumo di carni infette

Diagnosi post-mortem

utile per le indagini sulle carni macellate

Per il veterinario ispettore è

importante sapere se alla

presenza anticorpale

corrisponde una presenza del

parassita nelle carni!

Diagnosi post-mortem

utile per le indagini sulle carni macellate

Animali da macello con importanza sanitaria:

SUINI: alta sieroprevalenza ed alta presenza cistica nelle carni;

OVINI-CAPRINI: come sopra (nei caprini importante il latte e prodotti lattiero caseari);

BOVINI-BUFALINI: alta sieroprevalenza ma nulla o scarsissima presenza cistica;

EQUINI: alta sieroprevalenza e presenza cistica;

Diagnosi post-mortem

utile per le indagini sulle carni macellate

POLLI: alta sieroprevalenza (fino all’80%)/alta presenza cistica nelle carni e rarissima possibilità di tachizoiti nelle uova;

SELVAGGINA

Rischio emergente verso carne di capriolo, cinghiale (circa 15% in Umbria), daino

EFSA 2007- PIU’ DEL 50% DELLA SELVAGGINA CONSUMATA E’ SIEROPOSITIVA.

L’utilizzo delle tecniche sierologiche (IFAT, ELISA,MAT le più

utilizzate) per la messa in evidenza di IgG (infezione cronica)

ante-mortem, dà risultati non dirimenti per:

1) caduta del tasso anticorpale vicino ai livelli di background

dopo 6-10 mesi dall’infezione;

2) Stesso limite anche con antigeni sempre più purificati

fino ad antigeni ricombinanti (frammenti genici H4 e H11)

usati nella tecnica ELISA (Aubert, 2000);

3) Sierologia positiva non quantizza la carica

parassitaria e quindi non ha valore per l’immissione al

consumo delle carni!

• Tecniche per la ricerca di antigene circolante o DNA del

parassita sono allo studio;

• Sono necessarie tecniche poco costose e ad alto grado di

automazione per l’utilizzo nei mattatoi;

• E’ stata sviluppata una Real-Time PCR con primer la regione

ITS1 della sequenza genica 18SrRNA ed un probe fluorogenico

(Toxo Taq Man assay) in grado di evidenziare 0,1 pg DNA

equivalenti ad 1 bradizoite. Possibilità di automatizzazione,

diagnosi in 24 ore, applicabilità alle carcasse suine (Jauregni,

2001) e prodotti suini commerciabili. Limiti della prova →

campioni troppi piccoli < 1gr. data la distribuzione random delle

cisti e il basso numero delle cisti nei tessuti;

• Attualmente gli unici mezzi diagnostici applicabili nei mattatoi

sono le prove digestive triptiche su campioni di 50 gr di carne

(il carico parassitario è stimato < 1 ciste/50 gr).

Prospettive future

IFAT ed ELISA su succo carneo

Studi preliminari nella popolazione suina (Hill et al., 2006, Ranucci et al., 2010).

Confronto tra i diversi metodi (Hill et al., 2006) su siero di sangue e succo carneo

Ranucci et al.,hanno evidenziato una buona concordanza fra IFAT su siero e succo carneo (K=1) a partire da positività sieriche di 1/32

TEST SENSIBILITA’

CAT

BIOASSAY

100%

SERUM ELISA 100%

SERUM MAT 80,64%

TISSUE FLUID

ELISA

76,9%

REAL-TIME

PCR

20,51%

PCR 0

Prospettive future

Nel suino consentirebbe un monitoraggio della presenza del parassita non solo a livello di produzione primaria ma anche di industria di trasformazione.

Importante per commerciare prodotti Toxoplasma-free dato che la capacità del parassita di sopravvivere alle tecnologie di preparazione è ancora oggetto di studio.

La diagnosi di toxoplasmosi sulle carcasse al mattatoio per l’immissione al consumo di carni Toxoplasma-free rimane ancora un capitolo aperto.

CONCLUSIONI

• La complessità biologica del parassita;

• la mosaicità antigenica tipica di ogni stadio biologico;

•la variabilità della risposta immune in rapporto alla

diversità degli ospiti intermedi;

CONCLUSIONI

• le diverse finalità diagnostiche in campo veterinario;

• la variabilità in specificità e sensibilità delle varie

tecniche disponibili e la variabilità interlaboratori

nell’applicazione di una stessa tecnica;

• rendono la diagnosi di toxoplasmosi in campo

animale difficile e legata all’esecuzione contemporanea

di un pannello di metodiche tradizionali ed innovative o

molecolari.

Grazie per la cortese attenzione !!

Stages of Toxoplasma gondii